JPS6144841A - １−ヒドロキシシトロジンおよびそれらの微生物学的製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は弐１ （ただし式中、Ｒ１は水素または基ＯＲ５を表わし、そ
してＲ２は基−ＯＲ４または一００ＯＲ５Ｃただし式中
、Ｒ５は０１〜０５−アルキルを表わし、そしてＲ３お
よびＲ４は同一または異なりて水＃ｇまたはつぎの組成
すなわちＲｏａ−ｄＦ−Ｒｏｄ％Ｒｏａ−１’？−０１
ｎＡ　％Ｒｏａ−ｄＦＯ１ｎＢ　％Ｒｏａ−Ｒｏｄ−Ｒ
ｏｄ　％Ｒｏａ−ｄＦ−Ａｃｕ　、Ｒｏａ−Ｒｏｄ−０
１ｎＡ　５Ｒｏａ−Ｒｏｄ−ＡｃｕまたはＲｏｄ−Ｒｏ
ｄ−Ｒｏｄ　（ただし式中、Ｒｏａは四ドサミンを表わ
し、ｄＦ′はデオキシ７コースを表わし、Ｒｏｄはロジ
ノースを表わし、　Ａｃｕはアクロースを表わし、０１
ｎＡはシネルロースＡを表わしｓ　０１ｎＢはシネルロ
ースＢを表わし、そして（ｌＦ＝（！ｉｎＢは２個の糖
単位が通常のグリコシド結合の他にもう１個のエーテル
架橋によ多結合していることを表わす）から成る糖結合
を表わす〕を表わす）を有する１−ヒドロキシシトロジ
ンに関する。

本発明はまた式Ｉの化合物の製造法に関するものでアシ
、それはストレプトミセス・プルブラセンス（Ｓｔｒｅ
ｐｔｏｍｙｃｅａ　ｐｕｒｐｕｒａｓｃｅｎｓ）　ＤＢ
Ｍ２６５８の１１！株を適当な栄養培地中−＆５〜ａ５
、温度２４〜４０℃で且つ高い通気速度で発酵させ、そ
して通常の方法によシ＠養液および菌糸体から式Ｉの化
合物を単離することから成る。

ストレフトミセス・プルプラセンスＤＳＭ２６５８の単
離および同定はドイツ特許出ｗ４第ｐ３３２３０２５．
０号明細書に記載されている。その微生物はＤＳＭ〔ド
イツ微生物収集機構（Ｄｅｕｔｓｃｈｅ　Ｓａｍｍｌｕ
ｎｇｖｏｎ　Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉａｍｅｎ）ＣＤ　
−３４００ゲツテインゲン市グリ一スバツハ通、り８）
において１９８３　年５月２４日に寄託された。

上記の特許出顧誓にはまた好気Ｔ！＋条件下でストレプ
トミセス・プルプラセンスＤＳＭ２６５８の菌株を発酵
させることＫよる、式ｌの１−デヒドロキシアントラサ
イクリン誘導体いわゆるシトロジンの製造法に関する記
載が言まれている。

今や篤くべきことには、発酵の間酸素の供給を多くした
場合には１−ヒドロキシシトロジンが生成することが姑
い出された。特に細胞増殖抑制活性を有するこれらの新
規化合物は１−ヒドロキシアントラサイクリンのグルー
プに属し、それらのうちつぎのような代表的なものがす
でに記載されている。１−ヒドロキシ−β−ロドマイシ
ン（β−イソロドマイシンとも呼ばれる）：たとえばビ
オラマイシンＡ２およびＢニー１〔ダブリューフレック
氏ら著「ゼットアルゲムミクロバイオロギエＪ　（Ｗ、
Ｆ１ｅｃｋ氏ら著「Ｚ、Ａｉｌｇｅｍ。

ＭｉｋｒｏｂｉｏｌｏｇｉｅＪ　）第１４巻第５５１貞
（１９７４年）〕および〕β−インロドマイシンエイチ
ブロックマン氏ら著「ケムベルＪ　（Ｈ，Ｂｒｏｃｋｍ
ａｎｎ氏ら著［Ｏｈｅｍ、Ｂｅｒ、Ｊ　）ｆｉ　９８巻
第３１４５頁（１９６５年）］。

ε−ピロマイシン（シネルピン）：たとえばシネルピン
ＡＣダブリュケラーーシールレイン氏者「アンチミクロ
プエイジエンツケモテル」（Ｗ、Ｋｅｌｌｅｒ−８ｃｈ
ｉｅｒｌｅｉｎ氏著「Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ、Ａｇｅｎ
ｔｓＯｈｅｍｏｔｈｅｒ、Ｊ　）第６８頁（１９７０年
）〕、棟々のロジルビン〔エツチウメザワ氏ら著Ｆゼイ
アンテイブＪ　　（Ｈ，Ｕｍｅｚａｗａ氏ら者ｌ、ｒ、
Ａｎｔｉｂ、Ｊ　）第３０巻第６１６員（１９７７年〕
〕およびアクンシノマイシンＡ２　、Ｂ２　、Ｍ２．８
２およびＴ２〔ティーオキ氏ら著「ゼイアンテイブＪ　
　（Ｔ、０１（１氏ら著「Ｊ。

Ａｎｔｉｂ、Ｊ　）第２８巻第８５０頁（１９７５年）
および第３２巻第８０１頁（１９７９年）〕、およびム
セッター、マルセロ、ルードルフォーマイシンなど〔デ
゛イーイーネットルトン戊ら者「セイナットブロツドＪ
　　（Ｄ、に、Ｎｅｔｔｌｅｔｏｎ氏ら著「Ｊ、Ｎａｔ
。

Ｐｒｏｄ、Ｊ　）　ｍ　４３巻第２４２貞（１９８０年
）〕。

本発明による一般式Ｉの化合物の製造法は炭Ｘ源および
輩素蝕ならびに無機栄養塩および痕跡の元素を言むｔＡ
＊＠地中ｐＨ６，５〜８．５、温度２４〜４０℃で適当
な酸素の供給を伴った好気性条件下たとえば高速通気下
でストレプトミセス・プルプラセンスを発酵させ、つい
で以下に記載されるような通常の方法によシ培養液およ
び菌糸体から上記の化合物を単離することによシ行われ
る。

適当な炭素源はブドウ糖、殿粉、デキストリンおよびグ
リセロールである。適当な窒素源は大豆粉、酵母エキス
、肉エキス、麦芽エキス、とうもろこし浸出液、ペプト
ンまたはカゼインである。適当な無機栄養塩の例は塩化
ナトリウム、硫酸マグネシウムまたは炭酸カルシウムで
ある。使用することができる痕跡元素は鉄、マグネシウ
ム、銅、亜鉛およびコバルトである。

ストレプトミセス・プルプラセンスＤＳＭ２６５８は温
度２４〜４０℃、ｐｉ（６，５〜８．５、通気速度ａ８
〜ｔ　２　ｖｖｍで発酵させることができる。ストレプ
トミセス・プルプラセンスＤＳＭ２６５８の発酵は好ま
しくは好気性条件下３０Ｃで且つｐＨ７，０で行われる
。発酵は最高収率に達した時点で、すなわち７０〜１３
０時間後、好ましくは９０〜１１０時間後に中断される
。この発酵に対しては浸漬発酵が可能であシ、そして好
ましい。

発酵の進行およびアントラサイクリン化合物の生成はＳ
、アウレウス（Ｓ、ａｕｒｅｕｓ）　２０９　Ｆおよび
バチルス・サブチリス（Ｂａｃ、５ｕｂｔ、）　Ｋ対す
る抗菌活性によシ、そしてまた全培養液（菌糸体および
培養液）を有機溶媒で抽出し、そしてそのすみれ色の化
合物の４９５．５２５および５６８　ｎｍにおける吸収
強度を測定することによシ直接追跡することができる。

好ましく使用でれる有機溶媒は酢酸エチルである。

培養液および菌糸体中のアント２サイクリン化合物は本
明細書のダイヤグラムＩ・（実施例６も参照されたい）
に従って単離される。

菌糸体中のアントラサイクリン化合物は有機溶媒を使用
して、好ましくは−３，５ＩＣ調節きれた水性７２七ト
ンな使用して抽出される。アセトンを除去したのち水相
のｐｉ（を７．５にＢｉ２節し、そしてつぎに有機溶媒
たとえば酢酸ブチル、酢酸エチルまたはクロロホルムを
使用して、好ましくは酢酸エチルを使用してｐＨ７，５
でそれを抽出する。菌糸体および培養液からの酢酸エチ
ル抽出液は一緒Ｋかまたは別々に後処理し、凝縮し、そ
して有機溶媒たとえばベンゼンまたはトルエンに溶解す
る。好′ましくはトルエンが使用される。つき°にその
トルエン溶液をｐＨ３，５の酢酸後ｇＥ液で抽出する。

この段階でアントラサイクリン誘導体の混合物を２つの
フラクションに分ける。トルエン相に残っている混合物
はフラクションＡと呼ばれ、そして水相に残っているグ
リコシド混合物はフラクションＢト呼ｔｒ！れる。

さらにフラクションＢをダイヤグラム■に従って精製す
る。ダイヤグラム■に示されるように、フラクションＢ
から１−ヒドロキシシトロジンＡ、　Ｂ％Ｃ％Ｐおよび
■および混合物Ｎ十〇（１：１）が得られる。フラクシ
ョ７１１ｍ、■および■は式Ｉを有するアントラサイク
リン化合物の分離されていない混合物である。

ストレプトミセス・ブルプラセンスＤＳＭ　２６５８の
培養液から単離され、そしてダイヤグラムＩに従って精
製された化合物は一般式Ｉを有する。

本発明による好ましい化合物は式■ （ただし式中、　Ｒ４およびＲ５はつぎの意味を有する
）で表わされ゛る構造を有する。

化合物　　　Ｒ４Ｒ５ （式ｖ１）（式■） 〃　　　　　　　　リ　　　　　　　　　　Ｎ　　　　
　Ｒｏａ−Ｒｏｄ−Ｒｏｄ　　　Ｒｏａ−ｄＦ−Ｒｏｄ
（式Ｖｌ）　　　Ｃ式■） ｎ　　　　　　／／　　　　　　　ＯＲｏａ−ｄＦ−Ｒ
ｏｄ　　　Ｒｏａ−Ｒｏｄ−Ｒｏｄ（式■）　　（式■
） ／／　　　　　　／／　　　　　　　Ｐ　　　Ｒｏａ−
＋１１’−０１ｎＡ　　Ｒｏａ−Ｒｏｄ−Ａｃｕ（弐Ｖ
ｌｌ）　　　Ｃ式Ｖ） σ） （Ｖｌｌ） 本発明によるアントラサイクリン化合物はダラム陽性菌
に均する有効な作用および頭４Ｆな細胞増殖抑制作用を
特徴とする。

本発明をさらによく理解せしめるために以下に実施例を
あげて説明する。

実施例　１ ストレプトミセス・プルプラセンスＤＳＭ　２６５８の
発ｅＫよる１−ヒドロキシシトロジンの製造ストレプト
ミセス・プルプジセンスＤＳＭ２６５８をつぎの組成を
有する酵母／麦芽寒天に加える。

麦芽エキス　　１０ｆ 酵母エキス　　　４ｖ ブドウ楯　　　　　４ｆ 寒　　　天　　　　　　１５ｒ 蒸留水　　　１ｔ ｐＨ７，０ このために培地をルーボトルに分け、１２１℃で５０分
間滅菌し、冷却し、胞子Ｍ［物を接種し一２５℃で７〜
１４日間インキュベートする。このらと良好な成長およ
び良好な胞子形成が認められる。この保存培地から滅菌
した塩化ナトリウム（０，８％）中１−あたシ胞子１０
７個を含有する胞子懸濁物を製造する。つぎの前培養培
地５００ｍの接種物として１ｏ−を使用する。

ブドウ＄９１　　　　　　　　　　１ｓｔ大豆粉　　　
　　　１５９ とうもろこし浸出ＩＩ！３！ｌ（同体）　　　　　５９
炭酸カルシウム　　　　　　２を 塩化ナトリウム　　　　　　５を 蒸留水　　　　　　１ｔ ｐＨ７，０ 上記の培地５００−を２０００ｍの三角フラスコに入れ
、そして１２１℃で３０分間滅菌する。

この接種したフラスコな２００　ｒｐｚｎの回転娠盪器
を用いて２５℃で２日間インキュベートする。

その成長した前ｊ＠養物５００−をつぎの王培養のため
の接種物として使用する。

ブドウ糖　　　　　２１１ 麦芽エキス　　　１（１ 酵母エキス　　　　４を 蒸留水　　１ｔ ｐＨ６，８ 上記の培地９ｔを１２ｔの発酵槽に入れそして１２１℃
で１５分間滅−する。２８℃、攪拌速度６００　ｒｐｍ
　ｓそして通気速度１分間あたシ空気８〜９ｔで発酵を
行う。

発酵時間は９０〜１１０時間である。収穫時間を決定す
るために５６８ｎｍにおける吸収極大の変化を追跡する
。このために培養液の試料を酢酸エチルで抽出し、そし
て４００〜６００ｎｍの吸収スペクトルを記録する。

実施例　２ ストレプトミセス・ブルブラセンスＤＳＭ　２６５８の
大規模発酵 実施例１による前培養培地５００−を含む２．０００１
ｎｌの三角フラスコ中でストレプトミセス・ブルプ２セ
ンスＤ８Ｍ２６５８を培養し、そして２日後に前培養培
地２０１を含む３ｏｔの発＃楡にそれを移す。１６０〜
１８０　ｒｐｍで攪拌しながら通気速度１分間あた）６
〜７ｔで旦っ２８℃で発酵を行う。４８時間後にこの前
培養物を主培養培地（実施例１）２００ｔを含む３ｏｏ
ｔの発Ｗ＃檜の接種物として使用する。攪拌器の周辺部
速度３．５ｍ／５ｓｃ１通気速度１　ｖｖｍ　（２００
ｍｌ　／　ｍ１ｎ）で且つ２８℃で９０〜１１０時間発
酵を行う。収穫の基準は実施例１のそれに従う。

実施例　３ アントラサイタリン化合物の粗ｌ！ｉ混合物の単離培養
液１９０ｔに０．５％ホルマリンを加え、そして酢酸を
用いてその声を５．２に調節する。

通常の方法（固体分離器、圧ａ濾過器）によ）菌糸体を
除去し、そして少量の水で数回洗浄する。

培養１液（約１８５ｔ）な洗浄水と合し、水酸化ナトリ
ウムで声を７．５〜ａＯに調節し、そしてそれぞれ酢酸
エチル２Ｘ５０ｔを用いて抽出を行う。水相を廃棄する
。有機相を合し、真空下で８ｔまで濃縮し、つぎに酢酸
ナトリウム緩衝液（−五５）４Ｘ５ｔで抽出する。つぎ
に合した緩衝液をトルエン３Ｘ３ｔで洗浄する。

除去した一系体（約＆４０〕をア七トン１ｓｔとともに
攪拌しながら３回抽出し、そのアセトン溶液を傾瀉して
分離し、真空下で分離し、ｐＨ３，５の酢酸ナトｖウム
緩衝液５ｔを加え、そしてその混合物をトルエン２，５
ｔで３回洗浄する。

培＃Ｖ液の後処理によシ得られた水性の緩衝液相な水酸
化す）　ＩＪウムで−ｚ９に調節し、そして酢酸エチル
３Ｘ５ｔで抽出する。合した酢酸エチル抽出液を真空下
で後備する。

菌糸体の後処理によシ得られた水性の緩衝液相を水酸化
ナトリウムでｐｌ′ｉａｏｔｒｃｍｍし、そしてそれぞ
れ酢酸エチル５Ｘ２．５ｔで抽出する。合した有機抽出
液を真空下で濃縮する。

残留した水相は廃采する。

実施例　４ 逆相ＨＰＬＯによる１−ヒドロキシシトロジンＡの単離 極性のシトロジンの粗製混合物（複合体■）から酢酸を
含む移動相を使用する通常のシリカゲルカラムクロマト
グラフィーを行い、ざらに８１０２のブレノぐラテイプ
ＨＰＬＯによル濃縮して得られたシトロジンＡの倣いす
みれ色のバッチを逆相吸４剤を用いるプレパラテイブＨ
ＰＬＯによシざらに分画する。たとえば２５０ｑをクロ
ロホルム／メタノール／水中１０％酢酸アンモニウム１
５０：１０５０：３７５から成る移動相４ｓｄｌＣ溶解
し、加圧下で充填され走りクロゾルプ（ＬｉＯｈｒｏｓ
Ｏｒｂ（ＲＰＲＰ−１８％　２５〜４０μメルク社４ｉ
１）約１２０ｔを含むスチールのカラム（ｉ２Ｘ２５ｃ
ｌＬ）に加え、そして流ｉ　４　ｔｄ　／　ｍｉｎでク
ロマトグラフィーな行う。

波長４９０および５６０ｎｍにお妙る２つの連続した流
れ光度計で分別を追跡する。赤色およびすみれ色のフラ
クションを合し、通常の方法で後処理したのちつぎの結
果が得られた。

７ラク７ヨン　８８〜１０８　シトロジンａ６２ｍｇ（
’ＨＮＭＲによる）１０９〜１２０１−ヒドロキシシト
ロジンム４６■（純度約８０〜９０慢） 上記のようにして得られた１−ヒドロキシシトロジンＡ
約１５０　ＩｌＧを上記の条件下で新しく調製されたプ
レパラテイブＨＰＬＯ（ＲＰ−１８，２５〜４０μ）Ｋ
よ）さらに精製する。２％よシも少ない残留シトロジン
Ａを含有する１−ヒドロキシシトロジンＡ　６０　Ｈ９
が得られる。

ｊ−ＯＨ−Ａ：　　１）Ｉ　１ＭＲ ５６１（４，３０） ａ）　２４３（４，６９）　２７６（五８１）　５８９
（４，３０）　６３５（４，４４） Ｃ６０Ｈ８ＢＮ２０２１　＋Ｍ計算値：　１１７２（Ｆ
ＡＢ−ＭＳによシ確認）。

笑施例　５ 中程度の加圧下でのプレーぞ２ティグ層クロマトグラフ
ィーによる１−ヒドロキシシトロジンＶの単離 ダ＃に記載されたような培養液から抽出によｐ得られｆ
ｃ７トロジンの粗製混合物７ｔをクロロホルム／メタノ
ールフタ６％酢ｆＲ／水＝８０：１０：１０：２の移動
相混合物を使用して２つの放射状に圧縮されたシリカカ
ートリッジ（ウォーターズ社製、Ｐｒｏｐ　ＬＣ／　シ
ステＡ３００”）に充横されたシリカゲル６２Ｏｆ＜５
１μ、ダレイス社製）のクロマトグラフィーに付す。移
動相６５１ｎｔ中の試料を平衡に達したカラムに加え、
゛そして流速２５．ｆ／ｍｉｎにおいて−２３−ずつの
フラクションで分画する。薄層クロマトグラフィーおよ
び分析的ＨＰＬＯを使用して評価を行う。

シトロジンＶおよび１−ヒドロキシシトロジンＶの混合
物１９５す（純度８０％）がフラクション２９〜５４か
ら得られる（システムＡでＲｆＯ，３８）。

この試料６０ダなプレノぞラティブ薄層クロマトグラフ
ィー（メルク社製、シリカゲル６０なプレコートされた
ＴＬＯプレート）によ）さらにｎＩ製する。

吸着帯をかき取ジクロロホルム／メタノール１：１で溶
出する。溶出液を水性燐酸水素二ナトリウム溶液で中和
し、そしてクロロホルム相が分離するまで水を加える。

クロロホルム相を分離し、少量の水で１回洗浄し一無水
硫酸ナトリウムで乾燥し、そして蒸発させる。残留物を
少量のクロロホルムに溶解したのち、１０倍容量の石油
エーテルを用いて沈殿生成を行い、そして沈殿を真空下
で乾燥する。シトロジンＶ１２Ｉ１ｇの他に１−ヒドロ
キシシトロジンＶ１７１１ｆｉが得られる。

ｙ：１ａａＮＭＲＫｊｌｔＱ定 ０６０Ｈ８４Ｎ２０２０＋Ｍ計算値、　１１５２（ＦＡ
Ｂ−ＭＳによシ確１ｉ１）１−ＯＨ−Ｖ：　　ＩＨＮＭ
Ｒ （４，１０）　５４８（′５．９３）　５６１（３，９
３）ｃ）２４４（４，４６）２８０（＆７６）５９０（
五９９）ＩＳ３０（４，０４） ０６０”８４Ｎ２０２１＊Ｍ計算値：　１１６８（ＦＡ
Ｂ−ＭＳによシ確認）実施例　６ 逆相高速液体クロマドグ２フイーによる１−ヒドロキシ
シトロジンＢの単離 通常のシリカゲルを用いるプレ／ぐラテイブ力うムクロ
マトグ２フィー（移動相は酢酸を含む）Ｋより得られた
シトロジンＢのすみれ色のノ（ツチを１０μのりクロゾ
ルプ（６）ＲＰ−４８（メルク社製）３０ｆを充填した
スチール製θカラム（１゜Ｋ５ｃｍ）を用いて加圧下で
クロマトグラフィーに付す。このために１２０１１９を
クロロホルム／メタノール／水中１０％酢酸アンモニウ
ム１５０：１０５０：３７５から成る移動相１−に溶解
し、そしてその溶液を注入する。１分間あたシ４−の流
量で４−ずつのフラクションを集取し、そして４９０お
よび５７０ｎｍにおける吸光度測定により評価を行う。

同一物を含むフラクションを合し、そして通常通シ後処
理を行う。

つぎのものが得られる。

フラクション　１〜３２　シトロジンＢ　　　　　　　
　１５Ｑ３８〜５０１−ヒドロキシシトロジンＢ１ＤＪ
ＩｇＢ：ＩＨＮＭＲ，吸収スはクトルおよび’ＰＡＢ−
ＭＳによ）同定ｊ−ＯＨ−Ｂ：　　ＩＨＮＭＲ 吸収スはクトル（ｎｍ）　　ａ）２５９（４，４２）２
９０（３，（Ｓ６）５２２（Ａ９５）　５４９（ｉ８２
）　５６２（３，８５）ｂ）　　２３８（４，４５）　
２９８（五５７）　５２２（４，０３）　５４９（３，
９１）　　５６２（ｉ９３）ＯｄＯＨ８４Ｎ２０２２１
Ｍ計算値：　１１８６（Ｆ′ＡＢ−ＭＳによシ確認）実
施例　７ 逆相ＨＰＬＣによる１−ヒドロキシシトロジンＣの単離 通常のシリカゲルのプレパ２テイプ力ラムクロマトグラ
フイーによ）得られたシトロジンＣを含有する粗製のす
みれ色の生成物をクロロホルム／メタノール／水中１０
％酢酸アンモニウム１５０：１０５０：３７５の混合物
を使用して、１０μのりクロゾルプ（５）ＲＰ−１８（
メルク社製）３０２を充填したスチールのカラム（１，
６Ｘ２５ｃｍ）を用いて１分間あた）２−の流量でクロ
マトグラフィーに付す。２−のフラクションで集取し、
そして４９０および５７０ｎｍにおける吸光度を測定す
ることによシ評価したのちフラクションを合する。通常
の後処理を行ったのちつぎのものが得られる。

７ラクシヨン８０〜１４２　シトロジンＣｊＱｑ１５９
〜１７５１−ヒドロキシ−シトロジン０　７１９１−Ｏ
Ｈ−０：　　　１ｉ１　ＮＭＲ ０４０Ｈ８０’２０２３５Ｍ計算値、　１１９６（ＦＡ
Ｂ−ＭＳにより確ｇ）実施例　８ 逆相ＨＰＬＯによる１−ヒトルキシシトロジンＮ十〇の
単離 Ｂ系を使用するシリカゲルのＴＬＯおよび分析的ＨＰＬ
ＧにおいてシトロジンＮ十〇と同様の挙動を示す生成物
の濃いすみれ色のパッチは５１μのシリカゲル（ｐＨ７
，５）を、ついで１０μのりクロゾルプ（６）ＲＰ−１
ｆ３を用いる通常の多段階カラムクロマトグラフィーに
よ）得られ（実施例４も参照）、そしてそれはさらに逆
相吸着剤を用いる反復プレパラテイプクロマトグラフイ
ーによシ赤色およびすみれ色のフラクションに分離する
ことができる。

このためにたとえばすみれ色の生成物２３０属９をクロ
ロホルム／メタノール／水中１０％酢酸アンモニウム１
５０：１０５０：３７５から成る移動相４−に溶解し、
そして３．２Ｘ２５ｃＩＩＬのスチール製カラム中１０
μのりクロゾルプｃＲ）ＲＰ−１８（メルク社製）約１
００ｔを用いて１分間あたり４ゴの流量で加圧下でのク
ロマトグラフィーな行う。８−ずつフラクションを集取
し、４９０および５６０ｎｍにおける二重波長検出法で
分析的逆相ＨＰＬＣ！によＩＦ価したのち合わせる。通
常の後処理を行ったのちつぎのものが得られる。

フラクション　７０〜８５　シトロジンＮ＋０　９７１
ｇ（’ＨＮＭＲＫよれば純度約７ト８０％） ８６〜９５１−ヒドロキシシトロジンｔＪ＋０４０ｊＩ
ｇ（純度約６０％） 同様のクロマトグラフィー操作を２回行うことＫよシ合
計７３ｑの１−ヒドロキシシトロジンＮ十〇が得られ、
そしてこれを上記と同様にして再度クロマトグラフィー
に付す。１０％よシも少ない残留シトロジンＮ十〇を含
有する１−ヒドロキシシトロジンＮ＋０１８Ｆが得られ
る。

１−０Ｈ−Ｈ＋Ｏ：　　　ＩＨＮＭＲ 吸収スはシトロ（ｎｍ）　　ａ）２４０（４，６２）２
９５（３，７７）５２３（４，１６）　５５０（４，０
９）　５６２（４，１１）ｂ）　２４０（４，６４）　
２９５（３８３）　５２３（４，２２）　５５０（４，
１５）　５６２（４，１６）ｃ）　２４４（４，６４）
　２８０（ＳＨ）　５９２（４，１９）　６３４（４，
２８） ０６０Ｈ８８Ｎ２０２２．Ｍ計算値、　１１８８（ＦＡ
Ｂ−ＭＳＫｌ［ｇ）単離された生成物は２徳の構造異性
成分１−０Ｈ−Ｎおよび１−０Ｈ−０の１：１混合物で
ある。このことはＩＨＮＭＲスペクトル、分解試験（加
水素分解）および加水素分解および完全加水分解後の各
糖単位の決定から明らかである。

実施例　９ 逆相ＨＰＬＯｉｃよる１−ヒドロキシシトロジンＰの単
離 ＴＬＯＣＡ系）および分析的なシリカゲルＨＰＬＯにお
いてその主成分が１−ヒドロキシシトロジンＣ÷りもわ
ずかに大きい保持時間を示す濃いすみれ色の生成物は通
常の５１μのシリカゲル（ｐ）１７５）カラムクロマド
グ２フイーにょシ得られる。プレノぞラティプ逆相ＨＰ
ＬＯをくり返し行うことＫよルこの新規な化合物を単離
することができる。このためＫはたとえば粗製のすみれ
色の生成１１１３！１１７５＊ｊｌクロロホルム／メタ
ノ一ル／水申１５％酢酸アンモニウム５００：１１００
：３００から成る移動相２．５−に溶解し、そして３．
２８２５儂のスチール製カラム中の１０μリクロゾルブ
■Ｐ、Ｐ−１８（メルク社製）約１００ｔを用いて１分
間あた夛４−の流量で加圧下クロマトグラフィーを行う
。８−ずつのフラクションで溶出液を集取し、４９０お
よび５６０ｎｍにおける二重波長検出法を用いる分析的
逆相ＨＰＬＯで評価することによシ同−物を含むフラク
ションを合する。

つぎのものが得られた。

分析的逆相１ｆＰＬＯによシ フ２り７ヨン２１〜４５　　生として１−ヒドロキシシ
トロジンＣおよびＶ　　８５叩 ４６〜５２　主としてシトロジンＰおよび同定されてい
ないよシ極注の大きい化合ｗｓｏｍｙ同様のクロマトグ
ラフィー操作を数回行うととＫよシ得られたきわめて―
厚な１−ヒドロキシシトロジンのパッチを合し、そして
上記の条件下で再度クロマトグラフ・ｌ−を行う。約８
０１ｇから純粋な１−ヒドロ、キシシトロジンＰ２０叩
が得られる。

１−０Ｈ−Ｐ：　　ＩＨＮＭＲ （４，１７）　５４９（４，０３）　５６１（４，０３
）ｃ）　２４５（４，６５）　２７５（′５．８５）　
５９０（４，１１）　６３２（４，１７） Ｃ６０”８２Ｎ２０２２　＊Ｍ計算値、　１１８２ｄＦ
ＡＢ−Ｍｅ　Ｋよシ確認）実験条件 １、　シリカゲルの４速液体クロマトグラフィー（ＨＰ
ＬＯ） ７μのりクロゾルプ（６）ｓｔ　６０　（メルク）また
は７μのシリカゲル６０（ブレース〕を充填したスチー
ルカラム（４，６Ｘ２５０ｔｍ）　、移動相：クロロホ
ルム／メタノ−シフ８６％酢Ｍ／　ト！ｊエチルアミン
／水８０：１０：　１０：２：０．０１、流ｆ：０５〜
ｔ５ｓｄ／分、流れ光度ｌＫｆｌｏｗ　ｐｈｏｔｏｍｅ
ｔｅｒ）で２６０または４９Ｏｎｍ＆Ｃおいて検出。

。２）逆相ＨＰＬＯ １０μのりクロゾルプ＠ＲＰ−１８（メルク）を充積し
たスチールカラム（４，６Ｘ　２５０ｍ）、移動相：り
ｑロホルム／メタノール／水中１０係酢酸アンモニウム
２５０：１０５０：３７５流量＝ａ５〜１．５ｍｇ／分
、流れ光度計を用いて４９０ｎｍおよび５６０ｎｍにお
いて検出。

一般的には使用される分析用およびプレパラテイプＨＰ
ＬＣのカラムはメルク社（ダルムシュタット）推薦の方
法で空気ポンプ（）・スケル社縛を使用して本発明者が
充填した。

五　プレパラテイプ力ラムクロマトグラフイー普通のプ
レパラテイブカラムクロマトグラフイーの場合には３１
μのシリカゲル６０（ブレース）または１５〜４０μの
シリカゲル６０（メルク）を開口ガラスカラムまたはス
チールカラムに加圧下で充填して使用する。使用した移
動相は上記の分析用ＨＰＬＯ系と同様の組成１！：Ｍす
る浴媒混合物であるが、４当な場合にはメタノールを酢
酸および水の割合を減らして行う。

特に極性がよル大きい成分に対するクロマトグラフィー
の場合には３１μのシリカゲル６゜（ブレース）を２Ｎ
塩酸で洗浄して金属を除去し、そして酸を洗浄除去した
のち声が７．５になるまで５Ｎ水酸化ナトリウムを用い
て水ａｓ濁物中で処理する。傾瀉により分層したのちこ
の変性したシリカゲルを１３０℃で乾燥し、ふるい分け
し、そして移動相中のス２リーとしてカラムに加える。

使用した移動相はクロロホルム／水／メタノール１５：
４：５〜７から成る溶媒混合物でるる。充填比は約１：
１００〜１：３００である。

４、　薄層クロマトグラフィー（ＴＬＯ）Ａ糸：クロロ
ホルム／メタノール／９６％酢ｔｌＲ／水／トリエチル
アミン８ｏ：　１０：１０：２：０．０１またはＢ系：
クロロホルム／メタノール／９９φ酢酸／水７５：１５
：１０：２を用いてシリカゲルプレー１’　Ｆ２５４（
メルク〕を展開する。

５　通常の後処理 通常の後処理はつぎのようにして行う。逆相ＨＰＬＯか
らの合したフラクションをそれらの容量の約半量の水と
混合し、つぎに相が分離するまでクロロホルムを〃口え
る。クロロホルム相を除去し、水洗し、無水鎖酸ナトリ
ウムで乾燥し、そして真壁下で蒸発させる。このように
して得られた生成物をつぎの方法で処理して一緒に存在
する脂肪、可塑沖」および金網イオンを除去する。生成
物（たとえば３０　Ｔ１９　）を酢酸ナトリウム緩衝液
（ｐＨ３，５）２０−に浴解し、０．０［１１Ｍ水性エ
チレンジアミン四節：、、、酸１　ｄ　（ＥＤＴＡ　：
　水酸化ナトリウムでｐＨ３，５に調節する）を加え、
そしてその混合物をトルエン５−と−緒に振盪する。

トルエン相を廃粟し、水相を２Ｎ水酸化す）ＩＪウムで
−Ｚ５に調節し、クロロホルム２０ｗ１ｔと急激に振盪
して抽出した。無水硫酸ナトリウムで乾燥し、そしてＰ
遇したのちＰ液を真空下で蒸発させた。適当な場合には
残留物を少量のクロロホルムに溶解し、その溶液をグラ
スフィルターに通して吸引ＦＪＬ、そして乳白色液にヘ
プタンを加えたのち真空下で蒸発させる。

６、　分光学的研究 上記の実施例における成分の同定は以下に記載された測
定条件下で行われる。

プロトン共鳴スペクトル（ＩＨＮＭＲスはクトル）は２
７０　ＭＨｒ；のブルーカー（ＢＲＵＫＥＲ）ＨＸ　−
２７０ｆＪフーリエ変換核磁気共鳴スはクトロメーター
な用いて記録される。濃度は９５！８％重クロロホルム
（ＯＤＯ２３）中２〜４１ｇ／α５−である。調製後た
だちにその溶液を９９．５％重水（Ｄ２０）中５存在す
る低分子量の不純物および残留する溶媒からのものであ
る。

マススペクトルはＰＡＢ　（高速原子照射）イオン源を
用いるＡＩＣＩＭＳ−９０２８型マススペクトロメータ
ーを使用して記録する。ある場合には加えられたチオグ
リセロール、塩化アンモニウムのマトリックス中のイオ
ン源にそのＩｔ１１！Ｉ′Ｘを尋人する。

吸収スイクトルは ａ）水／メタノール１：９ ｂ）メタノール中１０％の１Ｎ塩酸 ｂ）メタノール中１０％の１Ｎ水酸化ナトリウム中で２
００〜７００　ｎｍの範囲内で測定する。

物質の濃度は１０〜ｓｏｍｙｉｔであシ、吸収極大（ｎ
ｍ）および分子吸光係数（ｌｏｇａ　）を記録する。

７、　細胞増殖抑制活性の測定 不明＃ｌ１ＩＦに記載された化合物の細胞増殖抑制活性
はＬ　１２１０マウス白崩病細胞を使用して測定する。

つぎのような特定の試験系を使用する。

ａ）増殖試験 この方法では＃Ｉ胞がどの＃ｌＩＲがどの程度放射性Ｄ
ＮＡ前駆体（たとえば０−１４でラベルされたチミジン
）を言むことができるか、その程度を試験宮内で６ｔｌ
Ｊ建し、ついでその＃Ｉ胞を種々の濃度の試験物質と一
緒にインキュベートする。処理されていないＬ１２１０
ａ／Ｍを同一の試験条件に付し、対照として使用する。

この方法を以下に簡単にＢ上載する。

対数生長期ノＬ　１２１０ａＪｊｌ　（ＲＰＭＩ　１６
４０　中５Ｘ１０−３／ｄ）を微量滴定板中で棟にの濃
度の試験物質とともに７２時間（７３７℃、５％ｃｏ。

２）相対湿度９５％）インキュベートする。対照は単に
新しい培地を用いてインキュベートされた細胞から成る
。すべての測定はム複して４回行われる。６５時間後Ｋ
ｍ胞のＤＮＡを放射能でラベルするためにＣ−１４−チ
ミジン５０μｔ（１，５μＯ１／ｍｔ）を加える。７時
間インキュベーションしたのちｔｍｔｍを吸引濾過し、
５係トリクロロ酢酸を使用してＤＮＡを沈殿させ、そし
て順次に水およびメタノールで洗浄する。

５０℃で乾燥したのちシンナレーション用の液体５−を
加え、つぎにＤＮＡ　Ｋ取シ込まれた放射能を測定する
。

試験物質とともにインキュベートしたのちのシンチレー
ション数の比を処理されていない対照とのパーセントと
して結果を記録する。このようＫして測定された値から
投与量−作用曲線が得られ、そして工０５Ｇすなわち上
記の試験条件下で対照と比較して放射性チミジンの＊Ｄ
込みを５０％減少させる濃度がグラフから決定される。

本明細書に記載された化合物のＩＯｇＱ値は表１に示さ
れてお）、アドリアマイシン（ＡＤＭ）と比較される。

ｂ）軟質寒天におけるＬ　１２１０白血病細胞のコロニ
ー生成 この方法は数世代にわたって細胞の成長挙動に及ぼす試
験？ｉ７ｘの作用を調べるために使用される（細胞周期
が１０〜１２時間の場合７日間の試験期間で約１４連続
世代が認められる）。

この試験においてＵＳ胞増殖抑制活性を有する物質は処
理されていない対照と比較して認められるコロニー数の
減少を引き起こす。試験方法の詳細はつぎのとお９であ
る。

プレートあたシラ００個の白血病細胞を種々の濃度の試
験物質とともに５７℃で１時間インキュベートする。つ
ぎにマツクコイ（ＭｃＯｏｙ）５Ａの培地で２回洗浄し
、そして最後にα３％寒天を加えたのちベトリ皿に注ぐ
。対照は単に新しい培地でインキュベートするだけであ
る。ある場合忙は１時間インキュベートする代わシに、
全インキュベーション時間中ずつと細胞を継続的（ｒさ
らすために種々の濃度の試験物質を上部の寒天層と混合
する。寒天が固化したのちインキュベーター中３７℃で
７日間（二酸化炭素５％、相対湿度９５％）インキュベ
ートする。つぎに生成した直径６０μのコロニーの数を
数える。処理された寒天板上のコロニー数を処理されて
いない対照とのパーセントとして結果を記録する・。こ
のようにして得られた投与量−作用曲線から物質の活性
の尺度として工Ｃ５０を決定する。本明細書中に記載さ
れた化合物に対する結果はアドリアマイシンと比較して
表１に示される。

表　１ ７日１１４１時間 ＡＤＭ　　　　　　　　６．０Ｘ１０−３２．２Ｘ１０
−２４．４ｘ１０−２１−ＯＨ−シ）ｏジンＡ　　３　
Ｘ１０−ｓ　　　２．８Ｘ１［１−’　　２．６Ｘ１０
−２／／　　　　　　　　　Ｖ　　２．ＢＸｌｏ−５４
，５Ｘ１０−４　２．４Ｘ１０−”上記に示されたよう
に本発明による１−ヒドロキシシトロジンは細胞増殖抑
制活性すなわち人を含めて動物の腫瘍特に悪性腫瘍に対
して活性を有する。

従って本発明の化合物およびそれらの酸付加塩は腫瘍を
抑制するためかまたは治療するために楽学的組成物とし
て使用することができる。

それらの化合物は意図された目的に適合する任意の経路
によシ、その投与経路により決定された投薬形態で投与
することができる。通常薬学的に許容しうる担体または
希釈剤で希釈された本発明の化合物が薬剤として投与さ
れる。たとえば本発明の化合物は単独でか、または担体
たとえばマルトースまたは乳糖との混合物としてか、ま
たは無毒性の複合体たとえばデスオキシリボ核酸との複
合体として投与することができる。

本発明の化合物の典型的な投与方法は＃留水または生理
食塩水中のそれらの溶液を注射する方法である。注射の
例としては腹腔内、静脈内または動脈内注射かめけられ
る。１日めたシの投与量および率位渠黛は勤！２２Ｉ冥
験の結果を、そして゛まだ試験管内試験の結果を考照し
て、継続的にかまたは継続的に投与される桑倉のａｔが
予定された範囲を越えないような方法で決定される。人
の治療周期に対する総投与量は体重Ｑあたシ約０．５〜
５　ｍｇで６９、それは対応する１回の投与量で７日間
にわたって投与することができる。実際の投与量は投与
方法および患者または動物の状態たとえば年令、体皿、
注、感受性、食物、投与時間、付随する薬剤、患者また
は動物の健康状態またはそれらの疾患の重篤さに従って
変更できることは言うまでもない。

【図面の簡単な説明】

添付図面は実施例化合物のプロトン共鳴スペクトルを示
すものである。 特許出願人　　ヘキスト・アクチェンゲゼルシャフト外
２名

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １）式 I ▲数式、化学式、表等があります▼ I ｛ただし式中、Ｒ＿１は水素または基ＯＲ＿３を表わし
   、そしてＲ＿２は基−ＯＲ＿４または−ＣＯＯＲ＿５〔
   ただし式中、Ｒ＿５はＣ＿１〜Ｃ＿３−アルキルを表わ
   し、そしてＲ＿３およびＲ＿４は同一または異なりて水
   素またはつぎの組成すなわちＲｏａ−ｄＦ−Ｒｏｄ、Ｒ
   ｏａ−ｄＦ−ＣｉｎＡ、Ｒｏａ−ｄＦ＝ＣｉｎＢ、Ｒｏ
   ａ−Ｒｏｄ−Ｒｏｄ、Ｒｏａ−ｄＦ−Ａｃｕ、Ｒｏａ−
   Ｒｏｄ−ＣｉｎＡ、Ｒｏａ−Ｒｏｄ−ＡｃｕまたはＲｏ
   ｄ−Ｒｏｄ−Ｒｏｄ（ただし式中、Ｒｏａはロドサミン
   を表わし、ｄＦはデオキシフコースを表わし、Ｒｏｄは
   ロジノースを表わし、Ａｃｕはアクロースを表わし、Ｃ
   ｉｎＡはシネルロースＡを表わし、ＣｉｎＢはシネルロ
   ースＢを表わし、ｄＦ＝ＣｉｎＢは２個の糖単位が普通
   のグリコシド結合の他にもう１つのエーテル橋により結
   合していることを表わす）から成る糖結合を表わす〕を
   表わす｝の化合物およびそれらの生理学的に許容しうる
   酸付加塩。 ２）特許請求の範囲第１項記載の式 I 〔ただし式中、
   Ｒ＿１は基−ＯＲ＿３を表わし、そしてＲ＿２は基ＯＲ
   ＿４（ただし式中、Ｒ＿３およびＲ＿４は同一または異
   なりて上記の糖結合の一つを表わす）を表わす〕を有す
   る化合物。 ３）Ｒ＿３が糖結合Ｒｏａ−Ｒｏｄ−Ｒｏｄを表わし、
   そしてＲ＿４が糖結合Ｒｏａ−Ｒｏｄ−Ｒｏｄを表わす
   、特許請求の範囲第２項記載の化合物およびその生理学
   的に許容しうる酸付加塩。 ４）Ｒ＿３が糖結合Ｒｏａ−Ｒｏｄ−Ｒｏｄを表わし、
   そしてＲ＿４が糖結合Ｒｏａ−ｄＦ−ＣｉｎＡを表わす
   、特許請求の範囲第２項記載の化合物およびその生理学
   的に許容しうる酸付加塩。 ５）Ｒ＿３およびＲ＿４が糖結合Ｒｏａ−ｄＦ＝Ｃｉｎ
   Ｂを表わす特許請求の範囲第２項記載の化合物およびそ
   の生理学的に許容しうる酸付加塩。 ６）Ｒ＿３が糖結合Ｒｏａ−ｄＦ−Ｒｏｄを表わし、そ
   してＲ＿４が糖結合Ｒｏａ−Ｒｏｄ−Ｒｏｄを表わす特
   許請求の範囲第２項記載の化合物およびその生理学的に
   許容しうる酸付加塩。 ７）Ｒ＿３が糖結合Ｒｏａ−Ｒｏｄ−Ｒｏｄを表わし、
   そしてＲ＿４が糖結合Ｒｏａ−ｄＦ−Ｒｏｄを表わす、
   特許請求の範囲第２項記載の化合物およびその生理学的
   に許容しうる酸付加塩。 ８）Ｒ＿３が糖結合Ｒｏａ−Ｒｏｄ−Ｒｏｄを表わし、
   そしてＲ＿４が糖結合Ｒｏｄ−Ｒｏｄ−Ａｃｕを表わす
   、特許請求の範囲第２項記載の化合物およびその生理学
   的に許容しうる酸付加塩。 ９）Ｒ＿３が糖結合Ｒｏａ−Ｒｏｄ−Ａｃｕを表わし、
   そしてＲ＿４が糖結合Ｒｏａ−ｄＦ−ＣｉｎＡを表わす
   、特許請求の範囲第２項記載の化合物およびその生理学
   的に許容しうる酸付加塩。 １０）微生物ストレプトミセス・プルプラセンス（Ｓｔ
   ｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ＰｕｒＰｕｒａｓｃｅｎｓ）（
   ＤＳＭ２６５８）を栄養培地の存在下酸素の供給を多く
   してか、または好気性条件下通常の方法で発酵させ、そ
   して生成した化合物を有機溶媒で抽出し、ついで通常の
   方法でクロマトグラフィーまたは分配を行うことにより
   培養液および菌糸体から単離することから成る、特許請
   求の範囲第１項記載の式 I の化合物の製造法。 １１）微生物ストレプトミセス・プルプラセンスＤＳＭ
   ２６５８を炭素源および窒素源ならびに無機栄養塩およ
   び痕跡の元素を含有する栄養培地中で旦つ温度２４〜４
   ０℃、およびｐＨ６．５〜８．５で発酵させ、酢酸エチ
   ルおよびクロロホルムを使用して生成した化合物を培養
   液から抽出し、そして菌糸体から最初に水性アセトンで
   抽出し、つぎにその分離した水相から酢酸エチルを使用
   して抽出し、合した酢酸エチル抽出液を濃縮し、残留物
   をベンゼンまたはトルエンに溶解し、得られる浴液をｐ
   Ｈ３．５の酢酸塩緩衝液で抽出し、得られる浴液からク
   ロマトグラフィーまたは分配により式 I の化合物を単
   離する、特許請求の範囲第１０項記載の方法。 １２）式 I の化合物のクロマトグラフィーによる単離
   がシリカゲルカラム、逆相吸着剤、小滴向液クロマトグ
   ラフィーまたは分配により行われ、ついで薄層または高
   速液体クロマトグラフィーにより行われる、特許請求の
   範囲第１０項記載の方法。 １３）特許請求の範囲第１項記載の式 I の化合物を適
   当な場合には通常の薬学的賦形剤および／または安定剤
   とともに治療上適当な投与形態に変換することから成る
   医薬品の製造法。 １４）特許請求の範囲第１項記載の式 I の化合物を含
   有する医薬品。 １５）医薬品として使用するための特許請求の範囲第１
   項記載の式 I の化合物。