FI81608C - Foerfarande foer framstaellning av 1-hydroxi-cytorodiner. - Google Patents

Description

1 81608

Menetelmä 1-hydroksi-sytorodiinien valmistamiseksi

Keksintö koskee menetelmää kaavan 1 mukaisen yhdisteen ja sen fysiologisesti hyväksyttävien happoadditiosuo-5 lojen valmistamiseksi, r ? OH O I 'OR.

OH 1 15 jossa kaavassa a) R2 ja R2 ovat samoja ja merkitsevät sokeriyhdis-telmää Roa-Rod-Rod tai Roa-dF-CinB, tai b) R2 ja R2 ovat erilaisia ja merkitsevät sokeriyh-distelmää Roa-Rod-Rod ja Roa-dF-Rod, tai 20 c) R2 ja R2 ovat erilaisia, jolloin Rt merkitsee sokeriyhdistelmää Roa-dF-CinA ja R2 merkitsee sokeriyhdis-telmää Roa-Rod-Rod tai Roa-Rod-Acu, tai Rx merkitsee sokeriyhdistelmää Roa-Rod-Acu ja R2 merkitsee sokeriyhdistelmää Roa-Rod-Rod.

25 Sokeriyhdistelmissä Roa on rodosamiinl, dF on des- oksifukoosi, Rod on rodinosiini, Acu on akulosiini, CinA on sineruloosi A ja CinB on sineruloosi B, ja merkintä dF«CinB tarkoittaa, että nämä sokerirakenneosat ovat liittyneet toisiinsa tavanomaisen glykosidisidoksen lisäksi 30 vielä eetterisillan välityksellä.

Keksinnön mukaiselle menetelmälle on tunnusomaista, että mikro-organismia Streptomyces purpurascens DSM 2658 fermentoidaan tehostetun happisyötön alaisena muuten sinänsä tavanomaisella tavalla aerobisissa olosuhteissa ra- 35 vlntoliuoksen läsnäollessa ja muodostuneet yhdisteet eris tetään uuttamalla viljelyliuoksesta ja rihmahuovastosta 2 81608 orgaanisilla liuottimilla, ja eristetään lopuksi kromato-grafialla tai jakamalla tavanomaisella tavalla.

Streptomyces purpurascens DMS 2658-kannan eristys ja identifiointi on kuvattu DE-patenttihakemuksessa 5 P 332 325.0. Mikro-organismi talletettiin 24.5.1983 kokoelmaan DSM (Deutsche Sammlung von Mikro-organismen; D - 3400 Göttingen; Grisebachstr. 8).

Mainitussa patenttihakemuksessa esitetään myös menetelmä kaavan 1 mukaisten 1-dehydroksi-antrasykllinijoh-10 dannaisten ns. sytorodiinien valmistamiseksi fermentoimal-la Streptomyces purpurascens DSM 2658-kantaa aerobisissa olosuhteissa.

Nyt on yllättävästi havaittu, että kun suurennetaan hapensyöttöä fermentoinnin aikana, muodostuu 1-hydroksi-15 sytorodiineja. Nämä uudet, ennen kaikkea sytostaattisesti tehokkaat yhdisteet kuuluvat 1-hydrokslantrasykliinien ryhmään, jonka seuraavat edustajat on kuvattu jo aikaisemmin: 1-hydroksi-e-rodoraysiinit, joita nimitetään myös 8-isoro-20 domysiineiksi; esim. violamysiinit A2 ja B I - 1 [W. Fleck et ai., Z. Allgem. Mikrobiologie 14, s. 551 (1974)]; ja B-isorodomysiinit [H. Brockmann et ai., Chem. Ber. 98, s. 3145 (1965)]; £-pyrromysiinit (sinerubiinlt); esim. sinerubiini A 25 [W. Keller-Schierlein, Antimicrob. Agents Chemother. 68, (1970)]; erilaisia rodirubilneja [H. Umezawa et ai., J. Antib. 30, s. 616 (1977)]; ja aklasinomysiinit A2, B2, M2, S2 ja T2 [T. Oki et ai., J.

30 Antib. 28, s. 830 (1975) ja 32, s. 801 (1979)]; sekä musetta-, marsello- ja rudolfomysllni yms. [D. E. Nettle-ton et ai., J. Nat. Prod, 43, s. 242 (1980)].

Keksinnön mukainen menetelmä kaavan I mukaisten yhdisteiden valmistamiseksi toteutetaan siten, että Strep-35 tomyces purpurascens DSM 2658-kantaa fermentoidaan pH-ar-vossa 6,5 - 8,5 ja lämpötilassa 24 - 40°C aerobisissa olo-

II

3 81608 suhteissa huolehtien riittävästä hapensaannista, esim. suurella ilmastusnopeudella ravintoalustassa, joka sisältää hiili- ja typpilähteitä sekä epäorgaanisia ravintosuo-loja ja hivenaineita, ja sen jälkeen eristetään yhdisteet 5 viljelynesteestä rihmastosta tavanomaisilla menetelmillä, kuten jäljempänä on kuvattu.

Hiililähteiksi sopivat glukoosi, tärkkelys, dekstraani ja glyseroli. Sopivia typpilähteitä ovat soijajauho, hiivauute, lihauute, mallasuute, maissin paisutus-10 vesi, peptonl tai kaseiini.

Epäorgaanisiksi ravintosuoloiksl sopivat esim. nat-riumkloridi, magnesiumsulfaatti tai kalsiumkarbonaatti.

Hivenaineina voidaan käyttää rautaa, magnesiumia, kuparia, sinkkiä ja kobolttia.

15 Streptomyces purpurascens DSM 2658-kantaa voidaan fermentoida 24 - 40°C:n lämpötilassa pH:ssa 6,5 - 8,5 ja Ilmastusnopeudella 0,8 - 1,2 vvm. Edullista on fermentoida Streptomyces purpurascens DSM 2658-kantaa aerobisissa olosuhteissa 30°C:ssa pH:ssa 7,0. Fermentointl keskeytetään 70 20 - 130 tunnin, edullisesti 90 - 110 tunnin kuluttua, kun on saavutettu suurin saanto. Edullisesti voi fermentointl olla uppofermentointi (submerssi-fermentointl).

Fermentaation edistymistä ja antrasykliiniyhdistei-den muodostumista voidaan seurata mikrobeja S. aureus 25 209 P ja B. subtilis vastustavan antibakteerisen tehon avulla sekä suoraan uuttamalla koko viljelyliuosta (rihmastoa ja viljelmäsuodosta) orgaanisella liuottimena ja mittaamalla violettien yhdisteiden absorptio-intensiteetti aallonpituuksilla 495, 525 ja 568 nm. Orgaanisena liuotti-30 mena käytetään edullisesti etyyliasetaattia.

Viljelmäsuodoksessa ja rihmastossa olevat antrasyk-liiniyhdisteet eristetään kaaviossa I esitetyn mallin mukaisesti (vrt. myös esimerkki 3).

4 81608

Rihmastossa olevat antrasykliiniyhdisteet uutetaan orgaanisella liuottimena, edullisesti vesipitoisella asetonilla, jonka pH on säädetty arvoon 3,5. Asetonin poistamisen jälkeen säädetään vesifaasin pH arvoon 7,5 ja uute-5 taan sitten pH-arvossa 7,5 orgaanisella liuottimelle, kuten butyyliasetaatilla, etyyliasetaatilla tai kloroformilla, edullisesti etyyliasetaatilla. Rihmastosta ja viljel-mäsuodoksesta saadut etyyliasetaattiuutteet yhdistetään tai jatkokäsitellään erikseen, väkevöidään ja otetaan or-10 gaaniseen liuottimeen, kuten bentseeniin tai tolueeniin.

Edullisesti käytetään tolueenia. Tolueeniliuosta uutetaan sitten asetaattipuskurilla, jonka pH on 3,5. Tässä vaiheessa antrasykliinijohdannaisten seos jaetaan kahdeksi fraktioksi. Tolueenifaasiin jäävää seosta nimitetään frak-15 tioksi A, vesifaasiin jäävää glykosidiseosta fraktioksi B.

Fraktio B puhdistetaan edelleen kaavion li mukaisesti. Kuten kaaviossa II on esitetty, saadaan fraktiosta B 1-hydroksi-sytorodiinit A, B, C ja P ja seos N + O (1:1). Fraktioiden I, II, III ja IV kohdalla ovat kyseessä 20 kaavan I mukaisten antrasykliini johdannaisten erottamattomat seokset.

Streptomyces purpurascens DSM 2658-kannan viljely-liuoksesta eristetyillä ja kaavion I mukaisesti puhdistetuilla yhdisteillä on kaava I.

5 81608

Kaavio I

Antibioottisen kompleksin eristäminen mikro-organismista Streptomyces purpurascens DSM 2568 5 fermentoitu viljelyliuos säädettynä pH-arvoon 5,2 10 rihmasto viljelmäsuodos I) sekoitus asetonin I) pH:n säätö arvoon kanssa 7,5 - 8,0 II) väkevöinti, asetaatti- II) uutto etyyliase- puskurin (pH 3,5) li- taatilla 15 säys, pesu tolueenilla ja uutto etyyliasetaatilla pH:ssa 7,5

\f 3Γ” V

vesi faasi etyyliasetaattifaasi vesi faasi 20 haihdutus uutto asetaattipusku-rilla (pH 3,5) l--1 etyyliasetaattifaasi vesifaasi 25 uutto tolueenilla ^ q, vesifaasi tolueenifaasi

I) pH:n säätö Fraktio A

arvoon 7,9 30 II) uutto etyyliasetaatilla """" ^ etyyliasetaattifaasi vesifaasi

Fraktio B

6 81 608

Kaavio II

Vesifaasin jatkokäsittely 5 I) pH:n säätö arvoon 7,5 II) uutto etyyliasetaatilla I-— -1 etyyliasetaattifaasi vesifaasi | (heitetään pois) 10 väkevöinti glukosidien suhteen rikastunut fraktio (1-hydroksi-sytorodiinien raakaseos) 15 I) jako tolueeniin ja metanoli/vesiseokseen ja/tal pylväskromatografia II) preparatiivlnen ohutkerroskromatografia (PDC) tai suurpainenestekromatografia (HPLC) 20 >-1--1 rikastunut kompleksi I rikastunut kompleksi II (heikosti polaarinen) (voimakkaammin polarinen)

I I

HPLC HPLC

25 I I

sytorodiineja ja sytorodiineja ja 1-hydroksi-sytorodiinej a 1-hydroksi-sytorodi inej a i-rVi-1 I—Hi-1

Fr. I C P V Fr. II Fr. Ill A B tN + O, Fr. IV

30 l\\ / PDC tai HPLC käänteisfaasi-adsorbenteilla i \ \ / \ \ 1-hydroksi-sytorodiineja 1-hydroksi-sytorodiinej a i \ \ / i \

35 1-OH-C 1-OH-P 1-OH-V 1-OH-A 1-OH-B 1-OH-N+O

II

7 81608

Keksinnön mukaisesti valmistetut yhdisteet ovat: Yhdiste Rj R2 5 1-hydroksi- sytorodiini V Roa-Rod-Acu Roa-Rod-Rod (kaava III) (kaava VI)

" C Roa-dF-Cin B Roa-dF-Cin B

(kaava IV) (kaava IV) 10 " B Roa-dF-Cin A Roa-Rod-Rod (kaava V) (kaava VI) " A Roa-Rod-Rod Roa-Rod-Rod (kaava VI) (kaava VI) " N Roa-Rod-Rod Roa-dF-Rod 15 (kaava VI) (kaava VII) " 0 Roa-dF-Rod Roa-Rod-Rod (kaava VII) (kaava VI) " P Roa-dF-Cin A Roa-Rod-Acu (kaava V) (kaava III) 8 81608 0_/CH3 _^Η3 /CH3 \ ° / 0 —( A*0

^NCCHO, _ _ J

* 2 Roa-Rod-Acu (ill) CH, ΓΗ

N<CH3>2 V0_y V

\ /”CH3 Roa-dF=Cin B

(IV) 0—S™3 0-^-^3 0^CH3 -/ 'V-o-/ °—/-Vo

\ / \ A \ / Roa-dF-Cin A

N(CH3)2 oh (V) CH-. .CH, CH, °H Roa-Rod-Rod ' Sn(ch3)2 ' ' (VI) CH CH /CH3 H^S0-<jV0-(^5_0H Rod-dF-Rod (VII) 9 81608

Keksinnön mukaisille antrasykllinlyhdlstellle on tunnusomaista voimakas gram-positiivlsten bakteerien vastainen teho sekä selvä sytostaattlnen vaikutus.

Sytotokslsen tehon tutkiminen 5 Tässä kuvattujen yhdisteiden sytostaattlnen vaiku tus määritettiin hiiren L1210-leukemlasoluilla.

Yksityiskohtaisesti kuvattuna käytettiin seuraavla koej ärjestelyjä: a) Lisääntymiskoe 10 Tässä kokeessa tutkitaan In vitro missä määrin so lut pystyvät sitomaan radioaktiivisia DNA-edeltäjiä (esim. C14-merkittyä tymidiiniä), sen jälkeen kun solut on lnkuboltu tutkittavien yhdisteiden eri pitoisuuksilla. Käsittelemättömiä L12l0-soluja saatetaan samoihin koeolo-15 suhteisiin ja ne toimivat vertailukokeena.

Seuraavassa kuvataan menetelmää lyhyesti.

L1210-soluja, jotka ovat eksponentiaalisessa kasvuvaiheessa (5 x 103/ml RPMI 1640:ssä), Inkuboidaan tiitteri-levyllä 72 tuntia tutkittavan yhdisteen eri pitoisuuksissa 20 (37°C; 5 % C02; 95-%:inen suhteellinen kosteus). Vertailuna käytetään soluja, joita inkuboidaan pelkässä elatusainees-sa. Kaikki määritykset suoritetaan neljällä rinnakkaisko-keella. 65 tunnin kuluttua lisätään 50 μΐ C-l 14 tymidiiniä (1,5 pc/ml) solujen DNA:n merkitsemiseksi radioaktii-25 visesti. 7 tunnin inkuboinnin jälkeen solut erotetaan imu-suodatuksella, DNA saostetaan 5-%:isella trikloorietikka-hapolla ja pestään peräkkäin vedellä tai metanolilla. Kun on kuivattu 50°C:ssa, mitataan DNA:hän liittynyt radioaktiivisuus, kun ensin on lisätty 5 ml tuikenestettä.

30 Tulokset annetaan tutkittavaa yhdistettä käyttäen suoritetun inkuboinnin jälkeisen tuikeindeksin suhteena %:eina käsittelemättömillä vertallusoluilla saadusta arvosta. Näin saaduista mittaustuloksista määritetään annos-vaste-käyrä ja lasketaan graafisesti IC50, so. pitoisuus, 35 joka koe-olosuhteissa vähentään radioaktiivisen tymidiinin liittymistä 50 %:lla vertailuarvoihin nähden. Tässä kuvat- 10 81 608 tujen yhdisteiden ICS0-arvot verrattuna adriamysiinillä saatuihin arvoihin, on koottu taulukkoon I.

b) L1210-leukemiasolujen pesakkeenmuodostus pehmeässä agarlssa 5 Tämän kokeen avulla osoitetaan tutkittavien yhdis teiden vaikutus solujen kasvukäyttäy tyrni seen useiden sukupolvien ajan (solusyklin ajan ollessa 10 - 12 tuntia seurataan 7-vuorokautisen koeajan kuluessa noin 14:ta peräkkäistä sukupolvea).

10 Sytostaattisesti vaikuttavat aineet aiheuttavat tässä kokeessa tarkasteltavien pesäkkeiden lukumäärän vähenemisen käsittelemättömiin vertailusoluihin verrattuna.

Yksityiskohdittain kuvattuna koe suoritetaan seuraavasti.

15 500 leukemiasolua levyä kohti inkuboidaan 1 tunti 37°C:ssa käyttäen erilaisia tutkittavan yhdisteen pitoisuuksia. Sen jälkeen solut pestään kahdesti McCoy 5A-ela-tusaineella ja kun on lisätty 0,3 % agaria, ne valetaan lopuksi petrimaljoihin. Vertailusoluja inkuboidaan pelkäs- 20 sä elatusaineessa. 1-tuntisen inkuboinnln sijasta sekoitetaan agarin yläkerrokseen useita erilaisia pitoisuuksia tutkittavaa yhdistettä, jotta saataisiin aikaan jatkuva altistus yli koko lnkubointiajan. Agarin hyytymisen jälkeen levyjä inkuboidaan inkubointikaapissa 7 vuorokautta 25 37°C:ssa (5 % C02; 95-%:inen suhteellinen ilmankosteus).

Sen jälkeen lasketaan muodostuneiden, läpimitaltaan 60 μ olevien pesäkkeiden lukumäärä. Tuloksena annetaan käsiteltyjen agarlevyjen pesäkkeiden lukumäärä %:eina käsittelemättömistä vertailunäytteistä todetuista lukumääristä.

30 Näin saadusta annos-vaste-käyrästä määritetään yhdisteen tehon mittana käytetty IC90-arvo. Tässä kuvatuilla yhdisteillä saadut tulokset verrattuna adriamysiiniin on koottu taulukkoon I.

Il 11 81608

Taulukko I

Li sääntymiskoe Pesäkkeenmuodostuskoe ic50 (pg/ml) ic50 (pg/ml) 5 7 vrk:n 1 tunnin inkubointi inkubointi ADM 6,0 x 10'3 2,2 x 10*2 4,4 x 10‘2 1-OH-sytorodiini A 3 x 10*3 2,8 x 10*3 2,6 x 10'2 1-OH-sytorodiini V 2,8 x 10'3 4,5 x 10-4 2,4 x 10‘3 10 _

Kuten edellä esitetystä käy Ilmi, on keksinnön mukaisesti valmistetuilla yhdisteillä sytostaattinen teho, so. terapeuttinen vaikutus eläinten ja Ihmisten kasvaimia, 15 varsinkin pahanlaatuisia kasvaimia vastaan.

Yhdisteitä ja niiden happoadditiosuoloja voidaan sen vuoksi käyttää lääkkeinä kasvainten käsittelyssä. Yhdisteitä voidaan käyttää eri tavoin riippuen annostusmuo-dosta. Normaalisti yhdisteitä käytetään sekoitettuina far-20 maseuttisesti tavanomaisiin kantajiin tai laimentimiin.

Siten niitä voidaan käyttää esim. yksittäin tai seoksina yhdessä kantajien, kuten maltoosin tai laktoosin kanssa, tai myrkyttöminä komplekseina, esim. deoksiribonukleiini-happokomplekseina.

25 Tyypillinen käyttömuoto on ruiske, joka on keksin nön mukaisesti valmistettujen yhdisteiden liuos tislatussa vedessä tai fysiologisessa keittosuolaliuoksessa. Liuoksia voidaan injektoida vatsaontelon sisäisesti, laskimoon tai valtimoon.

30 Vuorokausiannos ja annosyksikkö voidaan todeta eläinkokeilla ja myös in vitro-kokeilla siten, että koko-naisannos, joka annetaan jatkuvasti tai aikavälein, ei ylitä etukäteen määrättyä aluetta. Siten yhden käsittely-jakson aikana annettava kokonaisannos on noin 0,5 - 5 mg 35 kehon painokiloa kohti. Tämä annos voidaan antaa vastaavina murto-osina 7 vuorokauden pituisena ajanjaksona. On 12 81 6Q8 kuitenkin selvää, että konkreettiset annokset Ihmisen t*:i eläimen käsittelyä varten voidaan määrätä yksilöllisesti riippuen kulloisestakin tilanteesta, esim. potilaan iästä, painosta, sukupuolesta, herkkyydestä, ravinnosta, lääkesn-5 non ajankohdasta, muista käytetyistä lääkkeistä ja kehon kunnosta sekä sairauden vaikeudesta.

Keksintöä valaistaan lähemmin seuraavien esimerkkien avulla:

Esimerkki 1 10 1-hydroksi-sytorodiinien valmistus fermentolmalla

Streptomyces purpurascens DSM 2658-kantaa Streptomyces purpurascens DSM 2658 siirrettiin hii-va-mallasagarille, jolla oli seuraava koostumus: mallasuute 10 g 15 hiivauute 4 g glukoosi 4 g agar 15 g tislattu vesi 1 1 pH 7,0 20 Tätä varten kasvualusta jaettiin Roux-pulloihin ja steriloitiin 30 minuuttia 121°C:ssa, jäähdytettiin, siir-rostettiin itiösuspensiolla ja inkuboitiin 7-14 vrk 25°C:ssa. Sen jälkeen voitiin havaita kasvusto ja hyvä 25 itiönmuodostus.

Tästä perusviljelmästä valmistettiin steriiliin NaCl-liuokseen (0,8-%:inen) itiösuspensio, jossa oli 107 itiötä/ml. 10 ml tätä suspensiota käytettiin siirroksena 500 ml:aan seuraavaa esikasvatuselatusainetta: 30 glukoosi 15 g soijajauho 15 g maissin liotusjäännös (kiinteä) 5 g CaC03 2 g

NaCl 5 g 35 tislattu vesi 1 1 pH 7,0

II

« 81608 2 000 ml:n Erlenmeyer-pulloihin pantiin kuhunkin 500 ml edellä mainittua kasvualustaa ja steriloitiin 30 min 121°C:ssa. Siirrostuksen jälkeen pulloja inkuboitiin 2 vrk 25°C:ssa kiertoravistimessa kierrosnopeudella 200 kier-5 rosta/minuutti.

500 ml kasvanutta esiviljelmää käytettiin siirroksena seuraavaan pääviljelmään: glukoosi 20 g mallasuute 10 g 10 hiivauute 4 g tislattu vesi 1 1 pH 6,8 9 litraa edellä mainittua kasvualustaa mitattiin 12 15 litran fermenttoriln ja steriloitiin 50 minuuttia 121°C:ssa. Fermentointl suoritettiin 28°C:ssa sekoitusno-peudella 600 kierrosta/mlnuutti ja ilmastusnopeudella 8 -9 litraa ilmaa/minuutti. Fermentointiaika oli 90 - 110 tuntia. Talteenottoajän toteamiseksi seurattiin absorptio-20 maksimin muodostumista aallonpituudella 568 nm. Tätä varten uutettiin viljelyliuosnäytteitä etyyliasetaatilla ja mitattiin absorptiospektri alueella 400 - 600 nm.

Esimerkki 2

Streptomyces purpurascens DSM 2658-kannan viljely 25 suuremmassa mittakaavassa

Esimerkin 1 mukaisesti siirrettiin Streptomyces purpurascens DSM 2658 2 000 ml:n Erlenmeyer-pulloihin, joissa oli 500 ml esiviljelyelatusainetta, ja siirrostet-tiin näillä 2 vrk:n kuluttua 30 litran fermenttori, jossa 30 oli 20 litraa esiviljelyelatusainetta. Fermentointi suoritettiin 28°C:ssa sekoittaen nopeudella 160 - 180 kierros-ta/minuutti ilmastusnopeuden ollessa 6-7 litraa/minuut-ti. 48 tunnin kuluttua tätä esiviljelmää käytettiin siirroksena 300 litran fermenttoriln, jossa oli 200 litraa 35 päävlljelyelatusainetta (esimerkki 1). Fermentoitiin 90 -110 tuntia 28°C:ssa sekoittimen kehänopeudella 3,5 m/sek ja 14 81 608 ilmastusmäärällä 1 wm (200 ml/min). Talteenottokinteerlt olivat samat kuin esimerkissä 1.

Esimerkki 3

Antrasykliiniyhdisteiden raakaseoksen eristäminen 5 190 litraan viljelmää lisättiin 0,5 % formaliinia ja pH säädettiin etikkahapolla arvoon 5,2. Rihmasto erotettiin tavanomaisilla menetelmillä (kiinteäaine-erotin, suodinpuristin) ja pestiin useita kertoja pienellä määrällä vettä.

10 Viljelmäsuodos (n. 185 1) yhdistettiin pesuveteen, säädettiin NaOH:lla pH-arvoon 7,5 - 8,0 ja pestiin 2 x 50 litran etyyliasetaattierillä. Vesifaasi heitettiin pois. Orgaaniset faasit yhdistettiin, haihdutettiin tyhjössä 8 litraksi ja uutettiin sitten 4x3 litralla natriumase-15 taattipuskuriliuosta (pH 3,5). Yhdistetyt puskuriliuokset pestiin sitten 3x3 litralla tolueenia.

Erotettua rihmastoa (n. 3,4 kg) sekoitettiin 3 x 15 litran kanssa asetonia, dekantoimalla erotettu asetoni-liuos haihdutettiin tyhjössä, lisättiin 5 litraa Na-ase-20 taattipuskuriliuosta, jonka pH oli 3,5, ja pestiin 3 x 2,5 litralla tolueenia.

Viljelmäsuodoksen jatkokäsittelystä saatu vesipitoinen puskurifaasi säädettiin Na0H:lla pH-arvoon 7,9 ja uutettiin 3x3 litralla etyyliasetaattia. Yhdistetyt 25 etyyliasetaattiuutteet haihdutettiin tyhjössä.

Rihmaston jatkäkäsittelyssä saadun vesipitoisen puskurifaasin pH säädettiin Na0H:lla arvoon 8,0 ja uutettiin 3 x 2,5 litralla etyyliasetaattia. Yhdistetyt orgaaniset uutteet haihdutettiin tyhjössä.

30 Jäljelle jääneet veslfaasit heitettiin pois.

Esimerkki 4 1-hydroksi-sytorodiini A:n eristäminen käänteisfaa- si-HPLC:llä

Voimakkaan violetti sytorodiini A-erä polaarisesta 35 sytorodiiniraakaseoksestia (kompleksi II), joka oli saatu tavanomaisella pylväskromatografialla silikageelillä käyt- is 81608 täen etikkahappopitoista liikkuvaa faasia ja sitä seuraa-valla rikastuksella preparatiivisen HPLC:n avulla kään-teisfaasiadsorbenssillä. Siten esim. liuotettiin 250 mg 4 ml:aan liikkuvaa faasia, Jona oli CHClj/metanoli/ammo-5 niumasetaatin 10-%:inen vesiliuos suhteessa 150:1050:375 ja lisättiin teräskolonnlln (3,2 x 25 cm), joka oli täytetty paineen avulla noin 120 g:11a Lichrosork^ RP-18, 25 - 40 μ (Merck) ja kromatografoitiin virtausnopeudella 4 ml/min.

10 Erottumista seurattiin kahdella peräkkäin sijoite tulla läpivirtausfotometrlllä aallonpituuksilla 490 ja 560 nm. Kun punaiset ja violetit fraktiot oli erikseen kerätty yhteen ja Jatkokäsitelty tavanomaiseen tapaan, saatiin seuraava tulos: 15 Fraktiot 88 - 108; 62 mg sytorodiini A:ta (1H-NMR:n mukaan)

Fraktiot 109 - 120; 46 mg 1-hydroksi-syrotodiini A:ta (n. 80 - 90-%:inen puhtaus)

Noin 150 mg edellä esitetyllä tavalla saatua 1-hyd-roksi-sytorodiini A:ta puhdistettiin edelleen uudella pre-20 paratiivisella HPLC:llä adsorbenssilla RP-18, 25 - 40 μ edellä esitetyissä olosuhteissa. Saatiin 60 mg 1-hydrok-si-sytorodiini A:ta, jossa oli jäljellä alle 2 % sytorodiini A: ta.

l-OH-A: 1H-NMR: Kuvio 1 25 Absorptio- a) 240 (4,67), 298 (3,73), 522 (4,06), 550 (4,07) ja 561 (4,10) spektri b) 240 (4,75), 255 (SCH), 270 (4,37), 522 (4,30), 550 (4,29) ja 561 (4,30) (nm) c) 243 (4,69), 276 (3,81), 589 (4,30) ja 30 635 (4,44) C6oHeeN2°2i' M lask.: 1 172 (varmistettu FAB-MS:llä) ie 81608

Esimerkki 5 1-hydroksi-sytorodiinl V:n eristäminen preparatil-visella kesklpaine- ,1a kerroskromatografiällä 7 g sytorodliniraakaseosta, joka oli saatu viljely-5 liuoksesta uuttamalla kuten kaaviossa 1 on kuvattu, kroma-tografoltiin 620 g:11a silikageeliä 31 μ (Grace), joka oli kahdessa säteittäisesti tiivistetyssä silika-patruunassa (Waters, Prep LC/Systero 5od®) käyttäen ajonesteenä CHC13/-metanoli/96-%:inen etikkahappo/vesi-seosta suhteessa 10 80:10:2. Näyte lisättiin tasapainotettuun pylvääseen 65 ml:ssa liikkuvaa faasia ja erotettiin 23 ml:n fraktioiksi virtausnopeudella 25 ml/min. Arvostelu tapahtui ohutker-roskromatografian ja analyyttisen HPLC:n avulla.

Fraktioissa 29 - 34 oli 195 mg sytorodilni V:n ja 15 1-hydroksi-sytorodiini V:n seosta, jonka puhtaus oli 80 % (Rf 0,38 järjestelmässä A).

60 mg tästä näytteestä puhdistettiin edelleen pre-paratiivisella ohutkerroskromatografiällä (Merck, DC-Fer-tiogplatten Kieselgel 60).

20 Erotetut juovat eluoitiin CHCl3/metanoli-seoksella, 1:1. Eluointiliuos neutraloitiin dinatriumvetyfosfaatti-liuoksella ja lisättiin vettä, kunnes CHCl3-faasi erottui. Kloroformifaasi otettiin erilleen, pestiin kerran vähäisellä määrällä vettä, kuivattiin vedettömällä Na2S04:llä ja 25 haihdutettiin. Kun jäännös oli otettu pieneen määrään kloroformia, saostettiin 10-kertaisella tilavuudella petroli-eetteriä ja sakka kuivattiin tyhjössä. Saatiin 12 mg syto-rodiini V:tä ja sen lisäksi 17 mg 1-hydroksi-sytorodiini V: tä.

30 V: identifioitu ^-NMR:llä C6oh84n2°2o/ m lask.: 1 152 (varmistettu FAB-MS:llä).

Il 17 31608 l-OH-V: 1H-NMR: Kuvio 2

Absorptio- a) 237 (4,54), 295 (3,72), 522 (4,03), 548 (3,86) ja 561 (3,68) spektri b) 237 (4,57), 295 (3,79), 522 (4,10), 5 548 (3,93) ja 561 (3,93) (nm) C) 244 (4,46), 280 (3,76), 590 (3,99) ja 630 (4,04) C6oH84N2°2i' m lask.: 1 168 (varmistettu FAB-MS:llä). Esimerkki 6 10 1-hydroksi-sytorodiini B:n eristäminen kääntelsfaa- si-HPLC:lift

Era violettia sytorodiini B:tä, joka oli saatu tavanomaisella preparatiivisella pylväskromatografialla si-likageelillä (etikkahappopitoinen liikkuva faasi), kroma-15 tografoitiin paineen avulla teräskolonnissa (1,6 x 25 cm), joka oli täytetty 30 g:lla 10 μ Lichrosortf® RP-18 (Merck). Tätä varten 120 mg liuotettiin 1 ml:aan liikkuvaa faasia, jona oli CHClj/metanoli/ammoniumasetaatin 10-%:inen vesi-liuos suhteessa 150:1050:375, ja injektoitiin. Käyttäen 20 virtausnopeutta 4 ml/min kerättiin 4 ml:n fraktioita ja arvosteltiin mittaamalla ekstinktiot 490 nm:ssä ja 570 nm:ssä. Yhteen kuuluvat fraktiot yhdistettiin ja jatkokä-siteltlin tavanomaiseen tapaan. Tällöin saatiin:

Fraktiot 1-32; 15 mg sytorodiini B:tä 25 Fraktiot 38 - 50; 10 mg 1-hydroksi-sytorodiini B:tä B: identifiointi ^-NMRillä, absorptlospektrillä ja FAB-MS:llä l-OH-B: 1H-NMR: Kuvio 3

Absorptio- a) 259 (4,42), 290 (3,66), 522 (3,95), 30 549 (3,82) ja 562 (3,85) spektri b) 238 (4,45), 298 (3,57), 522 (4,03), 549 (3,91) ja 562 (3,93) (nm) c) 244 (4,41), 280 (3,62), 590 (3,93) ja 632 (4,01) 35 C60H86N2O22, M lask.: 1 186 (varmistettu FAB-MS:llä) 18 81 608

Esimerkki 7 l-hydroksi-sytorodiini C:n eristäminen käänteisfaa-si-HPLC:lia

Raakaa violettia sytorodiini C:tä sisältävä tuote 5 (25 mg), joka oli saatu tavanomaisella preparatiivisella pylväskromatografiällä silikageelillä, kromatografoltiin teräskolonnissa (1,6 x 25 cm), joka oli täytetty 30 g:lla 10 μ Lichrosort^ RP-18 (Merck), käyttäen CHCl3/metanoli/-ammoniumasetaatin 10-%:inen vesiliuos-seosta suhteessa 10 150:1050:375 virtausnopeudella 2 ml/min. Otettiin talteen 2 ml:n fraktioita ja ne yhdistettiin ekstinktiomittauksil-la 490 nm:ssä ja 570 nm:ssä saatujen tulosten mukaisesti. Tavanomaisen jatkokäsittelyn jälkeen saatiin:

Fraktiot 80 - 142; 10 mg sytorodiini C:tä 15 Fraktiot 159 - 175; 7 mg l-hydroksi-sytorodiini C:tä 1-OH-C: 1H-NMR: Kuvio 4

Absorptio- a) 240 (4,62), 296 (3,80), 523 (4,13), 550 (4,10) ja 562 (4,11) spektri b) 240 (4,64), 296 (3,80), 523 (4,21), 20 550 (4,15) ja 562 (4,16) (nm) c) 243 (4,69), 270 (SCH), 300 (SCH), 590 (4,24) ja 635 (4,35) C6ohson2°23' m lask.: 1 196 (varmistettu FAB-MS:llä) Esimerkki 8 25 1-hydroksi-sytorodiini N + O:n eristäminen kään- teisfaasi-HPLC:llä

Tavanomaisella monivaiheisella pylväskromatogra-fialla, joka suoritettiin 31 μ:η silikageelillä (pH 7,5) ja sen jälkeen Lichrosort^ RP-18:11a (kts. myös esimerkki 30 4), saatiin voimakkaan violetti erä tuotetta, joka käyt täytyi kuin sytorodiini N + 0 arvosteltuna DC:n ja analyyttisen, silikageelillä järjestelmällä B suoritetun HPLC:n perusteella; tämä tuote voitiin erottaa edelleen punaiseksi ja violetiksi komponentiksi toistetulla prepa-35 ratiivisella HPLC:llä käyttäen käänteisfaasi-adsorbentte-ja.

19 Tällöin liuotettiin esimerkiksi 230 mg violettia tuotetta 4 ml:aan liikkuvaa faasia, jona oli CHCl3/metano-li/ammoniumasetaatin 10-%:inen vesiliuos-seos suhteessa 150:1050:375, ja kromatografoitiin noin 100 μ Lichrosorl^ 5 RP-18 (Merck) 3,2 x 25 cm:n teräskolonnissa paineen alai sena virtausnopeudella 4 ml/min. Otettiin talteen 8 ml:n fraktioita ja yhdistettiin nämä mittaustulosten perusteella, jotka saatiin analyyttisessä käänteisfaasl-HPLC:ssä kaksolsaallonpituusllmalsimella 490 ja 560 nm:ssä. Tavan-10 omaisen jatkokäsittelyn jälkeen saatiin:

Fraktiot 70 - 85; 97 mg sytorodiini N + O:ta (n. 70- -80-%:inen puhtaus ^-NMRm mukaan)

Fraktiot 86 - 95; 40 mg 1-hydroksi-sytorodiini N + O:ta (n. 60-%:inen puhtaus) 15 Kahdessa samanlaisessa kromatografisessa ajossa saatiin yhteensä 73 mg 1-hydroksi-sytorodiini N + 0:ta, ja kromatografoitiin uudelleen edellä esitetyllä tavalla. Saatiin 18 mg 1-hydroksi-sytorodiini N + O:ta, joka sisälsi alle 10 % jäljelle jäänyttä sytorodiini N + 0:ta.

20 1-0H-N + 0: 1H-NMR: Kuvio 5

Absorptio- a) 240 (4,62), 295 (3,77), 523 (4,16), 550 (4,09) ja 562 (4,11) spektri b) 240 (4,64), 295 (3,83), 523 (4,22), 550 (4,15) ja 562 (4,16) 25 (nm) c) 244 (4,64), 280 (SDCH), 592 (4,19) ja 634 (4,28) C60HeeN2O22, M lask.: 1 188 (varmistettu FAB-MS:llä)

Eristetty tuote on rakenneisomeeristen aineosien 1-0H-N + l-OH-O seos (1:1). Tämä käy ilmi ^-NMR-spektris-30 tä, lohkomiskokeista (hydrogenolyysi) ja määrittämällä yksittäiset sokerirakenneosat hydrogenolyysin ja kokonais-hydrolyysin jälkeen.

20 81 608

Esimerkki 9 1-hydroksi-sytorodiini P;n eristäminen käänteisfaa- si-HPLC:11¾

Tavanomaisella pyiväskromatografiällä, joka suori-5 tettiin 31 μ:n silikageelillä pH:ssa 7,5, saatiin voimakkaan violetti tuote, jonka pääkomponenttina oli DC:ssa (järjestelmä A) ja analyyttisessä HPLC:ssä silikageelillä hieman suurempi retentio kuin 1-hydroksi-sytorodiini C:llä. Uusi yhdiste voitiin eristää toistetulla prepara-10 tiivisella käänteis£aasi-HPLC:llä. Tätä varten liuotettiin esim. 175 mg violettia raakatuotetta 2,5 ml:aan liikkuvaa faasia, jona oli CHCl3/metanoli/ammoniumasetaatin 10-%:inen vesiliuos suhteessa 500:1100:300, ja kromatografoitiin noin 100 g:11a 10 μ Lichrosort^ RP-18 (Merck) 3,2 x 25 cm:n 15 teräskolonnissa paineen alaisena virtausnopeudella 4 ml/-min. Eluaatti otettiin talteen 8 ml:n fraktioina ja analyyttisen käänteisfaasi~HPLC:n, jossa käytettiin kaksois-aallonpituusilmaisinta 490 ja 560 nm:ssä, perusteella arvioiden yhteen kuuluvat fraktiot yhdistettiin.

20 Tällöin saatiin analyyttisen käänteisfaasi-HPLC:n mukaan:

Fraktiot 21 - 45; 85 mg muun muassa 1-hydroksi-sytorodiini C:tä ja V:tä

Fraktiot 46 - 52; 50 mg muun muassa sytorodiini P:tä ja 25 tunnistamattomia voimakkaan polaarisia yhdisteitä

Fraktiot 53 - 61; 25 mg pääasiallisesti 1-hydroksi-sytorodiini P: tä

Useista samankaltaisista kromatografisista ajoista saadut 1-hydroksi-sytorodiinin suhteen voimakkaasti rikas-30 tuneet erät yhdistettiin ja kromatografoitiin uudelleen edellä esitetyissä olosuhteissa. Noin 80 mg:sta saatiin 20 mg puhdasta 1-hydroksi-sytorodiini P:tä.

Il 21 81608 l-OH-P; 1H-NMR: Kuvio 6

Absorptio- a) 238 (4,58), 292 (3,77), 522 (4,03) ja 549 (3,92) spektri b) 237 (4,63), 296 (3,77), 522 (4,17), 5 549 (4,03) ja 561 (4,03) (ran) c) 243 (4,65), 275 (3,85), 590 (4,11) ja 632 (4,17) ^6οΗβ2Ν2°22/ m lask.: 1 182 (varmistettu FAB-MS:llä) 10 Koe-olosuhteet: 1) Suurpalnenestekromatografia (HPLC) silikageelil-lä

Teräskolonnit (4,6 x 250 mm), täyttömateriaalina 7 μ Lichrosorb* Si 60 (Merck) tai 7 μ Kieselgel 60 (Grace); 15 liikkuva faasi: CHCl3/metanoli/86-%:inen etikkahappo/tri-etyyliamiini/vesi (80:10:10:2:0,01); virtaus: 0,5 - 1,5 ml/min; osoitus 260 tai 490 nm:ssä läpivirtausfotometril-lä.

2) Kääntelsfaasi-HPLC

20 Teräskolonnit (4,6 x 250 mm), täyttömateriaalina 10 μ Lichrosorb* RP-18 (Merck); liikkuva faasi: CHCl3/meta-noli/ammoniumasetaatin 10-%:inen vesiliuos (250:1050:375); virtaus: 0,5 - 1,5 ml/min; osoitus 490 nm:ssä ja 560 nm:ssä läpivirtausfotometrillä.

25 Käytetyt analyyttiset ja preparatiiviset HPLC-ko- lonnit täytettiin yleensä itse firman Merck (Darmstadt) suosittelemalla menetelmällä pneumaattisen pumpun (Haskel) avulla.

3) Preparatiivinen pylväskromatografia 30 Tavanomaiseen preparatiiviseen pylväskromatogra- fiaan käytettiin adsorbenttia 31 μ Kieselgel 60 (Grace) tai 15 - 40 μ Kieselgel 60 (Merck) avoimissa lasikolon-neissa tai paineen avulla täytetyissä teräskolonneissa. Liikkuvana faasina käytettiin liuotinseoksia, joilla oli 35 samankaltainen koostumus kuin edellä esitetyillä analyyt 22 81608 tisessä HPLC:ssä käytetyillä, mutta joissa mahdollisesti oli pienennetty metanolin, etikkahapon ja veden osuutta.

Voimakkaasti polaaristen aineosien kromatografoin-tiin käytettiin adsorbenttina 31 μ Kieselgel 60 (Grace), 5 joka oli pesty puhtaaksi metalleista 2 N HCl:llä, ja sen jälkeen kun happo oli pesty pois vesisuspensiossa, käsitelty 5 N NaOH:lla kunnes pH oli asettunut arvoon 7,5. Dekantoinnin jälkeen kuivattiin modifioitu silikageeli 130°C:ssa, seulottiin ja lietettiin kolonniin liikkuvan 10 faasin avulla. Liikkuvana faasina käytettiin liuotinseok-sia CHCl3/vesi/metanoli (13:4:3 - 7). Kuormitussuhde oli noin 1:100 - 1:300.

4) Ohutkerroskromatografia (DC)

Silikageelilevyt (Kieselplatten F254; Merck) kehi-15 tettiin järjestelmällä A: CHCl3/metanoli/96-%:inen etikka- happo/vesi/trietyyliamiini (80:10:10:2:0,01) tai järjestelmällä B: CHCl3/metanoli/99-%:inen etikkahappo (75:15:10:2).

5) Tavanomainen jatkokäsittely 20 Tavanomainen jatkokäsittely suoritettiin seuraavas ti : Käänteisfaasi— HPLC:stä saatuihin yhdistettyihin fraktioihin lisättiin vettä puolet niiden tilavuudesta ja sen jälkeen lisättiin kloroformia kunnes faasit erottui-25 vat. Erikseen otettu kloroformifaasi pestiin vedellä, kuivattiin vedettömällä Na2S04:llä ja haihdutettiin tyhjössä.

Näin saaduista tuotteista poistettiin niissä mukana olevat rasvat, pehmentimet ja metalli-ionit seuraavasti:

Tuotteeseen (esim. 30 mg) liuotettuna 20 ml:aan 30 natriumasetaattipuskuria (pH 3,5), lisättiin 1 ml etylee-nidiamiinitetraetikkahapon 0,001 M vesiliuosta (EDTA; pH säädetty NaOH:lla arvoon 3,5) ja ravisteltiin yhdessä 5 ml:n kanssa tolueenia. Tolueenikerros heitettiin pois, vesifaasin pH säädettiin 2 N NaOH:lla arvoon 7,5 ja sitä 35 uutettiin 20 ml:11a CHC13 voimakkaasti ravistaen. Kuivat-

II

23 81 608 ti in vedettömällä Na2S04:llä, suodatettiin ja haihdutettiin tyhjössä.

Joissakin tapauksissa jäännös liuotettiin pieneen määrään CHClj ja liuos suodatettiin imulla laslsuotimen 5 läpi ja heptaanilisäyksen jälkeen haihdutettiin tyhjössä, kunnes muodostui samennus.

6) Spektroskooppiset tutkimukset

Aineosien identifiointi edellä esitetyissä esimerkeissä tapahtui seuraavassa kuvatuissa mittausolosuhteis- 10 sa:

Protoniresonanssispektrit (1H-NMR-spektrit) määritettiin HX-270 BRUKER Fournier-Transform-ydinmagneettisen resonanssispektrin määrityslaitteella 270 MHzjllä. Pitoisuudet olivat 2-4 mg/0,5 ml 99,8-%:ista CDC13; liuoksia 15 ravisteltiin heti valmistamisen jälkeen 0,1 mlrssa 5-%:ista Na2C03 99,5-%:isessa D20:ssa.

Kuvissa tähdellä merkityt signaalit ovat peräisin pienimolekyylisistä epäpuhtauksista 0 %-alueella ja liuo-tinj äänteistä.

20 Massaspektrit mitattiin massaspektrometrillä MS-902 S, AEI, käyttäen FAB- (Fast-Atom-Bombardment-, kiinteä-atomi-pommitus-) ionilähdettä. Aineet vietiin ioni lähteeseen tioglyseriinimatriisissa, osaksi käytettiin ammoniumkloridilisäystä.

25 Absorptiospektrit mitattiin alueella 200 - 7090 nm seuraavissa liuottimissa: a) vesi/metanoli (1:9), b) 10 % 1 N HC1 metanolissa ja c) 10 % 1 N NaOH metanolissa.

30 Aineiden pitoisuus oli 10 - 30 mg/1; tuloksina il moitetaan absorptiomaksimit nanometreinä ja molaariset ekstinktiokertoimet (logB).

Claims (3)

24 8160B

1. Menetelmä kaavan 1 mukaisen yhdisteen ja sen fysiologisesti hyväksyttävien happoadditiosuolojen valmis- 5 tamiseksi, r · k >»·. 10 wJL jI* 7^1 ^oh 1 OH 0 I S0R. OH 1 15. ossa kaavassa a) Ri ja R2 ovat samoja ja merkitsevät sokeriyhdis-telmää Roa-Rod-Rod tai Roa-dF**CinB, tai b) Rx ja R2 ovat erilaisia ja merkitsevät sokeriyh-distelmää Roa-Rod-Rod ja Roa-dF-Rod, tai 20 c) Rj ja R2 ovat erilaisia, jolloin Rx merkitsee sokeriyhdistelmää Roa-dF-CinA ja R2 merkitsee sokeriyhdis-telmää Roa-Rod-Rod tai Roa-Rod-Acu, tai Rx merkitsee sokeriyhdistelmää Roa-Rod-Acu ja R2 merkitsee sokeriyhdistelmää Roa-Rod-Rod, 25 tunnettu siitä, että mikro-organismia Streptomyces purpurascens DSM 2658 fermentoidaan tehostetun happisyötön alaisena muuten sinänsä tavanomaisella tavalla aerobisissa olosuhteissa ravintoliuoksen läsnäollessa ja muodostuneet yhdisteet eristetään uuttamalla vil- 30 jelyliuoksesta ja rihmahuovastosta orgaanisilla liuottimilla, ja eristetään lopuksi kromatografiällä tai jakamalla tavanomaisella tavalla.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mikro-organismia Streptomyces 35 purpurascens DSM 2658 fermentoidaan hiili- ja typpilähtei-tä sekä epäorgaanisia ravinnesuoloja ja hivenaineita si- li 25 8 1 6 0 8 sältävässä ravintoliuoksessa 24 - 40°C:n lämpötilassa ja pHrssa 6,5 - 8,5, muodostuneet yhdisteet uutetaan viljely-liuoksesta etyyliasetaatilla ja kloroformilla ja rihmahuo-vastosta ensin vesipitoisella asetonilla ja erotetusta 5 vesifaasista sen jälkeen etyyliasetaatilla, etyyliasetaat- tluutteet yhdistetään ja konsentroidaan ja uutetaan ase-taattipuskurllla pH:ssa 3,5, vesifaasi uutetaan tolueenil-la ja kaavan I mukaiset yhdisteet eristetään jäljellä olevasta vesiliuoksesta kromatografiällä tai jakamalla.

3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että kaavan I mukaisen yhdisteen kromatograafinen eristäminen suoritetaan silikageelipyl-väällä, käänteisfaasi-adsorbenteilla, pisara-vasta-virta-kromatograflalla tai jakamalla ja sitten ohutkerros- tai 15 suurpainenestekromatografiällä. 26 81 608