KR830002206B1 - 신항생물질 sf-2052 물질의 제조법 - Google Patents

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Description

신항생물질 SF-2052 물질의 제조법

제1도는 SF-2052물질(HCl염)의 적외부 흡수스펙트럼 곡선도(KBr정중(錠中)).

제2도는 SF-2052물질(HCl염)의 중수중에서의 수소핵 핵자기공명 흡수스펙트럼도(100MHZ, TMS 외부표준).

제3도는 SF-2052물질(HCl염)의 중수중에서의 탄소핵 핵자기공명흡수 스펙트럼도(디옥산 내부표준)이다.

본 발명은 신규항생물질, SF-2052 물질의 제조법에 관한 것이다. 상세히 말하면 방선균을 배양하여 새로운 항생물질 SF-2052 물질을 제조하는 방법에 관한 것이다.

본 발명자들은 기지의 항생물질의 내성균을 함유한 여러가지의 그램음성균 및 그램양성균에 항균활성을 가진 유용한 항생물질을 연구한결과 닥틸로스포란굼 마쓰자키엔세(Dactylesporangium matsuzakiense) SF-2052주 또는 미크로모노스포라 SP. SF-2098주를 영양배지중에 배양함으로써 새로운 항생물질 SF-2052 물질을 분리하여 그 이화학적, 생물학적 성상을 확정함으로써 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명은 방선균에 속하는 SF-2052 물질 생산균을 배양하여 얻어진 배양물에서 SF-2052 물질을 채취하는 것을 특징으로하는 새로운 항생물질, SF-2052 물질의 제조법을 요지로 한다.

본 발명에 사용되는 SF-2052 물질 생산균의 예로서는 일본국 시즈오카겐 이즈(靜岡縣伊豆)반도 토양에서 새로 분리된 SF-2052주가 있어 본 균주의 균학적 성상은 다음과 같다.

관찰은 주로 SHIRLING, E.B.와 GOTTLIEB, D에 의해 Internaionational Journal of Systematic Bacriology(16:313-346, 1966)에 기재되어 있는 방법에 따라 실시하였다.

I. 형태

기생균사(基生菌

)는 잘 분기하여 파상으로 신장되며, 직경은 0.5-0.6미크론이다. 한천배지 및 액체배지의 어느것이나 기생균사의 분단은 보통 관찰되지 않았다. 기균사(氣菌

)는 거의 나타나지 않았으며, 사실상 형성되지 않는다고 생각된다. SF-2052주는 한천표면상에 포자주머니를 1개, 혹은 타프트상으로 형성한다.

포자주머니는 스타치한천에 비교적 많으며, 또 글리세롤. 아스파라긴 한천, 티로신 한천, 오우트밀 한천에 약간 확인되었다. 포자주머니는 지상(指狀)으로 크기는 약 0.9-1.4×4.0-6.0미크론이다.

각 포자주머니는 그 가운데 일열로 보통 3개의 포자를 가진다. 포자는 대부분 원통형 내지 란형(卵型)으로 표면구조가 미끄러우나 크기는 약 0.8-1.3×1.1-1.6미크론이다. 포자는 예로서 토양추출액 등에 현탁하여 15-30분 방치한후 검경(檢鏡)하면 유주성(遊走性)이 확인되었다.

II. 각종 배지상의 생육상태

새의 기재에 대해서 [ ]내에 표시하는 표준은[Container Corporation of America] 사제의[Color Harmony Manual]을 사용하였다. 관찰은 28℃, 21일간 배양한후 실시하였다.

III. 생리적 성질

(1) 생육온도범위 : 스타치 한천에 있어서 15-40℃의 온도범위에서 생육하며 25-37℃에서 양호하게 생육한다.

(2) 젤라틴의 액화 : 20℃, 21일 배양으로는 액화하지 않는다.

(3) 스타치의 가수분해 : 양성(28℃, 21일 배양)

(4) 초산염의 환원 : 음성(28℃, 21일 배양)

(5) 탈지유의 응고 : 음성(28℃, 21일 배양)

탈지유의 펩톤화 : 음성(28℃, 21일 배양)

(6) 메라닌과 같은 색소의 생성 : 음성

IV. 탄소원의 이용성

V. 화학조성

SF-2052주의 화학조성을 다음 문헌에 기재된 방법에 의해 분석하였다. YAMAGUCHI, T : Batc, 89 : 444-453(1965), BECKER, B 등 : APPI. Microbiol. 12 : 421-423(1964), LECHVALIER, M.P. : J. Lab. Clin. Med. 71 : 934-944(1968) 분석결과 ; SF-2052주는 세포벽타입 II에 속한다. 즉, 세포벽에 히드록시디아미노-피메린산(Hydroxydiamino-pimelic acid)와 글리신을 함유한다. 또, 전 세포당패턴은 D타입에 속한다. 즉, 전세포의 가수분해 물중에 키실로오스, 가락토오스 및 아라비노오스(미량)가 확인되었다.

이상의 성상에서 SF-2052주는 방선균(order Actinomycetales) 중에서 닥틸로스포란굼(Dactylosporan-gium)속에 속하는 균주이다. 닥틸로스포란굼. 오란티아쿰(Dactylosporangium aurantiacum) 및 닥틸로스포란굼. 타일란덴스(Dactylosporangium thailandense)의 2종이 알려지고 있다(J.E. Thiemann등, Arch. Mikrobiol. 58,42-52, 1967 및 Bergy'se Manual of Determinative Bacteriology, 8th Ed., 1974).

이 2균종과 SF-2052주의 비고를 다음표에 요약한다.

※ 1 : J. E. Thiemann 등이 기재한 배지 (Arch. Mikrobiol. 58,42-52, 1967)

※ 2 : ※ 1에 비타민을 첨가한 배지

※ 3 : 효모엑스. 탄산칼슘 한천배지, SF-2052주는 ※1, ※ 2의 배지에는 생육되지 않음.

위 표에서와 같이 SF-2052주는 이들 2균종과는 명백하게 구별된다. 따라서, 본 발명자들은 SF-2052주를 닥틸로스포란굼속의 신균종임을 확인하여 닥틸로스포란굼, 마쓰자키 엔스. 에스피. 노브(Dactylesporangium matsuzakiense sp. nov.)라고 명명하였다.

SF-2052주는 일본 미공연(微工硏)에 미공연균기(微工硏菌寄) 제4670호로서 기탁되어 있다. SF-2052주는 다른 방선균 균주인 경우에 볼수있도록 그 성상이 변화되기가 쉽고, 예로서 자외선, 엑스선, 고주파 방사선, 약품등을 사용하는 인공적 변이수단으로 변이한 것으로 어느 변이주라도 SF-2052 물질의 생산능을 갖는것은 모두 본 발명의 방법에 사용될 수 있다.

SF-2052주는 소와 52년 2월 일본 시즈오카겐가 보궁 마쓰사키죠이나가미진샤(일본국 靜岡縣賀茂郡松崎町伊服上神社)의 토양에서 분리하였다. 분리배지로서는 가용성전분 0.2%, 황산암모늄 0.04%, 인산 2칼륨 0.02%, 황산마그네슘 0.02%, 탄산칼슘 0.04%, 한천 1.5%(pH 조정없음)의 조성으로 된 한천 배지를 사용하여 28℃, 30일간 배양후 출현한 SF-2052주의 콜로니(colony)에서 스타치 한천에 조균(釣菌)하였다.

또, 본 발명자들은 일본국 지바겐 죠시시 이누와카(일본국 千葉縣

子市犬若)의 토양에서 새로 분리한 미크로모노스포라에 속하는 방선균 SF-2052주가 배양액중에 항생물질 SF-2052 물질이 생산된다는 것을 발견하였다.

위 방선균 SF-2098주의 균학적 성상은 다음과 같다.

I. 형태

SF-2098주는 일반적으로 사용되는 각종의 한천 배지상에서 기균사를 형성하지 않는다. 액체배지에서 배양한 SF-2098주를 현미경으로 관찰하면 분기로 신장한 기생균사의 각 부위에 포자가 1개씩 착생되어 있는것을 발견하였다. 전자현미경으로 관찰하면 포지는 거의 구형으로 직경은 1.0-1.3미크론이며, 포자표면은 선단이 원형상을 한 돌기가 다수 존재하여 일견 콘페이토 상으로 된다.

II. 각종배지상의 생육상태

여러가지의 배지에서 28℃, 15-20일간 배양하여 관찰한 생육상태는 다음표와 같다.

색의 표준은 Color Harmony Manuel(Container Corporation of Ameica 사제)에 따라 [ ]내에 표시한다.

III. 생리적 성질

(1) 생육온도범위 : 15-45℃

(2)젤라틴의 액화 : 양성(20℃, 21일 배양)

(3) 전분의 가수분해 : 양성(28℃, 21일 배양)

(4) 탈지유에 대한 작용 : 펩톤화 및 응고, 양성(28℃, 21일 배양)

(5) 메라닌과 같은 색소의 생성 : 음성

(6) 질산염의 환원 : 음성(28℃, 21일 배양)

(7) 내염성[Intern. J. Syst. Bacteriol., 21, 240(1971)의 방법] : 0-15%에서 양호, 3-4%에서도 생육하나 5%에서는 생육되지 않음.

IV. 탄소원의 이용성[배지 : 효모엑스(Difco) 0.5%, 탄산칼슘 0.1%, 바크트 한천 (Difco) 1.5%]

V. 세폭벽 조성

Becker등의 방법 Appl. Microbiol. 13.236(1965)에 의해 분석한결과 세포벽 조성 성분중의 디아미노피메린산으로하여 히드록시. 디아미노피메린산이 검출되었다.

위와같이 SF-2098주는 한천배지에서 기사균을 착생하지 않으며, 기생균사에 포자를 단일형성하는 중온균(中溫菌)이며, 세포벽중에 히드록시. 디아미노 피메린산을 갖고 있으므로 미크로모나스포라속에 속하는 균주이다.

본 발명자들은 SF-2098주를 미크로모나스포라. 에스피 SF-2098(Micromonspora sp. SF-2098)이라 칭하였다.

본 SF-2098주는 일본국 미생물공업연구소에 기탁되어 있다(미공연신청서 접수번호 제5073호).

미크로모노스포라. 에스피. SF-2098주는 다른 방선균인 경우에 볼수 있도록 그 성상이 변화되기쉽고, 예컨대 자외선, 엑스선, 방사선, 약품등을 사용한 인공적 변이수단으로 변이하며, 이와같은 변이주라도 항생물질 SF-2052 물질의 생산능을 가진 미크로모노스포라속의 균은 모두 본 발명의 방법으로 사용할 수 있다.

본 발명의 방법으로는 SF-2052 물질을 생산하는 위 방선균에 속하는 닥틸로스포란굼, 마쓰자키엔스 SF-2052주 또는 미크로모노스포라 sp. SF-2098주를 통상의 미생물이 이용되는 영양물을 함유한 배지에서 호기적 조건하에 SF-2052 물질을 생산하므로 충분한 시간으로 배양하여 얻어진 배양물에서 SF-2052 물질을 채취한다.

영양원으로서는 종래에 방선균의 배양에 이용되는 공지의것이 사용될수 있다. 예로서, 탄소원으로 글루코오스, 글리세롤, 슈크로오스, 전분, 덱스트린, 물엿, 당밀, 대두유등을 사용한다. 또, 질소원으로는 대두분, 소맥배아, 육엑스, 펩톤, 효모엑스, 건조효모, 콘스티프리카, 면실찌꺼기, 황산암모늄, 질산소다등을 사용한다.

기타 필요에 따라 탄산칼슘, 염화나트륨, 염화코발트, 인산염등 무기염류를 첨가하는 이외에 균의 발육을 도와, SF-2052 물질의 생산을 촉진할때 유기 및 무기물을 적당히 첨가할수 있다.

배양법으로는 일반항생물질 생산방법과 동일하게 액체배양법, 특히 심부배양법이 가장 적당하다. 배양은 호기적 조건하에서 실시되고, SF-2052주의 경우 배양에 적당한 온도는 25-37℃이나 대부분의 경우 28-32℃에서 배양한다. SF-2052 물질의 생산은 진탕배양, 탱크배양 다같이 2-10일에 축적이 최고에 달한다. SF-2098주의 배양에 적당한 온도는 25-40℃이나 보통 30℃부근에서 배양한다. pH는 중성-약알칼리성이 바람직하다. 액체배양으로 통상 3-10일간 배양을 하면 SF-2052 물질이 배양액중에 생성 축적한다. SF-2052 물질의 검정에 있어서는 다음 방식이 사용된다.

검정용 배지로서 폴리펩톤 0.5%, 우율엑스 0.3%ㅡ 한천 1.5%(pH 7.0)의 조정으로 된 배지를 사용한다. 검정균으로는 바틸루스즈프티루스 PCI-219주를 사용한다.

SF-2052 물질은 이것을 사용한 검정에 있어서 50mcg/ml-10mcg/ml에서 농도의 대수와 저지원 직경의 관계는 직선관계를 나타내며, 각각 21.2-12.8mm의 저지원직경이 주어진다(페이터 디스크평판법).

본 발명에 의해 얻어지는 SF-2052 물질은 수용성의 염기성 항생물질이다. 배양액내에 생산 축적된 SF-2052 물질을 분리 정제하는데는 수용성의 염기성 항생물질의 정제에 보통 사용되는 수단을 적당히 이용한다.

즉 앰버라이트 XAD-2, 다이어이온 HP-20등 합성흡착제, 세파딕스 G-10, 세파딕스 LH-20등 겔여과제, 앰버라이트 CG-50, CM-세파딕스등 양이온 교환수지등에 의한 크로마토그래피가 사용되나, 다음에 의한 채취방법이 효율적이다.

SF-2052주의 경우, SF-2052주의 배양법에 의해 균체 기타의 고형물을 원심분리에 의해 제거하고, 다음에 여액중 유효성분을 다이어이온 pH-20에 흡착시켜 50% 아세톤 용액(pH 조정안함)과 50% 아세톤 용액(pH 2.0)으로 용출시킨다.

용출액을 감압 농축하여 아세톤을 제거한다. 이것을 다시 CM-세파딕스(H⁺형), CM-세파딕스(Na⁺형), 활성탄컬럼 크로마토그라피등을 적당히 조합시킴으로써 고순도의 SF-2052 물질을 얻을수 있다.

또, SF-2098주의 경우, SF-2098주의 배양여액을 pH 2.0으로 조정한다음 하이프로스파셀등 여과조제를 사용하여 균체기타의 고형물을 제거하고, 다음으로 여액중의 유효성분을 앰버라이트 IRC-50(Na⁺)에 흡착시켜 0.4NHCl수로 용출시킨다. 이 용출액을 NaOH로 중화시킨후 활성탄으로 탈염한다.

이것을 다시 CM-세파틱스, 활성탄컬럼, 세파딕스 LH-20의 컬럼 크로마토그라피등을 적당히 조합시켜 고순도의 SF-2052물질(HCl염)을 얻을수 있다.

SF-2052 물질은 다음과 같이 알칼리성에서 극히 불안정하므로 유리염기 형태로 분리하는 것은 실질적으로 곤란하다.

이 때문에 SF-2052 물질은 최종적으로 미산성용액에서 동결건조함으로써 백색무정형 분말상의 HCl염으로 얻어진다.

SF-2052 물질의 산부가염의 예로는 위 염산염 이외에 브롬화수소산, 황산, 질산, 인산과 같이 약학적으로 허용할 수 있는 무기산의 염, 초산, 구연산, 안식향산, 아스콜빈산과 같이 약학적으로 허용할 수 있는 유기산의 염이다.

다음에 SF-2052물질(HCl염)의 이화학적 성상을 열거한다.

1. 외관 : 백색의 무정형분말

2. 융점 : 170℃부근에서 서서히 갈변하고 209-210℃에서 발포 분해한다.

3. 원소분석치 : C, 35.69%, H, 7.04%, N, 11.80%

4. 자외선흡수 스펙트럼 : 220nm-370nm에서 특징적인 자외부흡수 극대가 없다.

5. 적외부흡수 스펙트럼

브롬화칼륨 정(錠) 중에서 측정한 SF-2052물질(HCl염)의 스펙트럼은 제1도에 표시되어 있다.

6. 분자량

본 물질은 알칼리성이며, 불안정하고 유리염기가 안정한 형태로 얻어지지 않으며, 매스 스펙트럼으로 직접 분자량을 측정하기가 곤란하였다. 탄소핵 핵자기공명 스펙트럼등 데이터에서 본물질의 유리염기의 분자량은 400-450정도이다.

7. 용해성

물에 잘 녹으며, 메타놀에 가용, 클로로포름, 초산에틸, 핵산, 벤젠에테르등 유기용제에 실질적으로 불용이다.

8. 안전성

산성에서 중성에 걸쳐 비교적 안정하나 알칼리성에서 불안정하다.

9. 셀룰로오스박층 크로마토그라피 Rf치 :

n-프로파놀-피리딘-초산-물(15:10:3:12) 0.46

n-부타놀-초산-물(2:1:1) 0.10

10. 페이퍼 크로마토그라피의 Rf치(상승법) :

n-프로파놀-피리딘-초산-물(15:10:3:12) 0.40

n-부타놀-초산-물(2:1:1) 0.09

11. 정색반응

양성 : 닌히드린, 그레익-레이박, 레뮤반응

음성 : 사카구치(坂口), 질산은 반응

12. 중수중에서 측정한 수소 핵자기공명 스펙트럼(100MHZ, TMS 외부표준)은 제2도에 표시되어 있다. 또 중수중에 측정한 탄소핵 핵자기공명 스펙트럼(디옥산 내부표준)은 제3도에 표시되어있다.

13. 비선광도[α]²⁵ _D+87˚(Cl, H₂O)

이상의 물리화학적 특성을 가진 SF-2052 물질의 유리염기는 다음식,

으로 표시되는 구조식으로 항생제닥티미신(Dactimicin)이다.

다음으로 SF-2052 물질의 각종 미생물에 대한 항균 활성을 제1표에 표시한다.

[제1표]

SF-2052 물질(Dactimicin)의 항균스펙트럼

비고 : MIC : 최저 저지농도(Minimum Inhibition Concentration) 포르티미신(Fortmicin)의 구조식은 다음과 같다.

아미카신(amikacin) : 아미노글리코시드 항생물질로 일본국에서 임상용으로 시판되고 있음.

이와 같이하여 SF-2052물질은 그램양성균, 음성균에 대하여 강력한 항균력을 갖고 있으며, 또 포르티미신과 아미카신보다 우수한 항생능력이 있음을 알수있다. 이상 설명한 이화학적성상, 생물학적정상을 가진 SF-2052물질은 문헌상 해당되는것이 없으며, 본물질의 신규성은 명백하다. 따라서, 본발명은 상기의 SF-2052물질 및 그 산부가 염을 요지로한다.

다음에 본 발명의 실시예를 열거한다.

[실시예 1]

(1) SF-2052주의 배양

종균으로서 닥틸로스포란굼 마쓰자키엔스 SF-2052주(일본국 미공연신청서 수리번호 제4670호)를 사용하여 종배지로서 글루코오스 2.0%, 펩톤 0.5%, 우육엑스 0.2%, 이스트 0.3%, 대두분 0.2%, 탄산칼슘 0.1%(살균전 pH7.0)의 배지를 사용하였다.

종균 5-6백금이(platinum loop)를 100ml 3용 각 플라스크중 20ml의 상기 종배지에 접종하여 28℃, 6일간 배양하였다.

이것을 제1종 배양으로하여 10개 배양하였다. 다음으로 종배양 200ml를 500ml용 3각 플라스크중 80ml종배지에 20ml씩 10개에 접종하여 28℃, 72시간 배양하였다.

얻어진 제2종 배양을 500ml용 3각 플라스크중 생산배지 80ml에 5ml씩 150개에 접종하였다. 생산배지 조성은 종배지와 동일한 조성으로 농도를 2배로한 것을 사용하였다. 배양은 28℃ 6일간 진탕 배양방식으로 실시하였다. 배양액은 냉동원심기(도미사제)로 연속 처리하여 약 2시간에 10l의 배양여액을 얻었다.

(2) SF-2052물질의 채취

실시예 1 (1)에서 얻어진 배양여액 10l를 다이어 이온 HP-20(미쓰비시 가새이사제) 750ml를 충전한 탑에 통과시켜 유효성분을 흡착시켰다. 3l의 물로 세정한 다음, 50% 아세톤수 1.8l(pH 조정안함)로 용해시켜 분리하고 다시 50% 아세톤수(pH2.0) 1.8l로 용리시킴과 동시에 SF-2052물질이 용리되었다.

다음으로 이 활성프렉숀을 감압 농축하여 아세톤을 제거하였다.

이 농축액에서 생성한 침전물을 여과하여 제거한 다음 CM-세파딕스 C-25(H⁺)(팔마시아제) 300ml를 충전한 탑을 통과시켜 유효물질을 흡착시켰다. 0.1M 염화나트륨용액 1.0l, 0.2M 염화나트륨용액 1.0l, 0.4M 염화나트륨용액 3l로 각각 세정한 다음 0.6M 염화나트륨용액으로 용리시켜 프랙숀 No.26-92(18ml)분획)에 유효성분이 용리되었다.

이 활성구분을 크로마토용 활성탄 200ml를 충전한 탑에 통과하여 유효성분을 흡착시켜 900ml의 물로 세정한후, 50% 아세톤용액 1.2l(pH 조정안함)와 50% 아세톤용액(pH2.0) 600ml로 차례로 용리시켜 유효물질이 수율좋게 용리되었다.

활성프랙숀 1.8l를 감압 농축하고 동결건조하여 백색의 SF-2052물질 (HCl염) 170mg(순도 약 20%)을 얻었다.

(3) 정제

실시예 1 (2)에서 얻어진 SF-2052물질 조분말 170ml을 5ml의 물에 용해하여 미리 0.1M염화나트륨용액으로 전처리한 CM-세파틱스 C-25(Na⁺) 180ml를 충전한 탑에 처리하였다.

0.5M 염화나트륨용액 2l로 용해시켜 분리한다음, 1.0M 염화나트륨 용액으로 전개하여 프랙숀 NO.8-20(18ml분획)에 걸쳐 유효성분이 용출되었다.

이 활성프랙숀 220ml를 크로마토용 활성탄 40ml를 충전한 탑에 통과하여 유효성분을 흡착시키고 250ml의 물로 세정한 다음, 50% 아세톤용액 200ml와 50% 아세톤용액(pH2.0) 200ml로 용리시킴과 동시에 유효물질이 용리되었다.

이 활성프랙숀 400ml를 감압 농축하고 동결건조하여 SF-2052물질(HCl염)이 백색분말로서 26mg(거의 순품)이 얻어졌다.

(4) 채취별법

실시예1 (1)의 배양방법으로 얻은 배양여액 10l를 다이어이온 HP-20 800ml를 충전한 탑에 통과하여 유효성분을 흡착시켰다.

4l의 물로 세정한 다음, 50% 아세톤수(PH4.0)로 용리하여 500ml 분획으로 프랙숀 NO. 2-6에 활성분획이 얻어졌다.

이 활성프랙숀을 감압농축하여 아세톤을 제거하였다. 이 농축액에서 생성한 침전물을 여과하여 제거한 다음, 앰버라이트 IRC-50(Na⁺)(톰 앤드 파스사제) 250ml를 충전한 탑에 통과하여 유효성분을 흡착시켰다. 2l의 물로 세정한후 0.1N HCl용액으로 용리하여 18ml분획으로 프랙숀 NO.240-336에서 유효성분이 얻어졌다.

이 프랙숀을 앰버라이트 IR-45(OH^-) 150ml를 충전한 탑에 통과하여 중화하였다(pH5.4). 이 용액을 크로마토용 활성탄 80ml를 충전한 탑에 통과하여 유효성분을 흡착시켰다. 400ml의 물로 세정한 후 50% 아세톤용액(pH 조정안함)과 50% 아세톤용액(pH2.4)을 각각 300ml씩 차례로 용리시킴과 동시에 유효성분이 용리되었다.

이 활성용액을 합한 600ml를 감압 농축하여 동결 건조하여 SF-2052물질이 담황색의 조분말로서 260mg(순도 16%)이 얻어졌다.

[실시예 2]

실시예 1 (3)에서 얻어진 SF-2052물질(HCl염) 26mg을 100ml의 물에 용해시켜, 강염기성 음이온 교환수지 앰버라이트 IRA-400(SO₄ ^--)의 레진 100ml의 탑에 통과시켜 통과액을 농축, 동결 건조하여 SF-2052물질의 황산염을 백색분말로서 30mg 얻었다.

(분해점 : >220℃)

[실시예 3]

(가) SF-2098주의 배양

종균으로 미크로모노스포라. 에스피. SF-2098주(일본 미공연 신청서 접수번호 제5073호)를 사용하여 종배지로서 글루코오스 2.0%, 펩톤 0.5%, 우육엑스 0.2%, 이스트 0.3%, 대두분 0.2%, 탄산칼슘 0.1%(살균전 pH 조정안함)의 배지를 사용하였다. 종균 3-4 백금이를 100ml용 3각 플라스크중 20ml의 상기 종배지에 접종하여 28℃ 4일간 배양하였다. 이것을 종배양으로 20개 배양하였다.

다음에 이 종배양 400ml를 500ml용 3각 플라스크중 생산배지 80ml에 4ml씩 100개에 접종하였다. 생산배지 조성은 물엿 4%, 대두유 0.3%, 솔류블 베지터블프로데인(Soluble Vegetable protein) 0.5%, 파머메디아 1.0%, 황산제1철 0.001%, 염화코발트 0.0001%, 탄산칼슘 0.2%(살균전 pH7'0)의 배지를 사용하였다.

배양은 28℃ 6일간 진탕 배양방식으로 실시하였다. 배양액을 6N 염산수로, pH2.0으로 조정한다음 하이프로스파넬을 여과조제로 사용하여 약 7.0l의 배양여액을 얻었다.

(나) SF-2052물질의 채취

실시예 3 (가)에서 얻어진 배양여액 7l를 앰버라이트 IRC-50(Na⁺)(톰앤드파스사제) 220ml를 충전한 탑에 통과하여 유효성분을 흡착시켰다.

1l의 물로 세정한 다음 0.4N HCl용액으로 용리시켜 250ml분획으로 프랙숀 NO. 2-5에서 유효성분이 용출되었다.

이 프랙숀을 0.2N NaOH 용액으로, pH4-6으로 조정한 다음 활성탄 150ml를 충전한 탑에 통과하여 유효성분을 흡착시켰다. 500ml의 물로 세정한 다음, 50% 아세톤용액(pH조정안함)과 50% 아세톤용액(pH 2.2)을 각각 400ml씩 차례로 용리시킴과 동시에 유효성분을 용리시켰다. 이 활성용액을 합한 800ml를 감압 농축하여, 아세톤을 제거하였다.

다음으로 농축액을 CM-세파딕스 C-25(팔마시아제) 200ml를 충전한 탑에 통과시켜 유효물질을 흡착시켰다.

0.3M 염화나트륨용액 1l, 0.5M 염화나트륨용액 1l로 세정한 다음, 0.5M 염화나트륨용액으로 용리시켜 프랙숀 No.102-172(20ml분획)에서 활성 프랙숀이 용리되었다.

이 활성구분을 크로마토용 활성탄 50ml를 충전한 탑에 통과하여 유효성분을 흡착시켜 200ml의 물로 세정한 다음 50% 아세톤용액 (pH2.0)을 각각 200ml로 용리시켜 유효물질이 수율좋게 용리되었다.

이 활성프랙숀 800ml를 감압 농축하고 동결건조하여 백색의 SF-2052물질을 HCl염으로 124mg(순도 20%) 얻어졌다.

다음으로 그중 120mg 을 50% 메타놀수 4ml에 용해시켜 미리 90% 메타놀수로 세정한 세파딕스 LH-10(팔마시아제) 380ml를 충전한탑에 처리하고 90% 메타놀수로 전개하여 프랙숀 NO.12-16(12ml분획)에서 유효물질이 전개되었다.

이 활성프랙숀 60ml를 감압 농축하고 동결건조하여 SF-2052물질(HCl염)의 순품을 백색분말로서 20ml 얻었다.

Claims (1)

1. 원소조성으로서 중량비로 탄소 35.69%, 수소 7.04%, 질소 11.80%를 포함하고, 수용액중에서에서 220nm-370nm에서 특징적인 자외부흡수 극대를 나타내지 않으며, 브롬화칼륨 정(錠)중에서 제1도의 적외부 흡수스펙트럼을 가지고, 제2도에서 실질적으로 대표되는 수소핵 핵자기공명 흡수스펙트럼을 가지며, 제3도에서 실질적으로 대표되는 탄소핵 핵자기공명 흡수 스펙트럼을 가져, 닌히드린, 레뮤, 그레익-레이박 정색반응이 양성으로 사카구치(坂口), 질산은 정색반응이 음성이며, 또 외관은 백색의 무정형분말이고 물에 용해하기 쉬우며, 메타놀에 가용이고 초산에틸, 클로로포름, 벤젠, 에테르의 유기용제에 불용이고, 수용액중에서 비선광도가 [α]²⁵ _D+87˚(C=1, 물)이며, 셀룰로오스박층 크로마토그라피의 R_f치가 전개용매 n-프로파놀-피리딘-초산-물(15:10:3:12)로 0.46이며, 페이퍼 크로마토그라피의 Rf치가 전개용매 n-부타놀-초산-물(2:1:1 상승법)로 0.09를 나타내며 안정성은 산성에서 중성에 걸쳐 비교적 안정하나 알칼리성에서 불안정한 수용성의 염기성의 항균성물질염을 특징으로하는 SF-2052물질 및 그 산부가염의 제조법에 있어서 SF-2052물질의 생산하는 방선균을 배양하여 그 배양물에서 항생물질 SF-2052물질을 채취함을특징으로 하는 신항생물질 SF-2052물질의 제조법.

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