CH646432A5 - Beta-lactam-antibiotika. - Google Patents

Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf die Antibiotika C-19393S2 und C-19393H2, welche neue Verbindungen sind, sowie auf deren Salze und auf ein Verfahren zur Herstellung 3s dieser Antibiotika C-19393S2 und/oder C-19393H2.

Es ist gelungen, eine Anzahl von Mikroorganismen aus Bodenproben zu isolieren und die durch diese Mikroorganismen erhältlichen Antibiotika zu untersuchen. Aufgrund dieser Versuche wurde festgestellt, dass ein gewisser Mikroor- 40 ganismus fähig ist, neue Antibiotika zu erzeugen, wobei dieser Mikroorganismus der Gattung Streptomyces angehört. Es wurde auch festgestellt, dass die Züchtung dieses Mikroorganismus in einem geeigneten Züchtungsmedium neue Verbindungen in der Kulturbrühe anzureichern vermag und dass 45 diese Verbindungen gegen gramnegative und grampositive Bakterien eine antimikrobielle Wirkung besitzen. Es wurden somit die oben erwähnten Antibiotika isoliert, welche aufgrund ihrer chemischen und physikalischen Eigenschaften als neu angesehen werden müssen und der folgenden allge- 50 meinen Formel entsprechen:

(I)

,H

,0=c\

H NH-COCH.

55

OOH

worin R den Rest -SO3H oder das Wasserstoffatom bedeutet.

In der obigen Formel I wird die Verbindung, in welcher R den Rest -SO3H darstellt, als Antibiotikum C-19393S2 und 65 die Verbindung, in welcher R das Wasserstoffatom darstellt, als Antibiotikum C-19393H2 bezeichnet.

Die vorliegende Erfindung bezieht sich daher worin R den Rest -SO3H oder das Wasserstoffatom bedeutet, und

(2) auf ein Verfahren zur Herstellung der besagten Antibiotika C-19393S2 und/oder C-19393H2, welches darin besteht, dass man einen zur Gattung Streptomyces gehörenden Mikroorganismus, welcher die Antibiotika C-19393S2 und/ oder C-19393H2 zu erzeugen vermag, in einem Kulturmedium züchtet, um dank dem Mikroorganismus in der Kulturbrühe die Antibiotika C-19393S2 und/oder C-19393H2 anzureichern, worauf man diese Antibiotika C-19393S2 und/oder C-19393H2 aus der besagten Brühe isoliert.

In den vorliegenden Beschreibung wird das Antibiotikum C-19393S2 nachstehend kurz als «C-19393S2» und das Antibiotikum C-19393H2 kurzerhand als «C-19393H2» bezeichnet.

Zur Herstellung der Antibiotika C-19393S2 und/oder C-19393H2 verwendet man gemäss vorliegender Erfindung einen zur Gattung Streptomyces gehörenden, die Antibiotika C-19393S2 und/oder C-19393H2 erzeugenden Mikroorganismus. Ein typisches Beispiel eines solchen Mikroorganismus ist Streptomyces sp. Stamm C-19393 (nachstehend hin und wieder als «Stamm C-19393» bezeichnet, welcher dadurch erhalten wurde, dass man eine Suspension einer in Schweden gesammelten Bodenprobe in sterilem Wasser auf einem Kulturmedium, welches sich aus 1% lösliche Stärke, 0,05% Harnstoff, 0,05% Polypepton (Daigo Nutritive Chemicals, Ltd., Japan), 0,05% Hefeextrakt (Difco, USA), 0,02% Dikaliumphosphat, 0,02% Kaliumchlorid, 0,01% Magnesiumsulfat, 5 ng/ml Bleomycin und 2% Agar besteht und einen pH-Wert von 7,0 aufweist, der Plattenkultur unterzieht und den bei Züchtung der Kolonie während 2 Wochen bei 28°C gebildeten Mikroorganismus wiederholt reinigt.

Die mikrobiologischen Eigenschaften des Streptomyces sp. Stamm C-19393 sind die folgenden:

a) Morphologische Eigenschaften

Das Luftmycel hat eine Dicke von ungefähr 1 ji. und erstreckt sich aus dem weit verzweigten, vegetativen Mycel. Dies verzweigt sich monopodial aus der Hauptachse unter Bildung von Nebenketten. Gerade verlaufende oder schwach verborgene Sporenketten, d. h. sogennanter «rectus flexibilis (nachstehend kurzerhand mit «RF» bezeichnet) können am Ende der Seitenkette festgestellt werden. Jede Spore hat eine zylindrische Form (0,35-0,55 u x 0,7-1,4 u) und eine glatte Oberfläche. Es werden weder spezifische Organe, wie z.B. sphärische Sporangien und Sclerotia, noch bewegliche Sporen beobachtet.

b) Züchtungseigenschaften

Die Züchtungseigenschaften des Stammes auf verschiedenen Medien finden sich in der folgenden Tabelle 1. Soweit nichts anderes ausgesagt wird, wurden die Eigenschaften nach Züchtung während 2 Wochen bei 28°C festgestellt.

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Tabelle 1

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Medium Wachstum Luftmycel Rückseite lösliches Pigment

Saccharose Nitrat-Agar mässig weiss farblos kein

Glucose-Asparagin-Agar schwach weiss farblos kein

Glycerin-Asparagin-Agar mässig weiss farblos kein

Stärkeagar mässig kein ocker kein

Nähragar mässig weiss elfenbeinfarben kein

Tyrosinagar mässig kein farblos kein

Hefeextrakt-Malzextrakt-Agar mässig kein gräulichgelb kein

Weizenmehlagar mässig weiss farblos kein

Der Stamm C-19393 zeigt ein ausgiebiges Wachstum auf einem 2% Weizenmehl, 2% Tomatenpaste, 0,2% Bovril (der Firma Bovril, England) und 2% Agar enthaltenden Medium, welches einen pH-Wert von 7,0 aufweist (nachstehend als «T Medium» bezeichnet), wobei gräulich-gelbe Luftmycelien reichlich gebildet werden. Es bildet sich kein lösliches Pigment.

c) Physiologische Eigenschaften

(1) Temperaturbereich für das Wachstum:

unterer Wert: < 15°C oberer Wert: 32 bis 35°C optimale Temperatur 26,5 bis 30°C

(2) Verflüssigung von Gelatine: positiv

(3) Hydrolyse von Stärke: positiv

(4) Peptonisierung von Magermilch: positiv Koagulierung von Magermilch: negativ

(5) Erzeugung von Melanoidpigmenten:

Tyrosin-Agar: negativ Pepton-Hefeextrakt-Eisen-Agar: negativ

(6) Die Assimilierung von Kohlenstoffquellen (auf Pridham-Gottlieb-Agar) erfolgt gemäss nachstehender Tabelle 2.

Tabelle 2

Kohlenstoffquellen

Assimilation

Glycerin i-Inositol

D-Mannitol

D-Xylose

L-Arabinose

D-Glucose

D-Galactose

D-Fructose

Maltose

Saccharose

Rhamnose

Raffinose

Stärke

Cellulose

Blindversuch (ohne Zusatz)

+ ± + + + + + +

+ +

Bemerkung: - kein Wachstum

+ Wachstum zweifelhaft + Wachstum

Aus den oben erwähnten, verschiedenen Eigenschaften geht hervor, dass der Stamm C-19393 offensichtlich der Gattung Streptomyces angehören dürfte. Aufgrund der obigen Beobachtungen wurde die taxonomische Stellung des Stammes C-19393 überprüft und dabei festgehalten, dass dieser Stamm ein weisses bis gelbes Luftmycel entwickelt, die i5 Sporenkette RF ist, die Sporenoberfläche glatt ist, Melanoid-pigmente und lösliche Pigmente auf den Medien nicht erzeugt werden, keine bestimmte Farbe auf der Rückseite festgestellt wird und der Stamm Mannitol nicht verwertet, wobei zu diesem Zwecke die folgenden Literaturstellen her-20 angezogen wurden:

Literaturzitat 1. S.A. Waksman, «The Actinomycetes», Bd. 2, 1961

Literaturzitat 2. Bergey's Manual of Determinative Bacte-25 riology, 8. Ausgabe, 1974

Literaturzitat 3. E.B. Shirling und D. Gottlieb, «International Journal of Systematic Bacteriology», Bd. 18, S. 69-189,1968; ibid, Bd. 18, S. 279-392,1968; ibid. Bd. 19, S. 391-512,1969; und ibid, Bd. 22, S. 265-394,1972.

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Es konnte indessen in den obigen Literaturstellen 1 bis 3 kein Stamm gefunden werden, welcher sämtliche Eigenschaften des Stammes C-19393 aufgewiesen hätte. Es wurden daher der neue Stamm mit 7 in der Literaturstelle 2 auf Seiten 35 751, Tabelle 17.41b beschriebenen Stämmen verglichen, welche sich auszeichnen durch weisse Luftmycelien, RF, keine Melanoidpigmenterzeugung und glatte Sporenoberfläche. Streptomyces galtieri, welcher Mannitol nicht verwertet, unterscheidet sich aber vom Stamm C-19393 inso-.40 fern, als der erstere auf einem Saccharosenitratmedium

(nachstehend als «Czapek» bezeichnet) nicht wächst. Aus-" serdem sind die Arten der durch den Stamm C-19393und S. galtieri verwerteten Quellen häufig verschieden. Unter den Stämmen, wie sie in der Tabelle 17.41b aufgezählt sind, ist 45 Streptomyces albovinaceus dem Stamm C-19393 bezüglich der Verwertung von anderen Kohlenstoffquellen als Mannitol ähnlich, jedoch vom Stamm C-19393 insofern verschieden, als der erstere Stamm rote bis rosefarbene, lösliche Pigmente erzeugt.

so Von den 41 in Tabelle 17.43b auf den Seiten 795-796 in der Literaturstelle 2 aufgezählten Stämmen, die sich durch ein gelbes Luftmycel, RF, keine Melanoidpigmenterzeugung und glatte Sporenoberfläche auszeichnen, verwertet lediglich Streptomyces canescens kein Mannitol. Dieser Stamm unter-55 scheidet sich aber vom Stamm C-19393 insofern, als der erstere auf Czapek nur schwach wächst und überdies Xylose und Rhamnose nicht verwertet. Dem Stamm C-19393 hinsichtlich der Verwertung von Kohlenstoffquellen ausser Mannitol ähnliche Stämme sind weiter unten beschrieben, 60 doch unterscheidet sich ein jeder dieser Stämme vom Stamm C-19393 durch die in Klammern wiedergegebenen Angaben. Sowohl die Farbe des Luftmycels als auch die Erzeugung löslicher Pigmente wurden mit dem Stamm C-19393 und den typischen Stämmen der entsprechenden Spezies verglichen: 65 Streptomyces chrysomallus (Farbe des Luftmycels und Erzeugung von löslichen Pigmenten), Streptomyces citreo-fluorescens (Farbe des Luftmycels und Erzeugung von löslichen Pigmenten), Streptomyces fimicarius (schwaches

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Wachstum auf Czapek), Streptomyces globisporus (grosser Sporendurchmesser, schwache Stärkeverwertung), Streptomyces globisporus subsp. vulgaris (schwaches Wachstum auf Czapek), Streptomyces griseinus (schwaches Wachstum auf Czapek und Koagulierung von Magermilch), Streptomyces parvus (Erzeugung löslicher Pigmente und grosser Sporendurchmesser) und Streptomyces setonii (schwaches Wachstum auf Czapek und Erzeugung von löslichen Pigmenten).

Überdies wurden von den in der Literaturstelle 3 beschriebenen Stämmen des «International Streptomyces Project» insgesamt 34 Stämme, die sich auszeichnen durch ein weisses bis gelbes Luftmycel, durch keinerlei Bildung von Melanoid-pigment, durch keine bestimmte Farbe auf der Rückseite, durch keine Bildung eines löslichen Pigmentes und durch die Anwesenheit von RF Sporenketten und einer glatten Sporen-oberfläche, direkt mit Stämmen gemäss Literaturstellen 1,2 und 3 und nötigenfalls sogar mit Originalstämmen davon verglichen, indem man den Stamm auf einem «T»-Medium, auf welchem der Stamm C-19393 relativ charakteristische Züchtungseigenschaften aufweist, züchtete, wobei man feststellte, dass Streptomyces saprophyticus relativ ähnliche Eigenschaften wie jene des Stammes C-19393 aufwies. Der Stamm C-19393 besitzt aber ein bestimmtes charakteristisches Merkmal, insofern als er nicht Mannitol zu assimilieren vermag, wogegen die meisten der Gattung Streptomyces angehörenden Species, welche weisse bis gelbe Luftmycelien aufweisen, dies zu tun vermögen. Der Stamm C-19393 unterscheidet sich somit eindeutig vom obgenannten Streptomyces saprophyticus. Daraus ergibt sich, dass der Stamm C-19393 eine neue Art darstellt, so dass er als Streptomyces sp. C-19393 bezeichnet wird. Dieser Stamm ist beim Fermentation Research Institute, Agency of Industriai Science and Technology, Tsukuba, Japan, unter der Nummer FERM-P Nr. 4.774; am 18. Januar 1979 beim Culture Collection of the Institute for Fermentation, Osaka, 17-85, Juso-honmachi 2-chome, Yodogewa-ku, Osaka 532, Japan, unter der Nummer IFO 13886; am 30. Januar 1979 beim American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, USA, unter der Nummer ATCC 31486, hinterlegt worden.

Wenngleich der Stamm C-19393 gemäss obigen Ausführungen beschrieben worden ist, so ist doch bekannt, dass verschiedene Streptomyces-Stämme nicht fixiert sind und eine spontane oder künstliche Mutation möglich ist. Somit soll der gemäss vorliegender Erfindung verwendbare Stamm jeden beliebigen Stamm umfassen, welcher der Gattung Streptomyces angehört und die Antibiotika C-19393S2 und/ oder C-19393H2 zu erzeugen vermag.

Die Züchtung im Hinblick auf die Herstellung der erfin-dungsgemässen Antibiotika kann durch Wachsenlassen des oben erwähnten Stammes in einem assimilierbare Nährmittel enthaltenden Kulturmedium geschehen. Als Kohlenstoffquellen in diesem Medium können beispielsweise Glucose, Stärke, Glycerin, Dextrin, Saccharose, Hirsebrei, Melassen usw. verwendet werden. Beispiele von Stickstoffquellen sind Fleischextrakte, getrocknete Hefe, Hefeextrakt, Sojabohnenmehl, Maisquellflüssigkeit, Weizenkeime, Baumwollsamenmehl, Ammoniumsulfat, Ammoniumnitrat usw. Nötigenfalls kann man auch dem Medium in geeigneten Mengen anorganische Salze, wie z.B. Calciumcarbonat, Natriumchlorid, Kaliumchlorid, Phosphorsäuresalze usw., sowie das Wachstum des Mikroorganismus günstig beeinflussende und die Herstellung der Antibiotika C-19393S2 und C-19393H2 begünstigende organische und anorganische Substanzen zugeben.

Auch Salze von Schwermetallen, wie z.B. Ferrosulfat, Kupfersulfat usw., und Vitamine, wie z.B. Vitamin Bi, Biotin usw., kann man nötigenfalls dem Medium zugeben. Auch die

Schaumbildung verhindernde Mittel und oberflächenaktive Mittel, wie z.B. Silikonöl, Polyalkylenglykoläther usw., können dem Medium hinzugefügt werden. Andere organische und anorganische Substanzen, welche das Wachstum s des Mikroorganismus günstig beeinflussen und die Erzeugung von C-19393S2 und/oder C-19393H2 begünstigen, können ebenfalls in geeigneten Mengen dem Medium zugesetzt werden.

Die Züchtung kann in an sich bekannter Weise, wie dies im 10 allgemeinen für die Erzeugung von Antibiotika der Fall ist, erfolgen, wobei man entweder ein festes Züchtungsmedium oder ein flüssiges Züchtungsmedium einsetzt. Die Züchtung in flüssigen Medien kann durch stationäre Züchtung, durch Rühren der Kultur, durch Schüttelkultur oder aerobe Kultur is erfolgen. Vorzugsweise wird man die Kultur unter Belüftung schütteln. Die Züchtung erfolgt vorzugsweise bei einer Temperatur im Bereiche von ungefähr 15°C bis ungefähr 32°C bei einem pH-Wert von ungefähr 4 bis ungefähr 8 und dies während einer Zeitdauer von ungefähr 8 Stunden bis ungefähr 20168 Stunden. Vorzugsweise erfolgt die Züchtung während 24 bis 144 Stunden.

In der Fermentierbrühe werden die Antibiotika C-19393S2 und/oder C-19393H2 vorwiegend extrazellulär erzeugt. Daher ist es von Vorteil, die erhaltene Kultur in mikrobielle 25 Zellen und die überstehende Flüssigkeit mittels Zentrifu-gieren oder Filtrieren zu trennen und hierauf das gewünschte Antibiotikum aus der überstehenden Flüssigkeit zu isolieren. Das gewünschte Antibiotikum kann aber auch direkt aus der Fermentierbrühe gewonnen werden.

30 Die Prüfung der Wirkung des erhaltenen Produktes gegenüber Comamonas terrigena IFO 13299 als Testorganismus und unter Verwendung von C-19393S2 bzw. C-19393H2 als Referenzsubstanz lässt sich nach der Zylinderplattenmethode oder der Papierscheibenmethode unter Verwendung eines Bouillon-Agar-Mediums oder TSA (Trypti-case Soy Agar der Baltimore Biological Laboratory, USA) ausführen.

Das Isolieren von C-19393S2 und C-19393H2 kann gemäss 40 der für die Isolierung von Metaboliten, welche durch Mikroorganismen erzeugt worden sind, üblicherweise zur Anwendung gelangenden Methode durchgeführt werden. Da beispielsweise die zur Hauptsache extrazellulär erzeugten C-19393S2 und C-19393H2 wasserlösliche, saure Substanzen 4s sind, wird man sie im allgemeinen isolieren, indem man die mikrobiellen Zellen durch Filtrieren oder Zentrifugieren isoliert und dann trennt, worauf man die Wirksubstanz aus dem Filtrat reinigt und gewinnt. Es ergibt sich daraus, dass man dank des verschiedenartigen Löslichkeitsverhaltens und -aus-50 masses in verschiednenen Lösungsmitteln, dank des Ausfällensverhaltens oder Ausfällungsgeschwindigkeit und dank der Adsorptionsaffinitätsunterschiede zu diesem Zwecke zu verschiedenen Massnahmen greifen kann, wie z.B. Ionenaus-tauschchromatographie, Molekularsiebchromatographie, ss Konzentration unter vermindertem Druck und Gefriertrocknung usw. und dies einzeln oder in einer geeigneten Kombinationsform und zwar in beliebiger Reihenfolge oder sogar wiederholt. Beispiele von verwendbaren Adsorptionsmitteln sind Aktivkohle, Adsorptionsharze, Anionenaustauscher-60 harze, gepulverte Cellulose, Silikagel usw. oder Trägermittel mit Molekularsiebeigenschaften. Beispiele von Eluierungslö-sungsmitteln, welche verwendet werden können, sind wäss-rige Lösungen von wasserlöslichen, organischen Lösungsmitteln, wie z.B. Aceton, Methanol, Äthanol, Propanol, Butanol, «s Isopropanol, Isobutanol usw., oder wässrige Lösungen von Säuren oder Alkali, Puffermitteln, wässrige Lösungen von anorganischen oder organischen Salzen und dies ungeachtet des Umstandes, dass die geeignet erscheinenden Lösungs

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mittel je nach der Art des Trägermittels verschieden sein können.

Das Antibiotikum C-19393Sz wird nach beendeter Züchtung aus der Fermentierbrühe unter Verwendung eines Filterhilfsmittels zwecks Abtrennung der mikrobiellen Zellen abfiltriert. Das so erhaltene Filtrat wird durch eine Säule von Aktivkohle unter neutralen oder schwach sauren Bedingungen geleitet und das adsorbierte C-19393S: mit einem hydropilen Lösungsmittelsystem eluiert. Im wässrigen Eluat findet sich dann weitgehend das antibakteriell wirksame Material. Da die erfindungsgemässe antibiotische Substanz sauer reagiert, wird man mit Vorteil für die weitere Reinigung Anionenaustauschharze vom Cl- oder CHbCOO Typus, wie Amberlite IRA-400,402 und 410 (Rohm & Haas Co., USA), Dowex-1 (Dow Chemical Co., USA), Diaion SA-21A und C (Mitsubishi Chemical Industries, Japan) verwenden. Die antibiotische Substanz wird dann mit einer wässrigen Natriumchloridlösung oder einer Pufferlösung weiter eluiert. Das Entsalzen des Eluates kann dadurch bewirkt werden, dass man das Eluat schwach sauer stellt und es erneut mit Aktivkohle chromatographiert und hierauf mit wässrigem Alkohol eluiert usw. Das die Wirksubstanz enthaltende Eluat wird dann unter vermindertem Druck bei niedriger Temperatur eingeengt und das Konzentrat mit Methanol oder Äthanol versetzt. Der gebildete Niederschlag wird hierauf durch Filtrieren entfernt und die erhaltene wässrige Alkohollösung erneut unter vermindertem Druck eingengt. Der so erhaltene, eingeengte Rückstand wird mit Aceton oder einer ähnlichen Substanz versetzt und der Niederschlag durch Filtrieren abgetrennt. Das so erhaltene Pulver lässt sich vorteilhafterweise durch Säulenchromatographie unter Verwendung einer Kombination von DEAE oder QAE Sephadex in Cl-Form (Pharmacia Co., Schweden) und einem Adsorptionsharz XAD (Rohm & Haas Co., USA) oder Diaion High Porous Type Resin HP-20 (Mitsubishi Chemical Industries, Japan, nachstehend hin und wieder als «Diaion HP-20» bezeichnet) weiter reinigen. Dies will besagen, dass man eine wässrige Lösung des auf diese Weise erhaltenen Pulvers durch DEAE Sephadex A-25 (Cl-Form) leitet und darauf adsorbieren lässt, worauf man nach dem Waschen mit Wasser die Säule mit 0,4-molarem wässrigem Natriumchlorid eluiert. Das Eluat wird dann auf einen pH-Wert von 5 eingestellt und einer Säulenchromatographie auf Aktivkohle unterworfen. Die Eluierung aus der mit Aktivkohle beschickten Säule erfolgt unter Verwendung von wässrigem Isobutanol. Bessere Resultate kann man allerdings durch Eluieren unter neutralen oder schwach basischen Bedingungen, die man durch Zugabe von verdünntem wässrigem Ammoniak oder dergleichen erzielt, durchführen. Die erhaltene Substanz wird hierauf der Säulenchromatographie unterworfen, wobei man XAD-II oder Diaion HP-20 verwendet. Die adsorbierte Wirksubstanz wird fraktioniert mit Wasser eluiert. Die die Wirksubstanz enthaltenden Fraktionen werden gesammelt und eingeengt und das Konzentrat hierauf der Säulenchromatographie unterworfen, wobei man QAE-Sephadex A-25 (Cl-Form) verwendet. Hierauf wird mit einer 0,2-molaren wässrigen Natriumchloridlösung eluiert. Das Eluat wird mittels Aktivkohle durch Chromatographie in der gleichen Weise, wie oben beschrieben worden ist, entsalzt. Dann wird das Eluat eingeengt und das Konzentrat einer XAD-II Säulenchromatographie unterworfen und hierauf eluiert und mit Wasser fraktioniert. Die Fraktionen enthalten solche mit einem einzelnen Peak auf einem flüssigen Chromatogramm, wie dies aus den nachstehenden Angaben hervorgehen wird. Die aktiven Fraktionen werden gesammelt und unter vermindertem Druck bei niedriger Temperatur zur Trockne eingeengt. Dann versetzt man den Rückstand mit Aceton oder dergleichen, wobei man das C-19393S2 erhält.

Beim Antibiotikum C-19393H> wird man die nach vollendeter Züchtung erhaltene Fermentierbrühe unter Verwendung eines Filterhilfsmittels zur Entfernung der mikrobiellen Zellen filtrieren. Das erhaltene Filtrat wird dann durch eine Säule von Aktivkohle unter neutralen oder schwach sauren Bedingungen geleitet und das adsorbierte C-19393 H2 mit einem hydrophilen Lösungsmittelsystem eluiert. Da diese erfindungsgemässe antibiotische Substanz sauer ist, kann man mit Vorteil für die weitere Reinigung Anionenaustauschharze der Cl- oder CHîCOO-Form, wie Amberlite IRA-400, 402,410, Dowex-1, Diaion SA-21A und C einsetzen. Die aktive Substanz wird mittels einer wässrigen Natriumchloridlösung oder einer Pufferlösung weiter eluiert. Das Entsalzen des Eluates kann so durchgeführt werden, dass man das Eluat neutral oder schwach sauer einstellt und es erneut über Aktivkohle chromatographiert und anschliessend mit wässrigem Alkohol eluiert usw.

Das die Wirksubstanz enthaltende Eluat wird unter vermindertem Druck bei einer niedrigen Temperatur eingeengt und das Konzentrat hierauf mit Methanol oder Äthanol versetzt. Der gebildete Niederschlag wird durch Filtrieren entfernt und die entstandene wässrige Alkohollösung erneut unter vermindertem Druck eingeengt. Für die weitere Reinigung des entstandenen Konzentrats bedient man sich mit Vorteil der Säulenchromatographie unter Verwendung einer Kombination von DEAE oder QAE Sephadex in Cl-Form und dem Adsorptionsharz XAD oder Diaion HP-20. Somit wird das zuvor erhaltene Konzentrat durch Diaion HP-20 hindurchgeleitet und mittels Wasser fraktioniert eluiert. Die aktiven Fraktionen werden eingeengt und das Konzentrat durch DEAE Sephadex A-25 (Cl-Form) hindurchgeleitet. Nach dem Waschen mit einer 0,02-molaren wässrigen Natriumchloridlösung erfolgt die Eluierung mittels 0,05-molarem wässrigem Natriumchlorid. Das entstandene Eluat wird hierauf durch Diaion HP-20 geleitet, das man zuvor mit einer wässrigen Natriumchloridlösung behandelt hatte. Die Eluierung erfolgt mit einer Methanol enthaltenden, wässrigen Natriumchloridlösung. Das Entsalzen des Eluates erfolgt über Aktivkohle mittels Chromatographie in der oben beschriebenen Weise. Das entstandene Eluat wird eingeengt und das Konzentrat unter Verwendung von Diaion HP-20 (0,149 bis 0,297 mm) der Säulkenchromatographie unterworfen und anschliessend mit Wasser fraktioniert eluiert. Die wirksamen Fraktionen werden vereinigt und eingeengt und das Konzentrat unter Verwendung von QAE Sephadex A-25 (Cl-Form), welches zuvor mit einer 0,2-molaren wässrigen Natriumchloridlösung behandelt worden war, der Säulenchromatographie unterworfen. Die Fraktionierung erfolgt unter Verwendung von 0,04-molarer wässriger Natriumchloridlösung. Die aktiven Fraktionen werden in der gleichen Weise, wie dies oben beschrieben worden ist, über Aktivkohle chromatographiert und dabei entsalzt. Das Eluat wird eingeengt und das Konzentrat unter Verwendung von Avicel (kristalline Cellulose) (hergestellt durch Asahi Chemical Industry Co., Ltd., Japan) der Säulenchromatographie unterworfen, worauf man die Säule eluiert und mit 90%igem wässrigem Propanol fraktioniert. Das Eluat wird eingeengt und das Konzentrat unter Verwendung von XAD-II (0,074 bis 0,149 mm) der Säulenchromatographie unterworfen und hierauf eluiert und mit Wasser fraktioniert. Die aktiven Fraktionen werden eingeengt und das Konzentrat einer präpara-tiven Säulenchromatographie unterworfen und anschliessend eluiert und mit einer Methanol enthaltenden Phosphatpufferlösung fraktioniert. Die ein einzelnes Peak aufweisenden Fraktionen werden vereinigt und eingeengt und das Konzentrat unter Verwendung von Diaion HP-20 (0,074 bis 0,149 mm) der Säulenchromatographie unterworfen und hierauf mit Wasser eluiert, um das Puffermittel zu entfernen.

s

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

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6

Die eluierten aktiven Fraktionen werden unter vermindertem Druck bei einer niedrigen Temperatur eingeengt und das Konzentrat gefriergetrocknet, wobei man das C-19393H2 als weisses Pulver erhält.

Die erfindungsgemässen Verbindungen vermögen Alkalimetallsalze oder Ammoniumsalze zu bilden. Beispiele von Metallsalzen einer jeden Komponente sind die Natrium-, Kalium-, Lithiumsalze usw. Die physikalischen und chemischen Eigenschaften des Dinatriumsalzes von C-19393S2, wie es gemäss Beispiel 1 erhalten wird, sind die folgenden:

(1) Aussehen: weisses Pulver

(2) Spezifische Drehung: [a]o —152° ± 15° (c=0,5 in Wasser)

(3) Elementaranalyse (%): (über Phosphorpentoxyd während 6 Stunden bei 40°C getrocknete Probe)

C = 36,29 ±1,0 H = 3,72 ±0,5 N = 6,07 ±0,5 Na = 9,70 ±1,0 0 = 31,09*

S = 13,13 ±1,0

*(Der Sauerstoffgehalt stellt den Rest dar, berechnet durch Subtrahieren der Werte der anderen Elemente)

(4) Molekulargewicht (berechnet, als wenn zwei Natriumatome pro Molekül vorhanden sind) 528 bis 429

(5) Bruttoformel: geschätzte Bruttoformel: Ci4Hi6N2Na209S2

(6) Ultraviolettabsorptionsspektrum: Das in Wasser gemessene Spektrum ist aus Figur 1 ersichtlich, wobei die Maximalwerte die folgenden sind:

X5S 240 ± 2nm (Ej* = 296 ± 20) und 285 + 2nm (E',1 = 245 + 20)

(7) Infrarotabsorptionsspektrum: Das in Kaliumbromid-tablette gemessene Spektrum befindet sich in Figur 2, wobei die hauptsächlichen Peaks (Wellenzahlen) die folgenden sind:

3450,3220,3000,1770,1700,1630,1515,1395,1240-1260, 1100, 1050, 1010,980,950,915,900,860,815,795,760,715, 670,625,590,530 (cnr1)-

(8) Dünnschichtchromatographie (Cellulose f (Tokyo Kasei Co., Ltd., Japan)

Lösungsmittelsystem

Rf-Wert a) Propanol : Wasser (4:1 )

0,33±0,1

b) Butanol : Essigsäure : Wasser (2:2:1)

0,54±0,1

c) Propanol : Äthanol : Wasser (5:2:3)

0,62±0,1

(9) Hochleistungs-Flüssigkeitchromatographie (Waters Associates Inc., USA)

a) Microbondapak Cis/5% Methanol-0,02-molarer Citrat-Puffer (pH 6,3), 1,5 ml/Min/cm (ca. 169 kg/cm2) Rt = 9,0 (Min) ± 1 (Min)

b) Microbondapak NH2/70% Methanol-0,02-molarer Borat-Puffer (pH 7,5), 1,5 ml/Min/cm (ca. 162 kg/cm2) Rt = 7,0 (Min)+1 (Min)

(10) Löslichkeit: in Chloroform, Äthylacetat und Aceton unlöslich, in Äthanol, Butanol und Pyridin schwach löslich in Methanol, Dimethylsulfoxyd und Essigsäure löslich und in Wasser leicht löslich.

(11) Farbreaktionen:

Positiv: Ehrlich- und Kaliumpermanganatreaktionen Negativ: Ninhydrin-, Greig-Leaback-, Dragendorff-, Fer-richlorid- und Sakaguchi-Reaktionen

Die physikalischen und chemischen Eigenschaften des gemäss Beispiel 2 erhältlichen Natriumsalzes von C-19393H2 sind die folgenden:

(1) Aussehen: weisses Pulver

(2) Elementaranalyse (%) (an einer über Phosphorpentoxyd während 6 Stunden bei 40°C getrockneten Probe):

C = 45,34 ±1,0 H = 4,98 ±0,5 N = 7,48 ±0,5 Na = 6,15± 1,0 S = 8,51 ± 1,0

(3) Molekulargewicht (berechnet für die 1 Natriumatom pro Molekül enthaltende Verbindung) 426 bis 322

(4) Bruttoformel: geschätzte Bruttoformel: CMHnNîNaSOe

(5) Spezifische Drehung: [aß6 -134° (c=0,156 in Wasser)

(6) Ultraviolettabsorptionsspektrum: Das in Wasser gemessene Spektrum findet sich in Figur 3 und die maximale Werte sind die folgenden:

*££ (EU) = 242 ± 2nm (395 ± 20) und 289 + 2nm (314 ± 20)

(7) Infrarotabsorptionsspektrum: Das in Kaliumbromid-tablette gemessene Spektrum findet sich in Figur 4, wobei die hauptsächlichen Peaks (Wellenzahlen) die folgenden sind: 3400,2980,2940,1770, 1700,1630, 1530, 1390,1265, 1215,

1130,1090,1065,1040,1000,920,840, 820,790,770,700, 620, 540,450 (cm"1)

(8) Zirkulardichroismusspektrum (in Wasser): Positiver Cottoneffekt bei 234 nm und negativer Cottoneffekt bei 206, 258 und 292 nm

(9) Dünnschichtchromatographie [unter Verwendung von Cellulose f (Tokyo Kasei Co., Ltd., Japan)]

Lösungsmittelsysteme: Rf-Wert a) Propanol:Wasser (4:1) 0,45 ±0,1

b) Butanol:Essigwasser:Wasser(2:1:1) 0,65±0,1

c) Butanol:Pyridin:Essigsäure:Wasser 0,45±0,1 ( 15:3:2:12), obere Schicht

(10) Hochleistungs-Flüssigchromatographie (Waters Associates Inc., USA)

a) Microbondapak Cis/8% Methanol-0,02-molarer Phos-phat-Puffer (pH = 6,3), 2,0 ml/Min/cm (ca. 134 kg/cm2); Rt = 5,3 + 1,0 (Min)

b) Microbondapak NH2/5% Methanol-0,02-molarer Phosphat-Puffer (pH = 5,7), 1,3 ml/Min/cm (ca. 211 kg/ cm2); Rt = 4,8 ±1,0 (Min)

(11) Farbreaktionen:

Positiv: Ehrlich- und Kaliumpermanganat-Reaktionen Negativ: Ninhydrin-, Greig-Leaback-, Dragendorff-, Fer-richlorid- und Sakaguchi-Reaktionen

(12) Löslichkeit: In Chloroform und Äthylacetat unlöslich, in Aceton, Äthanol und Butanol spärlich löslich und in Methanol und Wasser löslich.

Aus den verschiedenen oben beschriebenen Eigenschaften geht hervor, dass die Antibiotika C-19393S2 und C-19393H2 Antibiotika vom ß-Lactamtypus sein dürften, wobei aufgrund der einzelnen Elementaranalysenwerte und der geschätzten Molekulargewichte die geschätzten Molekularformeln für diese beiden Antibiotika die folgenden sein dürften: Ci4Hi6N2Na20oS2 und CwHn^NaOsS. Ausgehend vom Umstände, dass beide Antibiotika Maximalwerte von s

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241+3 nm und 287 ± 4 nm beim Ultraviolettabsorptionsspektrum aufweisen, wird angenommen, dass die erfin-dungsgemässen Antibiotika die gleichen Chromophoren wie bei MM-4550 unter den bekannten Antibiotika vom ß-Lac-tamtypus aufweisen.

Die Tabelle 3 zeigt Vergleichswerte von 'H-NMR-Spektren dieser drei Antibiotika, nämlich:

beim Antibiotikum C-19393S2 werden im Bereiche des CFh-Protons im Gegensatz zum MM-4550 zwei CHb-Signale (S 1,66 ppm, 3H, s, 1,73 ppm, 3H, s) beobachtet; beim Antibiotikum C-19393H2 werden ebenfalls zwei CHb-Signale (81,36 ppm, 3H, s; 1,47 ppm, 3H, s) beobachtet; das Hs-Proton (84,97 ppm, 1 H, m), das man beim MM-4550 fest7 646432

stellt, wird weder beim Antibiotikum C-19393S2 noch beim Antibiotikum C-l 9393 Hi festgestellt; die chemischen Verschiebungen der restlichen Protonsignale sind miteinander im wesentlichen gleich; die Kupplungskonstanten von HU bis s Hs und Hs bis Ha, erhalten durch Spinentkopplung mittels H5-Bestrahlung sind wertmässig die gleichen; beim Antibiotikum C-19393S2 wird die Anwesenheit von SO3 durch die starken Absorptionsbanden bei 1260 und 1050 cm-1 des IR-Spektrums bestätigt, während beim Antibiotikum 10 C-19393H2 die oben erwähnte von der SCb-Gruppe herrührende Absorption im IR-Spektrum nicht beobachtet wird.

Aufgrund dieser Überlegungen wurde den Antibiotika C-19393S2 und C-19393H2 die obige Formel I zugeschrieben.

Tabelle 3

'H-NMR-Spektren von C-19393S2und C-19393Ha

H2

S2

MM-4550"

8-CH3

l,36(3H,s)

l,66(3H,s)

l,45*(3H,d,J=6,5)

(100 MHz,

8-CH3

l,47(3H,s)

l,73(3H,s)

D2O, TMS)

N-Ac

2,16(3H,s)

2,16(3H,s)

2,05(3H,s)

(3mg/0,4ml)

H4a

3,08(dd, j4Ha.5H = 9

3,10(dd, j4Ha.5H = 9

2,99(dd, j4Ha,5H = 9

j4Ha,b=18)

J'':Ha.h.— 18)

j4Ha,b— 18,5)

H4b

3,93(dd, j4Hb,5H= 10,5)

3,90(dd, J4Hb.5H= 10,5)

3,46(dd, J4Hb.5H= 10,5)

Hô

3,84(d,J5H,6H=6)

4,00(d,j5H,6H = 6)

3,88(dd,j5H,6H=6)

Hs

4,60(m)

4,52(m)

4,37(m)

N-CH=

6,41(d,J=14)

6,42(d,J=14)

6,24**(d,J=14)

S-CH=

7,59(d)

7,60(d)

7,18**(d)

=CH-NH

10,65**(d,J=ll)

Hs

4,97(m,J6H.8H=9)

* DdO/CHsCN, ** DMSO-ds/CHsCN

11 A.G. Brown, D.F. Corbett, A.J. Englington und T.T. Howarth, J. Chem, Soc., Chem. Comm., 1977, 523-525.

Die biologischen Eigenschaften von C-l9393S2 sind nachstehend beschrieben. Das antibiotische Spektrum von C-19393S2 in Form des Natriumsalzes gegenüber verschiedenen Mikroorganismen findet sich in der folgenden Tabelle 4. Wie aus der Tabelle ersichtlich ist, ist das Antibiotikum C-l9393S2 gegen grampositive und gramnegative Bakterien wirksam.

Tabelle 4

Antimikrobielles Spektrum des Natriumsalzes von C-19393S2

Testorganismus

Minimale

Hemmkonzentration

(Hg/ml)

Escherichia coli NIHJ

12,5-25

Salmonella typhimurium IFO 12529

12,5

Klebsiella pneumoniae IFO 3318

12,5

Proteus vulgaris IFO 3045

100

Proteus mirabilis IFO 3845

50

Serratia marcescens IFO 12648

25

Alcaligenes faecalis IFO 13111

50

Pseudomonas aeruginosa IFO 3080

>100

Comamonas terrigena IFO 13299

6,25

Staphylococcus aureus 209P

12,5

Sarcina lutea IFO 3232

12,5

Bacillus subtilis IFO 3513

12,5

Bacillus cereus IFO 3460

>100

Das Antibiotikum C-19393S2 besitzt auch auf ß-Lactamase eine starke Hemmwirkung und erhöht daher in ausgesprochener Weise die Empfindlichkeit für Penicillin- oder Cepha-4o losporinderivate von verschiedenen Bakterien, welche gegen Penicillinderivate und/oder Cephalosporinderivate resistent sind. Die verstärkende Wirkung auf die antimikrobielle Aktivität von Ampicillin und Cefotiam mittels C-19393S2 findet sich in der folgenden Tabelle 5.

45

Tabelle 5

Verstärkungseffekt auf die antimikrobielle Aktivität von so Ampicillin und Cefotiam durch C-19393S2

Testorganismus*

C-19393S2 Minimale Hemmkonzentration (ug/ml)

Ampicillin

Cefotiam

55

Escherichia coli TN 659

Klebsiella pneumoniae 60 TN 1725

Proteus vulgaris TN 224

65

0

1 p-g/ml 5 ug/ml

0

1 jj-g/ml 5 ug/ml

0

1 ug/ml 5 p.g/ml

>800

3,13 ^ 0,003

800 50 0,78

400 1,56 1,56

0,2 0,1 0,006

200 0,2 0,02

200 0,2 0,2

(Bemerkung) Medium: Bouillon-Agar

* Klinisch isolierte Stämme, welche ß-Lactamase zu erzeugen vermögen Medium: Herzinfusions-Agar (Eiken Chemical Co., Japan)

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Wie aus dem obigen antimikrobiellen Spektrum augenfällig ist, besitzt das erfindungsgemässe C-19393S2 gegen grampositive und gramnegative Bakterien eine antimikrobielle Wirkung. Somit lässt sich C-19393S2 für die Behandlung von bakteriellen Infektionen bei Menschen und Säugetieren, z.B. bei Mäusen, Ratten, Hunden, und bei Vogelarten, wie z.B. Hausvögel, Geflügel und Enten, verwenden.

Um das C-19393S2 als Mittel für die Behandlung von z.B. E. coli-Infektionen einzusetzen, wird man das C-19393S2 in einer physiologischen Kochsalzlösung lösen, um auf diese Weise eine injizierbare Lösung zu erhalten, welche man parenteral, z.B. subkutan oder intramuskulär, in einer Posologie von 2 bis 200 mg/kg/Tag und vorzugsweise von 5 bis 50 mg/kg/Tag verabreichen kann. Für die orale Verabreichung kann man das Antibiotikum C-19393S2 mit Lactose vermischen und diese Mischung in Kapseln einfüllen. Auf diese Weise erhält man Kapseln, welche man in einer Posologie von 10 bis 500 mg/kg/Tag und vorzugsweise von 20 bis 200 mg/kg/Tag verabreichen kann.

Das erfindungsgemässe C-19393S2 kann auch als Desinfektionsmittel verwendet werden. So kann man beispielsweise ein flüssiges Präparat herstellen, indem man C-l9393S2 in destilliertem Wasser in einer Konzentration von 0,1 bis 1,0% (Gew.-Vol.) löst. Man kann auch eine Salbe herstellen, welche 2 bis 50 mg und vorzugsweise 5 bis 20 mg C-19393S2 pro g Paraffinöl oder Lanolin als Grundmasse enthält. Diese Salbe kann auf Händen, Beinen, Augen, Ohren usw. sowohl beim Menschen als auch bei den oben erwähnten Tieren als Bakterizid oder Desinfektionsmittel verwendet werden.

Wie aus dem in der Tabelle 4 ersichtlichen Resultat einwandfrei hervorgeht, besitzt das Antibiotikum C-19393S2 eine ß-Lactamase hemmende Wirkung und erhöht daher in ausgeprägter Weise die Empfindlichkeit von auf Penicillin oder Cephalosporin resistenten Bakterien in bezug auf Ampicillin oder Cefotiam dank des Umstandes, dass diese Verbindung ß-Lactamase zu erzeugen vermag. Demzufolge kann man C-19393S2 für die Behandlung von Infektionen bei Mensch und Tier, z.B. Mäusen, Ratten oder Hunden, und Vogelarten, wie z.B. Hausvögel, Geflügel und Enten, anwenden, insbesondere aber bei bakteriellen Infektionen, welche ß-Lactam resistenten Bakterien zuzuschreiben sind; dann verwendet man das Antibiotikum in Kombination mit Penicillin- oder Cephalosporinantibiotika.

Wird C-19393S2 in Kombination mit anderen Mitteln vom ß-Lactamtypus für die Behandlung von Infektionen, z.B. durch ß-Lactam resistenten E. coli, verwendet, wird man gleiche Mengen an C-19393S2 und Ampicillin in einer physiologischen Kochsalzlösung lösen, um auf diese Weise Injektionslösungen zu erhalten, die man ohne weiteres parenteral, z.B. subkutan oder intramuskulär, in einer Dosierungsmenge von 0,1 bis 20 mg/kg/Tag und vorzugsweise 0,5 bis 5 mg/kg/Tag, verabreichen kann. C-19393S2 kann auch oral in einer Dosierungsmenge von 1 bis 200 mg/kg/Tag und vorzugsweise 5 bis 100 mg/kg/Tag in Form von Kapseln verabreicht werden, wobei jede Kapsel mengenmässig die gleiche Menge C-19393S2 und Cephalexin enthält.

Wird C-19393S2 als Desinfektionsmittel verwendet, so kann es als flüssiges Präparat, beispielsweise als wässrige Lösung vorliegen, welche C-19393Sa in einer Konzentration von 0,1 bis 10% (Gew./Vol.) und Benzylpenicillin in einer Konzentration von 0,1 bis 1,0% (Gew./Vol.) enthält. Man kann aber auch eine Salbe herstellen, welche 5 bis 20 mg C-19393S2 und 5 bis 20 mg Benzylpenicillin per g Paraffinöl oder Lanolin als Grundlage enthält. Diese Lösungen bzw. Salben lassen sich zum Abtöten von Bakterien oder zum Desinfizieren von Händen, Beinen, Augen, Ohren usw. beim Menschen und den obigen Tieren anwenden.

Das Antibiotikum C-l9393S2 dürfte auch als Zwischenprodukt für die Synthese von neuen Typen von Pharmazeu-tika interessant sein. Das erfindungsgemässe Antibiotikum ist in wässriger Lösung in einem neutralen pH-Bereich beständig.

Die physiologischen Eigenschaften von C-l 9393H2 werden nachstehend beschrieben.

Das antimikrobielle Spektrum des Natriumsalzes von C-19393H2 gegenüber verschiedenen Mikroorganismen findet sich in der nachstehenden Tabelle 6. Wie aus den Resultaten der Tabelle 6 herevorgeht, besitzt das Antibiotikum C-19393H2 eine antibakterielle Wirkung gegen grampositive und gramnegative Bakterien.

Tabelle 6

Antimikrobielles Spektrum des Natriumsalzes des Antibiotikums C-19393H2

Testorganismus

Minimale

Hemmkonzentration

(Hg/ml)

Escherichia coli NIHJ

0,08

Salmonella typhimurium IFO 12529

0,31

Klebsiella pneumoniae IFO 3318

0,31

Proteus vulgaris IFO 3045

5

Proteus mirabilis IFO 3845

5

Serratia marcescens IFO 12648

0,31

Alcaligenes faecalis IFO 13111

5

Pseudomonas aeruginosa IFO 3080

10

Comamonas terrigena IFO 13299

0,16

Staphylococcus aureus 209P

0,63

Sarcina lutea IFO 3232

0,31

Bacillus subtilis IFO 3513

0,31

Bacillus cereus IFO 3460

10

(Bemerkung) Medium: Bouillon-Agar

Wie aus der obigen Tabelle 6 ersichtlich ist, besitzt das erfindungsgemässe Antibiotikum C-19393H2 eine antimikrobielle Wirkung gegen grampositive und gramnegative Bakterien und kann daher für die Behandlung von bakteriellen Infektionen bei Menschen und Säugetieren, beispielsweise bei Mäusen, Ratten und Hunden und dergl., sowie bei Vogelarten, wie z.B. Hausvögeln, Geflügel, Enten und dergl., eingesetzt werden.

Um das C-19393H2 zur Behandlung von beispielsweise E. coli-Infektionen zu verwenden, wird es in einer physiologischen Kochsalzlösung gelöst, um auf diese Weise eine Injektionslösung zu erhalten, welche man parenteral, z.B. subkutan oder intramuskulär, in einer Dosierungsmenge von 0,1 bis 50 mg/kg/Tag und vorzugsweise von 0,5 bis 20 mg/ kg/Tag verabreichen kann. Für die orale Verabreichung kann das Antibiotikum C-l9393H2 mit Lactose vermischt und diese Mischung in Kapseln eingefüllt werden, welche man in Mengen von 1 bis 100 mg/kg/Tag und vorzugsweise von 5 bis 50 mg/kg/Tag verabreichen kann.

Ferner kann man das erfindungsgemässe C-19393H2 auch als Desinfektionsmittel verwenden. So kann man beispielsweise ein flüssiges Mittel herstellen, indem man C-19393H2 in destilliertem Wasser bei einer Konzentration von 0,01 bis 0,1% (Gew./Vol.) löst. Man kann aber auch eine Salbe herstellen, welche 0,2 bis 20 mg, vorzugsweise 1 bis 10 mg C-l9393H2 pro g Paraffinöl oder Lanolin als Grundlage enthält. Eine solche Salbe bzw. eine solche Lösung lässt sich als bakterizides oder desinfizierendes Mittel für Hände, Beine, Augen, Ohren usw. beim Menschen oder den oben erwähnten Tieren anwenden.

Das Antibiotikum C-19393H> dürfte auch als Zwischens

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produkt für die Synthese neuer Arten von pharmazeutischen Mitteln wertvoll sein. Das Antibiotikum ist in wässriger Lösung in einem neutralen pH-Bereich beständig.

Wie oben beschrieben worden ist, kann man MM-4550 als Beispiel eines relativ ähnlichen Antibiotikums wie die erfin-dungsgemässen Antibiotika C-19393S2 und C-19393H2 ansehen. Das Antibiotikum MM-4550 ist aber strukturell von den Antibiotika C-19393S2 und C-l9393H2 verschieden. MC 696-SY2-A (Maeda et al., The Journal of Antibiotics, Bd. 30, S. 770-772,1977), welches die gleiche Substanz wie MM-4550 ist, ist sehr unbeständig [Umezawa et al., The Journal of Antibiotics, Bd. 26, S. 51-54,1973], wogegen die Antibiotika C-19393S2 und C-19393 H2 beständige Verbindungen darstellen.

Die vorliegende Erfindung sei durch die folgenden Beispiele ausführlicher erläutert. Wo nichts andres ausgesagt wird, entsprechen die Prozente Gewichtsteilen pro 100 Volumenteilen.

Beispiel 1

Eine Kultur von Streptomyces sp. Stamm C-19393 (IFO 13886, ATCC 31486) wurde auf einem 200 ml T-Medium, welches sich in einem 1 -Liter-Erlenmeyerkolben befand, wachsen gelassen, um Sporen zu erhalten. Die so erhaltenen Sporen wurden hierauf in sterilem Wasser bei einer Konzentration von 1,2 x 108 lebenden Zellen/ml suspendiert. Die Sporensuspension wurde mit sterilem Wasser bis auf ein zehnfaches Volumen des ursprünglichen Volumens verdünnt, und dann wurde 1 ml der verdünnten Suspension verwendet, um 40 ml eines Impfmediums in einem 200-ml-Erlen-meyerkolben zu impfen. Das geimpfte Medium wurde hierauf auf einer rotierenden Schüttel vorrichtung während 2 Tagen bei 28°C gezüchtet. Die entstandene Kultur wurde dazu verwendet, um 500 ml eines Impfkulturmediums zu impfen, das sich in einem 2-Liter-Sakaguchi-Schüttelkolben befand. Das geimpfte Medium wurde auf einer sich hin und her bewegenden Schüttelvorrichtung während 2 Tagen bei 28°C gezüchtet. Dann wurde die so erhaltene Impfkultur in einen Fermentierbehälter aus rostfreiem Stahl von 50 Liter Inhalt übergeführt, welcher 30 Liter eines Impfmediums enthielt, das 15 ml Actocol (Takeda Chemical Industries, Ltd., Japan) enthielt, worauf die Züchtung während 3 Tagen bei 28°C unter Belüftung bei 30 Liter/Minute und rühren mit 280 Umdrehungen pro Minute geschah. Die Kulturbrühe wurde dann in einen 2-m3-Fermentierbehälter eingebracht, welcher 1,2 m3 eines Hauptkulturmediums enthielt. Die Züchtung erfolgte dann während 5 Tagen bei 30°C unter Belüftung bei 840 Liter/Minute und rühren bei 180 Umdrehungen pro Minute. Das oben verwendete Impfmedium setzte sich aus 20 g Glucose, 30 g löslicher Stärke, 10 g rohem Sojabohnenmehl, 10 g Maiskornflüssigkeit, 5 g Polypepton (Daigo Nutritive Chemicals, Ltd., Japan), 3 g Natriumchlorid und 5 g ausgefälltem Calciumcarbonat per Liter Medium zusammen, wobei der pH-Wert des Mediums vor dem Sterilisieren auf 7,0 eingestellt worden war. Das oben verwendete Hauptzüchtungsmedium setzte sich aus 30 g Glucose, 30 g löslicher Stärke, 15 g entfettetem Sojabohnenmehl, 15 g Baumwollsa-menmehl, 0,25 g Kaliumdihydrogenphosphat, 0,6 g Kalium-monohydrogenphosphat, 0,002 g Kobaltchlorid und 0,5 g Actocol per Liter des Mediums zusammen, wobei das Medium vor dem Sterilisieren auf einen pH-Wert von 7,0 eingestellt worden war. Sämtliche oben verwendeten Medien wurden während 20 Minuten bei 120°C unter Dampf sterilisiert.

Die so erhaltene Fermentierbrühe wurde über Hyflo-Supercel (Johnes Manville Co., USA) filtriert, um 1230 Liter Filtrat zu erhalten, das hierauf auf einen pH-Wert von 6,3 eingestellt und dann durch eine mit 100 Liter Aktivkohle beschickte Säule geleitet wurde. Hierauf wurden die Antibiotika C-19393S2 und C-19393H2 aus der Säule mittels 300 Liter Wasser bzw. 700 Liter 7%igem wässrigem Isobutanol eluiert. Das das Antibiotikum C-19393S2 enthaltende Eluat wurde durch eine Säule von Dowex 1 x 2 (Cb-Form, 2 Liter) geleitet und die Säule hierauf mit 6 Liter Wasser gewaschen und dann mit 32 Liter 5%igem wässrigen Natriumchlorid eluiert. Das Eluat wurde auf einen pH-Wert von 5 eingestellt und durch eine mit 4 Litern Aktivkohle beschickte Säule geleitet. Nach dem Waschen mit 12 Litern Wasser wurde das gewünschte Antibiotikum mit 7 Litern 8%igem Isobutanol und 12 Litern Isobutanol : wässrigem 0,05 n-Ammoniak (8:92) eluiert und das Eluat unter vermindertem Druck auf ein Volumen von 150 ml eingeengt. Das Konzentrat wurde hierauf mit 1350 ml Methanol versetzt und der so gebildete Niederschlag durch Filtrieren entfernt. Das Filtrat wurde auf ein Volumen von 200 ml eingeengt und durch eine mit 300 ml DEAE-Sephadex A-25 (CNForm) beschickte Säule geleitet. Die Säule wurde nacheinander mit 0,1 molaren und 0,2 molaren wässrigen Natriumchloridlösungen (jeweils 900 ml) gewaschen, worauf die gewünschte antibiotische Substanz mit 1500 ml wässrigem 0,4 molarem Natriumchlorid eluiert wurde. Das Eluat wurde auf einen pH-Wert von 5 eingestellt und durch eine mit 500 ml Aktivkohle beschickte Säule geleitet. Nach dem Waschen mit 1,5 Litern Wasser wurde die Säule mit 2,5 Litern Isobutanol: wässrigem 0,05 n-Ammoniak (8:92) eluiert und das Eluat zur Trockne eingeengt.

Dann wurde der Rückstand mit Aceton versetzt, wobei man 2,4 g eines blassgelben Pulvers erhielt. Nach dem Lösen des so erhaltenen Pulvers in wenig Wasser wurde die Lösung durch eine mit 1,21 Amberlite XAD-II(0,074-0,149 mm) beschickte Säule geleitet und mit Wasser fraktioniert eluiert. Die Fraktionen, denen eine antibiotische Wirkung zukam, wurden vereinigt und eingeengt, worauf das Extrakt durch eine mit 200 ml QAE-Sephadex A-25 (Cl"-Form) beschickte Säule geleitet wurde. Nach dem Waschen mit 600 ml wässrigem 0,1 molarem Natriumchlorid wurde die Säule mit 1,2 Liter wässrigem 0,2 molarem Natriumchlorid eluiert. Das Eluat wurde dann auf einen pH-Wert von 5 eingestellt und durch eine mit 600 ml Aktivkohle beschickte Säule geleitet. Nach dem Waschen der Säule mit 1,8 Liter Wasser, wurde sie mit 3 Liter Isobutanol : wässrigem 0,05 n-Ammoniak (8:92) eluiert. Das Eluat wurde zur Trockne eingeengt und der Rückstand hierauf mit Aceton versetzt, worauf man 1,07 g eines Pulvers erhielt. 620 mg des so erhaltenen Pulvers wurden in wenig Wasser gelöst und die Lösung durch eine mit 360 ml Amberlite XAD-II (0,074-0,149 mm) beschickte Säule geleitet. Die Säule wurde hierauf eluiert und mit Wasser fraktioniert und jede der Fraktionen, denen eine antibiotische Wirkung zugeschrieben wurde, durch Flüssigchromatographie in der oben beschriebenen Weise analysiert. Die ein einzelnes Peak aufweisenden Fraktionen wurden vereinigt und zur Trockne eingeengt, worauf das Konzentrat mit Aceton versetzt wurde. Auf diese Weise erhielt man 136 mg Antibiotikum C-19393S2 in Form des Dinatriumsalzes als weisses Pulver.

Beispiel 2

Das gemäss Beispiel 1 erhaltene Eluat von C-l9393H2 wurde durch eine Säule von Dowex 1 x 2 (Ch-Form) geleitet, die Säule hierauf mit 6 Litern Wasser gewaschen und hierauf mit 180 Litern einer 5%igen wässrigen Natriumchloridlösung eluiert. Das Eluat wurde durch eine mit 25 Litern Aktivkohle beschickte Säule geleitet. Nach dem Waschen mit 75 Litern Wasser wurde das gewünschte Antibiotikum mit 175 Litern Isobutanol : Wasser (7:93) eluiert und das Eluat unter vermindertem Druck auf ein Volumen von 2 bis 3 Litern eingeengt. 15 Liter Methanol wurden dem Konzentrat dann zugegeben s

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und der auf diese Weise gebildete Niederschlag durch Filtrieren entfernt. Das Filtrat wurde auf ein Volumen von 2 Litern eingeengt und durch eine mit 5 Litern Diaion HP-20 (0,149 mm Maschenweite) beschickte Säule geleitet. Hierauf wurde die Säule mit 5 Litern Wasser und 10 Litern Methanol: Wasser (Mischungsverhältnis 1:9) eluiert und fraktioniert. Die aktiven Fraktionen wurden vereinigt und eingeengt und das Konzentrat durch eine mit 3 Litern DEAE-Sephadex A-25 (CNForm) beschickte Säule geleitet. Dann wurde die Säule mit 9 Litern einer wässrigen 0,02 molaren Natriumchloridlösung gewaschen und das gewünschte Antibiotikum mit 12 Litern einer 0,05 molaren wässrigen Natriumchloridlösung eluiert und fraktioniert. Die aktiven Fraktionen wurden durch eine mit 2 Litern Diaion HP-20 (0,149 mm Maschenweite) beschickte Säule geleitet, welche zuvor mit 4 Litern wässrigem Natriumchlorid behandelt worden war. Nach dem Waschen mit 10 Litern 5%iger wässriger Natriumchloridlösung wurde der Wirkstoff mit 10 Litern Me-thanol:5%igem wässrigem Natriumchlorid (5:95) und 10 Litern Methanol : 5%igem wässrigem Natriumchlorid (1:9) eluiert und fraktioniert. Die aktiven Fraktionen wurden durch eine mit 500 ml Aktivkohle beschickte Säule geleitet und nach dem Waschen mit 1,5 Litern Wasser mit 2,5 Litern 7%igem wässrigem Isobutanol eluiert. Das Eluat wurde eingeengt und das Konzentrat durch eine mit 1 Liter Diaion HP-20 (0,149-0,297 mm Maschenweite) beschickte Säule geleitet und mit Wasser eluiert und fraktioniert. Die Fraktionen mit antibiotischer Wirkung wurden vereinigt und eingeengt und das Konzentrat durch eine mit 200 ml Q AE-Sephadex A-25 (Cl-Form) beschickte Säule geleitet, welche zuvor mit 400 ml einer 0,02 molaren wässrigen Natriumchloridlösung behandelt worden war. Dann wurde die Säule nacheinander mit 0,02 molaren, 0,03 molaren und 0,04 molaren wässrigen Natriumchloridlösungen, und zwar jeweils 1 Liter, eluiert. Die aktiven Fraktionen wurden über eine mit 200 ml Aktivkohle beschickte Säule geleitet und nach dem Waschen mit 0,6 Litern Wasser mit 1 Liter 7%igem wässrigem Isobutanol eluiert. Das Eluat wurde eingeengt und das Konzentrat anschliessend mit Propanol versetzt, um eine 90%ige wässrige Propanollösung zu erhalten, welche anschliessend in einer mit Avicel beschickten Säule, welche zuvor mit 90%igem wässrigem Propanol behandelt worden war, chromatographiert wurde. Die Säule wurde mit 90%igem wässrigem Propanol eluiert. Die aktiven Fraktionen wurden eingeengt und das Konzentrat über 350 ml Amberlite XAD-II (0,074 bis 0,149 mm) chromatographiert und die Säule mit Wasser eluiert. Die aktiven Fraktionen wurden eingeengt und das Konzentrat einer präparativen Hochlei-stungs-Flüssigchromatographie unter Verwendung von RP-18 (E. Merck & Co., BRD) als Trägermittel unterworfen und mit 10% Methanol in 0,02 molarem Phosphatpuffer (pH 6,3) eluiert. Die aktiven Fraktionen wurden durch eine mit 40 ml Diaion HP-20 (0,074-0,149 mm) beschickte Säule geleitet und mit Wasser fraktioniert eluiert. Jede der eine antimikrobielle Wirkung aufweisenden Fraktionen wurde in der oben beschriebenen Weise durch Flüssigchromatographie analysiert. Die ein einzelnes Peak aufweisenden Fraktionen wurden vereinigt und gefriergetrocknet, wobei man 12 mg C-19393H2 als weisses Pulver erhielt.

Beispiel 3

1150 Liter eines Kulturbrühenfiltrates, hergestellt in ähnlicher Weise wie in Beispiel 1, wurden auf einen pH-Wert von 5 eingestellt und dann durch eine mit 100 Liter Aktivkohle beschickte Säule geleitet. Nach dem Waschen mit 300 Litern Wasser wurde die Säule mit 350 Litern Isobutanol : 0,02 n-Natriumhydroxyd (8:92) eluiert. Das Eluat wurde durch eine mit 10 Litern Diaion SA-21A (CKForm) beschickte Säule geleitet und nach dem Waschen mit 30 Litern Wasser wurde die Säule mit 100 Litern 5%iger wässriger Natrium-chloridlösung eluiert. Das Eluat wurde hierauf durch eine mit 20 Litern Diaion HP-20 (0,297 mm) beschickte Säule geleitet, welche zuvor mit 40 Litern einer 5%igen wässrigen Natriumchloridlösung behandelt worden war. Dann wurde die Säule mit 20 Litern 5%igem wässrigem Natriumchlorid gewaschen. Hierauf wurden die Antibiotika C-19393S2 und C-19393H2 mit 40 Litern Wasser bzw. 60 Litern Meth-anol:5%igem wässrigem Natriumchlorid (5:95) aus den Säulen eluiert. Das das Antibiotika C-19393S2 enthaltende Eluat wurde auf den pH-Wert von 5 eingestellt und durch eine mit 2 Liter Aktivkohle beschickte Säule geleitet. Nach dem Waschen mit 6 Litern Wasser wurde die Säule mit 10 Litern 8%igem Isobutanol: wässrigem 0,05 n-Ammoniak eluiert und das Eluat eingeengt. Das Konzentrat wurde durch eine mit 200 ml QAE-Sephadex A-25 (CKForm) beschickte Säule geleitet und die Säule nach dem Waschen mit 1 Liter 0,2 molarem wässrigem Natriumchlorid mit 1 Liter 0,4 molarem wässrigem Natriumchlorid eluiert. Nach dem Entsalzen des Eluates durch Chromatographie über Aktivkohle wurde es über Amberlite XAD-II der Säulenchromatographie unterworfen und in ähnlicher Weise wie in Beispiel 1 aufgearbeitet, wobei man 100 mg Antibiotikum C-19393S2 in Form des Dinatriumsalzes als weisses Pulver erhielt.

Beispiel 4

Das gemäss Beispiel 3 erhaltene Eluat von C-l9393H2 wurde auf einen pH-Wert von 5 eingestellt und durch eine mit 2 Litern Aktivkohle beschickte Säule geleitet. Nach dem Waschen mit 6 Litern Wasser wurde die Säule mit einer Mischung von 10 Litern Isobutanol und wässrigem 0,05 n-Ammoniak (Mischungsverhältnis 8:92) eluiert und das Eluat eingeengt. Das Konzentrat wurde durch eine mit 200 ml QAE-Sephadex A-25 (CKForm) beschickte Säule geleitet und nach dem Waschen mit 1 Liter 0,02 molarem wässrigem Natriumchlorid wurde die Säule mit 1 Liter 0,04 molarem wässrigem Natriumchlorid eluiert. Nach dem Entsalzen des Eluates durch Chromatographie über Aktivkohle wurde es über Diaion HP-20 (0,074-0,149 mm) der Säulenchromatographie unterworfen und die Säule mit Wasser eluiert und fraktioniert. Die ein einzelnes Peak bei der Flüssigchromatographie zeigenden Fraktionen wurden vereinigt und eingeengt und das Konzentrat gefriergetrocknet. Auf diese Weise erhielt man 48 mg C-19393H2 in Form des Natriumsalzes als weisses Pulver.

s

10

IS

20

25

30

35

40

45

50

55

B

4 Blatt Zeichnungen

Claims (3)

1. 646432

   PATENTANSPRÜCHE 1. Die Antibiotika C-19393S2 und C-19393H2 der folgenden allgemeinen Formel:

   (1) auf die Antibiotika C-19393S2und C-19393H2 der folgenden allgemeinen Formel:

   /H

   ,C = C\

   H NH-COCH

   OOH

   (I)

   ,H

   H NH-COCH.

   OOH

   worin R den Rest -SO3H oder das Wasserstoffatom bedeutet, sowie die Salze dieser Verbindungen. 15
2. 2. Verfahren zur Herstellung der Antibiotika C-19393S2 und/oder C-19393H2, dadurch gekennzeichnet, dass man einen zur Gattung Streptomyces gehörenden Mikroorganismus, welcher die Antibiotika C-19393S2 und/oder C-19393H2 zu erzeugen vermag, in einem Kulturmedium, 20 welches assimilierbare Kohlenstoffquellen und assimilierbare Stickstoffquellen enthält, solange züchtet, bis im Züchtungsmedium die besagten Antibiotika C-19393S2 und/oder C-19393H2 wesentlich angereichert sind, worauf man diese Antibiotika isoliert. 25
3. 3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet,

   dass der Mikroorganismus Streptomyces sp. C-19393, IFO 13886 ist.

   30