JPS589679B2

JPS589679B2 - 抗生物質の製造法

Info

Publication number: JPS589679B2
Application number: JP2008077A
Authority: JP
Inventors: 金高一彦; 片本和義; 北野一昭
Original assignee: Takeda Chemical Industries Ltd
Current assignee: Takeda Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1977-02-24
Filing date: 1977-02-24
Publication date: 1983-02-22
Also published as: JPS53104796A

Description

【発明の詳細な説明】本発明は、新菌種ストレプトミセス・カツラハマヌスを
用いる次式で示されるクラバラン酸（Ｉ）の製造法に関
するものである。

クラバラン酸は、（Ｉ）式で示される化合物であって、
ごく最近コールらによって、ストレプトミセス・クラバ
リゲルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｃｌａｖｕ−
１ｉｇｅｒｕｓ）の培養物から単離され（コー−ルら
；公開特許公報特開昭５０−１４２７８９およびジャー
ナル・オブ・アンテイバイオテイツクス，第２９巻，６
６８頁，１９７６年に記載）、β−ラクタマーゼ阻害物
質として注目されている化合物である。

本物質は、それ自身、ダラム陽性および陰性菌に対し、
抗菌活性を有し、感染症の治療に用いられうる他、その
β−ラクタマーゼ阻害作用を利用して、ペニシリンやセ
ファロスポリン類と併用スることによって、ペニシリン
やセファロスポリン類の抗菌活性を増大させることがで
きる。

また、本化合物は、新しい半合成β−ラクタム化合物の
出発原料となりうろことも予想され、極めて重要な化合
物である。

しかるに、その生産は、ストレプトミセス・クラバリゲ
ルスの１菌株ＮＲＲＬ３５８５について知られているに
すぎず、その生成量も、工業的に必ずしも十分なもので
はない。

本発明者らは、新規なβ−ラクタム抗生物質を生産する
微生物を得る目的で鋭意スクリーニングを続けている過
程で、高知市の土壌より分離された１菌株Ｔ−２７２株
が、極めて著量のβ−ラクタム化合物を生産することを
見出し、そのβ−ラクタム化合物を結晶として単離し、
その理化学的性状を調べたところ、本化合物は、クラバ
ラン酸（Ｉ）と全く一致することが明らかになった。

一方、生産菌Ｔ−２７２株の菌学的性状について種種検
討を加えたところ、本菌はストレプトミセス属に属する
が、公知のいずれの種にも属さない新菌種の微生物であ
ることを見出し、この新菌種をストレプトミセス・カツ
ラハマヌスと命名した。

これらの知見に基づきさらに研究した結果、本発明を完
成するに至った。

すなわち、本発明は、新菌種ストレプトミセス・カツラ
ハマヌスを培地に培養し、クラバラン酸を生成蓄積せし
め、培養物からクラバラン酸を採取することを特徴とす
る抗生物質の製造法である。

以下に、Ｔ−２７２株の分類学的諸性質を列記し、この
株がストレプトミセス属の新菌種に属するものであるこ
とを明らかにする。

Ｔ−２７２株の菌学的性状ａ）形態学的特徴気菌糸は比較的長く伸長し、単軸分岐する。

その先端の形態は一般にオープンスパイラル状であるが
、培地によっては曲状またはループ状も含まれる場合が
ある。

胞子鎖は１０個以上の胞子よりなり、その形は、楕円体
ないし短円筒状で、大きさは０，６〜０．８Ｘ０．９〜
１．２μ，表面構造は平滑状である。

鞭毛胞子，胞子のうの形成は認められない。

ｂ）各種培地における生育状態Ｔ−２７２株の各種培地における生育状態を表１に示す
。

Ｃ）生理的性質１）生育温度至適温度は２５〜２８℃で、３７℃では生育しない。

２）生育ｐＨｐＨ６〜１０で生育，至適ｐＨは８〜９ｏ３）ゼラチン
の液化：陽性４）デンプンの加水分解：陽性（中程度）５）脱脂牛乳
の凝固，ペプトン化：凝固せず，ペプトン化する。

６）硝酸塩の還元：陰性７）メラニン様色素の生成：陰性８）セルロースの加水分解：陰性ｄ）炭素源の利用性プリドハム・ゴドリーブ寒天培地で調べた結果を表２に
示す。

ｅ）細胞壁構成々分：Ｌ，Ｌ−ジアミノピメリン酸を含
む。

注；＋：利用する（発育する），−：利用せず（発育せ
ず）以上の性状からＴ−２７２株は、まずストレプトミセス
属に属していることは明らかである。

ワックスマン著，ザ・アクチノミセテス（ＴｈｅＡｃ
ｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｓ）第２巻（１９６１年），シャ
ーリングおよびゴットリーブのＩＳＰ（インターナショ
ナル・ストレプトミセス・プロジェクト（Ｉｎｔｅｒ
ｎａｔｉｏｎａｌＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓＰｒｏ
ｊｅｃｔ））報告（インターナショナル・ジャーナ
ル・オブ・システマテイツク・バクテリオロジー（Ｉ
ｎｔｅｒｎａｔ−ｉｏｎａｌＪｏｕｒｎａｌｏｆ
ＳｙｓｔｅｍａｔｉｃＢａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ）＞
第１８巻６９頁，２７９頁（１９６８），同第１９巻，
３９１頁（１９６９），同第２２巻，２６５頁（１９７
２））およびバージーズ・マニュアル・オブ・デターミ
ネイティブ・バクテリオロジー（Ｂｅｒｇｅｙ’ｓ
ＭａｎｕａｌｏｆＤｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｖｅＢａ
ｃｔｅｒｉｏ１ｏｇｙ）第７版（１９６１），第８版
（１９７４）およびその後報告された放線菌の新種発表
文献の中から検索すると、Ｔ−２７２株のように、気菌
糸が灰青色ないし灰緑色で、胞子鎖がらせん状，胞子表
面が平滑である菌種は、極めて少ないが、Ｔ−２７２株
とやや類似するものとしては、ストレプトミセス・アマ
クサエンシス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓａｍａｋ
ｕｓａｅｎｓｉｅＮａｇａｔｓｕｅｔａｌ）（ジ
ャーナル・オブ・アンテイビオテイツクス（Ｊｏｕｒ
ｎａｌｏｆＡｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ）シリーズＡ
・第１６巻，２０７頁（１９６３）およびストレプトミ
セス゜トサエンシス（Ｓｔｒｅｐｆｏｍｙｃｅｓｔ
ｏｓａｅｎｓｉｓＫｏｕｎｅｅｔａｌ）（特許
公報特公昭４９−１８７１）があげられる。

Ｔ−２７２株の性状をこれら２株の原記載と比較すると
ともに、さらにストレプトミセス・アマクサエンシス
ＩＳＰ５２１９（ＩＦＯ１２８３５）およびストレプト
ミセス・トサエンシスＦｅｒｍＰ−６０１とＴ−２７２
株とを同一条件下で培養して性質を比較した。

Ｔ−２７２株とこれら２菌種との主な相違点を表３にま
とめた。

これによると、ストレプトミセス・アマクサエンシスと
は、気菌糸の形態が明らかに異なり、さらに、本菌がメ
ラニン様色素を形成するのに対し、Ｔ−２７２株は、メ
ラニン様色素を形成しない点から明確に区別された。

また、ストレプトミセス・トサエンシスとも、気菌糸の
形態が明らかに異ななること、および炭素源の利用性が
全く異なる点さらに、硝酸塩の還元性の点でも異なり明
らかに別種の菌種と考えられる。

さらに、従来、クラバラン酸を生産することが知られて
いるストレプトミセス・クラバリゲルスＮＲＲＬ３５
８５（ヒゲンス・カストナー，インターナショナ
ル・ジャーナル・オブ・システマテイツク・バクテリオ
ロジー，第２１巻３２６頁（１９７１））とも比較した
が、ＮＲＲＬ３５８５株の場合には気菌糸の形態に特徴
があり、直・曲状で、短い根棒状の数個の胞子よりなる
側枝が形成される。

これに対して、Ｔ−２７２株は、オープンスパイラル状
であり、したがって全く異なる種に属することは明らか
である。

以上の事実から、Ｔ−２７２株はストレプトミセス属の
既知菌種のいずれにも属さず、新菌種と認められ、本菌
が分離された土壌の採取地にちなんで、ストレプトミセ
ス・カツラハマヌス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ
Ｋａｔｓｕｒａｈａｍａｎｕｓ）と命名された。

Ｔ−２７２株は、財団法人発酵研究所および工業技術院
微生物工業技術研究所に、ＩＦＯ−１３７１６，ＦＥＲ
Ｍ−ＰＮｏ−３９４４としてそれぞれ寄託されている。

ストレプトミセス・カツラハマヌスの性状は、上記の通
りであるが、本発明においては、ストレプトミセス・カ
ツラハマヌスに属する株はすべて使用することができる
。

また、放線菌とりわけストレプトミセス属に属する微生
物の諸性質は一定なものではなく、自然的にあるいは人
工的に容易に変異することは周知のことであり、本菌種
の場合もその例外ではなく、たとえば紫外線，エックス
線，放射線照射，薬品（例、亜硝酸ナトリウム，Ｎ−メ
チル−Ｎ′−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジンなど）処
理などの人工的変異手段で容易に変異しうるものであり
、このような変異株であっても、クラバラン酸生産能を
有するものはすべて本発明の方法に使用することができ
る。

本菌の培養に際しては、培地中に炭素源として、たとえ
ばグルコース，シュークロース，マルトース，スターチ
，グリセリン，デキストリン，水あめ，糖密，油脂類（
例、大豆油，オリーブ油など），アルコール類（例、エ
タノール），有機酸類（例、コハク酸，リンゴ酸など）
など菌が資化しうるものが適宜用いられる。

窒素源としては、たとえば大豆粉，コーン・ステイープ
・リカー，綿実粉，肉エキス，ペプトン，尿素，乾燥酵
母，酵母エキス，アンモニウム塩類（例、硫酸アンモニ
ウム，塩化アンモニウムなど），硝酸塩類（例、硝酸ソ
ーダ，硝酸アンモニウムなど）などが有利に使用される
。

無機塩としては、たとえば炭酸カルシウム，塩化ナトリ
ウム，塩化カリウム，リン酸カリウム，硫酸マグネシウ
ムなどが挙げられ、さらに、菌の発育を助けクラバラン
酸の生産を促進する有機または無機の化合物（例、ビタ
ミン類，核酸塩基類，アミノ酸類など）などを適宜添加
してもよい。

培養は、液状でも固状でもよく、また液状の場合、静置
あるいは振盪培養のいずれでもよいが、好気的条件下に
深部培養するのが一般に有利である。

又培養温度はおよそ１８°〜３５℃の範囲が望ましく、
培地のｐＨは約５〜１０、好ましくは約７〜９の範囲で
、およそ２４〜２４０時間培養するのが好ましい。

生成したクラバラン酸の大部分は培養ｒ液中に存在する
ので、通常培養物を遠心分離あるいは炉過して菌体を除
去した液体部分からこれを採取するのがよい。

クラバラン酸の採取には、微生物の生産する代謝産物を
採取するのに通常用いられる手段が適宜に利用されうる
。

すなわち、イオン交換樹脂，活性炭，セルロース，シリ
カゲル，非イオン性ポーラスポリマーなどを用いるクロ
マトグラフイー，ゲル炉過法，溶媒抽出法などを組合せ
ることにより、有利に所期の目的を達することができる
。

なお、クラバラン酸の検出，定量には、電気泳動，薄層
クロマトグラフイーまたはペーパークロマトグラフイー
で分別後、被験菌に対する抗菌力を測定する方法、また
はβ−ラクタマーゼ阻害活性を調べる方法（コールら、
特開昭５０−１４２７８９）が用いられる。

またクラバラン酸の同定には元素分析，核磁気共鳴スペ
クトル，赤外線吸収スペクトル，紫外部吸収スペクトル
，ろ紙電気泳動および薄層クロマトグラフイーなどが用
いられる。

クラバラン酸はかかる操作を組合せることにより遊離あ
るいはその塩、たとえばナトリウム，カリウム，リチウ
ムなどのアルカリ金属塩，カルシウム，マグネシウムな
どのアルカリ士類金属塩として採取される。

本発明は、前記したように、新菌種ストレプトミセス・
カツラハマヌスを用いることにより、極めて著量のクラ
バラン酸を生成蓄積せしめることができるので、工業上
有利な方法である。

以下に実施例をもってさらに詳細に本発明の内容を説明
するが、これによって本発明が限定されるものではない
。

実施例１グルコース３％，コーンスターチ３％，棉実粉１％，大
豆粉０．５％，酵母エキス０．５％，ポリペプトン０．
５％，コーン・ステイープ・リカ−０．５％および炭酸
カルシウム１％からなる種培地３０ｍｌを２００ｍｌ容
三角フラスコに分注、滅菌後、これにストレプトミセス
・カツラハマヌスＴ−２７２（ＦＥＲＭ−ＰＮｏ３９４
４）を一白金耳づつ接種し、回転式振盪培養機上で２８
℃３日間培養した。

この種培養物を、２００ｍｌ容三角フラスコに、綿実粉
（プロフロ（ＴｒａｄｅｒｓＯｉｌＭｉｌｌＣｏ
．米圃製））２％，大豆粉２％および表４に示す種類お
よび量の炭素源を添加した組成の培地（ｐＨ６．５）
３０ｍｌを入れ、滅菌、冷却した醗酵培地にＬ５ｍ
ｌ宛接種し、回転式振盪培養機上で２８℃で培養し、５
日目に培養物を取り出し、遠心分離にて菌体を除いた上
澄液について、クラバラン酸の生成量を調べ、表４に示
す結果を得た。

実施例２グルコース３％，コーン・スターチ３％，棉実粉１％，
大豆粉０．５％，酵母エキス０．５％，ポリペプトン０
．５％，コーン・ステイープ・リカ一〇．５％および炭
酸カルシウム１％からなる種培地５００ｍｌを２ｌ容坂
口フラスコに分注し、滅菌後これにストレプトミセス・
カツラハマヌスＴ一２７２（微工研申請書受理番号第
３９４４号）の１斜面培養を接種し、往復式振盪培養機
上で２８℃、３日間培養した。

別にステンレス製５０ｌ容発酵槽に、グルコース３％，
コーンスターチ３％，棉実粉１．５％および大豆粉１．
５％からなる培地（ｐＨ６．５）３０１を仕込
み、常法により滅菌冷却した。

これに上記種培養液を無菌的に接種し、２８℃で通気撹
拌培養（通気毎分３０ｌ，撹拌毎分２８０回転）した。

９０時間培養後、培養物をとり出し、炉過によって菌体
を除き、培養沖液２５７を得た。

このＰ液中には、１１５０μｇ／ｒｕｌのクラバラン酸
が含まれていた。

この沖液を強塩基性アニオン交換樹脂アンバーライト■
ＲＡ−４０２（ロームアンドハース社，米国）Ｃｔ
型６ｌを充填したカラムに通液しクラバラン酸を吸着さ
せる。

吸着後１５７の水で水洗し０．５Ｍ食塩水で溶出す
る。

クラバラン酸を含む区分１５７を２ｌの活性炭カラムに
通液する。

通液後５ｌの水で水洗した後７％ブタノール水で溶出し
、クラバラン酸を含む区分５ｌ（水洗液及び溶出液）を
集め濃縮する。

濃縮液を３ｌのセルロースカラムに通し、７５％プロパ
ノール水で展開し、クラバラン酸区分を濃縮する。

次いでこの濃縮液を１ｌのセファデツクスＧ−１５（フ
ァルマシア社製）でゲル炉過精製した後、活性炭５００
ｍｌに吸着させ１０％メタノール水で溶出する。

クラバラン酸を含む区分を集め苛性ソーダ溶液でｐＨ７
．０に中和した後、濃縮し、濃縮液にエタノールを滴下
して冷保すると結晶が析出する。

これを炉取乾燥し２．３ｇの結晶を得た。

この結晶母液より同様にして更に１．１ｇの第二結晶を
得た。

別にストレプトミセス・クラバリゲルスＮＲＲＬ−３５
８５を用い、コールらの方法に従って調整したクバラン
酸ナトリウムとストレプトミセス・カツラハマヌスＴ−
２７２株より上述の様にして得られた結晶とを比較した
ところ、それらの抗菌スペクトル，元素分析値，赤外線
吸収スペクトル（ＫＢｒディスク，第１図参照），核磁
気共鳴スペクトル（Ｄ，２０，６０ＭＨｚ，第２図参
照），薄層クロマトグラフイーおよび電気泳動的挙動等
全ての理化学的性状が一致した。

【図面の簡単な説明】

第１図は、ストレフトミセス・カツラハマヌスＴ−２７
２の培養物から得られたクラバラン酸ナトリウムの赤外
線吸収スペクトル（ＫＢｒ法）を、第２図は、ストレプ
トミセス・カツラハマヌスＴ一２７２の培養物から得ら
れたクラバラン酸ナトリウムの核磁気共鳴スペクトル（
Ｄ２０中、６０ＭＨｚ）を、それぞれ示す。

Claims

【特許請求の範囲】

１新菌種ストレプトミセス・カツラハマヌスを培地に
培養し、クラバラン酸を生成蓄積せしめ、培養物からク
ラバラン酸を採取することを特徴とする抗生物質の製造
も