HU181721B - Process for preparing antibiotics c-19393sdown 2 and c-1939hdown 2 - Google Patents
Process for preparing antibiotics c-19393sdown 2 and c-1939hdown 2 Download PDFInfo
- Publication number
- HU181721B HU181721B HU80180A HU18080A HU181721B HU 181721 B HU181721 B HU 181721B HU 80180 A HU80180 A HU 80180A HU 18080 A HU18080 A HU 18080A HU 181721 B HU181721 B HU 181721B
- Authority
- HU
- Hungary
- Prior art keywords
- antibiotic
- strain
- antibiotics
- column
- streptomyces
- Prior art date
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
- C07D477/00—Heterocyclic compounds containing 1-azabicyclo [3.2.0] heptane ring systems, i.e. compounds containing a ring system of the formula:, e.g. carbapenicillins, thienamycins; Such ring systems being further condensed, e.g. 2,3-condensed with an oxygen-, nitrogen- or sulphur-containing hetero ring
- C07D477/10—Heterocyclic compounds containing 1-azabicyclo [3.2.0] heptane ring systems, i.e. compounds containing a ring system of the formula:, e.g. carbapenicillins, thienamycins; Such ring systems being further condensed, e.g. 2,3-condensed with an oxygen-, nitrogen- or sulphur-containing hetero ring with hydrogen atoms, hydrocarbon or substituted hydrocarbon radicals, directly attached in position 4, and with a carbon atom having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen, e.g. an ester or nitrile radical, directly attached in position 2
- C07D477/12—Heterocyclic compounds containing 1-azabicyclo [3.2.0] heptane ring systems, i.e. compounds containing a ring system of the formula:, e.g. carbapenicillins, thienamycins; Such ring systems being further condensed, e.g. 2,3-condensed with an oxygen-, nitrogen- or sulphur-containing hetero ring with hydrogen atoms, hydrocarbon or substituted hydrocarbon radicals, directly attached in position 4, and with a carbon atom having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen, e.g. an ester or nitrile radical, directly attached in position 2 with hydrogen atoms, hydrocarbon or substituted hydrocarbon radicals, attached in position 6
- C07D477/16—Heterocyclic compounds containing 1-azabicyclo [3.2.0] heptane ring systems, i.e. compounds containing a ring system of the formula:, e.g. carbapenicillins, thienamycins; Such ring systems being further condensed, e.g. 2,3-condensed with an oxygen-, nitrogen- or sulphur-containing hetero ring with hydrogen atoms, hydrocarbon or substituted hydrocarbon radicals, directly attached in position 4, and with a carbon atom having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen, e.g. an ester or nitrile radical, directly attached in position 2 with hydrogen atoms, hydrocarbon or substituted hydrocarbon radicals, attached in position 6 with hetero atoms or carbon atoms having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen, e.g. an ester or nitrile radical, directly attached in position 3
- C07D477/20—Sulfur atoms
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
- C12N1/205—Bacterial isolates
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P17/00—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms
- C12P17/18—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms containing at least two hetero rings condensed among themselves or condensed with a common carbocyclic ring system, e.g. rifamycin
- C12P17/182—Heterocyclic compounds containing nitrogen atoms as the only ring heteroatoms in the condensed system
- C12P17/184—Heterocyclic compounds containing nitrogen atoms as the only ring heteroatoms in the condensed system containing a beta-lactam ring, e.g. thienamycin
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
- C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
- C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
- C12R2001/465—Streptomyces
Description
A találmány tárgya eljárás új (I) általános képletű C-19393S2 jelzésű antibiotikumok és a vegyületek sóinak előállítására. Az (I) általános képletben R jelentése SO3H csoport.
A találmány feltalálói talajmintákból számos mikroorganizmust különítettek el és tanulmányozták a talált mikroorganizmusok által termelt antibiotikumokat és ezek hatását. E kutatómunka eredményeként azt találtuk, hogy bizonyos mikroorganizmusok, amelyek a Streptomyces fajhoz tartoznak, képesek új, hasznos antibiotikumok előállítására, az említett mikroorganizmusok megfelelő tápközegen történő tenyésztése útján az új antibiotikumok feldúsíthatok a fermentációs közegben és az így nyerhető új antibiotikumok antimikrobiális aktivitást mutatnak a Gram-pozitív és Gram-negatív baktériumokkal szemben.
Az így elkülönített új antibiotikumok kémiai és fizikai tulajdonságait vizsgálva azt találtuk, hogy a találmány szerint előállítható új antibiotikumok az (I) általános képletnek felelnek meg, e képletben R egy -SO3H csoportot képvisel.
Azt az (I) általános képletű új antibiotikumot, amely az R helyén —SO3H csoportot tartalmaz, „C-19393S2„ antibiotikumnak nevezzük el.
A találmány tárgyához legközelebb áll kémiai szerkezet tekintetében az MM—4550 jelzésű antibiotikum (J. Chem. Soc. Chem. Comm. 523—525 (1977), amely azonban nem mutat olyan kedvező 181721 tulajdonságokat mint a találmány szerinti vegyületek.
A találmány tehát új eljárás az (I) általános képletű új C-19393S2 jelzésű antibiotikumok - a 5 képletben R -SO3H csoportot képvisel - előállítására, amelyet az jellemez, hogy a Streptomyces fajhoz tartozó és a C—19393S2 antibiotikumok termelésére képes mikroorganizmus-törzset asszimilálható szénforrást tartalmazó táptalajon tenyésztjük a 10 C—19393S2 antibiotikumoknak a tápközegben való feldúsulásáig, majd a termelt C-19393S2 antibiotikumot elkülönítjük a tápközegből.
A C— 19393S2 antibiotikumoknak a jelen találmány szerint történő előállítására a C-19393S2 an15 tibiotikumok termelésére képes, Streptomyces-fajú mikroorganizmusokat alkalmazunk. Az ilyen mikroorganizmusok jellemző példája a Streptomyces sp. C.19393 törzs, amelyet a továbbiakban általában csak „C—19393 törzs” elnevezéssel említünk, ezt a 20 törzset egy Svédországban talált talajmintából különítettük el és oly módon nyerjük ki, hogy az említett, Svédországban talált talajminta szuszpenzióját steril vízben szuszpendáljuk és a szuszpenziót egy 1% oldható keményítőt, 0,05% karbamidot, 25 0,05% „Polypepton” tápanyagot (A Daigo Nutritive Chemicals Ltd. japán cég gyártmánya), 0,05% élesztőkivonatot 0,02% dikálium-foszfátot 0,02% kálium-kloridot, 0,01% magnézium-szulfátot, 5 pg/ml bleomicint és 2% agart tartalmazó, 7,0 pH-értékű tápta3° lajra terítjük, majd a képződött tenyészetből a mik
-1181721 roorganizmus-törzset ismételten tisztítjuk, 28 °C hőmérsékleten 2 hétig folytatott inkubáció folyamán.
A C—19393 Streptomyces sp. törzs mikrobiológiai jellemzői az alábbiakban foglalhatók össze:
a) Morfológiai jellemzők:
A körülbelül 1 μ szélességű légmicélium a jól elágazó vegetatív micélium főtengelyéből nyúlik ki és monopodiális elágazást mutatva oldalláncokat képez. Egyenes vagy enyhén hajlott spóraláncok — az úgynevezett „rectus flexibilis” (az alábbiakban rövidítve: „RF”) alakban — figyelhetők meg az oldal lánc végén. Az egyes spórák hengeres alakúak, 0,35-0,55 μ · 0,7-1,4 μ méretűek és sima felületűek. A spórákon különleges szervek, mint szférikus spóranghimok vagy szklerociumok nem láthatók és mozgékony spórák sem figyelhetők meg.
b) A kultúrák jellemzői:
Az új törzs kultúra-jellemzőit különböző táptalajokon az alábbi I. táblázatban foglaltuk össze. Amennyiben más kifejezetten megadva nincs, a megadott jellemzők 28 °C hőmérsékleten történő 2 heti inkubáció után figyelhetők meg.
I. táblázat
| Közeg | Növekedés | Légmicélium | A telep fonákja | Oldható pigment |
| Szacharóz-nitrát agar | mérsékelt | fehér | színtelen | nincs |
| Glükóz-aszparagjn agar | gyenge | fehér | színtelen | nincs |
| Glicerin-aszparagin agar | mérsékelt | fehér | színtelen | nincs |
| Keményítő agar | mérsékelt | nincs | okker | nincs |
| Táp-agar | mérsékelt | fehér | elefántcsont | nincs |
| Tirozin agar Élesztőkivonat | mérsékelt | nincs | színtelen | nincs |
| malátakivonat agar | mérsékelt | nincs | szürkéssárga | nincs |
| Zabliszt agar | mérsékelt | fehér | színtelen | nincs |
A C-19393 törzs bőséges fejlődést mutat a 2% zablisztet, 2% paradicsompépet, 0,2% „Bovril” tápanyagot (a Bovril angliai cég gyártmánya) és 2% agart tartalmazó, 7,0 pH-értékű táptalajon (amelyet a továbbiakban „T táptalaj” elnevezéssel említünk); ezen’a táptalajon bőségesen képződnek szürkéssárga légmicéliumok. Oldható pigment nem képződik.
C) Fiziológiai jellemzők:
1. A fejlődés hőmérséklet-tartománya: alsó határ: 15 °C alatt felső határ: 32-35 °C optimális hőmérséklet: 26,5—30 °C
2. Zselatin elfolyósodása: pozitív
3. Keményítő hidrolízise: pozitív
4. Soványtej peptonizálása: pozitív
Soványtej megalvadása: negatív
5. Melanoid pigment képződése: tirozin agar: negatív pepton-élesztőkivonat-vas agar: negatív
6. Szénforrások asszimilációját (Pridham-Gottlieb agáron) az alábbi II. táblázat mutatja:
II. táblázat
| Szénforrás | Asszimiláció |
| glicerin | + |
| i-inozit | + |
| d-mannit | — |
| d-xilóz | + |
| 1-arabinóz | + |
| d-glükóz | + |
| 2 |
Táblázat folytatása
Szénforrás Asszimiláció 35 -----------------------------------d-galaktóz+ d-fruktóz+ maltóz+ szacharóz40 ramnóz+ raffinóz— keményítő+ cellulóz± kontroll (adalék nélkül)45 -----------------------------------Megjegyzés: — = nincs növekedés ± = növekedés kétes + = növekedés mutatkozik
A fenti különféle jellemző tulajdonságok alapján úgy tűnik, hogy a C-19393 törzs a Streptomyces fajhoz tartozik. Vizsgáltuk a C-19393 törzs taxonómiai helyzetét a fenti megfigyelések alapján, amelyek szerint a törzs fehér vagy sárga légmicéliumot képez, spóralánca RF alakú a spórák felülete sima, melanoid pigmentek és oldható pigmentek nem képződnek különféle táptalajokon, tenyészetek fonákja nem mutat határozott színt és a törzs nem hasznosítja a mannitot; a taxonómiai besorolást az alábbi irodalom figyelembevételével végeztük:
1. s. A. Waksman, „The Actinomycetes”, 2. kötet, 1961;
2. Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology,
8. kiadás, 1974;
3. Ε. B. Shirling és D. Gottlieb, Jnternational Jour65 nal of Systematic Bacteriology”, 18, 69—189
-2181721 (1968); ugyanott, 18, 279-392 (1968); ugyanott, 19, 391-512 (1969); ugyanott, 22, 265-394 (1972).
Nem találtunk azonban olyan törzset a fenti irodalomban, amely a C—19393 törzs fentebb összefoglalt valamennyi jellemző tulajdonságát mutatta volna. A C—19393 törzset összehasonlítottuk a Bergey’s Manual 751. oldalán közölt 17.41b táblázatban leírt 7 törzzsel, amelyeket ott fehér légmicélium, RF, negatív melanoíd pigmentképzés és sima spórafelület alapján jellemeztek, azonban az idézett irodalomban szereplő Streptomyces galtieri törzs, amely a mamutot nem hasznosítja, abban különbözik a C-19393 törzstől, hogy nem fejlődik szacharóz-nitrát tápközegben (a továbbiakban: „Czapek-tápközeg”) és ezen felül az S. galtieri törzs által hasznosítható tápanyagforrások több esetben különböznek a C—19393 törzs által hasznosíthatóktól. A 17.41b táblázatban szereplő Streptomyces albovinaceus törzs hasonlít a C-19393 törzsre a szénforrások hasznosítása szempontjából, minthogy a mannitot ez a törzs sem hasznosítja, de eltér a C-19393 törzstől annyiban, hogy vörös vagy rózsaszín oldható pigmentet termel.
A Bergey’s Manual 795—796 oldalán közölt 17.43b táblázatban felsorolt 41 törzset sárga légmi· célium, RF, negatív melanoíd pigmentképzés és sima spórafelület jellemzi; a Streptomyces canescens törzs azonban abban különbözik a C-19393 törzstől, hogy bár a mannitot ez a törzs sem hasznosítja, viszont a S. canescens törzs csak gyengén fejlődik Czapek-tápközegen és emellett nem hasznosítja a xilózt és a ramnózt. Az alábbiakban említett ismert törzsek hasonlítanak ugyan a C—19393 törzsre anynyiban, hogy a mannitot nem hasznosítják, a többi fent felsorolt szénforrás viszont igen, de különböző egyéb különbségeket mutatnak a C-19393 törzzsel szemben, amely különbségeket az alábbiakban zárójelben említünk a törzs neve után. Az alább említendő törzsek által képezett légmicélium színét és az oldható pigmentképzést közvetlenül összehasonlítottuk a C—19393 törzs megfelelő tulajdonságaival és az egyes jellemző törzseknél az alábbi eltéréseket tapasztaltuk:
Streptomyces chrysomallus (a légmicélium színe és oldható pigment képzése)
Streptomyces citreofluorescens (a légmicélium színe és oldható pigment képzése)
Streptomyces fímicarius (gyenge fejlődés Czapek-táptalajon)
Streptomyces globisporus (nagy átmérőjű spórák, keményítő gyenge hasznosítása)
Streptomyces globisporus subsp. vulgáris (gyenge fejlődés Czapek-táptalajon)
Streptomyces griseinus (gyenge fejlődés Czapek-táptalajon, soványtej megalvasztása)
Streptomyces parvus (oldható pigment képzése, nagy spóra-átmérő)
Streptomyces setonii (gyenge fejlődés Czapek táptalajon és oldható pigment képzése).
Az Ε. B. Shirling és D. Gottlieb által leírt Jnternational Streptomyces Project,, (ISP) törzsek sorában összesen 34 törzset jellemez a fehér vagy sárga légmicélium képzése, melanoíd pigment képzésének hiánya, a kultúra fonákjának színtelensége, oldható pigment képzésének hiánya, RF spóralánc-formádó és sima spórafelület; ezeket a törzseket közvetlenül összehasonlítottuk a C—19393 törzzsel, a szükséghez képest a fentebb idézett 1. és 2. irodalom figyelembevételével, a „T” tápközegen (amelyen a C—19393 törzs viszonylag jellemző kultúra-tulajdonságokat mutat) tenyésztve az egyes törzseket és a következőket tapasztaltuk:
A Streptomyces saprophyticus törzs a C-19393 törzshöz viszonylag hasonló tulajdonságokat mutat, a C-19393 törzs azonban határozott eltérést mutat abban a tekintetben, hogy nem képes asszimilálni a mannitot, amelyet pedig a Streptomyces fajhoz tartozó és fehér vagy sárga légmicéliumot képező törzsek legtöbbje jól asszimilál; ezért a C—19393 törzs határozottan eltér az említett Streptomyces saprophyticus törzstől. Ennek megfelelően a C-19393 törzset új speciesként azonosítottuk és „Streptomyces sp. C-19393” elnevezéssel láttuk el. Ezt a törzset a „Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology”, (Tsukuba, Japán) intézetnél letétbe helyeztük FERM-P 4774 szám alatt, továbbá az „Institute fór Fermentation (Osaka, Japán) intézetnél IFO 13886 szám alatt, valamint az American Type Culture Collection (ATCC, USA) gyűjteményében ATCC 31486 szám alatt.
A C—19393 törzs fent leírt jellemző tulajdonságaival kapcsolatban utalnunk kell arra a jól ismert tényre is, hogy a Streptomyces faj különböző tulajdonságai nem mindig mutatkoznak jól meghatározottaknak és könnyen hajlamosak spontán vagy mesterségesen indukált mutációkra. Ezért a találmány szerinti eljárásban felhasználható mikroorganizmus-törzsek körébe a C-19393S2 antibiotikum termelésére képes Streptomyces sp. C—19393 tartozik.
A találmány szerinti eljárás keretében a mikroorganizmusok szaporítása olyan táptalajokon történhet, amelyek a mikroorganizmusok által asszimilálható tápanyagokat tartalmaznak. A táptalajban a szénforrás például glükóz, keményítő, glicerin, dextrin, szacharóz, köles-pép, melasz és hasonlók lehetnek; a felhasználható nitrogénforrások példáiként a húskivonat, szárított élesztő, élesztőkivonat, szójaliszt, kukoricalekvár, búzacsíra, gyapotmagliszt, ammónium-szulfát, ammónium-nitrát stb. említhetők. A táptalaj tartalmazhat a szükséghez képest szervetlen sókat is, mint kalcium-karbonátot, nátrium-kloridot, kálium-kloridot, foszforsav-sókat stb., valamint a mikroorganizmusok fejlődését és a C-19393S2 antibiotikum termelését előmozdító szerves és/vagy szervetlen adalékokat is a megfelelő mennyiségekben.
Adhatunk a tápközeghez a szükséghez képest nehézfémsókat, például vas(II)-szulfátot, réz-szulfátot, és hasonlókat, valamint vitaminokat, mint B]-vitamint, biotint és hasonlókat is. További lehetséges adalékokként a habzásgátlószerek és felületaktív anyagok, például szilikon-olaj, polialkilén-glikol-éterek és hasonlók említhetők.
A mikroorganizmusok szaporítása a szokásos és az antibiotikumok termelésében általában alkalmazott módszerekkel történhet, akár szilárd, akár folyékony táptalajokon. Folyékony táptalajok alkalmazása esetén nyugvó kultúrák, kevert kultúrák, rázott kultúrák vagy aerob kultúrák alkalmazhatók;
-3181721
8 előnyösen kevert kultúrákkal dolgozunk szellőztetés alkalmazásával, A mikroorganizmusok tenyésztését általában 15 °C-tól körülbelül 32 °C-ig terjedő hőmérsékleten, körülbelül 4 és 8 közötti pH-értéknél, 8 órától körülbelül 168 óráig, előnyösen 24 órától 144 óráig terjedő időtartammal végezzük.
A mikroorganizmusok a C-19393S2 antibiotikum termelését túlnyomórészt extra-cellulárisan végzik, tehát a mikroorganizmus a sejteken kívül, a fermentációs lében gyülemlik fel és ezért a fermentáció befejezése után a mikroorganizmus-sejteket célszerűen elkülönítjük a szupernatáns folyadéktól; az elkülönítés például centrifugálással vagy szűréssel történik. így az antibiotikumot a folyékony fázisból nyerjük ki; eljárhatunk azonban oly módon is, hogy közvetlenül a teljes fermentlevet dolgozzuk fel a mikroorganizmus kinyerése céljából.
A fenti módon termelt antibotikum hatóképességének meghatározását Comamonas terrigena IFO 13299 mikroorganizmussal szemben végeztük; hengeres-lemez módszenei vagy papírkorong-módszerrel, húsfőzet-agar közegben, vagy pedig a Baltimore Biological Laboratory amerikai cég által gyártott „TSA” (Trypticase Soy Agár) tápközeg felhasználásával.
A C-19393S2 antibiotikum elkülönítése ugyanolyan módszerekkel történhet, mint amilyeneket a különféle mikroorganizmusok anyagcsere termékeként nyert egyéb hatóanyagok elkülönítésére általában alkalmazni szoktak. így például, minthogy a C-19393S2 antibiotikumok vízben oldható savas jellegű és legnagyobbrészt extracellulárisan termelt anyagok, az elkülönítés oly módon történhet, hogy a mikroorganizmus-sejteket szűrés vagy centrifugálás útján eltávolítjuk a fermentléből és a szupernatáns folyadékból illetőleg szűrletből nyerjük ki a szokásos tisztítási módszerekkel a C—19393S2 antibiotikumot. Elkülönítési módszerként a hatóanyagok különböző oldószerekben való különböző oldhatóságának felhasználásán alapuló módszerek, továbbá a lecsapás során mutatott viselkedés vagy a leválási sebesség eltérésein, a különböző adszorpciós affinitáson alapuló módszerek, ioncserélő-kromatográfia, molekulaszűrő-kromatográfia, csökkentett nyomáson történő betöményítés, liofilizálás és hasonlók vagy az említett módszerek különböző kombinációi alkalmazhatók, bármilyen sorrendben és esetleg ismételten. A tisztítás céljaira felhasználható adszorbensek példáiként az aktívszén, adszorbens gyanták, anioncserélő gyanták, porított cellulóz, szilikagél és hasonlók, továbbá molekulaszűrő-tulajdonságú hordozók említhetők. Eluáló oldószerként vízzel elegyedő szerves oldószerek, mint aceton, metanol, etanol, propanol, butanol, izopropanol, izobutanol és hasonlók vizes oldatai, továbbá savak vagy alkáliák vizes oldatai, pufferoldatok, valamint szervetlen vagy szerves sók vizes oldatai alkalmazhatók; az adott esetben célszerűen alkalmazható oldószer az adszorbens illetőleg hordozó fajtájától is függ.
A C—19393S2 antibiotikum esetében a fermentáció befejeztével a a fermentlevet leszűijük és valamely szűrési segédanyagot alkalmazunk a mikroorganizmus-sejtek eltávolítása céljából. A kapott szűrletet azután semleges vagy gyengén savas körülmények között egy aktívszén-oszlopon vezetjük keresztül, majd az adszorbeált C—19393S2 antibiotikumot valamely hidrofil oldószer-rendszerrel eluáljuk. Az antibakteriális aktivitás legnagyobb részét a vizes eluá5 tumban találjuk. Minthogy az antibiotikum savas természetű, anioncserélő gyanták, különösen Cl vagy CHjCOO típusú anioncserélők, mint Amberlite IRA-400, 402 és 410 (a Rohm & Haas Co. amerikai cég gyártmánya), Dowex-1 (a Dow Chemi10 cal Co. amerikai cég gyártmánya) vagy Diaion
SA-21A és C (a Mitsubishi Chemical Industries japán cég gyártmánya) alkalmazhatók célszerűen további tisztításra. Az antibiotikus hatóanyagot azután vizes nátrium-klorid-oldattal vagy valamely pufferol15 dattal eluáljuk a gyantáról. Az eluátum sómentesítése oly módon történhet, hogy az eluátumot gyengén megsavanyítjuk, majd ismét aktívszénen kromatografáljuk, amikor is vizes alkohollal vagy hasonlókkal eluálunk. A hatóanyagot tartalmazó eluátumot 20 azután csökkentett nyomáson és alacsony hőmérsékleten betöményítjük és a kapott koncentrátumhoz metanolt vagy etanolt adunk. A képződött csapadékot szűréssel elkülönítjük és a szűrletként kapott vizes alkoholos oldatot ismét betöményítjük 25 csökkentett nyomáson. A maradékként kapott koncentrátumhoz acetont vagy valamely hasonló szerves oldószert adunk és a képződött csapadékot szűréssel elkülönítjük. Az így kapott por alakú terméket azután célszerűen oszlop-kromatográfiával tisztíthatjuk 30 tovább, Cl-alakban levő DEAE vagy QAE Sephadex gyanta (a Pharmacia Co. svéd cég gyártmánya) és XAD adszorbens-gyanta (a Rohm & Haas Co. amerikai cég gyártmánya) vagy Diaion HP-20 nagymértékben pórusos gyanta (a Mitsubishi Chemical Indust35 ries japán cég gyártmánya) kombinációjának adszorbensként való felhasználásával. A kapott por alakú termék vizes oldatát tehát egy Cl-alakban levő DEAE Sephadex A-25 gyantával töltött oszlopon vezetjük keresztül a hatóanyag adszorbeáltatása 40 végett, azután az oszlopot vízzel mossuk és 0,4 mólos vizes nátrium-klorid-oldattal eluáljuk. Az eluátumot 5 pH-értékre állítjuk be, majd aktívszén-oszlopon kromatografáljuk. Az aktívszén-oszlopot vizes izobutanollal eluálhatjuk, de jobb eredményt ka45 púnk, ha semleges vagy gyengén bázisos körülmények között végezzük az eluálást; ebből a célból az oldatot híg vizes ammónium-hidroxid-oldat hozzáadásával állítjuk be a kívánt pH-értékre. Az így kapott anyagot azután XAD—II vagy Diaion HP—20 50 gyanta-oszlopon kromatografáljuk és az oszlopon adszorbeált hatóanyagot vízzel frakcionáltan eluáljuk. A hatóanyagot tartalmazó frakciókat összegyűjtjük és betöményítjük, majd a koncentrátumot Cl-alakban levő QAE Sephadex A—25 gyantával töltött 55 oszlopon kromatografáljuk és 0,2 mólos vizes nátrium-klorid-oldattal eluálunk. Az eluátumot azután a fent leírt módon, aktívszenes kromatografálással mentesítjük a sóktól. A kapott eluátumot betöményítjük és ezt a koncentrátumot XAD-Π oszlopon 60 kromatografáljuk, majd vízzel frakcionáltan eluálunk. E frakciók között találunk olyanokat, amelyek az alább ismertetett folyadék-kromatogrammon egyetlen csúcsértéket mutatnak. Az ilyen aktív frakciókat egyesítjük és csökkentett nyomáson, alacsony 65 hőmérsékleten szárazra pároljuk, majd acetont vagy
I
-4181721 valamely hasonló szerves oldószert adunk hozzá a C-19393S2 kinyerése céljából.
A találmány szerinti eljárással előállítható (I) általános képletü C—19393S2 jelzésű antibiotikumok alkálifémsók és ammóniumsók képzésére alkalmasak. 5 Alkálifémsók gyanánt nátrium-, kálium-, lítium- stb. sók készíthetők.
A C-19393S2 antibiotikum dinátriumsójának - amelyet az alábbi 1. példa szerinti módon állíthatunk elő - fizikai és kémiai tulajdonságaik az aláb- 10 biak:
1. Külső megjelenés: fehér por
2. Fajlagos forgatóképesség: [α]θ2 = —152° ± 15° (c = 0,5, vízben)
3. Elemzési adatok (foszfor-pentoxid felett 40 °C 15 hőmérsékleten 6 óra hosszat szárított mintából):
C 36,29+ 1,0%
H 3,72 + 0,5%
N 6,07 + 0,5%
Na 9,70+1,0%
O 31,09% (az oxigéntartalmat az egyéb alkotórészek összegének levonásával számítottuk ki)
S 13,13 ±1,0%
4. Molekulasúly (molekulánként 2 nátriumatommal számítva): 528-429
5. összegképlet: Ci4Hj éN2Na2O9S2
6. Ibolyántúli abszorpciós színkép:
A vízben mért színképet az 1. ábra szemlélteti; a maximum-értékek a következők:
λ ml? 240 ± 2 nm (E}^m = 296 ± 20) és
285 ± 2 nm (E}=245 + 20)
7. Infravörös abszorpciós színkép:
A kálium-bromid-tablettában ismert színképet a
2. ábra mutatja;
a főbb csúcsértékek a következők:
3450, 3220, 3000, 1770, 1700, 1630, 1515, 1395, 1240-1260, 1100, 1050, 1010,980,950, 915, 900, 860, 815, 795, 760, 715, 670, 625, 590, 530 cm’1
8. Vékonyréteg-kromatográfia („Cellulose f” rétegen;^ a Tokyo Kaséi Co. Ltd. japán cég gyártmánya):
10. Oldhatóság:
Oldhatatlan kloroformban, etil-acetátban és acetonban; kevéssé oldható etanolban, butanolban és piridinben; oldható metanolban, dimetil-szulfoxidban és ecetsavban; jól oldódik vízben
11. Színreakciók:
Pozitív: Ehrlich- és kálium-permanganát-reakció Negatív: ninhidrin-, Greig-Leaback-, Dragendorff-, vas-klorid és Sakaguchi-reakció.
A fent ismertetett különböző tulajdonságaik alapján a C-19393S2 antibiotikumok béta-laktám típusú antibiotikumoknak tekinthetők; az egyes elemi analízis-értékek és a becsült molekulasúly alapján a becsült összegképletek:
C—19393S2 C14H16N2Na2O9S2
Annak a ténynek az alapján, hogy a két antibiotikum ibolyántúli abszorpciós színképében a maximum-értékek λ = 241 ± 3 nm és 287 ± 4 nm, feltételezzük, hogy a találmány szerinti új antibiotikumok ugyanolyan kromofórt tartalmaznak, mint az ismert béta-laktám típusú antibiotikumok sorában az MM—4550.
Az alábbi III. táblázat e három antibiotikum ’H-NMR színképének összehasonlító adatait tartalmazza; a táblázatból a következőket láthatjuk;
A C-19393S2 antibiotikum színképében két CH3 szignál (δ 1,66 ppm, 3H, s, 1,73 ppm, 3H, s) ffigyelhető meg a CH3 proton tartományában (az MM-4550 antibiotikumétól eltérően); a C—19393H2 antibiotikum színképében is két CH3 szignál figyelhető meg (δ 1,36 ppm, 3H, s;
1,47 ppm, 3H, s); Hg proton (δ 4,97 ppm, 1H, m), amely az MM-4550 antibiotikum színképében jelen van, a C-19393S2 antibiotikum színképében nem látható; a további proton-szignálok kémiai eltolódása 40 lényegileg ugyanolyan a H4-H5 és H5— H6 kapcsolási állandókkal, amelyeket spin-kioldással kapunk H5 besugárzás útján ugyanolyan értékekkel; a C-19393S2 antibiotikumban az SO3 csoport jelenlétét erős abszorpció mutatja γ^ΐίχ 1260 és 45 1 050 cm-1 értékeknél az infravörös színképben.
A fenti adatok alapján az (I) általános képlet állítható fel a C—19393S2 antibiotikumokra.
| Oldószer-rendszer | Rf-érték |
| (a) propanol: víz (4 :1) | 0,33 + 0,1 |
| (b) butanol: ecetsav : víz | |
| (2:2:1) | 0,54 + 0,1 |
| (c) propanol: etanol: víz | |
| (5:2:3) | 0,62 + 0,1 |
A C—19393S2 antibiotikumok ’H.NMR színképének jellemző értékeit az alábbi III. táblázatban foglaltuk össze, összehasonlításul megadva az MM-4550 antibiotikum színképének megfelelő értékeit is, A. G. Brown, D. F. Corbett, A. J. Eg55 lington és T. T. Howarth (J. Chem. Soc., Chem. Comm. 1977, 523—525) közlése alapján.
9. Nagynyomású folyadék-kromatográfia (Waters
Associates Inc., USA):
a) Microbondapak C18/5% metanol - 0,02 mólos citrát pufferoldat (pH 6,3), 1,5 ml/ /perc/cm (160 atm); Rt = 9,0 (perc) + 1 (perc)
b) Microbondapak NH2/70% metanol — 0,02 mólos borát pufferoldat (pH 7,5), 1,5 ml/ /perc/cm (154 atm); Rt = 7,0 (perc) ± 1 (perc);
A C—19393S2 antibiotikum biológiai tulajdonságait az alábbiakban ismertetjük. Az alábbi IV. táblázat 60 a C-19393S2 antibiotikum nátriumsójának különféle mikroorganizmusokkal szembeni antibiotikus spektrumát mutatja. Amint a táblázat adataiból latható, a C—19393S2 antibiotikum Gram-pozitív és Gram-negatív baktériumokkal szemben egyaránt aktivitást 65 mutat.
-5181721
III. táblázat
| C-19393S2 | MM-45 50 | ||
| 8-CH3 | 1,66(3H, s) | 1,45 (3H, d, J = 6,5) | |
| (100 MHz) | 8-CH3 | 1,73 (3H, s) | |
| D2O, TMS) | N—Ac | 2,16 (3H, s) | 2,05 (3H, s) |
| (3 mg/0,4 ml) | H4a | 3,10 (dd, | 2,99 (dd, |
| J4Ha,5H ~ 9, | I4Ha,5H =9, | ||
| J4Ha,b = 18) | J4Ha,b = 18,5) | ||
| H4b | 3,90 (dd, | 3,46 (dd, | |
| J4Hb,SH ' 10,5) | J4Hb,5H= 10,5) | ||
| h6 | 4,00 (d, Jsh.őH = 6) | 3,88 (dd, Jsh,6H=6) | |
| h5 | 4,52 (m) | 4,37 (m) | |
| S-CH= | 6,42 (d, J --14) | 6,24 (d,J = 14) | |
| N-CH= | 7,60 (d) | 7,18 (d) | |
| =CH-NH | 10,65 (d, J = 11) | ||
| h8 | 4,97 (m, J6H,8H=9) | ||
| d2o/ch3cn, | DMSO-d6/CH3CN |
IV. táblázat V. táblázat
A C—19393S2 antibiotikum dinátriumsójának 25 antibakteriális spektruma
| Mikroorganizmus | Minimális gátló koncentráció (Mg/ml) |
| Escherichia coli NIHJ | 12,5-25 |
| Salmonella typhimurium IFO 12529 12,5 | |
| Klebsiella pneumoniae IFO 3318 | 12,5 |
| Proteus vulgáris IFO 3045 | 100 |
| Proteus mirabilis IFO 3845 | 50 |
| Serratia marcescens IFO 12648 | 25 |
| Alcaligenes faecalis IFO 13111 | 50 |
| Pseudomonas aeruginosa IFO 3080 | 1 > 100 |
| Comamonas terrigena IFO 13299 | 6,25 |
| Staphylococcus aureus 209P | 12,5 |
| Sarcina lutea IFO 3232 | 12,5 |
| Bacillus subtilis IFO 3513 | 12,5 |
| Bacillus cereus IFO 3460 | > 100 |
| Megjegyzés: a kísérleteket húsfőzet-agaron vé- | |
| geztük. |
A C—19393S2 antibiotikum szenzitivitás-megnövelő hatása ampicillin és cefotiam antimikrobiális aktivitására
Minimális gátló koncentráció, Mikroorgá- C-19393S2 Mg/ml nizmus -------------------ampicillin cefotiam
Escherichia
| coli | 0 | > 800 | 0,2 |
| TN 659 | 1 Mg/ml | 3,13 | 0,1 |
| 5 Mg/ml | <0,003 | 0,006 | |
| Klebsiella | 0 | 800 | 200 |
| pneumoniae | 1 Mg/ml | 50 | 0,2 |
| TN 1725 | 5 Mg/ ml | 0,78 | 0,02 |
| Proteus | |||
| vulgáris | 0 | 400 | 200 |
| TN 224 | 1 Mg/ml | 1,56 | 0,2 |
| 5 Mg/ml | 1,56 | 0,2 |
Megjegyzés: Mirkoorganizmusként klinikailag izolált, béta-laktamáz képzésére képes törzseket alkalmaztunk.
Tápközeg: szív-infúziós agar (Elken Chemical Co., Japán)
A C—19393S2 antibiotikum erős béta-laktamáz-gátló aktivitással is rendelkezik és ezért határozottan megnöveli különféle olyan baktériumok szén- 55 zitivitását, amelyek egyébként rezisztenciát mutatnak penicillin-származékokkal és/vagy cefalosporin-származékokkal szemben. Az alábbi V. táblázat mutatja a C-19393S2 szenzitivitás-megnövelő hatását az ampicillin és a cefotiam antimikrobiális akti- 60 vitásával szemben.
Amint ez a fenti antimikrobiális spektrumból látható, a találmány szerinti eljárással előállított C-19393S2 antibiotikum Gram-pozitív és Gram-negatív baktériumokkal szemben egyaránt jó antimik- 65 robiális aktivitással rendelkezik. E tulajdonsága alapján a C-19393S2 antibiotikum eredményesen alkalmazható baktériumos fertőzések gyógykezelésére emlős állatokon, például egéren, patkányon, kutyán, valamint emberen, továbbá madarakon, például házi szárnyasokon, mint tyúkokon, kacsákon és hasonlókon is.
A C—19393S2 antibiotikumot például Escherichia coli fertőzések gyógykezelésére fiziológiai scoldattal készített injekció-oldatok alakjában alkalmazhatjuk parenterális úton, például szubkután vagy intramuszkuláris injekcióban, 2-200 mg/kg, előnyösen 5-50 mg/kg napi adagokban. Alkalmazható
-613 azonban a C-19393S2 antibiotikum orális úton is, például tejcukorral keverve és kapszulákba töltve; orális alkalmazás esetén a napi adag 10-500 mg-kg, előnyösen 20-200 mg-kg lehet.
Alkalmazható továbbá a találmány szerinti eljárással előállított C-19393S2 antibiotikum fertőtlenítőszerként is. így például folyékony fertőtlenítőszer-készítményt állíthatunk elő oly módon, hogy a C-19393S2 antibiotikumot desztillált vízben oldjuk 10 0,1-1,0 súly/tf.% koncentrációban, vagy kenőcsöt állíthatunk elő ilyen célra, amely 1 g fehér petrolátum vagy lanolin alapban 2—50 mg, előnyösen
5-20 mg C-19393S2 antibiotikumot tartalmaz; az ilyen kenőcs baktericid és fertőtlenítő kenőcsként alkalmazható a kéz-láb, szem, fül stb. fertőtlenítésére például a fentebb említett állatokon.
A IV. táblázat adataiból az is látható, hogy a C-19393S2 antibiotikum béta-laktamáz-gátló aktivitással rendelkezik és ezért határozottan megnöveli a penicillin- vagy cefalosporin-rezisztens baktériumok szenzitivitását például ampicillinnel vagy cefotiammal szemben. Ezért a C—19393S2 antibiotikum eredményesen alkalmazható az ilyen bakté- 25 riumokkal történt fertőzések gyógykezelésére is embereken, emlős állatokon, például egéren, patkányon vagy kutyán, valamint madarakon, például házi szárnyasokon, kacsán stb., penicillinnel vagy cefalosporinnal és ezek származékaival kombinálva. 30
Amikor a C-19393s2 antibiotikumot más béta-laktám típusú szerekkel kombináltan alkalmazzuk például a béta-laktám típusú antibiotikumokkal szemben rezisztens Escherichia coli fertőzések 35 gyógykezelésére, akkor célszerűen oly módon járunk el, hogy a C-19393S2 antibiotikum és például ampiciüin egyenlő mennyiségeit oldjuk fiziológiai sóoldatban és az így készített injektálható oldatot adjuk be parenterálisan, például szubkután vagy 40 intramuszkuláris úton, 0,1-20 mg/kg, előnyösen 0,5-5 mg/kg napi adagokban. Ilyen célra is adható orálisan is a C-19393S2 antibiotikum, 1-200 mg/kg, előnyösen 5-100 mg/kg napi adagokban, olyan kapszulázott készítmények alakjában, ame- 45 lyek egyenlő mennyiségi arányban tartalmaznak C-19393S2 antibiotikumot és például cefalexint.
Ha a C—19393S2 antibiotikumot fertőtlenítőszerként alkalmazzuk, akkor erre a célra folyé- 50 kony készítményt állíthatunk elő, például 0,1—10 súly/tf.% C-19393S2 antibiotikumot és 0,1-1,0 súly/tf.% benzilpenicillint tartalmazó vizes oldat alakjában; előállíthatunk fertőtlenítőszerként kenőcsöt is, amely 1 g fehér petrolátumban vagy lano- 55 linban 5—20 mg C—19393S2 antibiotikumot és
5-20 mg benzilpenicillint tartalmaz. Az ilyen kenőcsök — amint ezt fentebb már említettük — például egyes testrészek, mint kéz, láb, szem, fül, stb. baktericid kezelésére illetőleg fertőtlenítésére alkal- eo mázhatok emberen vagy a fentebb említett állatokon.
A C—19393S2 antibiotikum hasznos kiindulási anyag további új típusú gyógyszerkészítmények szintéziséhez is. A találmány szerinti eljárással előállít- 65 ható C—19393S2 antibiotikum vizes oldatban, a semleges pH-tartományban jó stabilitást mutat.
Amint ezt fentebb már ismertettük, az MM-45 50 antibiotikum viszonylag hasonló jellegű a találmány szerinti eljárással előállítható C—Í9393S2 antibiotikumokhoz. Az MM—4550 antibiotikum azonban szerkezetileg eltér a C-19393S2 antibiotikumoktól; emellett az MM-45 50 antibiotikummal azonos MC 696—SY2—A antibiotikum (vö.: Maeda és munkatársai, The Journal of Antibiotics, 30, 770—772, 1977) igen kevéssé stabil, amint ez például Umezawa és munkatársai (The Journal of Antibiotics, 26, 51—54, 1973) közleményéből ki15 tűnik, míg a C—19393S2 antibiotikumok stabil vegyületek.
A találmány szerinti eljárást közelebbről, további részleteiben az alábbi példák szemléltetik; megjegy20 zendő azonban, hogy a találmány köre semmilyen szempontból nincsen ezekre a konkrét példákra korlátozva. A példákban százalékokban megadott koncentrációk amennyiben más megadva nincs — súly/ /tf.%-ban értendők.
1. példa
A Streptomyces sp. C-19393 törzs (IFO 13886, ATCC 31486) kultúráját egy egyliteres Erlenmeyer-lombikban, 200 ml „T” tápközegen tenyésztjük spórák nyerése céljából. A kapott spórákat azután steril vízben szuszpendáljuk, 1,2 · 10’ élő sejt/ml koncentrációban. Ezt a spóra-szuszpenziót steril vízben eredeti térfogatának tízszeresére hígítjuk és ml ilyen hígított szuszpenziót alkalmazunk egy 200 ml-es Erlenmeyer lombikban levő 40 ml inokulum-tápközeg beoltására. Az inokulált tápközeget azután egy forgó rendszerű rázókészülékben, 28 °C hőmérsékleten 2 napig inkubáltatjuk. Az így kapott kultúrával azután egy 2 literes Sakaguchi-rázópalackban levő 500 ml tápközeget oltunk be és a beoltott tápközeget rázókészülékben 2 napig inkubáltatjuk 28 °C hőmérsékleten. Az így kapott inokulum-kultúrát azután egy 50 literes rozsdamentes acél fermentor-tartányba visszük át, amely 30 liter tápközeget tartalmaz (ehhez előzőleg 15 ml Actocolt — a Takeda Chemical Industries, Ltd, japán cég gyártmánya - adunk), majd a fermentor tartalmát 30 liter/perc szellőztetés és 280 fordulat/perc keverés mellett 3 napig hagyjuk fejlődni 28 °C hőmérsékleten. Az így kapott fermentációs levet azután egy 1,2 m3 kultúra-tápközeget tartalmazó, m3 űrtartalmú fermentor-tartányba visszük át és 30 °C hőmérsékleten 5 napig folytatjuk a fermentációt, 840 liter/perc levegőztetés és 180 fordulatpere keverés mellett.
A fentiek során alkalmazott inokulum-tápközeg literenként 20 g glükózt, 30 g oldható keményítőt, 10 g nyers szójalisztet, 10 g kukoricalekvárt, 5 g polipeptont (a Daigo Nutritive Chemicals, Ltd. japán cég gyártmánya), 3 g nátrium-kloridot és 5 g precipitált kalcium-karbonátot tartalmaz; pH-értékét sterilizálás előtt 7,0-ra állítjuk be. A kultúra-tápkö7
-7181721 zeg (fermentációs főtápközeg) literenként 30 g glükózt, 30 g oldható keményítőt, 15 g zsírtalanított szójalisztet, 15 g gyapotmaglisztet, 0,25 g kálium-dihidrogén-foszfátot, 0,6 g kálium-monohidrogén-foszfátot, 0,002 g kobalt-kloridot és 0,5 g „Actocol”-t tartalmaz; pH-értékét sterilizálás előtt 7,0-ra állítjuk be. Valamennyi fenti tápközeget felhasználás előtt gőzzel 20 percig sterilizálunk 120 °C hőmérsékleten.
A fent leírt módon végrehajtott fermentáció befejeztével kapott fermentációs levet Hyflo-Supercel szűrési segédanyaggal (a Jhones Manville Co. amerikai cég gyártmánya) szűrjük le; 1230 liter szűrletet kapunk, amelyet azután egy 100 liter aktívszénnel töltött oszlopon vezetünk keresztül. A C-19393S2 antibiotikumokat 300 liter vízzel, illetőleg 700 liter 7%-os vizes izobutanollal eluáljuk az oszlopról. A C-19393S2 antibiotikumot tartalmazó eluátumot azután egy 2 liter Cr-alakban levő Dowex 1 x 2 gyantát tartalmazó oszlopon vezetjük keresztül és az oszlopot előtte 6 liter vízzel mossuk, majd 32 liter 5%-os vizes nátrium-klorid-oldattal eluáljuk. A kapott eluátumot 5 pH-értékre állítjuk be és egy 4 liter aktívszenet tartalmazó oszlopra visszük. Az oszlopot előbb 12 liter vízzel mossuk, majd a kívánt antibiotikumot 7 liter 8%-os vizes izobutanollal és 12 liter 8 :92 arányú izobutanol - n/20 vizes ammónium-hidroxid-oldat eleggyel eluáljuk, majd az eluátumot csökkentett nyomáson 150 ml térfogatra pároljuk be. A maradékként kapott koncentrátumhoz 1350 ml metanolt adunk és a képződött csapadékot kiszűrjük. A szűrletet 200 ml térfogatra pároljuk be és ezt a koncentrátumot egy 300 ml Cr-alakban levő DEAE-Sephadex A—25 gyantával töltött oszlopon vezetjük keresztül. Az oszlopot azután 0,1 mólos, majd 0,2 mólos vizes nátrium-klorid-oldattal (900-900 ml mennyiséggel) mossuk, majd a kívánt antibiotikumot 1500 ml 0,4 mólos vizes nátrium-klorid-oldattal eluáljuk. Az eluátum pH-értékét 5-re állítjuk be, majd egy 500 ml aktívszénnel töltött oszlopon vezetjük keresztül. Az oszlopot 1,5 liter vízzel mossuk, majd 2,5 liter 8 :92 arányú izobutanol — n/20 vizes ammónium-hidroxid-oldat eleggyel eluáljuk, az eluátumot szárazra pároljuk és a bepárlási maradékhoz acetont adunk. Ily módon, 2,4 g halványsárga por alakú terméket kapunk. Ezt kis mennyiségű vízben oldjuk és az oldatot egy 1,2 liter Amberlite XAD-II gyantával (100-200 mesh szitafinomsággal) töltött oszlopon vezetjük keresztül és az oszlopot vízzel frakcionáltan eluáljuk. Az antibiotikus aktivitást mutató frakciókat egyesítjük és bepároljuk; a maradékként kapott koncentrátumot egy 200 ml Cl--alakban levő QAE-Sephadex A-25 gyantával töltött oszlopon vezetjük keresztül. Az oszlopot 600 ml 0,1 mólos vizes nátiium-klorid-oldattal mossuk, majd 1,2 liter 0,2 mólos vizes nátrium-klorid-oldattal eluáljuk. Az eluátum pH-értékét 5-re állítjuk be és egy 600 ml aktívszénnel töltött oszlopon vezetjük keresztül. Az oszlopot 1,8 liter vízzel mossuk, majd 3 liter 8 :92 arányú izobutanol - n/20 vizes ammónium-hidroxid-oldat eleggyel eluáljuk. Az eluátumot szárazra pároljuk, a bepárlási maradékhoz acetont adunk és így 1,07 g por alakú terméket kapunk. E por
620 mg-nyi részét kevés vízben oldjuk és az oldatot egy 360 ml 100-200 mesh szitafonomságú Amberlite XAD—II gyantával töltött oszlopon vezetjük keresztül, Az oszlopot azután vízzel frakcionáltan eluáljuk, valamennyi antibiotikus aktivitást mutató frakciót a fentebb leírt folyadék-kromatográfiai módszerrel megvizsgáljuk és az egyetlen csúcsértéket mutató frakciókat egyesítjük és szárazra pároljuk. A bepárlási maradékhoz acetont adunk, majd a kivált fehér por alakú terméket elkülönítjük. Ily módon 136 mg C—19393S2 antibiotikum-dinátriumsót kapunk.
2. példa
Az 1. példában leírthoz hasonló módon kapott fermentlé-szűrlet 1150 liter mennyiségét 5 pH-értékre állítjuk be, majd egy 100 liter aktívszenet tartalmazó oszlopon vezetjük keresztül. Az oszlopot azután 300 liter vízzel mossuk, majd 350 liter 8 :92 arányú izobutanol - 0,02 n nátrium-hidroxid-oldat eleggyel eluáljuk. Az eluátumot egy 10 liter Cl_-alakban levő Diaion SA-21A gyantával töltött oszlopon vezetjük keresztül, az oszlopot 30 liter vízzel mossuk, majd 100 liter 5%-os vizes nátrium-klorid-oldattal eluáljuk. Az eluátumot azután egy 20 liter 50 mesh szitafinomságú Diaion HP-20 gyantával töltött és előzetesen 40 liter 5%-os vizes nátrium-klorid-oldattal kezelt oszlopon vezetjük keresztül. Az oszlopot 20 liter 5%-os vizes nátrium-klorid-oldattal mossuk, majd a jelenlevő C—19393S2 és C—19393H2 antibiotikumot 40 liter vízzel, illetőleg 60 liter 5 :95 arányú metanol - 5%-os vizes nátrium-klorid-oldat eleggyel eluáljuk.
A C-19393S2 antibiotikumot tartalmazó eluátumot 5 pH-értékre állítjuk be és egy 2 liter aktívszenet tartalmazó oszlopon vezetjük keresztül. Ezt az oszlopot 6 liter vízzel mossuk, majd 10 liter 8% izobutanolt tartalmazó n/20 vizes ammónium-hidroxid-oldattal eluáljuk. Az eluátumot betöményítjük és a koncentrátumot egy 200 ml QAE-Sephadex A-25 gyantát (CC-alakban) tartalmazó oszlopon vezetjük keresztül. Az oszlopot 1 liter 0,2 mólos vizes nátrium-klorid-oldattal mossuk, majd 1 liter 0,4 mólos vizes nátrium-klorid-oldattal eluáljuk. Az eluátumot aktívszenes kromatografálással sómentesítjük, majd Amberlite XAD—II gyantával töltött oszlopon kromatografáljuk. Az eluátumot az 1. példában leírthoz hasonló módon dolgozzuk fel és így 100 mg C—19393S2 antibiotikum-dinátriumsót kapunk fehér por alakjában.
3. példa
A találmány szerinti vegyieteknek az ampicillinre és cefotiamra kifejtett potencírozó hatását az MM 4550 hatásával vetettük össze. A vizsgálathoz felhasznált mikroorganizmusokat egy éjjelen át Müller-Hinton féle táptalajon (Difco) egy éjszakán át 37 °C-on tenyésztjük.
Milliméterenként mintegy 107 mikroorganizmust tartalmazó szuszpenziót agar lemezre inokulálunk, a lemezeket 37°C-on 18 óra hosszat inkubáljuk, majd megállapítjuk a minimális gátló koncentrációt. A kapott eredményeket a VII. táblázat szemlélteti. 5
VII. táblázat összehasonlító vizsgálat a szenzitivitás-növelés vonatkozásában.
Minimális gátló koncentráció
| Beadagolt anyag mennyisége pg/ml | ampicillin (Mg/ml) | |
| E. coli ΤΝ635 | 20 K. pneumoniae TN1655 | |
| 800 | 100 | |
| C-19393S2 (0,1) | 3,13 | 6,25 25 |
| MM4550 (0,2) | 200 | 25 |
cefotiam P. vulgáris
Claims (2)
- Szabadalmi igénypontok:1 Eljárás az (I) általános képletű C—19393S2 jelzésű antibiotikumok és a vegyületek sóinak előállítására, a képletben R jelentése -SO3H csoport, azzal jellemezve, hogy valamely, a Streptomyces sp. C 19393 C-19393S2 antibiotikum termelésére képes mikroorganizmust (IFO 13 886) egy asszimilálható szénfonásokat és a mikroorganizmusok által emészthető nitrogénforrásokat tartalmazó tápközegen tenyésztünk a C—19393S2 antibiotikumok számottevő mennyiségeinek a fermentációs lében való felgyülemléséig, majd a termelt C—19393S2 antibiotikumot elkülönítjük a fermentációs termékből.
- 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás foganatosítási módja, azzal jellemezve, hogy mikroorganizmusként IFO 13886 törzset alkalmazzuk.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP1156079A JPS55104296A (en) | 1979-02-02 | 1979-02-02 | Antibiotic substance c-19393s2 and its preparation |
| JP8114179A JPS565496A (en) | 1979-06-26 | 1979-06-26 | Antibiotic c-19393h2 and its preparation |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| HU181721B true HU181721B (en) | 1983-11-28 |
Family
ID=26347007
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| HU80180A HU181721B (en) | 1979-02-02 | 1980-01-28 | Process for preparing antibiotics c-19393sdown 2 and c-1939hdown 2 |
Country Status (15)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4518529A (hu) |
| AU (1) | AU534530B2 (hu) |
| CH (1) | CH646432A5 (hu) |
| DE (1) | DE3003624A1 (hu) |
| DK (1) | DK12580A (hu) |
| ES (1) | ES488836A0 (hu) |
| FR (1) | FR2447922A1 (hu) |
| GB (1) | GB2042532B (hu) |
| HU (1) | HU181721B (hu) |
| IT (1) | IT1130246B (hu) |
| NL (1) | NL8000628A (hu) |
| PH (1) | PH14316A (hu) |
| PT (1) | PT70710A (hu) |
| SE (1) | SE8000842L (hu) |
| SU (1) | SU1075984A3 (hu) |
Families Citing this family (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4530791A (en) * | 1979-04-16 | 1985-07-23 | Kowa Co., Ltd. | β-Lactam antibiotics |
| JPS5740485A (en) * | 1980-08-25 | 1982-03-06 | Shionogi & Co Ltd | Novel antibiotic pa-39504-x3 and its preparation |
| JPS5746985A (en) * | 1980-09-05 | 1982-03-17 | Kowa Co | Preparation of antibiotic |
| ES506470A0 (es) * | 1980-10-24 | 1983-02-01 | Kowa Co | Proceso de produccion de un compuesto medicamentoso que con-tiene antibioticos de la serie ka-6643 |
| JPS57109786A (en) * | 1980-12-26 | 1982-07-08 | Takeda Chem Ind Ltd | Antibiotic c-19393e5 and its preparation |
| US4497742A (en) * | 1981-03-04 | 1985-02-05 | Takeda Chemical Industries, Ltd. | Isomerization of β-lactam compounds |
| US5391604A (en) * | 1993-07-30 | 1995-02-21 | Diemat, Inc. | Adhesive paste containing polymeric resin |
| CA2250400A1 (en) * | 1996-04-30 | 1997-11-06 | Metrika, Inc. | Method and device for measuring reflected optical radiation |
Family Cites Families (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4172129A (en) * | 1974-03-28 | 1979-10-23 | Beecham Group Limited | Antibiotics |
| GB1577725A (en) * | 1976-06-30 | 1980-10-29 | Beecham Group Ltd | Azetidinone derivatives |
| EP0002564B1 (en) * | 1977-11-12 | 1984-06-20 | Beecham Group Plc | Derivatives of 7-oxo-1-azabicyclo(3.2.0)-hept-2-ene-2-carboxylic acid, their preparation, pharmaceutical compositions containing them and intermediates |
| US4211707A (en) * | 1978-08-10 | 1980-07-08 | Merck & Co., Inc. | Process for hydrolytically cleaving O-sulfo thienamycins |
| US4232036A (en) * | 1978-10-24 | 1980-11-04 | Merck & Co., Inc. | 6-, 1- and 2-Substituted-1-carbadethiapen-2-em-3-carboxylic acids |
| US4530791A (en) * | 1979-04-16 | 1985-07-23 | Kowa Co., Ltd. | β-Lactam antibiotics |
-
1980
- 1980-01-10 AU AU54518/80A patent/AU534530B2/en not_active Ceased
- 1980-01-11 DK DK12580A patent/DK12580A/da not_active Application Discontinuation
- 1980-01-17 US US06/113,132 patent/US4518529A/en not_active Expired - Lifetime
- 1980-01-18 PT PT70710A patent/PT70710A/pt unknown
- 1980-01-28 HU HU80180A patent/HU181721B/hu unknown
- 1980-01-28 CH CH67680A patent/CH646432A5/de not_active IP Right Cessation
- 1980-01-31 NL NL8000628A patent/NL8000628A/nl not_active Application Discontinuation
- 1980-01-31 ES ES488836A patent/ES488836A0/es active Granted
- 1980-01-31 FR FR8002162A patent/FR2447922A1/fr active Granted
- 1980-02-01 DE DE19803003624 patent/DE3003624A1/de not_active Withdrawn
- 1980-02-01 SE SE8000842A patent/SE8000842L/xx not_active Application Discontinuation
- 1980-02-01 GB GB8003402A patent/GB2042532B/en not_active Expired
- 1980-02-01 PH PH23567A patent/PH14316A/en unknown
- 1980-02-01 SU SU802878699A patent/SU1075984A3/ru active
- 1980-02-01 IT IT19645/80A patent/IT1130246B/it active
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| PT70710A (en) | 1980-02-01 |
| NL8000628A (nl) | 1980-08-05 |
| CH646432A5 (de) | 1984-11-30 |
| AU5451880A (en) | 1980-08-07 |
| PH14316A (en) | 1981-05-20 |
| FR2447922B1 (hu) | 1982-05-28 |
| GB2042532A (en) | 1980-09-24 |
| FR2447922A1 (fr) | 1980-08-29 |
| SE8000842L (sv) | 1980-12-27 |
| DE3003624A1 (de) | 1980-11-20 |
| US4518529A (en) | 1985-05-21 |
| ES8102590A1 (es) | 1981-02-16 |
| ES488836A0 (es) | 1981-02-16 |
| IT1130246B (it) | 1986-06-11 |
| IT8019645A0 (it) | 1980-02-01 |
| SU1075984A3 (ru) | 1984-02-23 |
| AU534530B2 (en) | 1984-02-02 |
| DK12580A (da) | 1980-08-03 |
| GB2042532B (en) | 1983-07-20 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| IE42067B1 (en) | Antibiotic azetidinopyrrole derivative | |
| EP0182315B1 (en) | Novel antibiotic nk84-0218 pharmaceutical compositions containing it and process for the production of the same | |
| US4946941A (en) | Novel glycopeptide antibiotics | |
| AU614760B2 (en) | A new antimicrobial agent, fr 109615 and production thereof | |
| Kuroda et al. | FR-900130, a novel amino acid antibiotic I. discovery, taxonomy, isolation, and properties | |
| HU181721B (en) | Process for preparing antibiotics c-19393sdown 2 and c-1939hdown 2 | |
| US4954641A (en) | Novel antitumor antibiotic substance and a method for production thereof | |
| US4283389A (en) | Novel antibiotic, BN-183B substance | |
| US4656288A (en) | Antibiotics, their production and use | |
| US4017485A (en) | 7-Methoxycephalosporin derivatives | |
| US4409147A (en) | Carbapenem compounds and their production | |
| US4440752A (en) | Antibiotics Y-16482 α and/or Y-16482 β, a process for production thereof, and a pharmaceutical composition containing either or both of them | |
| US5039663A (en) | Antibiotics called "mureidomycins A, B, C, and D" and their therapeutic use | |
| US4521340A (en) | Pharmaceutically acceptable salts of the antibiotic C-19393 E5 | |
| US4427655A (en) | Antibiotics-875A and production thereof | |
| Imada et al. | Antibiotics C-19393S 2 | |
| US4667027A (en) | Cephem compounds and their production | |
| US5213974A (en) | Fermentation process for preparing antibiotics mureidomycins A, B, C and D | |
| US4654211A (en) | New compound, FR-900451, production and use thereof | |
| US4242327A (en) | Antibiotic SF-2052 substance and production and use thereof | |
| KR830002818B1 (ko) | 항생물질 c-19393 s_₂및 h_₂의 제조방법 | |
| US4201769A (en) | Antibiotic substances No. 17927A1 and No. 17927A2 and process for producing the same | |
| GB2087382A (en) | Antibiotic sf-2103a substance and process for production thereof | |
| KR830000617B1 (ko) | 신 항생물질 sf-2050 물질의 제조법 | |
| KR830000618B1 (ko) | 신 항생물질 sf-2050b물질의 제조법 |