DE2552638C3 - Thienamycin, Verfahren zu seiner Herstellung und Thienamycin enthaltende Arzneimittel - Google Patents

Description

mit dem optischen Drehwert [«]j'"t= +82,7° (0,1 Gewichtsteil in 100 Raumteilen einer lOmilümolaren wäßrigen Kaliumphosphatpufferlösung vom pH-Wert 6,95).

2. Verfahren zur Herstellung des Antibioticums Thienamycin gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, di>R man Streptomyces cattleya NRRL 8057 in einem üblichen wäßrigen Nährmedium, welches assimilierbare Quellen für Kohlenhydrate, Stickstoff und anorganische Salze enthält, in aerober Submerskultur züchtet, die Kulturflüssigkeit abtrennt und daraus das entstandene Antibioticum durch an sich bekannte Trennverfahren isoliert.

3. Arzneimittel, enthaltend Thienamycin und einen üblichen nichttoxischen, pharmazeutisch geeigneten Träger.

30

Die Entdeckung der bem^rkens* erten antibiotischen Eigenschaften des Penicillins hat auf diesem Gebiet ein großes Interesse hervorgerufen, <j s zur Auffindung a vieler anderer wertvoller Antibiotica, wie anderer Penicilline, Streptomycin, Bacitracin, Tetracycline, Chloramphenicol, Erythromycine, geführt hat. Im allgemeinen erstreckt sich die antibakterielle Aktivität aller «Dieser Antibiotica nicht auf gewisse klinisch wichtige pathogene Bakterien. Einige Antibiotica sind z. B. in trster Linie nur gegen gram-positive Bakterien wirksam. Ferner hat die im Verlaufe der weitverbreiteten Anwendung der bisher bekannten Antibiotica für die Behandlung von bakteriellen Infektionen erworbene Resistenz zu einem ernsthaften Resistenzproblem geführt.

Die Mangel der bekannten Antibiotica haben weitere Forschungen angeregt, um andere Antibiotica aufzufinden, die gegen einen weiteren Bereich von Krankheits- to erregern sowie auch gegen resistente Stämme von besonderen Mikroorganismen aktiv sind.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein neues und wertvolles Antibioticum zur Verfügung zu stellen, das in hochgradig wirksamer Weise das Wachstum π verschiedener gram-negativer und gram-positiver Mikroorganismen hemmt.

Der Gegenstand der Erfindung ist in den Patenten- »prüchen definiert.

Auf Grund umfangreicher taxonomischer Untersuchungen wurde der aus einer Bodenprobe isolierte Streptomyces cattleya als ein bisher fioch nicht beschriebener Actinomycet identifiziert und in der Kultursafnmlung Von Merck & Co., Ina, Rahway, N. j., V.St.A., als MA'4297 bezeichnet. Eine Kultur davon wurde als permanente Hinterlegung bei der Kultursämfnlung der Northern Regional Research Laboratories, Northern Utilization Research and Development Division, Agricultural Research Service, U.S. Department of Agriculture, Peoria, Illinois, V.StA„ hinterlegt und mit NRRL 8057 bezeichnet. Auch wenn nachstehend diese Hinterlegungsnummer nicht immer angegeben ist, ist unter der Bezeichnung Streptomyces catlleya immer dieser spezielle Stamm zu verstehen.

Die Klassifizierungsdaten für das Genus Streptomyces und die Kulturbeschreibungen von Streptomyces-Species, die sich in »Bergeys Manual of Determinative Bacteriology« (7. Auflage, 1957), in »The Actinomycetes«. Band II (1961) von S. A. Waksman und in »Cooperative Descriptions of Type Cultures of Streptomyces« von E. B. S h i r I i η g und D. G ο 111 i e b, »International Journal of Systematic Bacteriology«, P-and 18, Seite 69-189 (1968), Band 18, Seite 279-392 (1968), Band 19, Seite 391-512 (1969), und Band 22, Seite 265-394 (1972) finden, sind nach Streptomyces-Species mit morphologischen Merkmalen und Kulturmerkmalen ähnlich denjenigen von MA-4297 durchsucht worden. In den genannten klassischen Bezugswerken ist aber keine Streptomyces-Species beschrieben, die die orchideenfarbene Pigmentierung des Luftmycels, die morphologischen Eigenschaften und die Abwesenheit von diffusionsfähigem Pigment aufweisen, die zusammen die unterscheidenden MerkmaJe von MA-4297 bilden. Diese Umstände .echtfertigen und erfordern die Zuordnung einer neuen Streptromyces-Species.

Die morphologischen Merkmale und Kulturmerkmale von Streptomyces cattleya sind nachstehend zusammengefaßt:

Morphologie

Die Sporophoren sind kompakte Spiralen, die als Seiten- und Endzweige am Luftmycel auftreten. Die Sporen sind in ihrer Form ellipsoidisch bis zylindrisch, haben Größen von 0,9 μ χ 1.2 μ und kommen in Ketten von mehr als 10 vor.

Kulturmerkmale
Tomatenmark-Hafermehl-Agar

Vegetatives Wachstum — Unterseite bräunlich, flach, sich ausbreitend;

Luftmycel — orchideenfarben (10 gc), gemischt mit weiß: lösliches Pigment — keines.

Czapek-Dox-Agar (Saccharosenitrat-Agar)

Vegetatives Wachstum — farblos, flach, sich ausbreitend;

Luftmycel — spärlich, rosaweiß;

lösliches Pigment — keines.

Eieralbumin-Agar

Vegetatives Wachstum - bräunlich mit ins Graue gehendem orchideenfarbenem Anflug, flach, sich ausbreitend;

Luftmycel — orchideenfarben (10 gc), gemischt mit helleren Tönen der Orchideenfarbe und etwas weiß;

lösliches Pigment — keines.

Glycerih^Asparagin^Agar

Vegetatives Wachstum " Rückseite bräunlich mit graufösa Anflug, flach, sich ausbreitend)
Luftmycel — orchideenfarben (10 gc), gemischt mit etwas Weiß;
lösliches Pigment — keines^

Hefeextrakt-Glucose + Salz-Agar Vegetatives Wachstum — bräunlich mit ins Graue gehendem rosa Anflug; Luftmycel — orchideenfarben (IO gc), gemischt mit rosaweiß;

lösliches Pigment — keines.

Hefeextrakt-Malzextrakt-Agur

Vegetatives Wachstum — bräunlich;

Luftmycei — orchideenfarben (10 gc), gemischt mit rosaweiß;

lösliches Pigment — keines.

Pepton-Eisen-Hefeextrakt-Agar Vegetatives Wachstum — bräunlich; Luftmycel — keines; lösliches Pigment — geringe Braunfärbung des Mediums:

Melanin — negativ; HiS-Erzeugung — negativ.

Nähragar

Vegetatives Wachstum — hellbräunlich; Luftmycel — keines; lösliches Pigment — keines.

Nährstärke-Agar

Vegetatives Wachstum — rahmfarben bis bräunlich;

Luftmycel — keines; lösliches Pigment — keines; Hydrolyse von Stärke — mäßig.

Nährgelatine-Agar

Vegetatives Wachstum — rahmfarben; Luftmycel — keines; lösliches Pigment — keines; Gelatineverflüssigung — mäßig. Gelatinestichtulturen (Gelatin stabs)

25

JO

35 Magermilch

Vegetatives Wachstum — bräunlich;

Luftmycel — keines;

lösliches Pigment — keines;

Koagulation und/oder Peptonisierung — Teilpeptonisierung, wird alkalisch.

Tyrosin-Agar

Vegetatives Wachstum — bräunlich;

Luftmycel — Gemisch aus orchideenfarben (10 gc) und weiß;

lösliches Pigment — keines;

Zersetzung von Tyrosin — positiv.

Alle oben angegebenen Beobachtungen wurden, falls nichts anderes angegeben ist, nach 3wöchiger Inkubation bei 28°C angestellt. Der pH-Wert des für die Untersuchungen verwendeten Mediums war ungefähr neutral und betrug 6,8 bis 7,2. Die für die Beschreibung verwendeten Farbbezeichnungen s> .imen mit den Definitionen des »Color Harmony Mai>ua^!«, 4. Auflage (1958), Container Corporation of America, Chicago, Illinois, V.St.A-, überein.

Streptomyces cattleya wurde ferner auf seine Fähigkeit untersucht, verschiedene Kohlehydrate zu verwerten oder zu assimilieren. Zu diesem Zweck wurde der Mikroorganismus 3 Wochen bei 28°C auf einem synthetischen Grundmedium (PHd harn und Gottlieb) gezüchtet, das 1% Kohlehydrat enthielt Der pH-Wert des für die Untersuchung verwendeten Mediums war etwa neutral, (6,8 — 7,2). In Tabelle 1 ist die Verwertung der Kohlehydratquellen durch Streptomyces cattleya NRRL 8057 angegeben:

+ bedeutet gutes Wachstum;
± bedeutet Wachstum und
— bedeutet kein Wachstum

auf dem betreffenden Kohlehydrat.

40

Vegetatives Wachstum — bräunlich; LuFtmycel — keines; lösliches Pigment — keines; Gelatineverflüssigung — mäßig.

Kartoffelscheiben

Vegetatives Wachstum — mäßig, bräunlich; Lufimycel — spärlich, graurosaweiß; lösliches Pigment — keines.

Loefflers Blutserum

Vegetatives Wachstum — cremefarben; Luftmyi el — keines; lösliches Pigment — keines; Verflüssigung — keine.

Magermüch-Agar

Vegetatives Wachstum — bräunlich; Lufimycel — spärlich, weißlich; lösliches Pigment — schwache Bräunung des Mediums;

Caseinhydrolyse = positiv, ^

Lackmusmilch

Vegetatives Wachstum — bräunlich bis braun; Luftmycel — keines; Farbe — kein lösliches Pigment, Lackmüs^ndäkä^ _6f.

tor wird bläulich; Koagulation und/oder Peptonisierung — Teilpep*

ionisierung, v/ird alkalisch.

45

5o

55

Tabelle I

Glue ,se

Arabinose

Cellulose

Fructose

Inosit

Lactose

Xylose

Maltose

Mannit

Mannose

Raffinose

Rhamnose

Saccharose

Für das Ausmaß_des Wachstums bei Temperaturänderung, für den Sauerstoffbedarf und für den Einfluß von Nitrat auf den Mikroorganismus wurde folgendes gefunden:

Tenpeiaturbereich (Hefeextrakt-Glucose + SaIz-Agar)

28° C - gut

37°C - mäßig

50° C — kein Wachstum

Sauerstoffbedarf (Siichkultur in Hefeextrakt-Glucose + Salz-Agar)

aerob

Nitratreduktion — positiv.

Für die Erzeugung von Thienamycin eignen sich wäßrige Medien, die auch für die Erzeugung anderer Antibiotica verwendet werden, Solche Medien enthalten Quellen für Kohlenstoff, Stickstoff sowie durch den Mikroorganismus assimilierbare anorganische Salze, *

Im allgemeinen kann man Kohlehydrate, wie Zucker, z. B. Glucose, Fructose, Maltose, Saccharose, Xylose und Mannit und Stärkeprodukte, z. B. auf der Basis von Getreide, wie Hafer, Roggen, Maisstärke und Maismehl entweder allein oder im Gemisch als Quellen für assimilierbaren Kohlenstoff in den Nährmedium ver^ wenden. Die genaue Menge der Köhlehydratquelle(n) in dem Medium richtet sich zum Teil nach den übrigen Bestandteilen des Mediums; im allgemeinen variiert aber die Menge der Kohlehydrate zwischen etwa 1 und 6 Gewichtsprozent des Mediums. Diese Kbhlenstöffquellen können in dem Medium einzeln verwendet werden, oder es können mehrere Kohlenstoffquellen miteinander kombiniert werden. Im allgemeinen können bei den Fermentationsverfahren viele Proteine als Slickstoffquellen verwendet werden. Geeignete Stick stoffquellen sind z. B. Hefehydrolysate, Primärhefe, Sojabohnenmehl. Baumwollsaatmehl, Cascinhydrolysa- tp N/1 iiicnupllu/ncepr Ioclir*!*** ^nhI^mn^K^cfonHlAil** /ίγΙρ**

Tomatenmark. Die Stickstoffquellen werden entweder für sich allein oder in Kombination in Mengen von etwa 0,2 bis 6 Gewichtsprozent des wäßrigen Mediums angewandt.

Zu den anorganischen Nährsalzen, die dem Kulturmedium zugesetzt werden können, gehören die üblichen Salze, die Natrium-, Kalium-, Ammonium-, Calcium-, Phosphat-, Sulfat-, Chlor- oder Carbonationen zur Verfugung stellen. Ferner gehören dazu die Spurenmetalle, wie Kobalt, Mangan, Eisen und Magnesium.

Die in den Beispielen beschriebenen Medien dienen nur zur Erläuterung der großen Vielzahl verschiedener Arten von Medien, die bei dem Fermentationsverfahren verwendet werden können.

Die Fermentation wird bei Temperaturen im Bereich von etwa 20 bis 37°C durchgeführt; zur Erzielung der besten Ergebnisse führt man die Fermentation jedoch bei Temperaturen von etwa 22 bis 30⁰C durch. Der pH-Wert der zum Züchten der Kultur von Streptomyces cattleya und zur Erzeugung von Thienamycin geeigneten Nährmedien kann im Bereich von etwa 6,0 bis 8,0 variieren.

Obwohl das neue Antibioticum Thienamycin sowohl durch Oberflächenkultur als auch durch Submerskultur erzeugt werden kann, wird die Fermentation vorzugsweise in Submerskultur durchgeführt.

Eine Fermentation zur Herstellung des Antibioticums im kleinen Maßstab wird gewöhnlich durchgeführt, indem man ein geeignetes Nährmedium mit der das Antibioticum erzeugenden Kultur beimpft und die Fermentation nach Übertragung auf ein Produktionsmedium bei konstanter Temperatur von etwa 24° C in einer Schüttelmaschine mehrere Tage fortführt

Die Fermentation wird in einem das Medium enthaltenden sterilisierten Kolben in einer oder zwei Impfstufen durchgeführt. Das Nährmedium für die Impfstufe kann jede beliebige Kombination von Kohlenstoff- und Stickstoffquellen enthalten. Der Impfkolben wird in einer Kammer von konstanter Temperatur von etwa 28° C zwei Tage oder so lange geschüttelt, bis die Kultur zufriedenstellend ist, und etwas von der entstandenen Kultur wird verwendet, um entweder ein zweites [mpfmedium oder das Produktionsmedium zu beimpfen. Wenn zwischenstufige Impfkolben verwendet werden, werden sie im wesentlichen in der gleichen Weise entwickelt; d. h. ein Teil des inhaits des Koibens von der letzten Impfstufe wird zum Beimpfen des Produktionsmediums verwendet Die beimpften Kolben werden mehrere Tage bet konstanter Temperatur gcschüffelf, und am Ende der (nkubaiionszeit wird der Kolbehinhalt abzentrifugieft oder abfiltriert.

Für das Arbeiten in großem Maßstabe wird die Fermentation vorzugsweise in geeigneten Behältern durchgeführt, die mit einem Rührer und einer Einrichtung zürn Belüften des Fefmenlationsmediums versehen sind. Nach diesem Verfahren wird das Nähfmedium in dem Behälter hergestellt und durch

to Erhitzen auf Temperaturen bis etwa 120⁰C sterilisiert. Nach dem Erkalten wird das sterilisierte Medium ttiit einem zuvor gezüchteten Impfgut der Kultur beimpft und die Fermentation z. B. 3 bis 5 Tage unter Rühren und/oder Belüften des Nährmediums und Innehaltung einer Temperatur von etwa 24°C durchgeführt. Diese Methode zur Erzeugung von Thienamycin eignet sich besonders für die Herstellung großer Mengen des Antibioticums.

Γ)|ρ Hac Δ-niiHtnjir»nm enthaltenden !isch lien hier beschriebenen Verfahren hergestellten Fermentationsflüssigkeiten haben Aktivitäten im Bereich von etwa 50 bis 400 Einheiten je ml, wenn sie nach der Scheibendiffusionsmethode unter Verwendung von Staphylococcus aureus ATCC 6538P analysiert werden. Präparate des Antibioticums, die eine Aktivität von mindestens 2 Einheiten je mg aufweisen, können gereinigt werden, und das Antibioticum kann daraus nach einer Anzahl von Verfahren gewonnen werden. Ein solches Verfahren ist die Adsorption von Thienamycin an ein stark kationisches Austauschharz. Beispiele für solche Harze sind Sulfonate mit einem Styrol-Divinylbenzolgerüst.

z. B. das kemsländige Sulfonsäuregruppen aufweisende Polystyrol in der Natriumform.

Weiter gereinigtes Thienamycin erhält man durch Gelfiltration durch ein Polyacrylsäureamidgel mit einer Porengröße, die Moleküle mit einem Molekulargewicht von mehr als 1800 ausschließt.

Das absorbierte Antibioticum läßt sich von dem Kationenaustauschharz leicht mit wäßrigen Lösungen von Ammoniak oder organischen Basen, wie Pyridin, Picolinen, Lutidinen, Collidinen und Alkylaminen eluieren. Das so erhaltene Eluat kann gegebenenfalls nach anderen Reinigungsmethoden weiter gereinigt werden. So kann man das Eluat reinigen, indem man es durch Polyester, Polystyrol oder hydrophobe, vernetzte Divinylbenzolpolymerisate, leitet.

Ein bevorzugtes Verfahren zum Gewinnen von gereinigtem Thienamycin besteht darin, daß man eine Lösung des Antibioticums, wie die filtrierte Fermentationsflüssigkeit, deren pH-Wert auf einen Wert zwischen 4 und 5 eingestellt worden ist durch oine Kolonne leitet, die ein starkes Kationenaustauschharz vom Sulfonattyp in der Natriumform enthält Das Adsorbat wird dann mit einem geeigneten Eluierungsmittel, wie 2prozentigem wäßrigem Pyridin, eluiert Die Eluate werden in Fraktionen aufgefangen, deren Größe sich nach der Größe der Kolonne richtet Die weitere Reinigung kann nach einer Verfahrensfolge vorgenommen werden, bei der die folgenden chromatographisehen Medien angewandt werden: Anionenaustauschharze des Polystyrol-Trimethylammoniumtyps (z. B. in der Chloridform), Kationenaustauschharze vom PoIystyrolsulfonattyp (z.B. in der 2,6-Lutidiniumform), Gelfiltrationsharze (z. B. ein Polyacrylsäureamidharz) und polymere Absorptionsmittel (z. B. ein Polystyrolharz). Die Bioaktivität der Eluate wird durch Analysieren des Eluats unter Verwendung von Staphylococcus aureus ATCC 6538P als Analysenorganismus bestimmt

Analysen der antibakieficllen Aktivität werden, falls nichts anderes angegeben ist, nach dem folgenden Scheibendiffusionsverfahren durchgeführt* Die Analysenplatten werden folgendermaßen hergestellt: Eine über Nacht entwickelte Kultur des Analysenofganisnius Staphylococcus aureus ATCG 6538P in einem Nährmedium, das 0,2% Hefeextrakt enthält, wird fnitNährmediunii das J.2% Hefeextrakt enthält, tu einer Suspension mit einer Durchlässigkeit für Licht von einer Wellenlänge von 660 ίτιμ von 55% verdünnt, Diese Suspension wird zu Niihragar zugesetzt, das durch 2,0 g Hefeextrakt je Liter ergänzt worden ist und sich auf 47 bis 48°C befindet, wobei man eine Masse erhält, die 33,2 ml Suspension je Liter Agar enthält. 5 ml dieser Suspension werden in Petrischalen von 85 mm Durchmesser gegossen, und die Schalen werden gekühlt und bis zur Verwendung (maximal 5 Tage) auf 4° C gehalten.

Proben des zu analysierenden Anlibioticums werden hut kaliumphosphatsaurcs Kaliumphosphat-Puffer (pH-Wert 7) auf eine geeignete Konzentration verdünnt. Filterpapierscheiben von 12,7 mm Durchmesser werden in die Prüflösung getaucht und auf die Oberfläche der Analysenplaiie gelegt. Normalerweise werden für jede Probe zwei Scheiben auf die gleiche Platte einander gegenüber gelegt. Die Platten werden über Nacht bei 37°C inkubiert und die Hemmungszonen dann in Millimeter Durchmesser gemessen. Die in Millimeter gemessene Hemmungszone bestimmt die relative Stärke oder, wenn sie mit einer gereinigten Vergleichsverbindung, wie Cephalothin, verglichen wird, uie Stärke des Antibioticums in Einheiten/ml. Die in den Beispielen 4 bis 7 angegebene Aktivitätseinheit basiert auf geeichten Cephalothinlösungen mit Konzentrationen von 8, 4, 2 bzw. 1 y/ml. Eine Echtheit ist als diejenige Menge definiert, die der Berechnung zufolge die gleiche Hemmung erzeugt wie 1 γ Cephalothin/ml, wobei die Hemmungszone einen Durchmesser zwischen 16 und 21 mm hat.

Physikalische und chemische Eigenschaften
des Thienamycins

Thienamycin ist ein weißer fester Stoff, der in Wasser sehr löslich ist und eine begrenzte Löslichkeit in Methanol aufweist.

Das scheinbare Molekulargewicht in phosphatgepufferten Lösungen wird, bestimmt durch analytisches Ultrazentrifugieren unter Anwendung der Kurzkolonnen-Sedimentationsmethode und der Ultraviolettabsorption zur Überwachung der Sedimentationsgrenze der bei 300 nm absorbierenden Stoffe zu etwa 282 Dalton berechnet. Die Felddesorptions-Massenspektrometrie ergibt ein Molekulargewicht von 272. Aus einer Energiedispersionsanalyse der von dem Antibioticum unter dem Strahl eines Abtastelektronenmikroskops ausgesandten Röntgenstrahlen wurde in Verbindungsmolekulargewicht von 290+20 auf der Basis von Schwefel errechnet, der das einzige Element mit einer Ordnungszahl von mehr als 9 ist, das in signifikanten Mengen in dem Antibioticum vorkommt

Thienamycin hat die empirische Formel C11H16N2O4S, bestimmt durch Massenspektrometrie mit hoher Auflösung. Die berechnete Elementarzusammensetzung, die dieser empirischen Formel entspricht, ist die folgende: 48,52% Kohlenstoff, 5,92% Wasserstoff, 1032% Stickstoff, 23,5% Sauerstoff und 11,77% SchwefeL

Das Infrarotspektrum (Figur) des Thienamycins, bestimmt an einer Suspension in Nüjol, zeigt die folgenden Absorptionsmaxima;

scharfes Maximum bei
breite Maxima bei

1765 cm-'
1650-155OCm-',
2800-^2500 cm-' und
3500-3100Cm-¹,

Andere Bänden werden bei 1290, 1245, 1150--113O, 1065, 995, 970, 945--935, 885, 805, 785 Und 720Cm-¹ gefunden.

Ein bei 100 MHz aufgenommenes NMR-Spektrum (kernmagnetisches Resonanzspektrum) von aus D2O gefriergetrocknetem Thienamycin, untersucht in einer Konzentration von 1,5 mg je 0.4 ml D₂O, das eine Spur Natrium-2,2-dimethyl-2-silapentan-5-sulfonat als inneren Standard enthält, ergibt die folgenden Maxima:

Λ \7Τ\.Λ_\ H. J = fi R; Λ 1.1¹S. in 6 H;

(5 3.39.d.d. I H j = 6.0,2,9;δ4.20.m.2 H.

Thienamycin hat eine spezifische optische Drehung von [ix]'r ' = +82,7° (Konzentration 0,1 Gewichtsteil in 100 Raumleilen einer lOmillimolaren wäßrigen kaliumphosphatsauren Kaliumphosphat-Pufferlösung vom pH-Wert6.95).

Die Dispersion der optischen Drehung zeigt einen einzigen, positiven Cotlon-Effekt mit einem Maximum bei 311 nm und einer Mulde bei 242 nm. Der Zirkulardichroismus zeigt ein positives Maximum bei 287,5 nm und ein negatives Minimum bei 216 nm.

Das Ultraviolelt-Absorptionsspektrum des Thienamycins, aufgenommen in wäßriger Lösung im pH-Bereich von 4 bis 8, hat ein Maximum bei 296,5 nm (E \ 1=290, ε = 79ΟΟ) und eine Mulde bei 242 ηm

}5 (E W =88). Spektren, die unmittelbar nach der Herstellung der Lösungen bei einem pH-Wert von 2 aufgenommen sind, zeigen eine Rotverschiebung im Absorptionsmaximum auf 309 nm. Spektren, die unmittelbar nach der Einstellung des pH-Wertes auf 12

^o aufgenommen worden sind, zeigen eine Rotverschiebung des Absorptionsmaximums auf 300,5 nm.

»lic!«

Stoff, dessen Säurefunktion, bestimmt in 30millimolarer kaliumphosphatsaurer Kaliumphosphat-Pufferlösung unter Ausnutzung der durch den pH-Wert ausgelösten Verschiebung im Ultraviolett-Absorptionsspektrum, einen pKai-Wert von 3,08 aufweist.

Mit Ninhydrin, jodplatinat und Folinschem Reagens erhält man positive Farbreaktionen. Der Sakaguchi-Test ist negativ.

Wenn Thienamycin der Dünnschichtchromatographie auf Celluloseplatten, die einen fluoreszierenden Indikator enthalten, unterworfen und mit einem Gemisch aus 70% Äthanol und 30% Wasser entwickelt wird, wird es nach jedem der folgenden Kriterien gesondert bei einem Rf-Wert von 0,45 bis 0,50 festgestellt: 1) Bioautographie auf Agarplatten, die mit dem Detektor-Organismus Staphylococcus aureus MB-108, der nachstehend als Staphylococcus aureus ATCC 6538P identifiziert wird, beimpft worden sind; 2) Auslöschung der durch einfallendes ultraviolettes Licht erregten Fluoreszenz; 3) pfirsichfarbene Reaktion nach dem Besprühen mit Ninhydrin und Erhitzen; 4) langsames Ausbleichen des aufgesprühten Jodplatinat-Reagens.

Die Beweglichkeit von Thienamycin in verschiedenen weiteren Chromatographiesystemen ist nachstehend angegeben:

Lösungsmittelgemisch

Adsorptionsmittel

Butanol: Essigsäure: Wasser (40:10:50)
Äthanol: Wasser Π0:30)
n-PropanoI: Wasser (70: 30)

Äthanol :Wasser (70:30)
Äthanol: Wasser (70: 30)

Mikrokristalline Cellulose für die; Dünnschichtchrorhato- 0,43 graphie

Kieselgel G 0,49

Mikrokristalline Cellulose 0,48

Kieselsäuregel G 0,31

Mikrokristalline Cellulose 0,36

Absteigendes Papierchromalograifim auf Filterpapier Nr. 1 0,63

Dünnschichtchromatographie auf Kieselsäuregel HF, 0,44 vorgewaschen mit Äthanol

Die Rf Werte beziehen sich auf die Entfernung vom Anfangspunkt bis zum Zentrum der Bioaktivität (bestimmt durch Bioautographie an Staphylococcus •ureus ATCC 6538P). dividiert durch den Abstand der Lösungsmittelfmnt vom Anfangspunkt.

Die mit einem automatisierten Aminosäureanalysator durchgeführte Aminosäureanalyse eines Säurehydrolysats des Thienamycins ergibt eine mit Ninhydrin reaktionsfähige Hauptkomponente mit einer Reten-Honszeil in der Mitte zwischen derjenigen des Alanins und des Glycins, die Tilt Ninhydrin ein Reaktionsprodukt ergibt, dessen bei 440 nm bestimmte Extinktion um das 3fache größer ist als die bei 540 nm bestimmte Extinktion. Wenn das Antibioticum vor der Säurehydrolyse mit kalter Perameisensäure und dann mit Bromwasserstoff behandelt wird, wie es üblich ist, um Thioäthergruppen und Sulfhydrylgruppen in Sulfongruppen bzw. Sulfonsäuregruppen überzuführen, ergibt die Aminosäureanalyse eine mit Ninhydrin reaktionsfähige Hauptkomponente mit einer Retentionszeit, die nur wenig größer ist als diejenige der Asparaginsäure, wobei das Reaktionsprodukt mit Ninhydrin bei 540 nm bestimmte Extinktionen zeigt, die um das 3,2fache größer sind als die bei 420 nm bestimmten Extinktionen. Diese Komponente ist identisch mit Taurin (2-Aminoithansulfonsäure), was durch Vergleich mit der EIutionszeit einer authentischen Probe festgestellt wird, die der gleichen Aufeinanderfolge von Oxidation und 5äurehydroiyse unterworfen worden ist. Aus diesem Vergleich wird geschätzt, daß der Anteil des gewonnenen Taurins 0,8 μΜοΙ je mg des der Reaktionsfolge zugeführten Thienamycins beträgt.

Thienamycin zeigt eine optimale Stabilität in wäßriger Lösung, wenn es bei Konzentrationen unter I mg/ml und in Gegenwart von kaliumphosphatsauren Kaliumphosphat-Puffern gehalten wird, die einen pH-Wert zwischen 6 und 7 ergeben. Eine bei 0°C aufbewahrte wäßrige Lösung von 1 mg/ml (pH 7,0) hat z. B. eine Halbwertszeit von 20 Tagen, während die Halbwertszeit bei der gleichen Konzentration in

Tabelle II

tOmillimolarer Kaliumphosphatlösung (pH 7,0) auf 37 Tage verlängert wird. Wenn aber eine Lösung von 12 mg Antibioticum je ml lOmillimoIarer kaliumphosphatsaurer Kaliumphosphat-Pufferlösung bei 10⁰C aufbewahrt wird, zeigt sie nur eine Halbwertszeit von 3 Tagen. Diese Lösung, die anfänglich blaßgelb ist, nimmt im Verlaufe der 48stündigen Lagerung eine tiefdunkelgelbe Farbe an.

Die Halbwertszeit des Thienamycins im pH-Bereich unter dem Neutralpunkt bei Raumtemperatur beträgt:

346 Minuten bei pH-Wert 4,0; 30 Minuten bei pH-Wert 3,0; 6,7 Minuten bei pH-Wert 2,0. wobei in allen Fällen ein 30millimolarer kaliumphosphatsaurer Kaliumphosphat-Puffer verwendet wird, um die Wasserstoffionenkonzentration unter Kontrolle zu halten. Oberhalb des

jo Neutralpunktes bei 30°C beträgt die Halbwertszeit 10 Minuten bei pH-Wert 8,2, 5,7 Minuten bei pH-Wert 8,8 (Boratpuffer) und 2,1 Minuten bei pH-Wert 12 (0,01 molare Natronlauge).

Die antibiotische Aktivität und die Ultraviolettextinktion, bestimmt bei 296,5 nm, werden in Reaktionsgemischen, die anfänglich 0,05 μΜοΙ Antibioticum und 4 μΜοΙ Hydroxylamin je ml enthalten und bei einem pH-Wert von 7,0 bei 20°C inkubiert werden, streng proportional mit einer Halbwertszeit von 5,7 Minuten ausgelöscht. Eine Halbwertszeit von 2,5 Minuten wird beobachtet, wenn man als Reagens Cystein in einer Konzentration von 4 μΜοΙ/ml bei einem pH-Wert von 7,0 und 2G~C anwendet. SchiieSiich werden die antibiotische Aktivität und die Extinktion bei der Einwirkung von Präparaten von /?-Lactamase ausgelöscht, die durch Beschallungsabbau eines Stammes von Enterobacter cloacea erhalten werden.

Thienamycin weist das folgende antibiotische Wirkungsspektrum auf. Bei diesem Test wird die Bauer-Kirby-Scheibendiffusionsmethode angewandt, die nur in bezug auf die im vorliegenden Falle verwendete Agartiefe von 2 mm abgeändert ist. Die Ergebnisse, ausgedrückt in mm Durchmesser der Hemmungszone, sind in Tabelle II zusammengestellt

Mikroorganismus

Resistenz gegen	Antibiotisches Präparat**)	II	9,7	III
Antibiotica*)	I	γ Antibioticum/Scheibe***)	39
	12	39	6,6
	19	26	38
-	40	48	38
P	27,5		24
-	48,5	46
—

Staphylococcus aureus
Staphylococcus aureus
Streptococcus faecalis
Bacillus subtilis

2985

2314

755

964

12

Forlseizung

Mikroorganismus

Resistenz gegen Anlibiotisches Präparat**) Antibiotica*) j ,.

y Anlibioticum/Scheibe***) 12 9,7

Escherichia coli	2017	-	30	29	28
Escherichia coli	2964	P1C	28	27	27
Escherichia coli	2482	-	30	28	27
Klebsiella	2921	P	26	25	25
Klebsiella	2922	P	26	25	25
Enterobacter cloacae	2646	P1C	26	26	25
Enterobacter cloacae	2647	-	30	30	27,5
Proteus mirabilis	2830	P1C	23	22	21
n-n»„..,. ::		η /~*	OO C	^o
ι rCtCüS iiiGrgai/ΐε		1 , O		ZZ	ZU
Serratia	2840	P1C	25	24	23
Pseudomonas aeruginosa	2824	P1C	31	32	30
Pseudomonas aeruginosa	3210	P1C	27	27	25
Pseudomonas aeruginosa	2616	P, C	23	22	20,S

*} P = Penicilline, vertreten durch Ampicillin.

C = Cephalosporine, vertreten durch Cephalothin. **) 1: Rohes Präparat (310 Einheiten/mg). II: Mittlere Reinheit (13200 Einheiten/mg). III: Praktisch rein (geschätzt 51000 Einheiten/mg). Die Einheit der antibakteriellen Stärke ist in dem nachstehenden

Abschnitt über »Analyse« definiert. ***) Berechnet auf der Basis der nachstehenden, durch Hydroxylamin auslöschbaren Extinktion.

Fortsetzung von Tabelle II

Mikroorganismus

Vergleichs-Antibiotica****) 50

y Antibioticum/Scheibe CB KF

Staphylococcus aureus
Staphylococcus aureus
Streptococcus faecalis
Bacillus subtilis
Escherichia coli
Escherichia coli
Escherichia coli
Klebsiella
Klebsiella

Enterobacter cloacae
Enterobacter cloacae
Proteus mirabilis
Proteus morganii
Serratia

Pseudomonas aeruginosa
Pseudomonas aeruginosa
Pseudomonas aeruginosa

****) CB: Carbenicillin.

KF: Cephalothin.

AMP: Ampicillin.
R = resistentes Wachstum.

2985 2314 755 964 2017 2964 2482 2921 2922 2646 2647 2830 2833 2840 2824 3210 2616

34 18 30 34 28 0 26 13 0 16 26

0 19 28 22 20

33 30 18 49 24 13 21 23 18

25,5 12 R

Für eine weitere Auswertung von praktisch reinem Antibioticum wird die Agar-Verdünnungsmethode angewandt. Ein Impfgut aus 2 χ 10* bis 1 χ ΙΟ⁵ Mikroorganismen wird in Form eines Tröpfchens von 0,002 ml auf die Oberfläche von Mueller-Hinton-Agar aufgebracht, das eine Reihe von Verdünnungen des Antibioticums auf jeweils das Doppelte im Bereich von

Tabelle HI

0,01 bis 73y/ml enthält. Die Ergebnisse (Tabelle III) werden als geringste Hemmungskonzentration in y/ml ausgedrücki, d. h. als die niedrigste Konzentration des Antibioticums, bei der das Wachstum des Prüforganismus im Verlaufe von 18 Stunden bei 37° C noch gehemmt wird.

Prü !organism us

Resistenz gegen	Geringste Hemmungs
Antibiotica*)	konzentration
	y/ml
P	0,02
-	0,3
P, C	0,3
-	0,15
P	0,3
P	0,3
P, C	4,7
P, C	4,7
P, C	0,6
P, C	4,7
P, C	2,4

Staphylococcus aureus 2314

Eschericbip coil 2482

Escherichia coli 2964

Escherichia coli 2017

Klebsiella 2921

Klebsiella 2922

Proteus mirabilis 2830

Serratia 2840

Pseudomonas aeruginosa 2824

Pseudomonas aeruginosa 2616

Pseudomonas aeruginosa 3210

♦) P - Penicilline, vertreten durch Ampicillin.
C Cephalosporine, vertreten durch Cephalothin.

Thienamycin zeigt in vivo Aktivität gegen gram-negative und gram-positive Organismen und eignet sich daher zur Bekämpfung von bakteriellen Infektionen bei Wirtstieren. Zur Bestimmung der Aktivität in vivo wird Thienamycin in 0,I5molarer Kochsalzlösung, die mit 0,01 molarer Natriumphosphatlösung auf einen pH-Wert von 7,0 eingestellt worden ist, gelost und zur Untersuchung fünfmal nacheinander auf je das 4fache verdünnt. Weibliche weiße Schweizer Mäuse mit einem mittleren Körpergewicht von etwa 21 g werden intraperitoneal und subkutan mit dem in Nährflüssigkeit suspendierten Prüforganismus infiziert. Die Anzahl der injizierten Mikroorganismen wird nach genormten Plattenzähimethoden bestimmt. Zum Zeitpunkt der Snfektion und 6 Stunden später werden einige der Mäuse intraperitoneal, subkutan und oral mit dem Antibioticum behandelt. Für jede Konzentration des untersuchten Antibioticums werden 5 Mäuse verwen-

4Ί det Weitere zwei Mäuse, die nicht infiziert worden sind, werden ebenfalls mit dem Antibioticum behandelt, um festzustellen, ob die injizierte Menge des Mittels toxisch war. Für jeden der verschiedenen Verdünnungsgrade der infizierenden Kultur werden bei jedem Versuch weitere fünf Mäuse zur Kontrolle verwendet, um die Anzahl der Mikroorganismen zu berechnen, die für 50% der infizierten, unbehandelten Mäuse letal war (LD50). Diese Berechnungen werden auf Grund der Anzahl der am siebenten Tag nach der Infektion noch überlebenden Tiere durchgeführt, zu welchem Zeitpunkt die Menge des Antibioticums, die 50% der infizierten Mäuse schützen sollte (ED50) ebenfalls berechnet wurde.

Alle Tiere, die diese Infcktionsbehandlung erhielten und nicht mit dem Antibioticum behandelt wurden, verendeten innerhalb 48 Stunden nach der Infektion. Der Wirkungsgrad von Thienamycin mit einer Stärke von 30 000 Einheiten/mg ergibt sich aus Tabelle IV.

Tabelle IV

Untersuchung des Wirkungsgrades (an Mäusen)")

Mikroorganismus

Anzahl LD«,

Behandlungsart,
Dosen

mg/kg/Dosis

Staph. aureus 2949

Pseudomonas aeruginosa 3210

E. coli 2017

13

7
7
9

i. p. x 2
s. c. x 2
p. o. x 2

Lp
S.C.X3
i. p. X 2

0,012

0,08

0,67

0,45
2,05
0,375

°) X 3 Bedeutet Behandlung zUm Zeitpunkt der infizierenden Dosis sowie 2 und 4 Stunden nach

der Infektion.
X 2 Bedeutet Behandlung zum Zeilpunkt der infizierenden Dosis und 6Stunden später.

Λ Vor der Infektion lind der thefäpeütischeri Behandlung haben die Tiere 24Stunden keine Nahrung erhalten.

Thienamycin zeigt bei einmaliger intravenöser Verabfolgung an Mäuse in einer Dosis von 1 g/kg Körpergewicht keine toxischen Wirkungen.

Cephalotin wirkt bei intravenöser Verabfolgung an Mäuse in einer Dosis von 5 g/kg Körpergewicht nicht toxisch; vgl. CQLeeetaL, Clinical Medicine, Bd. 70 (1963), S. 1123.

Carbenicillin zeigt bei subkutaner Verabfolgung an Hunde in Dosen von über 2 g/kg Körpergewicht keine toxische Wirkung; vgl. P. A c r e d et al. Nature, Bd. 215 ίο (1967), S. 25 bis 30.

Ampicillin zeigt bei einer intravenösen Verabfolgung an Mäuse in Dosen von ZU bis 3 g/kg Körpergewicht keine toxische Wirkung; vgl. British Journal of Pharmacology, Bd. 18 (1962), S. 356 bis 369.

Thienamycin ist ein wertvolles Antibioticum, das gegen verschiedene gram-positive und gram-negative Bakterien aktiv ist und sich infolgedessen für die Human- und Veterinärmedizin eignet. Die Verbindung l".r.i -t* nntIkn^tnriolW \A'tt*C*l 7ΙΙΓ R oK t r\A I > ■ Tt ΙΎ *>nr* -Ut fiailll Ülj aillll/Cintt.1 IVIH-J imtlVI «.t*· Ui-IIUllUIUIIg TWII Z\l Infektionen verwendet werden, die durch gram-positive oder gram-negative Bakterien, wie z. B. Staphylococcus aureus, Proteus mirabilis. Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae. Pseudomonas aeruginosa und Enterobacter cloacae, verursacht worden sind. Das antibakterielle Mittel gemäß der Erfindung kann ferner als Zusatz zu Tierfutter, zum Konservieren von Nahrungsmitteln und als Desinfektionsmittel verwendet werden. Es kann z. B. in wäßrigen Mitteln in Konzentrationen von 0.1 bis 100 Teilen Antibioticum je Million Teile Lösung verwendet werden, um das Wachstum von schädlichen Bakterien auf ärztlichen und zahnärztlichen Geräten zu zerstören oder ζο hemmen; ferner können solche Mittel als Bakterizide für technische Anwendungszwecke, λ B. in Anstrichfarben auf wäßriger Basis oder in dem y, Siebwasser von Papierfabriken, verwendet werden, um das Wachstum schädlicher Bakterien zu unterdrücken.

Das Antibioticum gemäß der Erfindung kann in den verschiedensten pharmazeutischen Präparaten als einziger Wirkstoff verwendet werden. Sie können oral. örtlich, intravenös oder intramuskulär dargereicht werden.

Tabletten und Kapseln für die orale Darreichung können in Einheitsdosisforni vorliegen und herkömmliche Streckmittel, wie Bindemittel. z. B. Sirup, Gummiarabikum. Gelatine. Sorbit. Tragantharz oder Polyvinylpyrrolidon. Füllstoffe. /. B. Lactose. Zucker. Maisstärke. Calciumphosphat. Sorbit oder Glycerin, Gleitmittel, ζ. Β Magnesiumstearat. Talkum. Polyäthylenglykol oder Kieselsäure. Sprengmittel, wie Kartoffelstärke, oder Netzmittel, wie Nalnumlaurylsulfat. enthalten. Die Tabletten können in an sich bekannter Weise beschich tet stm. Oral darzureichende flüssige Präparate können beispielsweise in Form von wäßrigen Suspensionen. Ölsuspensionen. Lösungen. Emulsionen. Sirupen oder Elixieren vorliegen oder als trockenes Produkt zum Anmachen mit Wasser oder anderen geeigneten Trägern vor der Verwendung bereitgestellt werden Solche flüssigen Präparate können herkömmliche Zusätze, wie Suspendiermittel, Z. B, Sorbitsirup, Methyl* 6ö Cellulose, GlücosC'ZtJckersifup, Gelatine, Hydröxyäthyl· cellulose, Carboxymethylcellulose, Aluminiumstearatgel öder hydrierte Speisefette, Emulgiermittel, z. B. Lecithin, Sofbitanfhoriooleat oder Gummiarabikum, nicht· wäßrige Träger, wie Speiseöle, z. B. Mandelöl, fraklioliiertes Kokosnußöl, ölförmige Ester, Propylenglykol ode? Äthylalkohol, Konsefviefüngsmitfel, z. B. p*Hydro< xybenzoesäuremethyl- oder -pföpyleslef oder Sorbinsäure, enthalten. Zäpfchen enthalten herkömmliche Zäpfchengrundstoffe, z.B. Kakaobutter oder andere Glyceride.

Mittel für die Injektionen können in Einheitsdosisform in Ampullen oder in mehrere Dosen enthaltenden Behältern mit Zusatz eines Konservierungsmittels zur Verfügung gestellt werden. Die Mittel können als Suspensionen, Lösungen, Emulsionen in öligen oder wäßrigen Trägern vorliegen und können Formulierungsmittel, wie Suspendier-, Stabilisier- und/oder Dispergiermittel, enthalten. Der Wirkstoff kann auch in Form eines Pulvers vorliegen, das vor der Verwendung mit einem geeigneten Träger, z. B. sterilem, pyrogenfreiem Wasser, angemacht wird.

Die Mittel können auch in für die Absorption durch die Schleimhäute der Nase und des Halses od°r des Bronchialgewebes geeigneter Form hergestellt werden, in welchem Falle sie als pulverförmige oder flüssige Sprüh- oder Inhaliermittel, Pastillen oder Halspinselmittal karaitnoftnll, **.ar-Ax*n b^nnor» Ci\r· /iio DnknnrJliinn

Ιτ-l U\.ICIlg\,Jl\.lll TT\.IU\.1I nVllllt.II. I Ul UIW t^WIIUIlVlllJIIg, von Augen und Ohren können die Mittel in Form einzelner Kapseln, in flüssiger oder halbfester Form bereitgestellt werden oder als Troplen verwendet werden. Für die lokale Anwendung können sie in hydrophoben oder hydrophilen Grundstoffen als Salben. Creme. Spülungen. Farben oder Pulver formuliert werden.

Außer einem Träger können die Mittel gemäß der Erfindung andere Bestandteile, wie Stabilisierungsmittel. Bindemittel, Oxidationsverzögerer. Konservierungsmittel. Gleitmittel, Suspendiermittel. Verdicker oder geschmackgebende Mittel enthalten.

In der Veterinärmedizin. *ie bei der Behandlung von Hühnern. Kühen, Schafen, Schweinen und dergleichen, können die Mittel /. B. als in die Brust einzuspritzende Präparate entweder mit Langzeitwirkung oder mit schneller Wirkstoffabgabc hergestellt werden.

Die Dosierung richtet sich weitgehend nach dem Zustand und Gewicht des zu behandelnden Tieres, der Art der Infektion, dem Weg und der Häufigkeit der Darreichung, wobei die parenterale Applikation für allgemeine Infektionen und die orale Applikation für Darminfektionen bevorzugt werden.

Für die Behandlung von bakteriellen Infektionen beim Menschen wird die Verbindung gemäß der Erfindung oral oder parenteral nach herkömmlichen Methoden für die Behandlung mit Antibiotica in Mengen von etwa 2 bis b00 rng/kg/Tag und vorzugsweise von etwa 5 bis 100 mg/kg/Tag in vorzugsweise unterteilten Dosen, z. B. drei oder viermal pro Tag. dargereicht Die Mittel können in Dosiseinheiten dargereicht werden, die z. B. 25. 250. 500 oder 1000 mg Wirkstoff zusammen mit geeigneten physiologisch unbedenklichen Trägern oder Strcckmitteln enthalten. Die Dosiseinheiten liegen in Form von flüssigen Präparaten, wie Lösungen oder Suspensionen, oder als feste Stoffe in Tabletten oder Kapseln vor. Die günstigste Dosis ruhtet sich in jedem (alle nach der Art und Si hwereder /u behandelnden Infektion. Für Kinder werden geringere Dosen verwendet.

Die Beispiele erläutern die Erfindung,

Beispiel 1

Ein Glas mit einer gefriergetrockneten Kultur von Slreptörriyces cattleya wird aseptisch geöffnet und der Inhalt in einem Reagenzglas in 0,7 ml steriler Salzlösung der folgenden Zusammensetzung suspendiert!

Natriumcitrat
K₃HPO₄
KH₂PO₄
(NH₄)₃SO₄
MgSO₄ - 7 H₂O
Destilliertes Wasser

0,5 g 7,0 g 3,0 g 1,0 g 0.1g 1000 ml

0,2 ml dieser Suspension werden zum Beimpfen eines Kulturschrägröhrchens von Medium A (+ Agar) der folgenden Zusammensetzung verwendet:

Medium A	10,0 g
Hefeautolysat	10,0 g
Glucose	2,0 ml
Phosphatpuffer*)	0,05 g
MgSO4 · 7 H2O	1000 ml
Destilliertes Wasser
pH-Wert: wird mit NaOH auf 6,5
eingestellt.
*) Phosphatpufferlösung	91.0 g
KHiPO4	95,0 g
NazHPOi	1000 ml
Destilliertes Wasser
Für Schrägröhrchen setzt man Agar
zu - 25,0 g/I.

10

15

20

25

	Alter, Stunden	53	72
	48	35/41 h	34
Aktivität gegen ATCC	34/40 Ii
6538 P, mm Zone		5,9	5,0
Anfänglicher pH-Wert	6,3	6,8	6,2
Eingestellter pH-Wert	-
h bedeutet trüb.

Das beimpfte Schrägröhrchen wird 8 Tage bei 28° C inkubiert und dann bei 4° C gelagert. _J0

Ein Teil der Sporen und das Luftmycels dieses Schrägröhrchens wird zum Beimp'in eines 250 ml fassenden, mit Umlenkorganei? versehenen Erlenmeyer-Impfkolbens verwendet, der 5ö ml ,^l1ediurn A (ohne Agar) enthält. Dieser Impfkolben wird 2 Tage bei 28°C in einer mit 220 U/min laufenden Schottelmaschine (Hub 5,1 cm) geschüttelt, worauf sich eine zufriedenstellende Kultur entwickelt hat.

Fünfzehn 250 ml fassende Erlenmeyerkolben, die je

40 ml Medium B enthalten, werden je Kolben mit 1 ml 40 Konzentration der aus dem Impfkolben erhaltenen Kultur beimpft. Medium B hat die folgende Zusammensetzung:

Nach 53 Stunden werden die Flüssigkeiten aus 13 Kolben zusammengegossen. Ein Teil wird abzentrifugiert und analysiert Der Rest der Flüssigkeit wird filtriert, auf den pH-Wert 7 eingestellt, und 500 ml werden zu 10,7 g Feststoffen gefriergetrocknet. 1,5 g dieser Feststoffe werden in 25 ml eines Gemisches aus 1 Teil n-ButylalkohoI und 99 Teilen Wasser aufgenommen. Der pH-Wert der Lösung wird auf 7,0 eingestellt Diese Lösung wird durch eine 5 cm weite und 118 cm lange Kolonne von Polyacrylamidgel (Teilchengrößen 37 — 74 μ) gegossen, die zuvor mit dem Gemisch aus n-Butylalkohol und Wasser ins Gleichgewicht gebracht worden ist Das Gel wird mit der gleichen Lösung mit einer Geschwindigkeit von 10 ml/min entwickelt wobei man einen Vorlauf von 650 ml und dann 75 Fraktionen zu je 20 ml auffängt. Der Ablauf wird mit einem registrierenden Differentialrefraktometer überwacht Jede Fraktion wird auf ihre antibakterielle Aktivität analysiert. Thienamycin findet sich in den Fraktionen 34 bis 40 mit einem Maximum in der Fraktion 37.10 ml der Fraktion 37 werden zu 2,0 mg Feststoffen gefriergetrocknet Die Feststoffe werden für die Analyse in 5 ml Wasser aufgenommen. Analysenplatten werden über Nacht bei 28°C inkubiert. Die Ergebnisse sind die folgenden:

Zonengröße in mm;
Staph. aureus
ATCC 6538 P

Medium B

Maismehl

Lösliche Schlernpebestandteile Sojabohnenmehl

Natriumcitrat

CaCl₂ · 2 H₂O

MgSO₄ · 7 H₂O

CoCIv 6 H₂O

FeSO₄ ■ 7 H₂O

Polyglykoi M.G. 2000

Destilliertes Wasser

pH-Wert: wird mit NaOH auf 6,5 eingestellt.

20.0 g 10,0 g 15.0 g 4.0 g 0.5 g 0.1g 0,01g 0,01g 0.25 Vol.-% 1000 ml

45

80 y/ml 40 y/ml 20 y/ml 10 y/ml 30 mm
25 mm
21 mm
17mm

50

Beispiel 2

Kin Glas mit einer gefriergetrockneten Kultur von Streptomyces cattleya wird aseptisch geöffnet und der r, Inhalt in 0.8 ml steriler Salzlösung der folgenden Zusammensetzung suspendiert:

Diese 15 Produklionskolben werden für Zeiträume bis zu drei Tagen bei 28°C in eineF mit 220 U/min Umlaufenden Schüttelmaschine (Hub 5,1 cm) geschüttelt, wobei Während des Gärungsvorganges Analysen durchgeführt werden. Die Analysen Werden an der ■bzerilrifugierten Ferrnentalionsflüssigkeit vorgenom* men.

Vor der Analyse wird der pH-Weft der Fermenta* tiönsflüssigkeit, wie in der nachstehenden Tabelle angegeben, eingestellt:

Natriumcitral
K₂HPO₄
KH2PO4
(NH₄J₂SO₄
MgSO₄ ■ 7 H₂O
Destilliertes Wasser

0.5 g
7.0 g
3,0 g
1,0 g
O₁Ig
1000 ml

65 Diese Suspension wird zum Beimpfen von vier Schrägröhrchen von Medium A (+ Agar) der folgenden Zusammensetzung verwendet:

Medium A

Hefeautolysat
Glucose *

Phosphatpuffer*)
MgSO₄ · 7 H₂O
Destilliertes Wasser

pH-Wert: wird mit NaOH auf 6,5 eingestellt

*) Phosphatpufferlösung
JCH2PO4

Destilliertes Wasser

Für Schrägröhrchen setzt man Agar zu - 25,0 g/I.

10,0 g 10,0 g 2,OmI 0,05 g 1000 ml

91,0 g 95,0 g 1000 ml

Die beimpften Schrägröhrchen werden eine Woche bei 28° C inkubiert und dann bei 4° C gelagert

Ein Teil der Sporen und des Luftmycels eines der Schrägröhrchen wird zum Beimpfen eines 25OmI fassenden, mit Umlenkorganen versehenen Erl^nmey er-lmpfkolbens verwendet, der 50 ml Medium A enthält Dieser Impfkolben wird zwei Tage bei 28°C in einer mit 220 U/min umlaufenden Schüttelmaschine (Hub 5,1 cm) geschüttelt, worauf sich eine zufriedenstellende Kultur entwickelt hat

Fünfzehn 250 ml fassende Erlenmeyerkolben, die je 40 ml Medium B enthalten, werden je Kolben mit 1 ml der aus dem Impfkolben entnommenen Kultur beimpft Das Medium B hat die folgende Zusammensetzung:

Medium B	20,Cg
Maismehl	10,0 g
Lösliche Schlempebestandteile	'15.0 g
Sojabohnenmehl	4,0 g
Natriumeitrat	0,5 g
CaCl2 · 2 H2O	0.1g
MgSO4 · 7 H2O	0,01g
CoCI2 · 6 H2O	0,01g
FeSO4·7 H2O	0,25 Vol.-%
Polyglycol M.G. 2000	1000 ml
Destilliertes Wasser

Alter Stunden 48 53

72

pH-Wert 6,7 6,4

Aktivität gegen 38 40

ATCC 6538 P, mm

5,5 38 Sulfonsäuregruppen in der Natriumionenform mit einer Geschwindigkeit von 14 ml/min adsorbiert Das Adsorbat wird mit 200 ml entmineralisiertem Wasser gewaschen und mit 2prozentiger wäßriger Pyridinlösung eluiert, wobei man 6 Fraktionen zu je 70 ml auffängt Der pH-Wert der Fraktionen wird auf 7,0 eingestellt

Von allen Fraktionen werden Analysen durchgeführt; die Zonendurchmesser sind nachstehend angegeben:

Filtrierte Fermentationsbrühe

pH-Wert: wird mit NaOH auf 6,5 eingestellt

Diese Kolben werden für Zeiträume bis zu drei Tagen bei 28° C in einer mit 220 U/min umlaufenden Schüttelmaschine (Hub 5,1 cm) geschüttelt wobei während der Fermentation Analysen durchgeführt werden. Die Analysen werden nach dem Zentrifugieren der Fermentationsflüssigkeit an der überstehenden Flüssigkeit durchgeführt Die Ergebnisse sind die folgenden:

Nach 53 Stunden werden die Flüssigkeiten aus 13 Kolben zusammengegossen und filtriert Der pH-Wert von 400 ml des Filtrafs wird mit verdünnter Salzsäure auf 4,8 eingestellt, worauf nian das Material an 140 ml Styrol-Divinylbenzol-Polymerisat mit kernständigen

Verdünnung	Zonendurchmesser
1:4	33 mm
1:8	30 mm
1:16	27 mm
1:32	23 mm
Eluatfraktionen
Ver	Zonendurch
dünnung	messer

1.
2.
3.
4., 5. u. 6.

1:5	22,5 mm
1:5	36 mm
1:5	20 mm
1:5	0 mrr.

Diese Analysen zeigen, daß 45% der Aktivität sich in den Eluaten befinden. Die Eluatfraktujn Nr. 2 liefert beim Gefriertrocknen 117 mg Feststoffe.

Die 117 mg Feststoffe v.-erden in 1,5 ml eines Gemisches aus 1 Teil n-Butylalkohol und 99 Teilen Wasser gelöst Die Lösung wird durch eine 1,4 cm weite und 81,5 cm lange Kolonne von Polyacrylamidgel gegossen, das zuvor mit dem Gemisch aus n-Butylakohol und Wasser ins Gleichgewicht gebracht worden ist Das Gel wird mit dem Gemisch aus n-Butylalkohol und Wasser mit einer Geschwindigkeit von 1 ml/min entwickelt, wobei Fraktionen zu je 2 ml aufgefangen werden. Der Ablauf wird mit einem registrierenden Refraktometer überwacht. Die Fraktioner v/erden in einer Verdünnung von 1 :20 auf ihre antibakterielle Aktivität analysiert. Von der Fraktion 44 bis zur Fraktion 53 wird ein Bioaktivitätsmaximum beobachtet Die Fraktionen 46 bis 49 und die Hälfte der Fraktion 50 werden miteinander vereinigt Aus den vereinigten Fraktionen wird 1 ml für die nochmalige Analyse abgenommen und der Rest gefriergetrocknet wobei man 4,2 mg teilweise gereinigtes Antibioticum erhält

Beispiel 3

Ein Glas mit einer gefriergetrockneten Kultur von Streptomyces cattleya wird aseptisch geöffnet und der Inhalt in 0,8 ml steriler Salzlösung der folgenden Zusammensetzung suspendiert:

Natriumeitrat
K₂HPO₄
KHjPO₄
(NH₄J₂SO₄
MgSO₄ · 7 H₂O
Destilliertes Wasser

7,0 g
3,0 g
1,0 g
0,1g
1000 ml

Diese Suspension wird zum Beimpfen von vier Schrägröhrchen Von Medium A (4- Agar) der folgenden Zusammensetzung verwendet:

Medium A

Hefeautolysat

Glucose

Phosphatpuffer*)

MgSO₄ · 7 H₂O

Destilliertes Wasser

pH-Wert: wird mit NaOH auf 6,5 eingestellt.

·) Phosphatpufferlösung
KHjPO₄
Na₂IIPO₄

Destilliertes Wasser

Für Schrägröhrchen setzt man Agar zu - 25,0 g/l.

10,0 g 10,0 g 2,0 ml 0,05 g 1000ml

91.0 g 95.0 g 1000 ml

Die beimpften Schrägröhrchcn werden eine Woche

U-: noo/. :_i...u: « ..—ι u«: jor _πηΐ»_πηκ» π:« t„:i A_n-

UCI ^U *— IIIr\ULMl;l I UIlU Wl* I T V^ gUIUgbl I. 1-.1If I 1*11 ULI Sporen und des Luftmycels eines der Schrägröhrchen wird zum Beimpfen von drei mit Umlenkorganen versehenen, 250 ml fassenden Erlenmeyer-Impfkolben verwendet, die je 50 ml Medium A enthalten. Diese Impfkolben werden einen Tag bei 28⁰C in einer mit 220 U/min umlaufenden Schüttelmaschine (Hub 5,1 cm) geschüttelt, worauf sich eine zufriedenstellende Kultur entwickelt hat.

Zwölf Erlenmeyerkolben mit einem Inhalt von je 2000 ml, die je 250 ml Medium C enthalten, werden mit je 7 ml der durch aseptisches Vereinigen des Inhalts der drei Impfkolben erhaltenen Suspension beimpft. Das Medium C hat die folgende Zusammensetzung:

Medium C	20.0 g
Maismehl	10,0 g
Lösliche Schlempebestandteile	15.0 g
Sojabohnenmehl	0.5 g
CaCI2 ■ 2 H2O	0.1g
MgSO4 · 7 H2O	0.01g
CoCI2 ■ 6 H2O	0,01g
FeSO4 ■ 7 H2O	4,0 g
CaCÜ3	0,25 Vol.-%
Polyglycol M.G. 2000	10 000 ml
Destilliertes Wasser
pH-Wert: wird mit NaOH auf 6,5
eingestellt

280 ml der vereinigten Fraktionen des Eluals der Ionenauslauschcrsäule werden bei einem pH-Wert Von 7,0 durch eine 40 ml fassende Säule von Anionenaustauschefhäfz vom Pölystyrol-Trimethylärhmöniümtyp in der Chlorionenform gegossen. Das Harz wird mit 160 ml entmineralisiertem Wasser gewaschen. Der Ablauf und die Waschfraktionen werden vereinigt wobei man 440 ml Lösung erhält Diese Lösung wird mit verdünnter Natronlauge auf einen pH'Wert von 8,2 eingestellt, unter vermindertem Druck auf 300 ml eingeengt, dann mit verdünnter Salzsäure auf den pH-Wert 7,0 eingestellt und zu 189 mg Feststoffen gefriergetrocknet

Die 189 mg gefriergetrockneten Feststoffe werden in einem Gemisch aus I Teil n-BulylalkohoI und 99 Teilen Wasser gelöst Diese Lösung (25 ml) wird durch eine 5 cm weite und 108 cm lange Kolonne von Polyacryl-

flllllUgCI \ ICfIUIIClIgIUUClI J/ — /Τ ft/ gVgir33i:il, Ulli tUIUI mil dem Gemisch aus n-Butylalkoliol und Wasser ins Gleichgewicht gebracht worden ist. Das Gel wird dann mit dem Gemisch aus n-Butylalkohol und Wasser mit einer Geschwindigkeit von 6,7 ml/min entwickelt. Der Ablauf wird mit einem registrierenden Differentialrefraktometer überwacht. Nach einem Vorlauf von 500 ml werden Fraktionen zu je 20 ml aufgefangen, jede Fraktion wird in einer Verdünnung von 1 :25 auf ihre antibak», iriellc Aktivität untersucht. Die Bioaktivität wird in den Fraktionen 37 bis 42 beobachtet, wobei das Maximum in der Fraktion 39 auftritt. Die Fraktionen 38 bis 41. die ein Gesamtvolumen von 80 ml haben, werden vereinigt Diese Lösung wird bei einem pH-Wert von 7,0 auf 10 ml eingeengt und gefriergetrocknet Man erhält 133 mg gefriergetrocknete Feststoffe, deren relative Stärke ungefähr sechsmal höher ist als die Stärke der in die Polyacrylamidgel Kolonne eingegebenen Probe, verglichen mit den mit Staphylococcus aureus durchgeführten Scheibendiffusionsanalysen.

Beispiel 4

Ein Glas mit einer gefriergetrockneten Kultur von StreDtomvces cattleva wird aseptisch eeöffnet und der Inhalt in 0,8 ml steriler Salzlösung der folgenden Zusammensetzung suspendiert:

45

Diese Kolben werden 72 Stunden bei 28° C in einer mit 220 U/min umlaufenden Schüttelmaschine (Hub 5,1 cm) geschüttelt Die Fermentationsflüssigkeiten werden vereinigt und ein Anteil wird für die Analyse zentrifugiert Die abgeernteten Fermentationsflüssigkeiten haben einen pH-Wert von 7,4, und die antibakterielle Analyse der nach dem Zentrifugieren überstehenden Flüssigkeit ergibt 43 mm.

Die Fermentationsflüssigkeit wird filtriert, der pH-Wert des Filtrats mit verdünnter Salzsäure auf 4,0 eingestellt und 3000 ml werden an 300 ml Styrol-PolyvinylbenzoI-Polymerisat mit kernständigen Sulfonsäuregruppen in der Natriumionenform mit einer Geschwindigkeit von 30 ml/min adsorbiert Das Adsorbat wird mit 300 ml entmineralisiertem Wasser gewaschen und mit 2prozentiger Pyridinlösung eluiert, wobei man acht Fraktionen zu je 150 ml auffängt Der pH-Wert der Fraktionen wird auf 7,0 eingestellt Die Eluatfraktionen Nr. 2 und 3 (300 ml) werden miteinander vereinigt und enthalten 48% des gesamten bioaktiven Materials, das in der Ionenaustauschersäu'e behandelt worden ist

Natriumeitrat
K₂HPO₄
KH₂PO₄
(NH₄)₂SO₄
MgSO₄ ■ 7 H₂O
Destilliertes Wasser

7,0 g
3,0 g
1.0 g
0,1g
1000 m¹

Diese Suspension wird zum Beimpfen von vier Schrägröhrchen von Medium A (+ Agar) der folgenden Zusammensetzung verwendet:

Medium A	10,0 g
Hefeautolysat	10,0 g
Glucose	2,0 ml
Phosphatpuffer*)	0,05 g
MgSO4 - 7 H2O	1000 ml
Destilliertes Wasser
pH-Wert: wird mit NaOH auf 63
eingestellt
*) Phosphatpufferlösung	91.0 g
KH2PO4	95,0 g
NaJHPO4	1000 m!
Destilliertes Wasser
FürSchrägröhrchen setzt man Agar
zu — 25,0 g/L

Die beimpften Schrägröhrchen werden eine Woche bei 28°C inkubiert und dann bei 4°C gelagert.

10 ml Medium Λ werden aseptisch auf eines dieser Schrägröhrchen übertragen, die Sporen und das Luflmycel werden abgeschabt und in Suspension gebracht, und 3,3 ml dieser Suspension werden um Beimpfe.f eines 21 fassenden, mit Umlenkorganen versehenen Erlenmeyerkolbens verwendet, der 500 ml Medium A enthält. Dieser Impfkolben wird 48 Stunden bei 28°C in einer mit 160 U/min uriliaufendcn Schütlelmaschine (Hub 5,1 cm) geschüttelt, worauf sich eine zufriedenstellende Kultur entwickelt hai.

Die Kultur dieses Impfkolbens wird zum Beimpfen von 1601 Medium A in einem 1901 fassenden Impfbehälter aus rostfreiem Stahl verwendet. Dieser Behälter wird 24 Stunden bei 28°C mit einer Rührgeschwindigkeit von 150 U/min und einer Luflströ-AKcr

pll

Anlibiotischc
Aktivität gegen
ATCC 65381»

Dextrose

mg/ ml

60

72

84

96

108

120

5,8
6,1
6,6
6.7
6,5
6.5

21,5

41,5

4,3
2,5
1,6
1,0
1,0
0,5

400 I der vollständigen Fermentationsflüssigkeit werden nach Zumischung eines Filterhilfsmittels in einer Filterpresse filtriert. Das Filtrat wird mit 1,2 g

iiiungsgesuiiwinuigKeii vuri öd i/min Demcocri. ms SchaUmvcrhülungsmittel wird nach Bedarf Polyglycol M.G. 2000 zugesetzt, aber nicht in Mengen von mehr als 0,1%. Die pH-Beslimmungcn ergeben die folgenden Werte:

Aller, Stunden
0 12

pH-Wert

6,4

6,4

43 I der Kultur dieses Impfbehälters werden zum Beimpfen von 467 I Medium E in einem 756 I fassenden Fermentationsbehälter aus rostfreiem Stahl verwendet. Das Medium E hat die folgende Zusammensetzung:

Medium E	25,0 g
Kristalline Dextrose
Maisqueliwasser	15,0 g
(auf nasser Basis)	10,0 g
Lösliche Schlempebestandtcile	5s0g
Baumwollsqatmedium	nnig
CnCU ■ ft H,n
CaCO3	3,0 g
(nach Einstellung des pH-Wertes)	0,25%
Polyglycol M.G. 2000	1000 ml
Leitungswasser

pH-Wert: wird mit NaOH auf 73
eingestellt.

In diesem Behälter wird die Fermentation 120 Stunden bei 24° C mit einer Rührgeschwindigkeit von 95 U/min und einer Luftströmungsgeschwindigkeit von 283 l/min durchgeführt Als Schaumverhütungsmittel wird nach Bedarf Polyglycol 2000, aber nicht in Mengen von mehr als 0,1%, zugesetzt Die antibaktenellen Analysen ergeben die folgenden Werte:

Alter	0	pH	Antibiotische	Dextrose
	12		Aktivität gegen
	24		ATCC 6538 P
h	36		mm	mg/ml
48	6,8		22
6,6	-	21,3
6,2	-	16,5
5,8	25	12,1
5.7	25	7.8

trat wird auf 6 C gekühlt, auf einen pH-Wert von 4.0 ±0,2 eingestellt und auf 6°C gehalten. Das kalte Filtrat wird an 38 I Styrol-Divinylbenzol-Polymerisat mit kernständigen Sulfonsäuregruppen in der Natriumionenform (Teilchengröße 0,3 bis 0,84 mm) mit einer Geschwindigkeit von 4 l/min adsorbiert Das Adsorbat wird mit 401 entmineralisiertem Wasser gewaschen. Das Adsorbat wird mit 2prozentiger wäßriger Pyridinlösung eluiert. wobei drei Fraktionen zu je 19 1 aufgefangen und analysiert werden. Die antibakterielle Analyse zeigt, daß die Eluatfraktionen Nr. 2 und 3 22% der Aktivität enthalten. Diese Fraktionen werden miteinander vereinigt, auf 3,8 I eingeengt und auf einen pH-Wert von 7 eingestellt

Die so erhaltenen 3,8 1 Konzentrat werden an 2,5 1 Anionenaustauscherharz vom Polystyrol-Trimethylammonium-Typ (Teilchengröße 0,15 bis 0,3 mm) in der Chloridform mit einer Geschwindigkeit von 200 ml/min adsorbiert. Das Harz wird mit der gleichen Geschwindigkeit mit entmineralisiertem Wasser ausgewaschen. Es werden zehn Fraktionen zu je 1 I aufgefangen, und jede Fraktion wird, falls erforderlich, auf einen pH-Wert von 7.0 eingestellt Die Analysen ereeben. daß 75% der Bioaktivität sich in den Fraktionen 5 bis 8 befinden. Diese Fraktionen werden miteinander vereinigt und durch ein Filter mit Öffnungen von 0,45 μ filtriert. 3 I des Filtrats werden zu 16,6 g Feststoffen mit einer Stärke von 70 Einheiten/mg gefriergetrocknet

4 g dieser gefriergetrockneten Feststoffe werden in 50 ml einer O.imolaren 2,6-Lutidinacetat-Pufferlösung aufgenommen. Die Lösung wird bei einem pH-Wert von

so 6,3 durch eine folgendermaßen vorbereitete Säule mit Kationenaustauscherharz gegeben.

2,5 I Styrol-Divinylbenzol-Polymerisät mit kernständigen Sulfonsäuregruppen in der Wasserstoffionenform (Teilchengrößen 37 bis 74 μ) werden in die 2,6-Lutidinform umgewandelt Das Harz wird mit fünf Kolonnenvolumina von 0,1 molarem 2,6-Lutidinacetat-Puffer von einem pH-Wert von 6,3 ins Gleichgewicht gebracht Die ins Gleichgewicht gebrachte Harzsäule hat einen Durchmesser von 5 cm und eine Länge von 114 cm. Die Säule wird mit 0,1 molarer Pufferlösung mit einer Geschwindigkeit von 14 ml/min entwickelt.

Der Ablauf wird mit einem registrierenden Differentialrefraktometer überwacht Die Entwicklung wird durchgeführt, bis 220 Fraktionen zu je 20 ml aufgefangen worden sind. Von den Fraktionen Nr. 44 bis 142 wird jede zweite Fraktion bei einer Verdünnung von 1 :50 analysiert Die Bioaktivität wird in den Fraktionen 78 bis 136 bei einem Maximum in den Fraktionen 92 bis

94 festgestellt. Die Fraktionen 82 bis 116 werden ausgewählt und zu einer Lösung von 700 ml vereinigt, Diese Lösung wird in zwei Anteile zu je 350 ml geteilt und gefriergetrocknet.

Ein Teil der gefriergetrockneten Feststoffe wird in 0,tmolarer 2,6-Lutidinacelal-Pufferlösung von einem pH-Wert von 7 0 gelöst. Diese Lösung (27 ml) wird durch eine 5 cm weite und IÖ8cm lange Kolonne von Polyacrylamidgel (Teilchengrößen 37 bis 74 μ) gegossen, die zuvor mit der OjImolaren Pufferlösung ins Gleichgewicht gebracht worden ist. Dann wird das Gel mit der gleichen Pufferlösung mit einer Geschwindigkeit von 10 ml/min entwickelt.

Der Ablauf wird mit einem registrierenden Differentialrefraktometer überwacht. Die Entwicklung wird fortgesetzt, bis 105 Fraktionen zu je 20 ml aufgefangen Worden sind. Alle Fraktionen Von der Fraktion Nr. 51 bis zur Fraktion Nr. 90 werden in einer Verdünnung von 1 :50 analysiert. Die Analyse zeigt, daß die Bioaktivität in den Fraktionen 67 bis 75 mit einem Maximum in den Fraktionen 70 und 71 konzentriert ist. Die Fraktionen 68 bis 75 werden zu 162 ml Flüssigkeit vereinigt. 145 ml dieser vereinigten Fraktionen werden mit 3 ml einer 360millimolaren Natriumphosphatpufferlösung vom pH-Wert 7.0 versetzt, und die Lösung wird auf 9 ml eingeengt. Das Konzentrat, das 78% des gesamten, in die Polyacrylamidgel Kolonne eingebrachten bioaktiven Materials enthält, wird gefriergetrocknet, wobei man 185 mg erhält. Ein hinterbleibender Anteil von 17 ml der Fraktionen 68 bis 75 wird zu 1,9 mg Feststoffen mit einer Stärke von 1050 Einheiten/mg gefriergetrocknet.

Beispiel 5

Ein Glas mit einer gefriergetrockneten Kultur von Streptqmyces cattleya wird aseptisch geöffnet und der Inhalt in 0,8 ml steriler Salzlösung der folgenden Zusammensetzung suspendiert:

Natriumeitrat
K₂HPO₄

(NH₄J₂SO₄
MgSO₄ ■ 7 H₂O
Destilliertes Wasser

0.5 g
7,0 g
30 g

i'og

0,1g
1000 ml

Diese Suspension wird zum Beimpfen von vier Schrägröhrchen von Medium A (+ Agar) der folgenden Zusammensetzung verwendet:
Medium A

Hefeautolysat

Glucose

Phosphatpuffer*)

MgSO₄ - 7 H₂O

Destilliertes Wasser

pH-Wert: wird mit NaOH auf 6,5

eingestellt

*) Phosphatpufferlösung
KH2PO4
Na₂HPO₄
Destilliertes Wasser

Für Schrägröhrchen setzt man Agar
zu — 25,0 g/I.

10,0 g
10,0 g
2,0 ml
0,05 g
1000 ml

91.0 g
95,0 g
1000 ml

Die beimpften Schrägröhrchen werden eine Woche bei 28° C inkubiert und dann bei 4° C gelagert

10 ml Medium A werden aseptisch auf eines dieser Schrägröhrchen übertragen, die Sporen und das

Luftmycel werdt:fi abgeschabt und in Suspension überführt, und 3,3 ml dieser Suspension werden zum Beimpfen von 500 ml Medium A in einem 21 fassenden, mit Umlenkorganen versehenen Erlenmeyerkolben

¹S verwendet. Dieser Impfkölben wird 48 Stunden bei 28°C in einer mit 160 U/min umlaufenden Schüttelmaschine (Hüb 5,1 cm) geschüttelt.

Die Kultur aus diesem Impfkölben wird zum Beimpfen von 1601 Medium A in einem 190 I fassenden

K) Impfbehälter aus rostfreiem Stahl verwendet. In diesem Behälter wird die Fermentation 24 Stunden bei 28°C, einer Rührgeschwindigkeit von 150 U/min und einer Luftströmungsgeschwindigkeit von 85 l/min durchgeführt. Nach Bedarf wird als Schaumverhütungsmittel Polyglycol 2000, jedoch nicht in größeren Mengen als 0,1%, zugesetzt. Die pH-Wert-Bestimmungen ergeben folgende Werte:

Alter, Stunden 0 12

pH-Wert

6,3

6,6

35 1 der Kultur in diesem Impfbehälter werden zum Beimpfen von 467 I Medium E in einem 756 I fassenden Fermentationsbehälter aus rostfreiem Stahl verwendet. Das Medium E hat die folgende Zusammensetzung:

Medium E

Kristalline Dextrose 25,0 g

Maisquellwasser

(auf nasser Basis) 15,0 g

Lösliche Schlempebestandteile 10,0 g

Baumwollsaatmedium 5,0 g

CoCl₂ ■ 6 H₂O 0,01 g

CaCO₃

(nach Einstellung des pH-Wertes) 3,0 g

Polyglycol M.G. 2000 0,25%

Leitungswasser 1000 ml

pH-Wert: wird mit NaOH auf 7,3 eingestellt.

In diesem Behälter wird die Fermentation 120 Stunden bei 24⁰C, einer Rührgeschwindigkeit von 95 U/min und einer Luftströmungsgeschwindigkeit von 283 I/min durchgeführt. Nach Bedarf wird als Schaumverhütungsmittel Polyglycol 2000, jedoch nicht in größeren Mengen als 0,1 %, zugesetzt. Die antibakteriellen Analysen haben die folgenden Ergebnisse:

Alter

pH

Antibiotische Aktivität gegen ATCC 6538 P

0
12
24
36
48
60
72
84
96
108
120

6,9
6,8
6,3
6,4
6,3
6,4
6,8

T Λ
',"

7,1
7,2

7,1

26 32 25 25

OC

37

41,5

44,5

400 I der gesamten Fermentationsflüssigkeit werden Unter Beimischung eines Filterhilfsmittels in einer Menge von 4 Gewichtsteilen auf je 100 Raumteiie durch eine Filterpresse filtriert. Das Filtrat wird m't !,2 g Natrium-(äthylendinitrilo)-tetraäcetat versetzt. Das FiI-Ifat wird auf 6°C gekühlt, auf einen prNWert von 4,0±0,2 eingestellt und auf 6°C gehalten. Das gekühlte Filtrat wird an 38 I Styrol-Divinylbenzol-Polymerisat mit kernständigeti Sulfonsäuregruppen in der Natriumionenform (Teilchengröße 0,3 bis 0,84 mm) mit einer Geschwindigkeit von 4 l/min adsorbiert. Das Adsorbat wird mit 2prozentiger wäßriger Pyridinlösung eluicrt, wobei drei Fraktionen zu je 19 1 aufgefangen und analysiert werden. Die Analysen ergeben, daß 27% der Bioaktivität des Ausgangsgutes in den Fraktionen 2 und 3 konzentriert worden sind. Die Eluatfraktionen 2 und 5 werden vereinigt, auf 3,7 I eingeengt und auf einen pH-Wert von 7 eingestellt.

Das Eluatkonzentrat von 3,71 wird auf einen pH-Wert von ⁷,4 eingestellt und an 2,5 I Anionenaustauscherharz vom Polystyrol-Trimethylammonium-Typ in der Chlorionenform (Teilchengrößen 0,15 bis 0,3 mm) mit einer Geschwindigkeit von 200 ml/min adsorbiert. Dann wird das Harz mit der gleichen Geschwindigkeit mit entmineralisiertem Wasser eluiert.

Es werden zwei Fraktionen zu je 2 I₁ eine Fraktion zu 800 ml, eine Fraktion zu 4 1 und eine Fraktion zu 2 I aufgefangen und nach Bedarf auf einen pH-Wert von 7,0 eingestellt. Die Fraktion Nr. 4 (41), die 50% der Aktivität des Konzentrats enthält, wird durch ein Filter mit öffnungen von 0,45 μ filtriert. Das klare Filtrat wird in Schalen gefriergetrocknet, wobei man 12,4 g Feststoffe mit einer Stärke von 270 Einheilen/mg erhält.

4 g der gefriergetrockneten Feststoffe werden in 0,1 molarer 2,6-Lutidinacetat-Pufferlösung vom pH-Wert 6,3 aufgenommen. Die Lösung (50 ml) wird nach Wiedereinstellung des pH-Wertes auf 6,3 mit Essigsäure durch eine 5 cm weite und 114 cm lange Kolonne von Styrol-Divinylbenzol-Polymerisat mit kernständigen Sulfonsäuregruppen in der 2,6-Lutidinform (Teilchengrößen 37 - 74 μ) gegossen, die zuvor mit der u, 1 molaren Pufferlösung ins Gleichgewicht gebracht worden ist Dann wird das Harz mit der gleichen 0,1 molaren Pufferlösung von einem pH-Wert von 6,3 mit einer Geschwindigkeit von 14 ml/min entwickelt.

Der Ablauf wird mit einem registrierenden Differentialrefraktometer überwacht Die Entwicklung wird durchgeführt, bis 150 Fraktionen zu je 20 ml aufgefangen worden sind. Von der 72sten bis zur 150sten Fraktion wird jede zweite Fraktion in einer Verdünnung von 1 :50 analysiert Die Bioaktivität ist in den Fraktionen Nr. 76 bis 148 enthalten, wobei ein Maximum in den Fraktionen Nr. S2 bis 102 auftritt Die Fraktionen Nr. 86 bis 113 werden zu 580 ml einer Lösung vereinigt, die 71% der Bioaktivität des der Kolonne zugeführten Ausgangsgutes enthält Diese Lösung wird dann gefriergetrocknet

Die gefriergetrockneten Feststoffe werden in 0,1 molarer 2,6-Lutidinacetat-Pufferlösung (pH-Wert 7,0) zu 25 ml gelöst Die Lösung wird durch eine 5 cm weite und 108 cm lange Säule von Polyacrylamidgel (Teilchengrößen 37 — 74 μ) gegossen, die zuvor mit der 0,1 molaren Pufferlösung ins Gleichgewicht gebracht worden ist Dann wird das Gel mit der gleichen Pufferlösung mit einer Geschwindigkeit von 9 ml/min entwickelt Der Ablauf wird mit einem registrierenden Differentialrefraktometer überwacht Die Entwicklung wird fortgeführt bis 105 Fraktionen zu je 20 ml aufgefangen worden sind. Jede der Fraktionen 65 bis 80 wird in einer Verdünnung von 1 :200 analysiert. Die Bioaktivität findet sich in den Fraktionen 67 bis 76. Die Fraktionen 70 bis 72 werden vereinigt und zu 16,0 mg Feststoffen mit einer Stärke von 13 800 Einheiten/mg gefriergetrocknet. Die Fraktionen 69,73 und 74 werden vereinigt und zu 20,2 mg Feststoffen mit einer Stärke von 5200 Einheiten/mg gefriergetrocknet.
Die 16 mg gefriergetrockneten Feststoffe Werden in

ίο 0,1 molarer 2,6*Lulidinacetat-Pufferlösung (pH 7,0) zu 10 ml gelöst. Die Lösung wird durch eine 5 cm weite und 108 cm lange Säule von Polyacrylamidgel (Teilchengröße 37-74 μ) gegossen, die zuvor mit dem gleichen Puffer ins Gleichgewicht gebracht worden ist Das Gel

υ wird mit der Pufferlösung mit einer Geschwindigkeit Von 9 ml/min entwickelt. Der Ablauf wird mit einem registrierenden Differentialrefraktometer überwacht Die Entwicklung wird fortgesetzt, bis 105 Fraktionen zu je 20 ml aufgefangen worden sind. Jede der Fraktionen 65 bis 80 wird in einer Verdünnung von 1 :200 analysiert.

Die Bioaktivität findet sich in den Fraktionen 67 bis 75. Die Fraktionen 68 bis 72 werden vereinigt und zu 9,1mg Feststoffen mit einer Stärke von 15 000 Einheiten/mg gefriergetrocknet.

Beispiel 6

Ein Glas mit einer gefriergetrockneten Kultur von Streptomyces cattleya wird aseptisch geöffnet und der Inhalt in 50 ml sterilem Medium A in einem 250 ml fassenden, mit IMlenkorganen versehenen Erlenmeyerkolben suspendiert. Das Medium A hat die folgende Zusammensetzung:

Medium A

Hefeautolysat 10,0 g

Glucose 10,0 g

Phosphatpuffer**) 2,0 ml

MgSO₄ · 7 H₂O 0,05 g

Destilliertes Wasser 1000 ml

pH-Wert: wird mit NaOH auf 6,5
eingestellt.
*) Phosphatpuffi-'rlösung

K.H2PO4 91,0 g

Na.'HPO4 95.0 g

Destilliertes Wasser 1000 ml

Der beimpfte Kolben wird 48 Stunden bei 28° C in einer mit 220 U/min umlaufenden Schüttelmaschine (Hub 5,1 cm) geschüttelt 40 ml der 48-Stunden-KuItur werden aseptisch entnommen und mit 40 ml sterilem, 20volumprozentigen Glycerin gemischt Anteile von je 2 ml dieses Gemisches werden in sterile, 3,7 ml fassende Ampullen einpipettiert, die dann gefroren und in der Dampfphase eines mit flüssigem Stickstoff arbeitenden Tiefkühlers gelagert werden.

Der gefrorene Ampulleninhalt wird zum Beimpfen von 50 ml Medium A in einem 250 ml fassenden, mit Umlenkorganen versehenen Erlenmeyerkolben verwendet Dieser Impfkolben wird 24 Stunden bei 28° C in einer mit 160 U/min umlaufenden Schüttelmaschine geschüttelt

Anteile zu je 10 ml aus diesem lmpfkoiben werden zum Beimpfen von 500 ml Medium A in 2 1 fassenden, mit Umlenkorganen versehenen Erienmeyerkolben verwendet Die Impfkolben werden 24 Stunden bei

KOCO

29

28°C in einer mit 160 U/min umlaufenden Schüttelmaschine geschüttelt

mi des vereinigten Inhalt dieser Kolben werden zum Beimpfen von 467 I Medium A in einem 7561 fassenden Fermentationsgefäß aus rostfreiem Stahl verwendet In diesem Gefäß wird die Fermentation 24 Stunden bei 28°C bei einer Rührgeschwindigkeit von U/min und einer Luftströmungsgeschwindigkeit von 283 l/min durchgeführt Nach Bedarf, jedoch nicht in größeren Mengen als 0,1%, wird Polyglycol M.G. als Schaumverhütungsmittel zugesetzL Die Messungen der pH-Werte und des Dextrosegehalts haben die folgenden Ergebnisse:

Alter, Stunden 0 12

pH-Wert

6,4

6,4
8,1

1 dieser Kultur werden zum Beimpfen von 4082 I Medium E in einem 5670 I fassenden Fermentationsgefäß aus rostfreiem Stahl verwendet. Das Medium E hat die folgende Zusammensetzung:

Medium E

Kristalline Dextrose	25.0 g
Maisquellwasser
(auf nasser Basis)	15.0 g
Lösliche Schlempebestandteile	10.0 g
Baumwollsaatmedium
(Pharmamedia)	5.0 g
CoCI2 · 6 H2O	0.01g

CaCO₃

(nach Einstellung des pH-Wertes)

Polyglycol M.G. 2000

Leitungswasser

pH-Wert: wird mit NaOH auf 7,3
eingestellt

3,0 g
0,25%
1000 ml

In diesem Behälter wird die Fermentation 144 Stunden bei 24° C einer Rührgescnwindigkeit von

ίο 70 U/min und einer Luftströmungsgeschwindigkeit von 1537,5 I/min durchgeführt Nach Bedarf wird als Schaumverhütungsmittel Polyglycol M.G. 2000, jedoch nicht in größeren Mengen als 0,1%, zugesetzt Die Analysen werden nach dem Zentrifugieren der Fermentationsflüssigkeit an der überstehenden Flüssigkeit durchgeführt Die Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle unter der Oberschrift »Antibiotische Aktivität gegen ATCC 6538P« zusammengefaßt Die Analysen werden nach dem Scheibendiffusionsverfahren mit Filterpapierscheiben von 9,5 cm Durchmesser und iO-rni-Anaiyseripiaiten durchgeführt, und die Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle unter der Oberschrift »Antibiotische Aktivität (10-mI-Platten)« angegeben. Die 10-mI-Analysenplatten werden fol-

2=, gendermaßen vorbereitet: Eine über Nacht entwickelte Kultur des Analysenorganismus Staphylococcus aureus ATCC 6538P in einem 0,2% Hefeextrakt enthaltenden Nährmedium wird mit 0,2% Hefeextrakt enthaltendem Nährmedium zu einer Suspension mit einer Durchlässig -

iii keil für Licht mit einer Wellenlänge von 660 πιμ von 40% verdünnt Diese Suspension wird zu Nähragar von 47 bis 48° C zugesetzt, das mit 2,0 g Hefeextrakt je Liter ergänzt worden ist, wobei man einen Ansatz von 33,2 ml der Suspension je Liter Agar erhält. 10 ml dieser

η Suspension werden in Petriplatten mit einem Durchmesser von 85 mm gegossen, und die Platten werden gekühlt und bis zur Verwendung (höchstens 5 Tage) auf 4°C gehalten.

Alter

PlI

12

24

36

48

60

72

84

96

108

120

132

144

6,6
6,1
5,8
6,0
6,0
5.7
5,8
6,2
6,4
6.4
6,3
5,8 5,9

Dextrose

mg/ml

22,2

20,2

18,0

13,2

8,6

6,4

2,7

0,3

0,2

Antibiotische Aktivität gegen ATCC 6538P

41,5
43,0

Antihiotischc Aktivität (10-ml-Platlen)

21.5
21.5

26,5
25.5
27.5
36.0
35.(1
37.0
37,5
37,5

Die 40821 Fermcntalionsflüssigkeil werden nach 65 Natrium-(älhylcndiriitrilö)'tciraäcctal zugesetzt Das

Zumischung eines Filierhilfsmillels in Mengen von 4 Filtrat wird auf 6°C gekühlt, äUf einen pH-Wert von

Gcwiclitstcilcn auf je 100 Raumteile in einer 76-crii-Fil- 4,5 + 0,2 eingcstelll und auf 6°G gehalten. Das gekühlte

(erpresse filtriert. Zu dem Pillrat werden 12 g Filtrat wird mit einer Geschwindigkeit vöii 48 l/ittin an

480 I Siyrol-Divinylbenzol-Polymerisat mit kernständigen Sulfonsäuregruppen in der Natriumionenform (Teilchengrößen 0,3 bis 0,84 mm) adsorbiert Das Adsorbat wird mit 4801 entmineralisiertem Wasser gewaschen und dann mit 2prozentiger wäßriger Pyridinlösung mit einer Geschwindigkeit von 24 l/min eluiert wobei drei Fraktionen zu 300 I, 520 I bzw. 240 1 aufgefangen und bei einem pH-Wert von 7,0 analysiert werden. Die Analyse ergibt, daß die Eluatfraktionen 4%, 16% bzw. 6% der Bioaktivität des dem Ionenaustauscher zugeführten Ausgangsgutes enthalten. Die Eluatfraktion Nr. 2 wird auf 48 1 eingeengt und auf einen pH-Wert von 7 eingestellt

Die 48 I Konzentrat werden auf einen pH-Wert von 73 eingestellt und an 761 Anionenaustauscherharz vom Polystyrol-Trimethylammonium-Typ (Teilchengrößen 0,25 bis 03 mm) in der Chloridform mit einer Geschwindigkeit von 7,6 I/min adsorbiert Das Harz wird mit der gleichen Geschwindigkeit mit entmineralisiertem Wasser eluiert. ELs werden vier Fraktionen aufgefangen, /wei zu je 48 !, eine zu 70 1 und eine zu 48 I. Die Fraktionen werden auf einen pH-Wert von 7 eingestellt. Analysen ergeben, daß 68% der Anfangsbioaktivität sich in der 70-1-Fraktion befinden. Diese Fraktion wird auf 181 eingeengt, auf pH 7,0 eingestellt und durch ein Filter mit Öffnungen von 0,45 μ filtriert. Das Filtrat wird in Schalen gefriergetrocknet, wobei man 99 g Feststoffe mit einer Stärke von 310 Einheiten/mg erhält.

10 g der gefriergetrockneten Feststoffe werden in O.lmoiarer 2,6-Lutidinacetat-Pufferlösung vom pH 63 aufgenommen. Die Lösung (125 ml) wird mit Essigsäure wieder auf einen pH-Wert von 63 eingestellt und durch eine /\bcm weite und 142 cm lange Kolonne von Styrol-Divinylbenzol-Polymensat mit kernstandigen Sulfonsäuregruppen in der 2.6 l.utidinform (Teilchengrößen 37 bis 74 μ) gegossen, das zuvor mit dem Puffer ins Gleichgewicht gebracht worden ist. Die Kolonne wird mit O.lmoiarer Pufferlösung mit einer Geschwindigkeit von 25 ml/min entwickelt. Nach einem Vorlauf von 3 I werden 200 Fraktionen /u je 20 ml aufgefangen Von den Fraktionen Nr 3b bis 192 wird jede vierte Fraktion in einer Verdünnung von 1 : 200 analysiert. Die Bioaktivität ist in den Fraktionen Nr 56 bis 192 enthalten und erreicht ein Maximum in den Fraktionen Nr 92 bis % Die Fraktionen Nr. 80 bis 136 werden vereinigt und ergeben nach Zusatz von 590 ml entmineralmertem Wasser 1760 ml. Die vereinigte verdünnte Lösung, die 62% der dem Ionenaustauscher zugeführten anfänglichen Bioaktivität enthält, wird gefriergetrocknet.

Die gefriergetrockneten F esistoffe werden in 0.1 molarer 2.^f>Lutidinacetat-Pufferlösung mit einem pH-Wert vor 7.0 gelöst. Die Lösung (27 ml) wird durch eine 5 cm weile und 112 cm lange Säule von Polyacrylamidgel (Teilehengrößen 37 bis 74 μ) gegossen, die vorher mit der n.l molaren Pufferlösung ins Gleichgewicht gebracht worden ist Das Gel wird dann mit der gleichen Pufferlösung mit einer Geschwindigkeit von lOml/min entwickelt

Der Ablauf wird mit einem registrierenden Differöntialrcfraktometer uberwacflL Die Entwicklung wifd forlgesclzl, bis 105 Kiakliönch zu je 20 nil aufgefahgeff worden sind, jede der Fraktionen Nr. 70 bis 93 wird in einer Verdünnung von I :300 analysiert, Die Bioaktiv!' (ät findet sich in den Fraktionen Nf. 73 bis 82 Und erreicht ihr Maximum in den Fraktionen Nr. 77 und 78. Die Fraktionen 75 bis 80 werden zu 90 ifig Antibioticum mit einer mittleren Stärke von 10 000 Einheiten/mg gefriergetrocknet

Die 90 mg gefriergetrockneten Feststoffe werden in

4 ml O.OlmoIarer Kaliumphosphat-Pufferlösung (pH 7) aufgenommen. Diese Lösung, die 596 durch Hydroxylamin auslöschbare optische Dichteeinheiten enthält (diese Messung des Thienamycingehalts ist am Ende dieses Beispiels beschrieben), wird einer 1,7 cm weiten Kolonne zugeführt, die mit 90 ml vorgewaschenem hydrophobem, vernetztem Divinylbenzolpolymerisat beschickt ist und vor der Verwendung mit 180 ml 0,01 molarer Kaliumphosphat-Pufferlösung von 5°C und einem pH-Wert von 7 äquilibriert worden ist Das hydrophobe, vernetzte Divinylbenzolpolymerisat wird

vor der Verwendung nacheinander mit 1) 5 Raumteilen 1 η-Natronlauge und anschließend bis zur neutralen Reaktion des Ablaufs mit entmineralisiertem i^sser, 2)

5 Raumteilen 1 η-Salzsäure und anschließend bis zur neutralen Reaktion des Ablaufs mit entmineralisiertem Wasser, 3) je 5 Raumteilen Methanol, Aceton, einer ö.OOi iiiuiaren Lösung von Teiranatriumäthyiendiamintetraacetat und schließlich mit destilliertem Wasser gewaschen. Vor der Verwendung werden alle Lösungsmittel unter Vakuum gehalten.

Nach dem Einbringen der Probe in die Kolonne gießt man zweimal je 2 ml kaliumphosphalsaures Kaliumphosphat-Pufferlösung nach. Die Kolonne wird bei 5 C mit der Pufferlösung bei einer Strömungsgeschwindigkeit von 2 ml/mm entwickelt. Das F.luat wird in

so Fraktionen zu je 4 ml aufgefangen. Die nach dem Sammeln von 100 ml Eluat aufgefangenen und mit 253 ml endenden Fraktionen werden vereinigt und in einem rotierenden Verdampfer im Vakuum bei Temperaturen unter 10"C auf b ni eingeengt.

Γι Diese Lösung, die 436 durch Hydroxylamin auslöschbare optische Dithteeinheiten enthält, wird in eine 1.7 cm weite Kolonne eingegeben, die mit 90 ml hydrophobem, vernet/tem Divinylbenzolpolymerisai beschickt ist. welches, wie oben beschrieben, vorgewa

sehen und bei 5 C mit destilliertem Wasser ins Gleichgewicht gebracht worden ist. Im Anschluß an die Probe werden /wei Anteile destilliertes Wasser zu je 2 ml in die Kolonne eingegossen. Die Kolonne wird mit destilliertem Wasser mn einer Geschwindigkeit von

4Ί 2 ml/nun entwickelt. Das Fluat wird in Fraktionen zu je 4 ml aufgefangen. Die nach dem Auffangen von 100 ml Eluat erhaltenen und mit Hl ml endenden Fraktionen werden vereinigt und in einem rotierenden Verdampfer auf 2.73ml eingeengt; durch Gcfrier.-ocknen der

in Lösung erhält man b.49 mg Thienamycin Die zwischen 152 und 345 ml erhaltenen F raktionen werden miteinander vereinigt, in einem rotierenden Verdampfer auf 3.34 ml eingeengt und /u 11.53 mg Antibioticum gefriergetrocknet. Diese Fraktionen enthalten insge

i^r) samt 369 durch Hydroxylamin auslöschbare optische Dichteeinheiten. Dies entspricht einer 3.1 fachen Reim gung im Vergleich /u dem der ersten hydrophoben, vernetzten Divinylbcn/olpolymensal Kolonne /uge führten Material und ergibt cmc berechnete Stärke von

ho 31 000 Einheiten je mg Die spekirophotometrischc Analyse einer Probe dieses Produkts zeigt /T j> =253, bestimmt in einer käliümpliösphatsaurett K<iliuinphös^j phat-PuffcrlösUng vom pH-Wert 7 bei 297 rim,

Durch I iydroxyfamiH äusfösehbarc Extinktion

Der Anteil der bei 297 nrii beslimirileti Extinktionen, die auf den Gehalt unreiner Proben an Antibioticum züfückgefülm werden kann,- wird durch die selektive

Auslöschung dieser Extinktion (mit gleichzeitiger Inaktivierung der antibiotischen Aktivität) durch Umsetzung mit verdünntem Hydroxylamin bestimmt

Proben v/erden in 0,01 molarer Kaliumphosphat-Pufferlösung (pH-Wert 7,0) so hergestellt daß sie eine ■> anfängliche Extinktion A297 zwischen 0,05 und 2,0 aufweisen. Frisch hergestelltes, neutrales Hydroxylamin (NH₂OH · HCI+ NaOH bis zu einem End-pH-Wert von 7) wird bis zu einer Endkonzentration von 10 mMül/1 zugesetzt worauf man die Umsetzung mindestens 30 Minuten bei Raumtemperatur fortschreiten läßt Wenn man die dann bestimmte Extinktion A297 von der anfänglichen Extinktion (nach Korrektur für die Verdünnung durch das zugesetzte Reagens) subtrahiert, erhält man die durch Hydroxylamin auslöschbare Extinktion. Lösungen von reinem Thienamycin zeigen eine durch Hydroxylamin auslöschbare Extinktion von 94,5%.

B e i s ρ i e I 7 ,₀

10 g der 99 g gefriergetrockneter Feststoffe, die durch Reinigung an einem Anionenaustauscherharz vom Polystyrol-Trimethylammonium-Typ gemäß Beispiel 6 erhalten worden sind, werden in 0,1 molarer 2,6-Lutidinacetat-Pufferlösung vom pH-Wert 6,3 aufgenommen. Diese Lösung (125 ml) wird nach Wiedereinstellung des pH-Wertes mit Essigsäure auf 6,3 in eine 7,6 cm weite und 142 cm lange Kolonne von Styrol-Divinylbenzol-Polymerisat mit kernsländigen Sulfonsäuregruppen in der 2,6-Lutidinform eingegeben, die zuvor mit dem so Puffer ins Gleichgewicht gebracht worden ist. Die Kolonne wird mit 0,1 molarem Puffer mit einer Geschwindigkeit von 35 ml. min er..wickelt. Nach einem Vorlauf von 3,6 1 werden 2C0 Fraktionen zu je 20 ml aufgefangen. Von den Fraktionen Ni ο bis 194 wird jede j> vierte Fraktion in einer Verdünnung von I : 200 analysiert. Die Bioaktivität findet sich in den Fraktionen Nr. 18 bis 178 und erreicht ihr Maximum in den Fraktionen Nr. 62 bis 82. Die Fraktionen Nr. 42 bis 102 werden vereinigt und ergeben nach Zusatz von 640 ml w entmineralisiertem Wasser 1920 ml. Die vereinigic verdünnte Lösung enthält 63% der Bioaktivität des der Styrol-Divinylbenzol-Polymerisat mit kernsländigen Sulfonsäuregruppen Kolonne zugeführten Materials und wird gefriergetrocknet v,

Die gefriergetrockneten Feststoffe werden in 0.1 molarer 2.6-Lulidinacctat Pufferlösung (pH 7.0) gelöst. Diese Lösung (25 ml) wird durch eine 5 cm weile und 112 cm lange Kolonne von Polyacrylamidgel (Tcilchenf rößen 37 - 74 μ) gegossen, die zuvor mit der -,o 0.1 molaren Pufferlösung ins Gleichgewicht gebracht worden ist. Das Gel wird dann mit dem gleichen Puffer mit einer Geschwindigkeit von 10 ml/min entwickelt.

Der Ablauf wird mil einem registrierenden Differcnlialrefraktomcter überwacht. Die Entwicklung wird y, fortgosel/S. bis 125 Fraktionen /u je 20 ml aufgefangen worden sind. |ede der Fraktionen Nr. 70 bis 89 wird in einer Venlünung von I 300 analysiert Die ßioaktivität findet sich in den Fraktionen Nr. 72 bis 81 und erreicht ihr Maximum in der Fraktion Nr. 77. Die Fraktionen Nr. (,n 75 bis 79 werden zu löö,5mg Antibioticum mit einer Stärke von 8320 Einheiten/mg gefriergetrocknet

Die 100,5 mg gefriergetrocknete Feststoffe werden in 4 111I O.Oimolarör Kaliiiniphosphal· Pufferlösung (pH 7) aufgenommen- Diese Lösung, die 692 durch Hydroxyl· amin aüsiösclibare optische Einheiten enthält, Wird in eine 1,7 cm weite Kolönfie gegossen die mit 90 ml Vorgewascherieril hydrophobem, vernetzten! Diviiiyl* benzolpolymerisat beschickt und vor der Verwendung mit 180ml O.OImolarer Kaliumphosphat-Pufferlösung von 5°C und einem pH-Wert von 7 ins Gleichgewicht gebracht worden ist Vor der Verwendung ist das hydrophobe, vernetzte Divinylbenzolpolymerisat nacheinander mit 1) 5 Raumteilen 1 η-Natronlauge und anschließend bis zur neutralen Reaktion des Ablaufs mit entmineralisiertem Wasser, 2) 5 Raumteilen 1 n-Salzsäure und anschließend bis zur neutralen Reaktion des Ablaufs mit entmineralisiertem Wasser, 3) je 5 Raumteilen Methanol, Aceton, 0,001 molarer Lösung von Tetranatriumäthylendiamintetraacetat und schließlich mit destilliertem Wasser gewaschen worden. Alle Lösungsmittel werden vor der Verwendung unter Vakuum gehalten.

Nach der Probe werden in die Kolonne zwei Anteile kaliumphosphatsaure Kaliumphosphat-Pufferlösung zu je 2 ml eingegeben. Die Kolonne wird bei 5° C mit der Pufferlösung bei einer Strömungsgeschwindigkeit von 2 ml/min entwickelt. Es werden Eluatfraktionen zu je 4 ml aufgefangen. Die nach dem Auffangen von 109 ml Eluat erhaltenen und mit dem 309ten ml endenden Fraktionen werden miteinander vereinigt Zu diesem vereinigten Eluat setzt man 11,53 mg des nach Beispiel 6 an dem hydrophoben, vernetzten Divinylbenzolpolymerisat gereinigten Antibioticums zu, das 186 durch Hydroxylamin auslöVchbare optische Dichteeinheiten aufweist. Das vereinigte Eluat wird zusammen mit dem zugesetzten Antibioticum im Vakuum in einem rolierenden Verdampfer bei Temperaturen unter 10°C auf 7 ml eingeengt.

Diese Lösung, die 720 durch Hydroxylamin auslöschbare optische Dichteeinheiten enthält, wird in eine 1.7 cm weite Kolonne eingegeben, die mit 90 ml hydrophobem, vernetztem Divinylbenzolpolymerisat beschickt ist, welches, wie oben beschrieben, vorgewaschen und vor der Verwendung bei 5"C mit deslillie^rtem Wasser ins Gleichgewicht gebracht worden ist. Nach der Probe werden zweimal je 2 ml destilliertes Wasser in die Kolonne eingeführt. Die Kolonne wird mit destilliertem Wasser mit einer Geschwindigkeit von 2 ml/min entwickelt. Das Eluat wird in Fraktionen /u je 4 ml aufgefangen. Die nach dem Auffangen von 109 ml Eluat erhaltenen und mit dem 301stenml endenden Fraktionen werden vereinig! und in einem rotierenden Verdampfer auf 10.3 ml eingeengt. Diese Lösung, die 589 durch Hydroxylamin auslöschbare oplische Dichteeinheiten enthält, wird /u 23.6 mg Antibioticum gefriergetrocknet, dessen berechnete Starke 30 140 F.inheiten/mg beträgt.

Das so erhaltene Antibioticum ist ein weißer, amorpher, fester Stoff von faserartiger Konsistenz, von dem eine Probe in einer Giaskapillare bei Tempera tiirerhöhung um 3"C7inin ohne Auftreten einer flüssigen Phase Zersetzung erleidet: Die Substanz erweichl bei 130 bis 140 C unter Volumenverminderung des festen Stoffes, die bis 170- 174'C anhält; in dem letzlgenann len Temperaturbereich färbt sich die Substanz gelb; Sinlern und fortschreitende Intensivierung der Farbe bis rotbraun wird im Temperaturbereich von 180 bis 200°C beobachtet und schließlich findet man bei 205⁸C Verkokung und restliche Spuren von festem Stoff*

Eine weitere Probe dieses Materials zeigt bei der spektropliolottielrischen Analyse ein Exlihktiönsmaxi·' mutri bei 296,5 rim mil f?[* =268,2; Die Elerrierifararialyse hat die folgenden Ergebnisse: I) Gewichtsverlust bei 4sliindigem Trocknen im Vakuum 5,67%; 2) Zusammensetzung: 47,68% Kohlenstoff, 6,22% Wasser·

OR RO K.1Q

stoff, 11,48% Stickstoff. Diese Ergebnisse stimmen mit der empirischen Formel

C₁₁W₁BN₂O₄S . (NHj)o,28

Überein, die die folgende berechnete Elementarzusammensetzung hat:

C=47,68%; H =6,13%; N = I 1,52%; S= 11,57% und O=23,1%.

Die polarimetrische Analyse einer Lösung von I mg dieser Probe je ml lOmillimolarer Kaliumphosphat-Puf-

ferlösung zeigt eine spezifische optische Rotation [α]ί,'^l =+80°. Das Infrarotspektrum (Fig. I) einer Suspension dieser Probe in Nujol zeigt charakteristische Absorptionsmaxima bei 1765cnr', 1650-1550Cm ', -. 2800-2500Cm-¹ und 3500-3100Cm'. Ein bei 100MHz aufgenommenes kernmagnetisches Resonanzspektrum einer Probe dieses Produkts in Lösung in DjO zeigt ein Dublett bei ö 1,275, ein Paar von Dubletten bei <5 339 und Multiplette bei ö 3,15 und δ 4,20; in diese Maxima sind charakteristisch für Thienamycin.

Hierzu 1 Blatt Zeichnungen

Claims (1)

1. Patentansprüche:
   I. Thienamycin der allgemeinen Formel

   CH₃-CH(OH)

   S-CH₂-CH₂-NH₂

   (Π ίο

   COOH