KR830000617B1 - 신 항생물질 sf-2050 물질의 제조법 - Google Patents

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내용 없음.

Description

신 항생물질 SF-2050의 제조법

제1도는 SP-2050 물질의 자외선 흡수스펙트럼도(pH7, M/200 인산 완충액 38/㎍/ml).

제2도는 SF-2050 물질의 브롬화칼륨정의 적외선흡수스펙트럼도,

제3도는 SF-2050 물질의 중수중의 100MHZ 핵자기공명 스펙트럼도,

제4도는 SF-2050 물질의 원편광 2색성 스펙트럼도.

본 발명은 새로운 항생물질의 제법에 관한 것이다.

좀 더 구체적으로 말하면, 방선균을 배양하여 얻어진 새로운 항생물질 SF-2050 물질에 관한 것이다.

본 발명자들은 기지 항생물질의 내성균(耐性菌)을 함유한 여러가지의 그램음성균 및 그램양성균에 항균활성을 가진 새롭고 유용한 항생물질을 탐구한 결과 스트렙토미세스속에 속하는 방선균을 영양배지중에 배양시킴으로써 신항생물질 SF-2050 물질이 생산되는 것을 발견하여 SF-2050 물질을 분리하고, 그 이화학적, 생화학적 성상을 확정함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명에 사용되는 SF-2050 물질 생산균의 1예로서는 일본국의 이바라기현( 城縣) 토양에서 새로 분리된 SF-2050 주이다,

SF-2050 주의 균학적 성상은 다음과 같다.

Ⅰ. 형 태

기균사(氣菌

)의 착생은 일반적으로 빈약하다.

비교적 착생이 좋은 스타치(starch) 한천, 티로신(tyrosine) 한천, 수크로스질산염 한천 등으로 관찰하면 분기는 단순분기이며 차축(車軸)분기는 보이지 않고, 기균사의 선단은 직선상으로 된다.

균핵등의 특수구조는 관찰되지 않았다.

전자현미경의 관찰에 의한 포자의 표면구조는 평활형(smooth)이다.

포자는 타원형 내지 단원통형(short cylindrical shape)이고, 크기는 0.5-0.8×0.8×1.4미크론이며, 보통 0포자 이상 연쇄(連鎖)한다.

Ⅱ. 각종 배지상의 생육상태

색의 기재에 대해서 [ ]내에 나타낸 표준은 콘테이너,

코포레이숀. 오브 아메리카(container corporation of america) 사제의 컬러하모니 매뉴얼(Color Harmony Mannual)을 사용하였다.

배양온도는 28℃이며, 관찰은 14-21일 배양 후 실시하였다.

Ⅲ. 생리적 성질

(1) 생육 온도 범위 : 스타치 한천에 있어서 20℃∼33℃의 온도 범위에서 생육하며, 특히 25℃∼30℃가 최적온도이다.

(2) 젤라틴의 액화 : 양성(20℃, 14일 배양)

(3) 스타치의 가수분해 : 양성(28℃)

(4) 탈지유의 응고 : 음성(28℃)

탈지유의 펩톤화 : 양성(28℃)

(5) 멜라닌과 같은 색소의 생성 : 음성

Ⅳ. 탄소원의 이용성[프리드함-고틀리브(pridham-Gottlieb) 한천 배지, 28℃ 배양]

(1) 이용함 : D-글루코스, 람노스

(2) 이용에 문제있음 : D-키실로스, L-아라비

(3) 이용안함 : D-프룩토스, D-만니톨, I-이노시톨, 수크로스, 라피노스

Ⅴ. 전세포 가수분해물중의 디아미노피메린산(DAP) : LL형

이상의 성상을 요약하면, SF-2050 주는 스트렙트 미세스속에 속하며, 기균사 선단은 직선상이고, 포자표면구조는 평활형의 형태를 갖고 있다.

기균사 색조(color)는 초기 백색-담황색으로 성숙함에 따라 셀핑크로 되며, 이때에 황색을 띤다.

트레스너와 박커스[H. D Tresner & E. J. Backus : Appl Microbiol. 1l, 335(1963)]]의 적(Red) 내지 황(yellow) 시리즈(series)에 속한다.

이면(裏面)은 황색-담갈색으로 가용성색소는 어느 배지에 있어서도 생성하지 않는다.

본 발명자들은 SF-2050 주를 스트렙토 미세스 에스 피. SF-2050(streptomyces SP-2050)라 칭하였다.

본 균주는 일본국 미공연(微工硏)에 기탁되어 있으며, 미공연신청서 접수번호는 제4358호이다.

SP-2050 주는 다른 스트렙토 미세스속의 균주인 경우에서와 같이 그 성상이 변화하기 쉽고, 예컨데 자외선, X선, 고주파, 방사선, 약품등을 사용하는 인공적 변이수단으로 변이하며, 어느 변이주에서도 SF-2050 물질의 생산능을 가진 스트렙토 미세스속의 균을 모두 본 발명의 방법에 사용할 수 있다.

본 발명의 방법은 위 군주를 통상의 미생물이 이용되는 영양물을 함유하는 배지에서 배양한다.

영양원으로서는 종래의 스트렙토 미세스속의 균의 배양에 이용되는 공지의 것이 사용될 수 있다.

예컨데, 탄소원으로서 글루코스, 글리세린, 전분, 물엿, 당밀, 대두유 등을 사용한다.

또 질소원으로서 대두분, 소맥배아, 육엑스(meat extract)펩톤, 효모엑스, 코운스팁리커(corn steep liquor), 황산 암모늄, 질산나트륨 등을 사용한다.

기타, 필요에 따라 탄산칼슘, 식염, 염화칼리, 염화코발트, 인산염 등 무기염류를 첨가하는 이외, 균의 발육을 도와 SF-2050 물질의 생산을 촉진할 때 유기물 및 무기물을 적당하게 첨가할 수 있다.

특히, 코발트 이온의 첨가는 생산성 향상에 유효하다.

배양법으로서는 일반 항생물질 생산방법과 같으며, 액체배양법, 특히 심부배양법(深部培養法)이 가장 적당하다. 배양은 호기적조건하에서 하며, 배양에 적당한 온도는 22∼30℃이다.

대부분의 경우 28℃ 부근에서 배양한다.

SF-2050 물질의 생산은 진탕배양, 탱크배양과 같이 1∼4일에 축적이 최고에 달한다.

SF-2050 물질의 검정은 다음 방법으로 한다.

검정균으로서 바실러스 스테아로서모-필러스(Bacillns stero therom-philus)를 사용하며 검정배지로 하고 글루코스 0.1%, 트립톤 0.5%, 효모엑스 0.25％, 한천 1.5%(pH 7.0)의 조성으로 된 배지를 사용하였다.

검정은 페이퍼 디스크 평판법으로 하여 55℃, 16∼18시간 배양한 후 저지원(저止圓)(diameter of the inhibition zone)을 측정하였다. SF-2050 물질은 주로 배양여액중에 축적된다.

배양액중의 SF-2050 물질은 다음에 설명하는 이화학성질을 갖고 있어 이성상에 따라 추출, 정세가 가능하며, 다음에 설명하는 방법이 효율적이다.

즉, 유효성분을 함유한 배양물에서 고형분을 여과하고 여액을 활성탄에 흡착시킨 50% 아세톤수로 용출시킨다.

유효성분을 포함한 분액을 농축하여 아세톤을 제거한 다음 벤질디메틸암모늄 클로리드 혹은 테트라 n-부틸암모늄 히드로겐 술페이트와 같은 제 4 급 암모늄염을 함유한 할로게노알칸 예컨데, 디클로로메탄으로 유효성분을 추출하는 요오드 화나트륨(NaI)을 포함한 물로 재추출하고 동결 건조하여 SF-2050 물질의 거친 분말(crude powder)을 얻는다.

다시 정제분리하는데는 DATE-세파딕스 A-25, QAE-세파딕스 A-25, DATE-셀룰로스, 다우엑스 1×2와 같은 음이온 교환담체를 사용한 크로마토크래피를 반복함으로써 SF-2050 물질을 얻을 수 있다.

이외에, 바이오겔 P-2와 같은 겔여과제, 앰버라이트 XAD와 같은 다공성수지 혹은 셀룰로스컬럼 등을 적당하게 사용함으로써 정제가 가능하다.

이와 같이 하여 얻어진 SF-2050 물질의 분말을 각종 용제계에서 박층크로마토그래피로할 때 어느 계에 있어서도 단일 스포트를 나타내었다.

SF-2050 물질은 다음에 표시한 바와 같이 실온 이상의 고온 및 산성에서는 극히 불안정하므로 배양액에서 분리하는데 있어서는 용액중 pH가 산성으로 되지 않도록 세심한 주위를 하는 용액조정이 모두 저온에서 신속하게 하는 것이 중요하다.

또, SF-2050 물질은 산성에서는 극히 불안정하므로 유리산의 형태로 분리하는 것이 실질적으로 곤란하다.

이 때문에 SF-2050 물질은 최종적으로 중성수용액을 동결 건조함으로써백색무정형분말상의 염으로써 얻어진다. 그 순도는 배양역가에 의해 좌우된다.

염의 종류는 정제에 사용되는 양이온에 의해 규정되며, 예컨데 DATE-세파딕스 A-25의 크로마토 그래피로 식염수를 용리액으로 하여 사용하면 나트륨염으로서 얻어진다.

나트륨염 이외에 의약적으로 수용가능한 염으로서 칼륨과 같은 알칼리금속염, 칼슘과 같은 알칼리토류금속염, 알미늄 알모늄염 등 무기염 혹은 치환암모늄염 등 유기염을 위나트륨염과 동일한 방법으로 조제할 수 있다.

또, 나트륨염에서 다른 염으로의 변환은 다우엑스 50W와 같은 양이온 교환수지를 미리 변환하는 양이온으로 치환한 다음, 나트륨염의 수용액을 통과시킴으로써 가능하다.

다음으로 여기서 얻어진 최순도의 제품으로 생각한 SF-2050 물질의 나트륨염의 이화학적 성상에 대해서 기술한다. 단, 동결건조된 분말로서 얻기 위해 물 기타 다른 불순무리 함유되는 것도 있다.

1. SF-2050물질은 원소분석 및 전기냉동결과로부터 2염기 성산이라고 생각되며, 그 나트륨염은 실질적으로 디나트륨염이다.

2. pH6.7의 피리딘-아세트산 완충액중 고압여지 전기영동으로 SF-2050 물질은 양극으로 이동하여 세파마이신 A의 이동도를 1.0으로 한 경우 상대이동도는 1.6이다.

3, 분말은 건조상태로서 저온 보전하면 비교적 안정되나 그 수용액은 산성에서 극히 불안정하고, 알칼리성에서 불안정하며, pH7-8 부근이 가장 안정되나 중성에서도 고온에서는 신속하게 분해한다.

또, 중성수용액에서 0.02M의 중성 히드록실 아민용액을 동량가해 실온에서 30분이상 방치하면 항균활성이 완전히 소실(vanish)하고 295nm의 자외부흡수의 극대도 소실한다.

4. 물에 용해가 용이하고, 메타놀에 약간 용해하며, 클로로포름과 에틸아세텔이트에는 거의 녹지 않는다.

5. SF-2050 물질은 명확한 융점을 나타내지 않으며, 150℃이상에서 서서히 분해한다.

6. 원소분석치는 C32.5%, H5.0%, N5.8%, S13.3%이었다.

7.

M 인상완충액(pH7) 중에서 38㎍/ml로서의 자외흡수 스펙트럼은 제 1 도에서와 같으며, 295nm에서 극대흡수를 나타낸다.

8. 브롬화칼륨정으로 적외선 흡수스펙트럼은 제2도에 나타낸 바와 같다.

9. 중수(deutro-water) 중에서 특정한 핵 자기공명스펙트럼은 제3도에 나타낸 바와 같다.

10. 비선광도,

=-46°(C=0.1, H₂O)

11. 농도 1㎎/ml(수용액)으로 측정한 원편광 2색성곡선(circular dichroism spectrum curve)은 제4도에서와 같다.

12. 셀룰로스 박층 크로마토그래피에서의 Rf치는 다음과 같다.

(a) n-부타놀-이소프로라놀-물-(7:7:6), Rf=0.36

(b) 아세토니트닐-물(7:3), Rf=0.59

(c) 이소프로파놀-물(8:2), Rf=0.22

13. 술폭시드의 정색반응은 양성, 즉 여지 또는 박층상의 시료에 0.5% 요오드화나트륨 용액 10용량에 농염산 1용량의 혼합액을 분무하여 NaOH를 넣은 데시케이터 중에서 감압하여 어두운 곳에서 15분간 정지한다음 여지 또는 박층을 취출하여 0.5%가용성 전분용액을 분무하면 자색(purple)으로 정색된다. 닌히드린 반응은 음성이다.

SF-2050 물질의 항균활성을 페이퍼 디스크법으로 측정한 결과는 다음과 같다.

단, 위표에서의 배지는 다음과 같다.

또, SF-2050 물질은 사젠트(sargent) 방법[M. G. Sargent, Tournal of Bacteriology, 95, 1493(1968)]에 의해 측정하면 β-락타마제에 저해활성을 갖고 있음이 판명되었다.

즉, 시약으로서

A액 : 패니실리나아제(penicillinase)(미국, 칼비오켐사제)를 pH7.0, 0.1M 인산완충액으로 용해하여 하기의 측정조건하에서 측정하고, 490nm의 흡광도가 약 0.5를 나타내는 활성으로 되도록 희석한다.

B액 : 1.3% 페니실린 G칼륨염의 수용액

C액 : pH7.0, 0.1M 인산완충액

D액 : 요오드-아세트산완충액, 사젠트 방법에 의해 조제한다.

측정조건으로서 시험관에 B액 0.5ml와 C액 2ml를 합쳐 30℃에서 미리 5분간 유지하고, A액 0.5ml를 가하여 30℃에서 30분간 반응시킨다음, D액 5ml를 가하여 10분후 490nm에서의 흡광도를 측정한다.

블랭크시험으로서는 활성측정과 동일하나 A액만을 D액을 가한 직후에 첨가하여 이하 동일하게 조작한다.

저해력 측정시험으로서는 블랭크시험도 위와 거의 동일하게 조작하나 저해물질을 C액으로 적당하게 희석한 액을 C액으로 하여 사용한다.

위 측정방법에 의해 SF-2050 물질의 페니실리나아제 활성을 50% 저해하는데 요하는 농도를 구하면 그 값은 2.5㎍/ml이었다.

이와같이 SF-2050 물질은 여러가지 그램양성균 및 음성균에 대하여 활성일뿐만 아니라, β-락타마제를 생산할 수 있는 내성균에도 유효한 가치가 있는 항생물질이며, 사람 및 가축동물의 의약으로서, 또 식품 보조이나 의료기구의 살균제로서의 사용이외에 다른 항생물질, 특 β-락탑항생물질과의 병용에 효과적이다.

또, 이상으로 언급한 이화학적, 생물학적성상을 가진 SP-2050 물질은 문헌상에 해당되는 것이 없으며 따라서 본 물질의 신규성이 명백하다.

[실시예 1]

(1) SF-2050 주의 배양

종균으로서 스트렙토미세스. 에스피-SF-2050주[일본국 미공연균기(微工硏菌寄) 제4358호]를 사용하고 종배지로 하여 가용성 전분 0.1%, 대두분 3.0%(살균전 pH7.0)을 사용하였다.

종균 1백금이(白金耳, platinum loop)를 50ml 시험관 중에서 10ml의 위 종배지에 접종하여 28℃에서 48시간 배양하였다.

이 종배양을 500ml 플라스크에 100ml를 넣은 종배지 5개에 각각 1ml씩 접종하고 28℃로 24시간 배양하였다.

얻어진 종배양 500ml를 다시 30ℓ자-퍼멘터(Jar-ferenter) 중에서 20ℓ의 종배지에 접종하여, 28℃에서 24시간 통기하여서 교반배양을 하였다.

이 종배양 15ℓ를 300ℓ 용량의 자-파멘터중의 생산배지 200ℓ에 접종하였다.

생산배지의 조성은 글루코스 2.0%, 대두분 1.0%, K₂PHO₄0.1%, CaCO₃0.02%, CoCl₂6H₂O 0.0001%(살균전 pH6.5)이었다.

배양은 28℃에서 44시간 통기하여서 교반하는 방식으로 하였다.

배양후, 규조토를 사용해서 여과하여, 배양액 170ℓ를 얻었다.

(2) SF-2050 물질의 채취

위와 같이 하여 얻어진 배양여액 170ℓ를 활성탄소(和光純樂) 10ℓ의 탑에 통과하여 유효성분을 흡착시켜 6l씩 물로 2회 세척한 다음, 50% 아세톤수로 용출시켰다.

8l씩 분액을 4개로 취하여 프랙숀 No. 2와 3을 합쳐 감합하에서 아세톤을 제거하고 7l로 농축하였다.

0.2%(w/v)의 벤질디메틸 세틸 암모늄 클로리드를 함유한 디클로로메탄 7l를 농축액에 가하고 교반하여 유효성분을 추출하고, 디클로로메탄층에 1%(w/v)의 요오드화나트륨을 함유한 물 700ml를 가하여 유효성분을 다시 수액층으로 전용하였다.

이 수액층을, 미리 pH 7의 인산완충액으로 완충화한 DATE-세파딕스 A-25(팔마시아사제)의 1l 탑에 통과하여 유효성분을 흡착시켜 pH 7의 20mM 인산완충액으로 용해한 0.1M의 식염수 6l로 미리 세척하고 다시 동완충액으로 용해한 0.14M식염수로 유효성분을 용출시켰다.

150ml씩 분해하고 프랙숀 32에서 52까지를 병합하여 활성탄 25ml탑에 통과시켜 유효성분을 흡착시켰다.

이 활성탄의 탑을 물 10ml씩 2회 세척한 다음 50% 아세톤 물 290ml로 유효성분을 용출시켜 감압하에서 110ml까지 농축시켰다.

이 농축액을 미리 pH-7의 인산 완충액으로 완충화한 DEAE-세파딕스 A-25의 100ml 탑에 넣어 유효성분을 흡착시키고, pH 7의 20mM 인산완충액에 용해한 50mM의 식염수로 전개하였다.

100ml씩 분액하여 프랙숀 No.30에서 37까지를 합쳐 활성탄 8ml탑에 통과시켜 유효성분을 흡착시켰다.

이 활성탄을 물 30ml로 2회 세척한 다음, 150ml의 50% 아세톤 물로 유효성분을 용출시켜 감압하에서 7ml로 농축하고 동결건조하여 SF-2050 물질의 나트륨염으로서 백색분말 10.4㎎을 얻었다.

Claims (1)

1. 스트렙토미세스속에 속하는 SF 2050 물질생산균을 배양하여 배양물에서 SF-2050 물질을, 크로마토그 라피의 분리조작에 의해 Rf=0.59(전개용매 아세트나트릴-물=7:3을 사용한 셀룰로스박층 크로마토그라피)의 부분을 채취함을 특징으로 하는 신항생물질물 SF-2050 물질의 제조법.

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