KR790001476B1 - 포티마이신 c의 제조방법 - Google Patents

Abstract

내용 없음.

Description

포티마이신 C의 제조방법

제 1 도는 포티마이신 C의 적외선 흡수펙트럼에 관한 표이다.

본 발명은 광범위한 양성균과 음성균에 대해 강력한 항균력을 나타내는 새로운 항생물질, 포티마이신 C의 제조방법에 관한 것이다. 발명자들은 이와같은 항생물질을 위하여서 수많은 자연계의 미생물에 대한 생산성을 연구했다.

그 결과 광도현 광도시 교외의 수전토양에서 분리해낸 균주(MK-70주라 칭함)를 배지에서 배양하여 배양물중에 몇가지의 항생물질을 만들수 있음을 알아냈다. 그중에서 2가지의 항생물질 즉 포티마이신 B 및 포티마이신 A를 분리했다. (특허공개 소화 49-126892 및 50-29789). 본 발명자들이 더욱 연구한 결과 그 이외에 또 하나의 항생물질 포티마이신 C라고 명명되는 물질의 존재를 알아냈다. 그 항생물질에 대해 화학적, 물리적, 생물학적 성질을 분석한 결과 새로운 항생물질임을 알아냈다.

본 발명에 의하면 마이크로모노 스포라속에 속하는 포티마이신 C 생산균을 영양배지에서 배양함으로서 배양물중에 항생물질 포티마이신 C를 생성, 축적시킴이 가능하다.

본 발명에서 사용균으로는, 마이크로모노 스포라속에 속하고, 포티마이신 C를 배지중에 생성, 축적할 수 있는 균이 있다면, 어떠한 균주라도 사용할 수가 있다. 구체적으로 좋은 예로는 마이크로모노스포라ㆍ오리보아스테로 스포라 MK-70(미생물공업연구소 균주번호 제1560호)(ATCC 21819), 마이크로모노스포라, 오리보아스테로스포라 MK-80(미생물공업연구소 균주번호 제2192호)(ATCC 31010), 마이크로모노스포라, 오리보아스테로스포라 Mm 744(미생물공업연구 균주번호 제2193호)(ATCC 31009) 등등을 들수 있다.

이것들의 균주의 균학적 성질은 특허공개 소화 50-29789호에 명기되어 있다.

본 발명에 관한 배양은 다음과 같이 한다.

즉 본 균주를 배양하는데는 방선균 배양법을 일반적으로 쓴다. 배양을 위한 배양원으로는 여러 종류의 것들이 사용된다. 탄소원으로는 포도당, 전분, 만노즈, 과당, 서당, 당밀등이 단독 또는 조합되어 쓰인다. 흔히 균의 자화성에 따르면 탄화수소, 알콜, 유기산 등이 쓰인다. 무기 및 유기 질소원으로는 염화암모늄, 황산암모늄, 요소, 질산암모늄, 질산소다 등이 쓰이고 또 천연질소원으로는 펩톤, 육즙, 효모즙, 건조효모, 옥수수침지액, 대두분, 카자미노산, 용성 식물썽 단백질등이 단독으로 또는 조합하여 사용된다. 그 이외에 필요하면 식염, 염화칼리, 탄산칼슘, 염산염등의 무기염류를 가하는 외에 본균의 생장이나 포티마이신 C의 생산을 촉진하는 무기물 또는 유기물을 적당히 첨가할 수 있다.

배양법으로는, 액체배양법, 특히 심부교반 배양법이 있다. 이때의 배양온도는 섭씨 25 내지 40℃, pH는 중성 근처에서 행함이 바람직하다. 액채배양은 보통 2 내지 15일이 걸리며, 그 결과 본 항생물질이 배양액중에서 생성, 축적된다. 배양액중의 생성량이 최대에 달하면 배양을 중지하고 배양액중에서 목적하는 물질을 분리한다.

포티마이신 C의 정제, 분리는 다음과 같이 행한다.

배양액에서 본 물질을 정제, 분리하는데는 미생물대사 산물을 사용하는 분리, 정제 방법을 보통 쓴다.

본 항생물질 포티마이신 C는 물에는 잘 녹고, 일반 유기용매에는 잘 녹지 않는 염기성물질로, 소위 수용성 염기성 항생물질의 정제에 더욱 많이 쓰이는 방법으로 수행된다. 즉 양이온 교환수지에 의한 흡탈착법, 셀루로즈칼럼, 크로마토그라피, 세파덱스 LH-20 칼럼에 의한 흡탈착법, 실리카겔칼럼 크로마토그라피등의 방법을 적당히 조합시켜 쓸 수가 있다. 다음에 포티마이신 복합제를 (포티마이신 A,B,C 및 항균활성을 갖게하는 부생물을 함유한 혼합물) 생산균주로 사용하는 경우의 배양액에서의 포티마이신 C의 정제법을 기술하겠다. 즉 배양여액을 pH-7.5에 맞춘 후 양이온 교환수지 IRC 50(암모니아형)에 흡착시켜 물로 씻은후 0.5 N-암모니아수로 용출시킨다. 활성부분을 감압 농축시킨후 음이온 교환수지 다우-엑스 1×2(OH형)에서 처리한다. 녹여낸 활성성분을 모아서, 감압하에서 농축하여 포티마이신 복합제의 전분말을 얻는다. 그 전분가루를 물에 녹여 2N-황산에서 pH 5에 맞추어 놓고, 활성탄을 충진 시켜놓은 칼람에 통한다. 활성물질은 활성탄에 흡착되고 계속해서 물로 씻으면 활성탄에 흡착되지 않은 불순물은 유출된다. 그런 다음, 0.2 N의 황산으로 칼람을 씻어내면 활성물질은 녹아나오고, 활성성분을 모아서 음이온 교환수지다우엑스 44(OH형)에서 중화시킨후 동결 건조하므로써 포티마이신 복합제의 각 성분의 유리염기를 얻을 수가 있다.

그 다음에 실리카겔칼럼 크로마토그라피를 쓴다.

전개용매로는 클로로포름, 이소푸로파놀, 암모니아수(2:1:1)로 되어있는 용액의 아랫층을 사용한다. 위에 말한 분말을 이 용매에 현탁시켜서 칼람에 도입시키고 같은 용매로 매시 약 30ml의 유속으로 통과시킨다. 최초에 녹아 나오는 활성부분이 포티마이신 B이다. 다시한번 여러 성분을 가진 미량성분을 녹여 내면 가장 많은 량을 가진 활성성분인 포티마이신 A가 녹아 나온다. 그 다음에, 또 한번 녹여내기를 계속하면 그 다음으로 많은 성분의 포티마이신 C가 녹아 나온다. 이 부분을 모아서 감압 농축하고 동결 건조시켜서 백색인 본 물질의 유리염기를 얻는다. 이렇게 하여, 실리카겔칼럼 크로마토그라피에서 어느정도 근사한 포티마이신 C의 견본을 얻을 수 있지만, 대론 약간의 불순물이 섞이는 수가 있으므로 또 다시 셀루로즈, 칼람, 크로마토그라피에 보낸다.

전개용매로는 n-부탄올:피리딘:초산:물(6:4:2:4)의 혼합용매를 쓴다. 녹아나오는 활성성분을 모아 감압하에서 농축하면 순수한 포티마이신 C를 얻을 수 있다. 또한 혼합된 닌하이드린 양성물질을 제거하는데는 카르복시메틸 셀루로즈에 의한 칼럼 크로마토그라피도 유효하다. 다시말해 이런 경우는, 분말의 용액을, 카르복시메틸셀루로즈(암모늄형)을 충진시킨 칼람에 통과시켜 활성성분을 흡착시킨다. 그뒤에 물로 잘 씻으면 대부분의 색소 및 무기염이 녹아나오고 계속해서 0.2N-중탄산암모늄으로 녹여내면 활성물질이 용출되어 나온다. 포티마이신 C에 해당하는 성분을 모아, 동결 건조하므로써 포티마이신 C의 정제를 할 수 있다.

위의 정제공정중의 포티마이신 C의 활성성분의 동향은 Whatman No. 1 여과지에 의한 상승식 페이퍼크로마토그라피로 부터 검사된다. 전개용매로는 클로로포름, 메탄올, 17% 암모니아수(2:1:1) 용액의 하층부를 사용한다. 6 내지 15시간동안 실온에서 전개한다. 이렇게해서 이 페이퍼 크로마토, 포티마이신 C의 R_f값은 약 0.18 정도이다.

이렇게해서 얻은 포티마이신 C 유리염기의 이화학적 성질은 다음과 같다. 본 물질은 염기성 백색 분말로서 원소분석치는 탄소 : 44.84%, 수소 : 8.19%, 질소 : 17.36%, 산소 : 28.61%이고 융점은 160℃(분해)이다. 본 물질의 수용액의 자외선 흡수 스펙트럼은 220 내지 360mμ 사이로 특정적인 흡수극대를 표시치않고 말단흡수를 나타낼 뿐이다. 비선광도는 [α]

=+84°(C0/H₂0)이다. 적외선흡수 스펙트럼(브름화칼리로 측정)은 제 1 도에 나타나 있다. 흡수최대를 나타내는 파장은 다음과 같다(단위:cm^-1).

3,400, 2,900, 1,625, 1,570

1,450, 1,350, 1,100, 1,030

본 물질의 정색반응은 다음과 같다.

닌하이드린 반응 : 양성, 과망간산 칼리반응 : 양성, 에르슨모르간 반응 : 음성, 뷰렐반응 : 음성.

포티마이신 C 유리염기는 물에 지극히 잘 녹고, 메탄올에도 녹고, 에탄올이나 아세톤에는 약간 녹지만, 그러나 클로로포름, 벤젠, 초산에틸, 초산부틸, 에테르, 부탄올, 석유에테르, n-헥산같은 유기용매에는 불용이다.

포티마이신 C의 각종 전개제에 의한 페이퍼크로마토그라피 및 박층(薄層) 크로마토그라피의 R_f가는 다음과 같다. 다음에, 포티마이신 C에 근사하다고 생각되는 항생물질의 R_f치를 비교하기 위해 몇개의 표를 참조하겠다.

[제 1 표]

상승식 페이퍼크로마토그라피(28℃에서 진행됨)에서의 포티마이신 C의 R_f값.

[제 2 표]

실리카겔 박층(薄層) 크로마토그라피(실온에서 행하고 전개시간은 3시간)에서의 R_f값.

※ 전개제Ⅰ: 클로로포름, 메탄올, 17% 암모늄(2:1:1), (용량비)의 상층부.

전개제Ⅱ: 10% 초산암모늄, 메탄올(1:1), (용량비).

[제 3a 표]

전개제로는 클로로포름, 메탄올, 17% 암모늄용액(2:1:1)의 하층부를 사용하는 상승식 페이퍼 크로마토그라피(실온에서 행해지고 전개시간은 2시간)에서의 R_f값.

[제 3b 표]

* 특허공개 소화 49-13391에 표시된 항생물질

** 특허공개 소화 49-126892에 표시된 항생물질

*** 특허공개 소화 50-29789에 표시된 항생물질

또, 항생물질 포티마이신 C의 각종 미생물에 대한 항균 스펙트럼을 표 4에 나타내 보이겠다.

[제 4 표]

이와같이, 포티마이신 C는 광범위한 그람양성균이며 음성균에 대항하는 강력한 항균력을 가지고 있다.

이렇게 광범위하고, 강력한 항균력중에도 특히 특징적인 점은 가나마이신, 겐타마이신, 토브라마이신등에 내성이 있는 몇종류의 대장균에 유효하다는 점이다. 또한 포티마이신 C는 위에서 말한 여러종류 균이 감염되어 일으키는 여러가지 병에 대해 탁월한 치료효과를 나타낸다고 판명되어 있다. 포티마이신 C의 이와같은 탁월한 항균성은, 본 물질이 특히 항균성 항생물질로써 의약용으로 쓸수 있음이 판명됐다.

다음에 본 물질을 이미 알려져 있는 다른 항생물질과 비교하여 보겠다. 마이크로모노스포라 속에서 생산되는 수용성염기성인 또 보다 광범위한 항균범위를 갖는 항생물질로는, 겐타마이신 복합제(M.J. Weistein 등 : Antimicrobial Aqent and Chemotherapy, 1963 및 D.J. Cooper등 J. Infect Dis./19, 342, 1969, J.A Waitz 등, Antimicrob. Ag. Chemoth. 2,464, 1972), 안티바이오틱 No. 460(특허공개 소화 46-16153호 공보), 신마이신(M.J. Weistein 등, J. Antibiotics 23, 551, 555, 559, 1970), XK-62-2(특허공개 소화 47-13391), 포티마이신 B(특허공개 소화 49-126892) 및 포티마이신 A(특허공개 소화 50-29789)등의 항생물질이 있다. 우선 겐타마이신의 각 성분과 비교하면, 제3표에 나온 바와같이 겐타마이신 A,B,C₂,C₁의 R_f값이 각각 0.00, 0.00, 0.38, 0.59임에 반해서 포티마이신 C의 R_f값은 0.18이므로 이것들과는 다른 것이 확실하다. 그러나, 겐타마이신 C_1a의 R_f값(0.18)은 포티마이신 C의 R_f값(0.18)과 일치하고, 제3표의 R_f값에서는 구별할 수 없지만, 제2표의 전개제 Ⅱ에서 겐타마이신 C_1a(R_f값 0.16)과 포티마이신 C(R_f값 0.40)과는 확실히 구별된다. 다음에 안티바이오틱 No. 460, 신마이신, XK-62-2, 포티마이신 B와 비교하면, 제3표에서 확실했던 것처럼, 각각의 R_f값은, 0.01, 0.18, 0.49 0.65임에 반하여, 포티마이신 C의 R_f값은 0.18이 되므로 신마이신과 일치하는 R_f값을 나타낸다.

그러나 제2표의 전개제 Ⅱ에서는, 신마이신(R_f: 0.18)과 포티마이신 C(R_f: 0.40)와 확실히 구별된다.

흔히, 마이크로모노스포라속 이외의 방선균이 생산하는 수용성 염기성으로 더욱 광범위한 항균 범위를 갖는 항생물질로는, 스트렙토마이신, 리보스타마이신, 리비도마이신, 스펙티노마이신, 카주가마이신, 네오마이신, 가나마이신, 네브라마이신, 바로모마이신등을 들수 있으나, 포티마이신 C는 이 모든 항생물질과도 이 화학적 성질의 면에서는 커다란 상이가 확인되고, 흔히 제3표에서 알 수 있는 바와같이 페이퍼크로마토그래피의 R_f값에 있어서도 이들의 모든 항생물질과 다른점이 확실하다.

이상의 사실에서 포티마이신 C는 새로운 항생물질임이 확인되었다.

여기에 본 발명의 실시예를 보이겠다. 그러나 그것들이 본 발명을 특정범위에 국한시키지 않음을 밝혀둔다. 이때의 온도는 모두 섭씨임을 밝혀둔다.

[실시예 1]

A. MK-70주의 배양

균종으로는 마이크로모노스포라올리보아스테로스포라 MK-70(ATCC 21819)(미생물공업연구소 균주번호 제1560호)을 사용했고 제일종배지로는 글루코즈 2g/dl, 펩톤 0.5g/dl, 효모즙 0.5g/dl, 탄산칼슘 0.1g/dl(살균전 pH는 7.5)의 배지를 사용했다. 백금이를 사용하여 종균을 50ml의 대형시험관에 들어있는 위에서 말한 배지 10ml에 접종시켰고 그것을 섭씨 30°에서 5일간 배양시켰다. 이 종배양액 10ml를 250ml삼각프라스크에 들어있는 30ml의 제2종배지에 접종했다. 제2종배지의 조성은 제1종배지의 조성과 같았다. 제2종 배양은 섭씨 30°에서 2일간 진탕 배양했다. 이 종배양액 30ml를 조절판이 달린 2ℓ의 플라스크에 들어있는 300ml의 제3종 배지에 접종시켰다. 제3종 배지의 조성은 제1종배지의 조성과 같게 했다. 제3종 배양은 섭씨 30°에서 2일간 진탕 배양했다. 이러한 제3종 배지 1.5ℓ(플라스크 5개분)를, 30ℓ용량을 가진 스테인레스스틸로 만든 발효조에 들어있는 15ℓ의 제4종 배지에 접종했다.

제4종 배지의 조성은 제1종배지의 조성과 동일하게 했다. 이런 발효조에서의 배양은 섭씨 37°에서 2일간 공기를 통하여 교반하는 방식을 취했다(회전수 350rpm, 통기량 15ℓ/min). 또 제4종 배지액 15ℓ를 300ℓ의 용량을 가진 발효조에 들어있는 발효배지 150ℓ에 접종시켰다. 발효배지 조성은 가용성전분 4g/dl, 대두박 2g/dl, 옥수수침지액 1g/dl, K₂HP0₄, 0.05g/dl, MgS0₄, 7H₂0 0.05g/dl, 염화칼리 0.03g/dl, 탄산칼슘 0.1g/dl(살균전 pH 7.5)이었다. 발효조의 온도를 섭씨 37°로 유지하며 4일간 통기 교반시켰다(회전수 150rpm, 통기량 80ℓ/min).

B. 조제(粗製) 포티마이신 복합물의 분리

배양 종료후에 배양액에 농황산을 첨가하여 pH 2.5로 맞추고 30분간 교반한다. 또한 여과조제로는 라디오라이트^#600(소화화학공업 제조)을 약 7kg 가하고 균체를 통과시켰다. 여액에는 6N-가성소다를 가하여 pH 7.5로 만들었다. 이 여액을 양이온 교환수지, 암파라이트 IRC-50(암모니아형), 약 20ℓ로 충진된 칼럼을 통과시키며 유출액을 버렸다. 활성성분이 수지에 흡착되기 때문에 물로 수지를 세척한 후 0.5N-암모니아수로 흡착된 활성성분을 녹여냈다.

바실러스ㆍ섭틸리스 No. 10707의 한천평판을 써서 페이퍼 데스크법에 따라, 용출액의 활성을 측정했다. 이때의 활성부분을 합해서 감압하에서 약 1ℓ까지 농축시킨다. 계속해서 농축액을 음이온 교환수지로 다우엑스 1×2(0H형) 500ml를 충진시킨 칼럼에 통과시킨다. 그 다음으로 약 2ℓ의 물을 흘러보냈다. 이러한 조작으로 불순물이 제거되고 활성물질은 물에 녹아나오게 된다. 이 활성성분을 합하여 감압하에서 약 100ml까지 농축한다. 다시 농축액을 약 50ml의 활성탄산가루가 충진된 칼럼에 통과시킨다. 활성물질은 칼럼에 흡착되므로 물로 씻은 다음 유출액 및 씻은 물은 버리고 0.2N의 황산으로 칼럼을 용출시킨다. 용액을 바실러스, 섶틸리스에 의한 페이퍼데스크법으로 검출하고 활성성분을 모은다. 이 성분을 다우엑스 44(OH형) 수지에 통과시키고, 물로 활성성분을 용출시키고 재차 그 활성성분을 모은다. 이 활성성분을 농축시켜 약 50ml로 만든후 동결 건조시키면 포티마이신 복합체의 조분말을 얻을 수 있다. 이때 조분말의 수득량은 약 31g이 되며 활성은 570단위/mg이 된다(활성은 순수물 1mg을 1,000단위로 한다).

C. 포티마이신 C의 분리, 정제

전기한 B 공정에서 얻어진 조분말 10g을 실리카겔이 약 500ml 충진된 유리로 만든 칼럼의 상단에 두껍고 균일한 층이 되도록 넣는다. 시리카겔은 미리 클로로포름 : 이소프로판올 : 17%의 암모니아수(2 : 1 : 1, 용량비)의 용매로 현탁시키고, 굳고 균일한 층으로 충진시킨 다음 동일 용매로 잘 씻는다. 조분말을 충진시킨 다음 동일 용매를 상부에서부터 천천히 넣어주고 그다음부터는 정상적으로 매시 50 ml 정도의 유속으로 용리시킨다. 용출성분을 20ml씩 취하고 각 성분을 페이퍼데스크법에 따라 활성을 측정한다. 처음에는 포티마이신 B가 용출되어 그 다음에 포티마이신 A가 용출되어 나온다. 또다시 용출을 계속 시키면 포티마이신 C가 용출된다. 활성있는 함유물에 대한 페이퍼 크로마토그래피를 행하고 나서 포티마이신 C에 해당하는 성분을 가진 함유물을 모은다. 이 함유물을 감압하에서 농축하고 용매를 충분히 제거한 후에 소량의 물에 용해시키고 동결 건조시키면 포티마이신 C 유리염기 0.9g을 순수하게 얻을 수 있다. 이 물질의 활성은 약 980단위/mg이 된다.

[실시예 2]

종균으로는 실시예 1에 나타나 있는 것을 사용하여 종배지(제1종배지에서 제4종배지까지)도 실시예 1와 같은 것을 썼다. 생산배지로는 다음과 같은 조성의 것을 썼다. 즉 가용성전분 4g/dl, 건조분말효모 3g/dl, K₂PO₄, 0.05g/dl, MgS0₄, 7H₂O 0.05g/dl, 염화칼리 0.03g/dl, 탄산칼슘 0.1g/dl를 사용한 배지였다.

실시예 1과 동일한 조건에서 발효를 시켰고 실시예 1의 B항에 나타난 수법으로 포티마이신 복합물의 조분말을 분리시키니 활성이 약 650단위/mg인 조제 포티마이신 복합제를 약 63g 얻었다. 이 조분말 50g을 실시예 1의 C항과 같은 방법으로 정제시킨 결과 활성이 약 850단위/mg인 포티마이신 C가 약 7g 생겼다. 이것을 다시 정제하기 위해 셀루로즈칼럼크로마토그래피에 통과시킨다. 다시 말하면 셀루로즈분말(아비셀, 후나고시 약품 KK) 약 500ml가 충진된 유리로 만든 칼람의 상부에 위에서 말한 물질을 두껍고 균일한 층이 되도록 충진시킨다. 셀루로즈는 미리 n-부탄올; 초산 : 피리딘 : 물(6:2:4:4)의 혼합물로 현탁시키고 유리로 만든 칼럼에 굳고 균일한 층이 되도록 충진시키고 동일용매로 잘 씻는다. 이것을 충진시킨 다음에는 동일용매를 상부에서부터 천천히 넣어주고 그 다음부터는 정상적으로 매분 1ml 정도의 유속으로 용리시킨다. 용출시켜 나오는 용리액을 10ml씩 취하여 각 함유분을 페이퍼데스법으로 활성을 측정한다. 활성이 있는 함유분을 모아서 감압하에서 용매를 충분히 제거한 후 소량의 물에 녹여 동결 건조시킨다. 그 결과 포티마이신 C 유리염기의 순수물 3.5g을 얻으며 이것의 활성은 950단위/mg이다.

[실시예 3]

종균으로는 실시예 1에 나온것을 사용하고 종배지(제1종배지-제4종배지)도 실시예 1에 나타난 것을 사용한다. 생산배지로는 다음과 같은 조성의 것을 사용한다. 자세히 말하면 가용성전분 4g/dl, 카자미노산(카제인산의 가수분해를, 미국 DIFCO사 제조) 3g/dl, K₂HP0₄0.05g/dl) MgS0₄ㆍ7H₂O 0.05g/dl, 염화칼리 0.03g/dl, 탄산칼슘 0.1g/dl를 사용했다. 실시예 1에 나타난 것과 같은 조건에서 발효시켰다. 실시예 1에 방법과 같이 포티마이신 C의 분리, 정제를 하니활성이 980단위/mg인 정제물이 6.5g 생겼다.

[실시예 4]

실시예 1의 A항과 같은 식으로해서 얻은 배양액을 페이퍼크로마토그래피에 의해, 마이신 B가 극히 소량임을 확인하고, 실시예 1의 B항과 유사하게 처리했다. 이때 얻은 조분말 3g을 5ml의 물에 용해시켜, 카르복시메틸셀루로즈(암모니아형)를 약 200ml 가량 충진시킨 칼럼에 통과시켰다.

계속해서 약 1,OOOml의 물을 흘려 넣으니 활성성분이 카르복시메틸 셀루로즈에 흡착되었고 흡착되지 않은 대부분의 색소 및 무기염은 흘러나가 버렸다. 그런다음 0.2M-구연산ㆍ인산의 완충액(pH 3.0)으로 칼럼을 용출시켰다(이때의 유속은 약 50ml/시간이다). 용출되어 나오는 함유물을 1Oml씩 취하여 각 함유물에 대한 활성을 측정했다. 활성을 가진 함유물에 대한 페이퍼크로마토그래피를 시행하고 포티마이신 C에 해당하는 성분을 가진 함유물을 모았다. 이 함유물을 앰버라이트 CG-50(H형)에 통과시켜 활성성분을 흡착시켰다. 물로 수지를 세척한 다음 0.5N-염기로 용출시키고 활성을 가진 함유물을 모았다. 이 함유물을 다시 다우엑스 44수지(0H형)에 통과시켜 중화시킨 다음 활성함유물을 동결 건조하여 포티마이신 C의 유리염기를 약 350mg 얻었다. 이 물질의 활성은 약 985단위/mg이었다.

[실시예 5]

종균으로는 마이크로모노스포라, 오리보아스테로스포라 Mn 7 44, KY 11067주(미생물공업연구소 균주번호 제2139호, ATCC 31009호)를 썼고 제1종 배지 로는 글루코즈 2g/dl, 펩톤 0.5g/dl, 효모즙 0.3g/dl, 탄산칼슘 0.1g/dl(살균전 pH 7.2)의 배지를 썼다. 실시예 1에 나타난 것과 동일한 방법으로 종배양(제1종 배양-제4종 배양)을 행했다. 제2종 배지에서 제4종 배지까지의 조성은 전부 제1종 배지의 조성과 같았다. 이렇게 해서 얻어진 제4종배양액 150ℓ를 300ℓ크기의 스테인레스스틸로 만든 발효조에 들어있는 주발효배지 150ℓ에 접종시켰다. 주발효배지 조성은 가용성전분 2g/dl, 대두박 0.5g/dl, 글루코즈 2g/dl, 큰스팁액 1g/dl, 효모즙 1g/dl, K₂HPO₄0.05g/dl, MgS0₄ㆍ7H₂O 0.05g/dl, 염화칼리 0.03g/dl, 탄산칼슘 1g/dl(살균전 pH 7.0)인 것으로 배지를 썼다. 또 주발효배양은 섭씨 30°에서 4일간 통기 교반하며 행해졌다(회전수 150rpm 통기량 80ℓ/min), 이렇게 해서 얻어진 주발효액을 실시예 1의 B항에 나온 방식대로 포티마이신 복합제의 조분말을 분리시키면 활성이 약 560단위/mg인 조제 포티마이신 복합제를 약 42g 얻을 수 있다. 이 조분말을 실시예 1의 C항과 같은 방법으로 정제하면 활성이 약 980단위/mg인 포티마이신 C의 유리염기가 약 24g 얻어진다.

[실시예 6]

종균으로는 마이크로모노스포라ㆍ오리보아스테로 스포라, KY 11055주(미생물 공업연구소 균주번호 제2192호, ATCC 31010호)를 사용했다. 또 제1종 배지로는 글루코스 1%, 가용성전분 1g/dl, 효모즙 0.5g/dl, 펩톤 0.5g/dl, 탄산칼슘 0.1g/dl(살균전 pH 7.0)의 배지를 사용했다. 실시예 1과 같은 방법으로 종배양(제1종 배양에서 제4종 배양까지)을 행했다. 제2종 배지에서 제4종 배지까지는 조성이 모두 제1종 배지와 같았다. 이렇게해서 만든 제4종 배양액을 실시예 5와 같은 방법으로 주발효 배양을 실시했다. 주발효 배지 조성은 실시예 5의 것과 같은것을 사용했다. 이리하여 얻은 주발효 배양액을 실시예 1의 B항과 같은 방법으로 포티마이신 복합제의 조분말을 분리시키니 활성이 약 515단위/mg인 조제 포티마이신 복합제를 약 52g 얻었다. 이 조제 포티마이신 복합제 분말을 실시예 1의 C항과 같은 방법으로 정제하여 포티마이신 C 유리염기 약 5g을 얻었으며 이것의 활성은 약 990 단위/mg이었다.

[실시예 7]

종균으로는 마이크로모노스포라ㆍ오리보아스테로스포라 MK-70(미생물공업연구소 균주번호 제1560호)(ATCC 21819)를 사용했다. 실시예 1의 A항과 같은 방법으로 배양시켰다. 배양 종료후 배양액 150ℓ에 농황산을 첨가하여 pH 2.5가 되도록 하고 30분간 교반한다. 그런다음, 6N의 가성소다 용액을 가하여 배양액의 pH가 7이 되도록 한다. 이렇게하고 산처리를 행한 발효액에 앰버리이트 IRC-50(NH₄ ⁺형) 수지(미국 롬ㆍ앤드ㆍ하스회사 제조) 15ℓ를 넣고 30분간 천천히 교반한다. 그런후에 거친 여과포를 써서 수지를 걸러서 수지를 잘 씻은다음 내경이 15cm이고 높이가 17cm인 원통형의 칼람에 충진시킨다.

포티마이신 복합제는 이 수지에 흡착되기 때문에 이 칼람에 0.5N의 수산화암모늄 30ℓ을 통과시켜 항균활성을 가진 함유물, 포티마이신 복합체를 함유한 농축액 7ℓ를 얻을 수 있다. 이 농축액에는 포티마이신 C 이외에 포티마이신 A,B 등의 여러 종류가 미량으로 항균활성을 가진 부생물로써 존재하므로 이런 포티마이신 복합물에 대한 분리를 행해야 한다.

위에 말한 항균활성을 가진 농축액 7ℓ를 감압하에서 500ml까지 농축시켜 최종적으로 동결건조에 의해 포티마이신 복합제 4g을 얻었다. 이렇게 얻은 조분말을 클로로포름 : 메탄올 : 17%-암모니아수(2 : 1 : 1)의 하층부 50ml에 현탁시키고, 내경이 5cm 높이가 100cm인 원통형 칼럼에 충진시켜 놓은 셀루로즈 분말 칼람의 상부에 넣고, 같은 용매에서 전개시킨다. 전개용출되는 유출액을 일정량씩 나누어 취하고 각각의 함유물로 대한 항균활성 유무에 대해 페이퍼데스크법으로 측정한다. 함유물에 존재하는 성분에 대한 검사는 피검균으로 바티리스 섶틸리스 No. 10707을 사용한 바이오오토그래피를 사용한다. 이 셀루로즈칼럼크로마토그래피에 의해 포티마이신 복합제의 각 성분은 B, A, C의 순서로 용출되어 나온다. 포티마이신 함유물을 모아서 감압 농축시키면 포티마이신 C를 주성분으로 하는 조분말 125g이 백색의 부정형 분말형태로 생성된다. 이런 포티마이신 C를 주성분으로하는 조분말을 약 50ml의 물에 용해시킨 다음 묽은 염산으로 pH 7이 되도록 한다. 이 용액을 내경이 2cm이고 높이가 80cm이고 바이오렉스 70수지(NH₄ ⁺형 : 미국 바이오 랩 래버러터리회사 제조)를 충진시켜 놓은 유리로 만든 칼럼의 상단으로 통해주고 물로 잘 세척한다. 포티마이신 C를 주성분으로 하는 포티마이신 복합제는 이 수지의 윗부분에 흡착되고 불순물은 물에 씻겨 용출되어 나간다. 물로 세척한 후에 묽은 암모니아수(0.2N 이하)로 직선 농도구배법에따라 용출시킨다. 용출액을 일정량씩 취하여 각 함유분에 대한 페이퍼크로마토그래피를 행하면 마이신 C 이외의 성분 유무에 대하여 알수 있다. 이렇게 하여 얻은 마이신 C 이외의 성분에 대한 감압농축을 하고 최종적으로 동결 농축시키면 순수 마이신 C 유리염기 10.2g이 백색 부정형분말의 형태로 얻어진다. 이 마이신 C 유리염기는 활성이 1,000단위/mg이었다.

한편 이러한 마이신 C 유리염기 10g을 소량의 물에 녹이고 6N의 황산을 써서 pH를 4.5로 조절하고 동결 건조시키면 포티마이신 C 황산염 16.6g이 백색부정형 분말의 형태로 생성된다. 포티마이신 C 황산염은 600단위/mg의 역가를 가진다.

Claims (1)

1. 마이크로모노스포라 오리보아스테로 스포라(ATCC 21819)(ATCC 31009) 또는 (ATCC 31010)을 영양배지에 배양한 후 배양물중에서 항생물질 포티마이신 C를 생성케하여 배양물에서부터 항생물질을 채취함을 특징으로 하는 항생물질 포티마이신 C의 제조방법.

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