JPH0359913B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

本発明はストレプトマイセス属微生物の生産す
る新規な3′，5′−サイクリツクアデノシンモノホ
スフエートホスホジエステラーゼ（cAMPPDE）
阻害物質およびその製法に関する。 3′，5′−サイクリツクアデノシンモノホスフエ
ート（cAMP）はcAMP合成酵素（アデニル酸サ
イクラーゼ）とcAMP分解酵素〔ホスホジエステ
ラーゼ（PDE）〕のバランスの上に、動物組織
（臓器）に広く分布し各種ホルモン作用のセカン
ド−メツセンジヤーとして作用し、生理、生化学
的に重要な役割を演じている。更に細胞の分裂、
増殖、分化、心臓収縮、造血、中枢神経系への作
用、免疫反応、インスリン、ヒスタミンの放出な
どに関与していることが知られている。cAMPは
このように多岐にわたる生理作用を有するもので
あるが、このcAMPを分解する酵素（cAMP
PDE）の阻害物質は細胞内のcAMPのレベルを
上昇させるので心血管用剤、抗喘息剤、平滑筋弛
緩剤、精神神経用剤、抗炎症剤、癌治療剤、抗糖
尿病剤などになりうると期待される。 本発明者らは、先に放線菌ストレプトマイセ
ス・グリゼオオーランテイアカスNo.43894
〔Streptomyces griseoaurantiacusNo.43894（＝
SANK63479）〕株（微工研菌寄第5223号）を水
溶性培地に培養すると培養液中にグリゼオール酸
が生産されることを見出した（特開昭56−68695
号参照）。 更に、その誘導体として7′−デスオキシグリゼ
オール酸などについても研究した（特開昭60−
94992号）。今回、本発明者らは、上記菌株の培養
液中に他のcAMP PDE阻害物質が生成されてく
ることを見出し、この物質をジヒドロデスオキシ
グリゼオール酸（Dihydrodesoxy griseolic
acid）と命名した。ジヒドロデスオキシグリゼオ
ール酸は優れた脳代謝改善作用を有すること、制
癌剤と併用した時に制癌効果を増強すること、及
びインシユリンの作用を増強すること、さらにま
た毒性に関しては極めて磁いことを見出して本発
明を完成するに至つた。 ジヒドロデスオキシグリゼオール酸は下式を有
する。 ジヒドロデスオキシグリゼオール酸の生産菌で
ある放線菌ストレプトマイセス・グリゼオオーラ
ンテイアカスNo.43894株についての菌学的性質は
既に特開昭56−68695号に記載されている。 以上、ジヒドロデスオキシグリゼオール酸の生
産菌について説明したが、放線菌の諸性質は一定
したものではなく、自然的、人工的に容易に変化
することは周知の通りであり、本発明で使用し得
る菌株はストレプトマイセス属に属する、ジヒド
ロデスオキシグリゼオール酸を生産する菌株すべ
てを包含するものである。 次に、ジヒドロデスオキシグリゼオール酸の製
法について詳述する。 １ No.43894株の培養 本菌の培養においては、通常の放線菌の培養法
が一般に用いられる。培養のための栄養源として
は、各種のものが用いられるが、炭素源として
は、液糖、澱粉、グルコース、マニトール、フラ
クトース、ガラクトーン、ラムノースなどが単独
または組合せて用いられる。窒素源としては無機
及び有機のものが用いられるが、塩化アンモニウ
ム、硫酸アンモニウム、尿素、硝酸アンモニウ
ム、硝酸ソーダなど、また天然窒素源のペプト
ン、肉エキス、酵母エキス、乾燥酵母、生酵母、
コーンステイープリカー、大豆粉、きな粉、カザ
ミノ酸、ソリユブル・ベジタブル・プロテイン等
が単独または組合せで使用することも出来る。そ
の他食塩、塩化カリ、炭酸カルシウム、塩化マグ
ネシウム、燐酸塩など無機塩類を加える他、本菌
の生育やジヒドロデスオキシグリゼオール酸の生
産を促進する有機物または無機物を添加すること
をさまたげない。 特に、ジヒドロデスオキシグリゼオール酸はカ
ルボキシル基を２個、アミノ基を１個分子内に有
するので塩を形成する。従つて、例えば産生培地
に食塩、塩化カリ、炭酸カルシウム、塩化マグネ
シウムなどの無機塩類を添加することにより、ナ
トリウム塩、カリウム塩などのアルカリ金属塩、
カルシウム塩、マグネシウム塩などのアルカリ土
類金属塩として得られる。または、得られたジヒ
ドロデスオキシグリゼオール酸を常法により化学
的に処理することによつても塩として得られる。 培養法としては、往復振盪、回転振盪液体培養
法、固体培養法、特に深部撹拌培養法が最も適し
ている。培養温度は20〜35℃、PHは中性付近で培
養するのが望ましい。液体培養で通常48時間乃至
120時間培養を行うとジヒドロデスオキシグリゼ
オール酸もしくはその塩が培養液中に生成蓄積さ
れる。培養の進行に従つて培養液中に生産される
ジヒドロデスオキシグリゼオール酸もしくはその
塩は下記の試験例記載の方法により測定する。深
部液体培養終了時の培養液の示す阻害活性は70〜
85％を示す。 ２ ジヒドロデスオキシグリゼオール酸およびそ
の塩の単離・精製 ジヒドロデスオキシグリゼオール酸は酸性、水
溶性物質である。従つて培養液からの本物質の
単離・精製には水溶性の微生物代謝生産物をその
培養液から単離するために一般に用いられる分
離・精製の方法が利用可能である。深部培養法の
場合には、次のように行うのが好ましい。すなわ
ち、その菌糸体を過または遠心分離し、そのフ
イルターケーキを水で十分洗い、その洗液と液
を合わせる。この合併液を活性炭または他の吸着
剤、イオン交換樹脂で処理することによつてジヒ
ドロデスオキシグリゼオール酸およびその塩を吸
着させる。この吸着は、バツチ方式によつて行う
ことができるし、または、吸着塔に連続的に貫流
することによつても行うことができる。バツチ方
式においては、その液に活性炭吸着剤0.1〜0.6
重量／容量％、好ましくは0.35〜0.40重量／容量
％を加え、こうして得られた混合物を30〜60分撹
拌する。 その活性炭吸着剤を含水アセトンまたは含水低
級アルカノールで溶離し、この溶離液を減圧下で
濃縮することにより濃縮物を得る。更にイオン交
換樹脂カラム、活性炭カラム、ダイヤイオンカラ
ム、セフアデツクスカラムで精製を行い、純粋な
ジヒドロデスオキシグリゼオール酸およびその塩
を得ることが出来る。 ３ ジヒドロデスオキシグリゼオール酸の塩類の
別製法。 以上の如くして得られたジヒドロデスオキシグ
リゼオール酸は、化学的常法により塩に変換する
ことができる。例えばジヒドロデスオキシグリゼ
オール酸を少量の水または水と酢酸エチルのよう
な含水有機溶剤に懸濁し、次いでナトリウム、カ
リウムなどのアルカリ金属、カルシウム、マグネ
シウムなどのアルカリ土類金属の水酸化物、炭酸
塩、重炭酸塩などと室温付近で接触させてPH〜10
に調整する。次いで析出した沈澱をろ取すること
によつて得られる。得られた粗塩類は例えばカラ
ムクロマトグラフイーなどに付して精製すること
により純品として得られる。 本発明の化合物は、特に脳循環系疾患治療剤、
例えば脳卒中後遺症療剤、脳梗塞後遺症治療剤、
および脳代謝賦活剤、例えば老人性痴呆症治療
剤、外傷性脳障害治療剤として有用である。その
投与形態としては、皮下注射、筋肉内注射などの
非経口的投与の他、経口投与があげられる。 経口投与の際固型製剤として用いる場合は、製
剤上一般に使用される糖類、セルロース調合物の
様な賦形剤、でんぷん、ペースト、メチルセルロ
ースのような結合剤、崩壊剤等の添加物を包含し
てもよい。その投与量は症状、年令などによつて
異なるが、例えば成人に経口投与する場合は、１
日0.1〜100mgの範囲で１回若しくは数回に分けて
用いることができる。 次に実施例をあげて本発明を説明するが培養
法、分離・精製法はこれに限定されるものではな
い。 実施例 １ ジヒドロデスオキシグリゼオール酸グルコース
５％、大豆粉１％、イーストエキス0.1％、ポリ
ペプトン0.4％、ミートエキス0.4％、食塩0.25％、
炭酸カルシウム0.5％（PH7.0）の組成をもつ培地
30を作り、30ジヤー２基に13ずつ分注、
121℃、30分加圧殺菌した。冷却後同一培地で28
℃、72時間、回転振盪培養機にて前培養したNo.
43894菌培養液150mlずつ（１％、フラスコ２本）
を接種し、28℃、96時間、通気量１：１、回転数
200rpmで培養を行つた。２基分の液28（PH
7.0）はダイヤイオンHP20（三菱化成工業(株)社製）
を通過させカーボン吸着、水洗後60％アセトンで
溶出した。アセトンを留去、水層は濃縮後、更に
凍結乾燥して粗粉末150mgが得られた。次いで小
量の蒸溜水に溶かし、ダウエツクス１×４（ダウ
ケミカル社製、Cl^-型）へ吸着、食塩濃度をかえ
てグリゼオール酸とジヒドロデスオキシグリゼオ
ール酸の混合物を溶出した後、セフアデツクス
LH−20（フアルマシア社製）によるカラムクロ
マトグラフイーを行いジヒドロデスオキシグリゼ
オール酸を水を用いて溶出した。得られた目的物
質を含む分画をPH2.5に1NHClで調整し、ダイヤ
イオンHP20に吸着、水洗後、60％アセトンで溶
出した。60％アセトン分画を４℃にて一晩静置す
るとジヒドロデスオキシグリゼオール酸1.87mgが
板状結晶として得られた。本物質はシリカゲル薄
層クロマトグラフイー（メルク社製、Art.5715）
上、単一のスポツト標品（遊離型）であつた。 ジヒドロデスオキシグリゼオール酸の物理恒数
は次の通りである。 １ 外観：板状結晶 ２ 融点：160℃（褐変分解） ３ 分子量；365（ハイ・マススペクトルによる） ４分子式；C₁₄H₁₅N₅O₇ ５ 旋光度；〔α〕²⁰ _D＝−50.7゜（ｃ＝1.0，ジメチル
スルホキシド） ６ 紫外線吸収スペクトル；λ_naxnm（Ｅ１％ １cm）
0.01N塩酸水溶液および0.01N水酸化ナトリウ
ム水溶液中で測定した紫外部吸収スペクトルを
第１図に示す。 ７ 赤外部吸収スペクトル；ν^KBr _naxcm^-1 KBrベレツト中で測定した赤外部吸収スペ
クトルを第２図に示す。 ８ 1H核磁気共嗚スペクトル；δ：ppm d₆−ジメチルスルホキシド中、90MHzで測定
した核磁気共嗚スペクトルを第３図に示す。 実施例 ２ ジヒドロデスオキシグリゼオール酸ナトリウム
塩 グルコース５％、大豆粉１％、イーストエキス
0.1％、ポリペプトン0.4％、ミートエキス0.4％、
食塩0.25％（PH7.0）の組成をもつ培地を作り、
30ジヤー２基に15ずつ分注、実施例１に記載
したと同じ条件で培養を行なつた。２基分の培養
液28はダイヤイオンHP20を通過させた後、
カーボンカラムに吸着、水洗後60％アセトンで溶
出した。アセトンを留去した水層を濃縮後、さら
に凍結乾燥して粗粉末200mgが得られた。ついで
セフアデツクスLH−20（フアルマシア社製）に
よるカラムクロマトグラフイーを行い目的物を水
を用いて溶出した。グリゼオール酸の含まれてい
ない溶出液を濃縮後４℃にて一夜静置して生じた
沈澱物を遠心して集め凍結乾燥して、ジヒドロデ
スオキシグリゼオール酸ナトリウム塩が1.21mg得
られた。 ジヒドロデスオキシグリゼオール酸ナトリウム
塩の物理恒数は次の通りである。 １ 外観；白色粉末 ２ 融点；190℃（褐変分解） ３ 分子式；C₁₄H₁₃N₅O₇Na₂ ４ 元素分析値（％，１水塩として）； 計算値Ｃ，39.34，Ｈ，3.51，Ｎ，16.39， 測定値Ｃ，38.70，Ｈ，3.45，Ｎ，16.13 ５ 赤外部吸収スペクトル；ν^KBr _naxcm^-1 KBrペレツト中で測定した赤外部吸収スペ
クトルを第４図に示す。 実施例 ３ ジヒドロデスオキシグリゼオール酸 実施例１に記載したと同じ培地で600タンク
（内容300）を用いて行つた以外は実施例１と全
く同様に行つた。培養40時間目の培養液5μlの
示す阻害活性は80％であつた。培養液278か
ら実施例１と同様の方法で目的物の分離・精製を
行ないシリカゲル薄層クロマトグラフイー上、単
一のジヒドロデスオキシグリゼオール酸（遊離
型）20mgが得られた。 得られたジヒドロデスオキシグリゼオール酸の
物理恒数は実施例１で得たものと同じであつた。 実施例 ４ ジヒドロデスオキシグリゼオール酸ナトリウム
塩 実施例３に記載したと同じ方法で培養、分離・
精製を行ない、得られたジヒドロデスオキシグリ
ゼオール酸20mgを小量の水に懸濁した。
1NNaOHを用いてPH10に調整し、ついでセフア
デツクスLH−20カラムクロマトグラフイーを行
い凍結乾燥するとジヒドロデスオキシグリゼオー
ル酸ナトリウム塩18mgが得られた。 得られたジヒドロデスオキシグリゼオール酸ナ
トリウム塩の物理恒数は実施例２で得たものと同
じであつた。 試験例 酵素阻害活性 １ 酵素阻害活性測定法 cAMP PDEはラツト脳由来の粗酵素液を用
い、阻害活性測定法はアンネ・リース・ピチヤ
ード，ワイ・ユー・チユン著「ジヤーナル・オ
ブ・バイオロジカル・ケミストリー」251巻，
5726〜5737頁（1976年）に記載の方法を一部改
変して実施した。即ち¹⁴CでラベルしたcAMP
（終末濃度0.14μM）を基質とし、本系統化合物
（DMSO2〜5μlに溶解）、蛇毒液20μlおよび粗酵
素液40μlを0.2Mトリス−塩酸緩衝液（PH8.0）
中で混合し、全量100μlとし30℃、20分間反応
させる。反応終了後、反応液を樹脂アンバーラ
イトIRP−58で処理し、残存するアデノシンの
放射活性量からcAMP PDE阻害活性を100分
率で算出した。 ２ ジヒドロデスオキシグリゼオール酸のcAMP
PDEに対する阻害活性を50％阻害値（I₅₀）で
示すと第１表の通りである。

【表】 第１表に示した如く、ジヒドロデスオキシグリ
ゼオール酸はラツト脳由来のcAMP PDEに対し
て強い阻害活性をもつていることがわかる。公知
の本酵素の阻害物質であるパパベリンはラツト脳
由来のcAMP PDEに対してI₅₀値3.5μMであるの
と比較して本物質は約20倍強い阻害活性を示して
いる。

【図面の簡単な説明】

第１図はジヒドロデスオキシグリゼオール酸の
紫外部吸収スペクトル、第２図は同物質の赤外部
吸収スペクトル、第３図は同物質の核磁気共嗚ス
ペクトルを示す。第４図はジヒドロデスオキシグ
リゼオール酸ナトリウム塩の赤外部吸収スペクト
ルを示す。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 式 で示されるジヒドロデスオキシグリゼオール酸及
   びその塩類。 ２ ストレプトマイセス属に属するジヒドロデス
   オキシグリゼオール酸もしくはその塩の生産菌を
   培養して、その培養物よりジヒドロデスオキシグ
   リゼオール酸もしくはその塩を単離することを特
   徴とするジヒドロデスオキシグリゼオール酸もし
   くはその塩の製法。 ３ ジヒドロデスオキシグリゼオール酸もしくは
   その塩の生産菌がストレプトマイセス・グリゼオ
   オーランテイアカスNo.43894（Btreptomyces
   griseoaurantiacusNo.43894）である特許請求の範
   囲第２項記載の製法。 ４ ストレプトマイセス属に属するジヒドロデス
   オキシグリゼオール酸生産菌を培養して、その培
   養物よりジヒドロデスオキシグリゼオール酸を単
   離し、次いで塩形成物質と接触させてPH７〜10に
   調整することを特徴とするジヒドロデスオキシグ
   リゼオール酸の塩類の製法。