JPS637792A - 微生物によるｎ，ｎ′−ジアセチルキトビオ−スの製法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、微生物によるＮ、Ｎ−ジアセチルキトビオー
スの製法に関する。さらに詳しくは、本発明はＮ、Ｎ’
−ジアセチルキトビオース生産能を有する微生物を天然
界から分離し、これをキチンを含む培地に培養せしめ、
培養物からＮ、　Ｎ’−ジアセチルキトビオースを回収
することを特徴とするＮ、Ｎ’−ジアセチルキトビオー
スの製法に関する。

このＮ、Ｎ’−ジアセチルキトビオースはそれ自体試薬
として利用されるほか制癌剤、腸内有用細菌の生長因子
等の合成原料として有用な化合物である。

〔従来の技術〕

従来、Ｎ、Ｎ′−ジアセチルキトビオースの製造方法と
しては化学的方法が知られている。この製造方法は、か
にやえびの甲皮の構成多糖類であるキチンを原料として
、これを）；塩酸で４０℃１３時間分解し、活性炭カラ
ムクロマトグラフィーにより’ｉ、Ｎ’−ジアセチルキ
トビオース画分を分取し、精製する方法（Ｊ、Ａ、Ｒｕ
ｐｌｅｙ；Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ　ｅｔ　Ｂｉｏｐｈｙ
ｓｉ−ｃａ　Ａｃｔａ　　８３２４５〜２５５（１９６
４））である。

〔発明が解決しようとする問題点〕

従来の化学的方法によるＮ、Ｎ’−ジアセチルキトビオ
ースの製造においては、キチンを濃塩酸で分解するため
、その分解生成物はＮ−アセチルキトオリゴ糖の単量体
から七量体までの種々の化合物の混合物から成る。した
がって、この混合物からＮ、Ｎ’−ジアセチルキトビオ
ースを単離するためには数段の精製工程を経る必要があ
り、単離ロスや操作のわずられしさを伴うばかりでなく
、その収率が極めて低くなるのが常である。因みにこの
化学的方法においては、Ｎ、Ｎ４−ジアセチルキトビオ
ースの収率はキチン原料に対して７〜１３％である。

そして、本発明者らはこの点に注目して、微生物を用い
てＮ、Ｎ’−ジアセチルキトビオースを有利に製造する
方法を鋭意検討した結果、温泉地より分離した微生物が
キチンを分解してＮ、Ｎ−ジアセチルキトビオースのみ
を高い収率で生産することを見出し、本発明を完成する
に至った。

〔問題を解決するための手段〕

本発明は、バチルス属に属しＮ、Ｎ’−ジアセチルキト
ビオース生産能を有する微生物をキチンを含む培地で培
養し、培養物からＮ、Ｎ′−ジアセチルキトビオースを
採取することを特徴とする微生物によるＮ、Ｎ−ジアセ
チルキトビオースの製造方法である。

本発明で使用されるバチルス属に属するＮ、Ｎ’−ジア
セチルキトビオース生産能を有する微生物であるバチル
ス属Ｘ　−７ｕ　（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｐ、Ｘ−７ｕ
）は本発明者らが温泉地で分離した菌株であって、その
菌学的性質は次のとおりである。

（ａ）　　形態学的特徴 （１）細胞の形：桿状（湾曲はみられない）（２）細胞
の大きさ：　１．Ｏｘ２．Ｏ〜４．０　ｐｍ　（栄養寒
天斜面、５０℃、２４時間） 高温（５５℃）の液体培地で振盪す ると長さが１２μｍ程度まで延びて 鎖状につらなる傾向がある。

（３）運動性：あ　リ （４）鞭毛：周毛 （５）　　ダラム染色：陽　性 （６）胞子：楕円形、ｓｐｏｒａｎｇｉｕｍ　ｃｅｌｌ
を膨張させることはない。胞子はｓｐｏｒａｎｇ−ｉｕ
ｍ　ｃｅｌｌの中央に位置する。

（ｂ）　　培地における生育状態（栄養寒天平板、５０
’ｃ、２４時間） 集落二円状、偏平状、周縁は裂片状、乾いた表面をもつ
。

ｔｅｌ　　生理学的性質 （１）硝酸還元：陽性　ただし脱窒はみられない。

（２）アセトインの形成：陽　性 （３）カタラーゼ：陽　性 （４）炭水化合物から酸の形成ニゲルコース、アラビノ
ース、キシロースおよびマ ンニットから酸を形成するがガス は発生しない。

（５）　　エラグヨークテスト：わずかに陽性（６）デ
ンプンの分解：陽　性 （７１ＮａＣ１の耐性＝７％を含む培地で生育が可能。

（８）生育温度：５５℃で生育が可能、６０℃では生育
せず。

（９）その他；グルコースを含む培地で嫌気条件下で生
育する。

以上の菌学的性質に基づいて型苗をバージエイ・マニア
ル・オブ・デイタミネイテ、イブ・バクテリオロジー第
８版で検索すると、本菌はバチルス・リケニフォルミス
（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）に
近縁の種とするのが妥当であると考えられる。このバチ
ルス属Ｘ−７ｕは工業技術院微生物工業技術研究所に微
工研菌寄第８８１０号（ＦＥＲＭ−Ｐ魚８８１０）とし
て寄託されている。

本発明で使用される微生物は上記バチルス属Ｘ−７ｕに
限られるものでなく、バチルス属に属する微生物であっ
て、Ｎ、Ｎ４−ジアセチルキトビオース生産能を有する
微生物であればいずれでも良く、また、それらは自然界
から分離した菌、寄託機関から人手可能な菌或いはＮ、
Ｎ’−ジアセチルキトビオースの生産性を高めるため変
異させた菌株等のいずれの菌株も使用できる。

本発明で使用されるキチンはかにやえびの殻から分離し
たものが用いられ、例えば、くるまえびの殻を希塩酸、
希アルカリで処理して得られるキチンを３０℃で濃塩酸
に溶解後、多量の水に分散させたコロイド状キチンが用
いられる。このコロイド状キチンはキチンが部分加水分
解されたもので、Ｎ−アセチルキトオリゴ糖の六量体以
上のものの混合物である。このコロイド状キチンの濃度
は０．８〜４．０讐／Ｖ％が適当であるが、特に０．８
〜１．６Ｗ／Ｖ％が好ましい。窒素源としては硫酸アン
モニウム、硝酸アンモニウム等の無機化合物およびコー
ンスチープリカー、酵母エキス等の有機窒素化合物がと
もに使用できるが、特に酵母エキスが好ましい。

無機塩としてはＮ　ａ　ｚ　ＨＰ　Ｏｅ　’　１２　Ｈ
２０＋　Ｋ　Ｈ２Ｐ　Ｏａ　＋　Ｎ　ａ　Ｃｌ　。

ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ，Ｃａ（４２・２Ｈ２Ｏが用いら
れる。

培地のｐＨは５〜１０、好ましくは７〜９であり、培養
温度は４０℃以上６０℃未満であって、特に５０℃が望
ましい。本発明では培養温度が５０℃と比較的高い温度
であるため、培地が雑菌で汚染されることがなく、また
、比較的短時間で生産物が得られる利点がある。

培養は、バチルス属Ｘ−７ｕを菌体濃度が１０８ｃｅｌ
ｌ／ｍ　ｌとなるように接種して回転振盪培養法又は通
気攪拌培養法により行なわれる。上記条件下で培養する
と型苗は良好に生育し、培地中にＮ、　Ｎ’−ジアセチ
ルキトビオースを蓄積する。そして、その蓄積量は、２
，５〜３．４　ｇ／　ｌであり、収率は添加したキチン
に対して３０〜４０％である。

培養終了後、遠心分離により菌体を除去し、得られる上
澄液を、第１表に示す分析条件により、高速液体クロマ
トグラフィー（ＨＰ　Ｌ　Ｃ）にかけて分析した。

以下余白 第　　　１　　　表 カラム　　　　　　　５ｈｏｄｅｘ　　ＫＳ８００Ｐ　
＋　ＫＳ８０２カラム温度　　　　　　５０℃ 圧力　　　　　　　　　２０ｋｇ／ａＩ！溶融液　　　
　　　　　蒸留水 流速　　　　　　　　　０．２−／ｍｉｎ検出機　　　
　　　　　高感度示差屈折計感度　　　　　　　　　×
１ 検出機温度　　　　　　３５℃記 録紙速度　　　　　　１５０　ｔｍ／時間上記の分析の
結果を第１図に示す。

なお同図において、各符号の表す事項は以下のとおりで
ある。

Ａ：Ｘ−７ｕ　　５０℃　３０時間培養（５１ジヤーフ
アメンター使用）の培養液。

Ｂ　：　Ｊ、Ａ、ＲｕρＩｅｙの方法に準じて化学的に
調製したＮ−アセチルキトオリゴ糖の単量体から６量体
の混合物。ただし５量体と６量体はこの条件では分離不
能。

ｃｌ：Ｎ−アセチルグルコサミン（単量体）ａｘ　　：
Ｎ＋Ｎ−ジアセチルキトビオース（二量体）第１図に示
す分析結果により、培地中のキチン分解物としてＮ、Ｎ
−ジアセチルキトビオースと少量のＮ−アセチルグルコ
サミンが存在し、３量体以上のＮ−アセチルキトオリゴ
糖の生成が認められなかった。即ち上記結果は、本発明
の方法は実質的にＮ、Ｎ−ジアセチルキトビオースのみ
を選択的に産出することを示している。

このようにして得られた上澄液を活性炭を充填したカラ
ムに通し、その内容物を活性炭上に吸着させる。このカ
ラムに最初５％エタノール水溶液を通し無機塩、Ｎ−ア
セチルグルコサミン等の不純物を）容出させ、次いで１
０％エタノール水？容液を通してＮ、Ｎ’−ジアセチル
キトビオースを溶出させる。

この操作をくり返してＮ、　Ｎ’−ジアセチルキトビオ
ースを精製する。第２図に本発明の上記方法で精製した
Ｎ、　Ｎ’−ジアセチルキトビオースと従来法であるＲ
ｕｐｌｅｙの方法によって化学的に調製したキトビオー
ス各０．５％水溶液のＨＰＬＣによる結果をそれぞれＣ
及びＤの符号で示す。これによりＨＰＬ　Ｃの保持時間
及びピーク高さがほぼ同じであることがわかる。さらに
、第３図に上記の本発明法と従来法で調製したＮ、Ｎ−
ジアセトキシキトビオースの赤外線吸収スペクトルを第
２図と同様にそれぞれＣ及びＤの符号で示す。

実験例１　培地組成の検討 第２表の各培地成分を組み合せて８種類の培地を調製し
た。この培地５０．ｎｌを２００Ｉｒ１１三角フラスコ
に入れ、バチルス属Ｘ−７ｕを１０’ｃｅｌｌ／ｍｌと
なるように接種し、５０℃で４２時間振盪回転培養した
。

結果を第３表に示す。

第２表　バチルス属Ｘ−７ｕのための基本培地０．８Ｗ
／Ｖ％コロイド状キチン水ｉ＄１　１０００ｎｄ　　・
・・■Ｎａ、ｌｌＰＯ４−１２Ｈ２０３，４ｇ　”’■
ＫＨ２ＰＯ４，Ｉｇ　　・・・■ Ｎｌ１ｔＮ（ｈ　　　　　　　　　　　　　　　２ｇ　
　・・・■ＮａＣｊ２　　　　　　　　　　　　　　　
０．５　ｇ　・”０ＭｇＳＯ４・ＩＨｚＯＯ，５ｇ・・
・■ＣａＣｊｌ！　ｚ・２Ｈｚｏ　　　　　　　　　　
　　　Ｏ，１ｇ　−■酵母エキス（Ｄｉｒｃｏ）　　　
　　　　　　　Ｉｇ　　・・・■ポリペプトン（大玉栄
養化学）　　　　１ｇ　・・・■（ｐＨ８，４） この結果において、培地Ｂと培地Ｃ或いは培地Ｅと培地
Ｆとを比較すると明らかな通り、酵母エキスの添加によ
りＮ、Ｎ’−ジアセチルキトビオース（ＯＮＡＣ２）の
収率が大幅に増力口することが判る。

また培地Ｃと培地りとの比較により無機窒素はそれほど
必要としないことが判る。培地りと培地Ｇの結果からは
ＮａＣＩ！　、　ＭｇＳＯ４・７ＨｚＯ及びＣａＣＥ　
２・２Ｈ２０の各成分も添加効果があり、重要な成分で
あることが判る。他方、培地Ｇと培地Ｈとの結果は、過
剰な栄養がＮ、Ｎ−ジアセチルキトビオースの生成量を
逆に減少させることを示している。

第３表　培地組成とＧＮＡｃ２の収率との関係以上のこ
とから、バチルス属Ｘ−７ｕを培養するための好ましい
基本培地として第４表の培地組成を採用した。

０、８Ｗ／Ｖ％コロイド状キチン水溶液　１０００ｄＮ
ａｚＨＰＯｔ　−１２ＨｚＯ３，４ｇＫＨ２ＰＯ，、１
，０ｇ ＮＨ４Ｎ０ｆｆ　　　　　　　　　　　　　　　　　２
．０　ｇＮａＣ１０，５ｇ ＭｇＳＯａ・７１１□０　　　　　　　　　　　　　　
０．５ｇＣａＣＥ　ｚ・２１１ｚ０　　　　　　　　　
　　　　０．１　ｇ酵母エキス（Ｄｉｆｃｏ）　　　　
　　　　　　１．０　ｇ（ｐＨ８，４） 実験例２　培養液のキチン、・農度の影害第４表の組成
から成るバチルス属χ−７ｕの基本培地において、コロ
イド状キチンの濃度を０．８Ｗ／Ｖ％から４．８Ｗ／Ｖ
％まで変化させ、この培地を２００ｍ１三角フラスコに
入れバチルス属Ｘ−７ｕを１０８ｃｅｌｌ／−となるよ
うに接種し、４８時間培養後、生成したＮ、Ｎ’−ジア
セチルキトビオース（ＧＮＡＣ２）の量を比色による還
元＋）Ｍ　９ｔ　　（Ｓｃｈａ　ｌｅｓ法の変法）で測
定した。結果を第５表に示す。この表において、コロイ
ド状キチンの濃度は０．８Ｗ／Ｖ％〜４．０Ｗ／Ｖ％が
適当であるが特に０．８〜１．６Ｗ／Ｖ％がＮ、Ｎ’−
ジアセチルキトビオースの収率において好ましい結果を
もたらすことを示している。

実験例３　培養液のｐＨの影響 第４表の基本培地において、そのｐＨを４〜１２に変化
させたものを調製する。その培地５０ｍ／を２００−三
角フラスコに入れ、バチルス属Ｘ−７ｕを１ｏｓｃｅ１
１／−となるように接種し、５０℃で振幅２．５ｃｍ。

１５０ｒρｍで３８時間回転振盪培養した。結果を第６
表に示す。

以下余白 第６表　初発ｐ）Ｉと生成したにＮＡｃ２の濃度との関
係第６表の結果から培養液の最初のｐｌ＋が５．０〜１
０．０においてＮ、Ｎ’−ジアセチルキトビオースの蓄
積が認められ、特にｐｌ（７〜９において、蓄積量が３
ｇ／２以上となり、このｐＨ範囲が好ましい範囲である
ことを示している。

実験例４　バチルスｆｉｘ−７ｕの菌体濃度の検討 第４表に示す培地組成を持つ培地５０−を２００　ｍ／
三角フラスコに入れ、バチルスａＸ−７ｕの菌体濃度が
それぞれ、１．５Ｘ１０９ｃｅ１１／ａＪ、１．５Ｘ１
０”ｃｅｌｌ／−及び１．５　Ｘ　１０’ｃｅｌｌ／−
となるように接種し、５０℃で培養してＮ、Ｎ’−ジア
セチルキトビオース（Ｇ　Ｎ　Ａｃ　２　）の蓄積量を
調べた。結果を第６表及１”４図°°１ｔ・　　　　　
　　　以工余白この結果から、菌体濃度が１．５　Ｘ　
１０８ｃｅｌｌ／−のとき培養時間４１時間でＮ、Ｎ−
ジアセチルキトビオースの蓄積量が３．４ｇ／ｊ！（収
率４０％）と最問に達している。他方、菌体濃度が１．
５　Ｘ１０’ｃｅ１１／−のときは蓄積量が少なく、１
．５　Ｘ　１０９ｃｅｌｌ／−のときは生成したＮ、Ｎ
’−ジアセチルキトビオースが分解して蓄積量がゼロに
なっている。したがって、バチルス属Ｘ−７ｕの好まし
い菌体濃度を１０”　ｃｅｌｌ／ｄに設定した。

次に本発明の実施例を示す。

実施例１ 肉エキス１．０％、ペプトン１．０％、食塩０．２％の
組成を有するｐＨ８，４の肉エキス培地２００　ｍＺを
殺菌後５００ｍ１三角フラスコに入れる。この培地にバ
チルス属Ｘ−７ｕ菌株を１白金耳接種し、５０℃で２２
時間回転振盪培養する。この培養液を４℃、１０゜００
０Ｘｇで１０分間遠心分離して菌体を集める。フラスコ
４本分の菌体をＭ／１５リン酸緩衝液５０−に懸濁して
種菌を調製する。

次に、第４表の組成を有する０、８％コロイド状キチン
培地３．５１に上記種菌懸濁液５０．ｎｌを接種する。

この培養液の菌体濃度は１０８ｃｅｌｌ／ｍＩである。

なお、上記コロイド状キチン培地において、コロイド状
キチンは、くるまえびの殻を希塩酸、希アルカリで処理
して得られたキチンを３０℃で濃塩酸に溶解し、次いで
、この溶解液を多量の水に再沈させたものであってＮ−
アセチルキトオリゴ糖のへ量体以上のものを含むもので
ある。

この培養液を温度５０℃、振動数２００ｒｐｍ、通気量
３７！／ｍｉｎで２５時間培養し、Ｎ、Ｎ−ジアセチル
キトビオース３．２　ｇ／　ｌを含む培養液を得た。Ｎ
、　Ｎ’−ジアセチルキトビオースの収率はキチンに対
し４０％である。

実施例２ 実施例１で得られた培養液３．５７！を４℃１１０，０
００Ｇで１０分間遠心分離する。上澄液を活性炭（和光
純薬（株）製のクロマドクラフ用のもの）５００　ｇを
充填したカラム（９ｃｍ　Ｘ　５０ｃｍ）に通し、上澄
液中の成分を吸着させた。このカラムに５％エタノール
水溶液８１を流速１５〜１７ｍ／／ｍｉｎで通し、１分
画５００　ｎ、１づつ分取し、無機塩、Ｎ〜ルアセチル
グルコサミンどの不純物を溶離させた。続いて１０％エ
タノール水溶液を流速１５〜１７ｍ１／ｍｉｎで通して
Ｎ、Ｎ’−ジアセチルキトビオース画分を集め、エバポ
レーターでエタノール及び水分を除去し粉末化した。

このＮ、Ｎ−ジアセチルキトビオースを蒸留水に溶かし
、再度、活性炭２５０　ｇを充填したカラム（５，５（
至）Ｘ５Ｑｃｍ）に通し、Ｎ、Ｎ′−ジアセチルキトビ
オースを精製した。この結果、培養液３．５Ｐから純度
がほぼ１００％のＮ、　Ｎ’−ジアセチルキトビオース
４゜８３ｇを得た。

〔発明の効果〕

本発明によれば、キチンからＮ、Ｎ−ジアセチルキトビ
オースのみが選択的かつ高収率で製造される。そして、
バチルス属Ｘ−７ｕの培養温度が５０℃と比較的高い温
度であるため培地が雑菌で汚染されにくく、かつＮ、Ｎ
−ジアセチルキトビオースが短時間で製造される。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明の培養上澄液のＨＰＬＣによる結果を示
す。 第２図は本発明の方法と従来法ＮＩＮ’−ジアセチルキ
トビオースの０．５％水溶液のＨＰＬＣによる結果を示
す。第３図は本発明で調製したＮ、Ｎ’−ジアセチルキ
トビオースと化学的方法（従来法）により調製したＮ、
Ｎ−ジアセチルキトビオースの赤外線吸収スペクトルを
示す。第４図はバチルス属Ｘ−７ｕの菌体濃度が１．５
　Ｘ　１０’ｃｅｌｌ／−のときのＮ、Ｎ−ジアセチル
キトビオースの生成量と培養時間の関係を示す。 特許出願人　株式会社　加　ト　吉 代理人　弁理士　平　木　祐　輔 第１図 キチンの×−７ｕ培養液（Ａ）及び化学的分解液（Ｂ）
のＨＰＬＣｏ　　　１０　　２０　　３０　　４０　　
５０保狩時間（分） 第２図 保ｎ時間（分）

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. （１）バチルス属に属しＮ，Ｎ′−ジアセチルキトビオ
   ース生産能を有する微生物をキチンを含む培地で培養し
   、培養物からＮ，Ｎ′−ジアセチルキトビオースを採取
   することを特徴とする微生物によるＮ、Ｎ’−ジアセチ
   ルキトビオースの製法。
2. （２）微生物がバチルス属Ｘ−７ｕであることを特徴と
   する特許請求の範囲第１項記載の微生物によるＮ，Ｎ′
   −ジアセチルキトビオースの製法。
3. （３）培養を４０℃以上６０℃未満、好ましくは５０℃
   で行うことを特徴とする特許請求の範囲第１項記載の微
   生物によるＮ，Ｎ′−ジアセチルキトビオースの製法。
4. （４）培養をｐＨ５〜１０、好ましくは７〜９で行うこ
   とを特徴とする特許請求の範囲第１項記載の微生物によ
   るＮ，Ｎ−ジアセチルキトビオースの製法。