SU1075984A3

SU1075984A3 - Способ получени антибиотика @ -19393 @ и/или @ -19393 @

Info

Publication number: SU1075984A3
Application number: SU802878699A
Authority: SU
Inventors: Имада Акира; Харада Сецуо; Асаи Мицуко
Original assignee: Такеда Кемикал Индастриз,Л.Т.Д. (Фирма)
Priority date: 1979-02-02
Filing date: 1980-02-01
Publication date: 1984-02-23
Also published as: FR2447922A1; HU181721B; NL8000628A; AU5451880A; DK12580A; PH14316A; PT70710A; IT8019645A0; FR2447922B1; ES488836A0; US4518529A; AU534530B2; GB2042532B; GB2042532A; DE3003624A1; CH646432A5; ES8102590A1; SE8000842L; IT1130246B

Abstract

Способ получени антибиотика общей формулы СНз щ . Н ИНСОСНз соон где -R-SOjH - антибиотик С-19393 Sj и/или R-Н - антибиотик С-19393 З ЛЮЧаЮЩИЙСЯ в том, что ШТс1ММ Streptomyces С-19393 (iFo 13,886) культивируют в питательной среде, содержащей источники углерода и азота, и выдел ют целевой продукт С/) КЗ жидкой фракции культуральной рреды в виде смеси и/или отдельных антибиотиков . Приоритет по признакам: 02.02.79 при получении антибиотика C-19393S2; 06.06.79 при получении антибиотика С-19393Н2. «vl ел со СХ)

Description

Изобретение относитс к микробиологической промышленности и касаетс получени нового антибиотика . Целью изобретени вл етс полу чение нового антибиотика общей формулы х-Я -у KHCOCHj, где - антибиотик С-19393 S и/или R-Н - антибиотик С-19393 Н Цель достигаетс тем, что согла но способу получени антибиотика общей формулы V н Шз-у. -сС /г-0 о - NHCOCHj сош - антибиотик С-19393 S где ,R-SO,H и/или R-И - антибиотик С-19393 Н который заключаетс в том, что штамм Streptomyces С-19393 (IFo 13,886) культивируют в питательной среде, содержащей источники углеро да и азота, и выдел ют целевой продукт из жидкой культуральной ср ды в виде смеси и/или отдельных ан тибиотиков. Дл получени антибиотика С-19393 S и/или Hj изобретени ис пользуютс микроорганизмы, произво д щие антибиотик С-19393 S.j и/или Hj., принадлежсодие к разновидности Streptomyces sp. Типичным примером такого микроорганизма вл етс штамм Streptomyces sp С-19393, который получают посевом суспензии образцов почвы, собранной в Швеции, в стерильной воде на культурную среду, состо щую из 1% растворимого крахмала, 0,05% мочевины, 0,05% полипептона (Daigo Nutritive Chem.Ltd) 0,05% дрожжевого экстракта (Dif со uSA), 0,02% фосфата кали , 0,02% хлористого кали , 0,01% сульфата магни , 5 мг/мл блеомицина и 2% агара, имеющего рН 7,0 и повтор ющейс очисткой микроорганизма из колонии, полученной в ходе культивировани при в течении 2 недельi Штамм С-19393 разновидности Streptomyces имеет следующие микробиологические характеристики. Морфологические характеристики. Воздушный мицелий, имеющий ширину около 1, выт гиваетс от хо рошо разветвленного вегетативного мицели и моноподиально ответвл етс от главной оси с образованием боковых цепей. Пр мые или слегка изогнутые споровые цепи, наблюдаютс на конце боковой цепи. Кажда спора имеет цилиндрическую форму (0,35-0,55-0,7-1,4) и имеет гладкую поверхность. Никаких специальных органов, таких как сферические спорангии , склероции, а также подвижны2| спор не наблюдаетс . Культуральные характеристики. Культуральные характеристики штамма в различных средах представлены в табл.1. Представленные характеристики наблюдали после культивировани при 28°С в течение 2 недель .. Таблица 1

Сахароза нитратный

агар , Умеренный

Глюкоза аспараНезначитель- -. гиновый агар ный

Глицерин, аспара гиновый агар

Умеренный

Крахмальный агар

Бесцветна Нет

Белый

-

I I

I

Охра

Питательный агар

Тиризиновый

агар

I I

Дрожжевой экстракт Экстракт мальтозы агар

Овс но-мучной

« I j агар

Штамм С-19393 обильно растет на среде, содержащей 2% овс ной муки, 2% томатной пасты, 0,2% BovriE и 2% агара, имеющей рН 7,0 и происходит обильное образование серовато-желтого воздушного мицели . Растворимого пигмента не образует.

Физиологические характеристики.

Температурный интервал роста: нижний предел ниже верхний предел 32-35 С; оптимальна температура 26,5-30®С.

Желатин разжижает, крахмал гидролизует , пептонизирует сн тое молоко , но не коагулирует. Меланоидных пигментов тирозин-агар, и пептон-дрожжевой экстракт-железо-агар не образует.

Хорошо усваивает следующие источники углерода - глицерин, D-кслозу , L-арабинозу, D-глюкозу, D-галактозу , D-фруктозу, мальтозу, рамнозу крахмал. Слабо усваивает инозит, целлюлозу. Не усваивает D-маннит, схарозу , рафинозу.

Штамм Streptorayces С-19393 депонирован в Fermentation Reseach last Agencyof Ind.Science and TechnoCogy PERM-P № 4774 в институте ферментации . Осака под номером iFo 13886 и в American Туре Cuture СоКСection под номером AMCC 31486.

Шта1у1м Streptomyces С- 19393 (iFo 13886) культивируют в питательной среде, содержащей источники уг7 лерода и азота, в качестве источников углерода могут быть использованы глюкоза, крахмсЦ, глицерин декастрин , сахароза, студень из проса , маласса. Примером источника азота могут быть м сной экстракт, высушенные дрожжи, дрожжевой экстракт , соева мука, кукурузный экстракт, пшеничные почки, хлопковый цвет, сульфат аммони , нитрат аммони . При необходимости мо гут быть использованы неорганичесПродолжение табл, 1

Слонова

Белый кость

- Бесцветна

Серовато- -

1 желтый

Бесцветный

Белый

0

кие соли такие как карбонат кальци , хлористый натрий, хлористый калий, соль фосфорной кислоты, а также органические и неорганические вещества,которые способствуют

5 росту микроорганизма и могут добавл тьс в питательную среду в соответствующих количествах.

Кроме того, в среду могут Добавл ть соли т желых металлов, как

0 сульфат железа, сульфат меди, а также витамины В, биотин. .

В среду могут добавл ть противопенные и поверхностно-активные агенты, такие как силеконовые мас5 ла, эфир полиалкиленгликол .

Культивирование осуществл ют в твердой или жидкой среде в услоьи х аэрации. Культивирование ведут при 15-32 с, рН 4-8 в течение 8-168 ч, предпочтительно 24-144 ч.

0

Антибиотик С-19393 S и Н производ т внешнеклеточно и в ферментационном бульоне, отдел ют полученную культуру от микробиальных клеток и верхний слой жидкости центри5 фугированием или фильтрацией, а затем отдел ют антибиотик от верхнего сло жидкости. Однако антибиотик может быть также получен непосредственно из ферментацион-;-,

0 ного бульона.

Выделение С-19393 82 и Hj может производитьс по методике обычно используемой, дл выделени .метаболитов , производимых микроорганизмами . Так, например, поскольку С-19393 S2 и Н2 представл ет собой водно растворимое кислотное соединение , вырабатываемое, главным образом , внешнеклеточно, методика, включающа удаление микробиальных клеток фильтрацией или центрифугированием и отделение, очистку и сбор активного вещества из фильтрата обычно используетс дл выделени С-19393 S и Н. Таким образом, раз5 личные средства, использующие различие в растворимости и степени растворимости в различных раствори тел х, различие в природе осаждени и скорости осаждени и различи в. адсорбционной: способности, а та же ионо-обменна хроматографи , . хроматографи на молекул рных сита концентраци при пониженном давлении и сушка замораживанием и т.п. могут использоватьс сами по себе или в подход щей комбинации в любо пор дке и с любым числом повторени Примерами подход щих адсорбентов могут служить активированный уголь адсорбционные смеси, анионо-обменн смолы (анионного типа), порошкообразна целлюлоза, силикагель и т.п. или носители, обладающие свой ствами мoлeкyJIЯpныx сит. Примерами элюирующих растворителей, которые могут использоватьс , могут служит водные растворы водно-растворимых растворителей, таких как ацетон, метанол, этанол, пропанол, бутанол , изопропанол, изобутанол и т.п или водные растворы кислот или щелочей , или буфферные или водные растворы неорганических или органи ческих солей, хот используемые растворители могут измен тьс в зависимости от типа носител . Ферментационный бульон, получен ный после завершени культивации,, фильтруют с использованием фильтрую щего средства с целью удалени мик робиальных .клеток. Полученный в ре зультате фильтрат пропускают через колонку с активированным углем в нейтральных или слабо-кислых услови х и адсорбированный антибиотик С-19393 S элюируют водой или гидрофильной растворительной системой Больша часть антибактериальной активности обнаружена в водном элюате. Поскольку антибиотик С-19393 S вл етс по природе кислым, такие анионо-обменные смолы типа С или АсО, как Амбердит 1РА-400, 402 и 410 могут примен тьс дл дальнейшей очистки. Из полученного в результате элюата антибиотического соединени , активное вещество дополнительно элюируют водным раствором хлористого натри или буфферным раствором. Обессоливание элюата достигаетс слабым подкислением элюата и хроматографической обработкой элюата активированным углем с последующим элюированием водным раствором спирта и т.п. Элюат, со держащий активное соединение, концентрируют при пониженном давлении при низкой температуре и к концентр ту добавл ют этанол или метанол. Полученный осадок удал ют фильтрацией и полученный в результате водно-спиртовой раствор вновь концентрируют при пониженном давлении. К концентрированному осадку добавл ют ацетон или аналогичное соединение и осадок отдел ют фильтрацией . Полученный в результате порошок может быть подвергнут дополнительной хроматографической обработке с использованием колонной хроматографии с комбинацией фаз DEAE или QAE Сефадекс в СС -форме и адсорбента - смолы XAD или высоко пористой смолы типа Диаион НР-20. Водный раствор порошка, полученный выше, адсорбируют на DEAE Сефадексе А-25 (вСР - форме) и после промывани водой колонку элюируют 0,4 М водным раствором хлористого натри . рН элюата устанавливают равным 5 и его полвергают колонному хроматографированию с использованием активированного угл . Элюирование с колонки с активированным углем провод т с использованием водного изобутанола, однако лучший результат получают при элюировании в нейтральных или слабо-щелочных услови х, которые создают добавлением разбавленного водного раствора аммиака и т.п. Затем полученное в результате соединение подвергают колонной хроматографии с использованием XAD-H ил НР-20. Адсорбированное активное вещество фракционно элюируют водой. Активные фракции собирают и концентрируют , и концентрат подвергают хроматографической обработке на колонке с QAE-Сефадексом А-25 (СЕ -форма ) , после чего элюируют 0,02 М водным раствором хлористого натри . Полученный элюат обессоливают хроматографированием на активированном угле тем же способом, как описано выше. Элюат концентрируют и концентрат подвергают колонной хроматографии с использованием фазы из XAD-11, после чего провод т элюирование и фракционирование водой. Как было установлено, полученные фракции дают единственный пик на жидкостной хроматограмме, как будет показано ниже. Активные фракции объедин ют и концентрируют досуха при пониженном давлении, при низкой температуре и к остатку добавл ют ацетон или аналогичное соединение -с образованием С-19393 S2. Ферментационный бульон, полученый после завершени культивации, ильтруют с помощью фильтрующего редства дл удалени микробиальных ттеток. Полученный в результате ильтрат пропускали через колонку активированным углеродом в нейтальных или слабо-щелочных услови х

и адсорбированный антибиотик С-1939 Hj элюируют с помощью гидрофильной системы растворителей. Поскольку антибиотик Сг-19393 Н вл етс по природе кислым, дл дальнейшей очистки с успехом можно примен ть аниоиообменные ,смолы в форме С1 или СН СОО, такие как Амберит IRA-400, 402, 410, Дууэкс-1, Диаион А-21А и G. Активное вещество, дополнительно элюируют водным раствором хлбристого н атри или буфферным раствором. Обёссоливание элюата осуществл ют его нейтрализацией или слабым подкислением и последующим хроматографированием через активированный

уголь, .с последующим элюированием водным раствором спирта и т.п. Элюат, содержащий активное соедииеиие , концентрируют при пониженном давлении при низкой температуре и к концентраасу добавл ют метанол и этанол. Полученный осадок удал ют фильтрацией и полученный в результате водный раствор спирта снова концентрируют при пониженном давлении. Дл дальнейшей очистки полученного в результате концентрата с успехом можно примен ть колонную хроматографию с использованием комбинации DEAE или QAE Сефадекса вС -форме, а также адсорбцион ную смолу XAD или Диаион РН-20, т.е. полученный ранее концентрат пропускают через Диаион HP-2О и фракционно элюируют водой. Активные фракции концентрируют и концентрат пропускают через ДЕАЕ Сефадекс. А-25/се -форма. После промывани 0,02 М водным раствором хлористого натри ,, элюирование осуществл ют 0,05 М водным раствором хлористого натри . Затем полученный в результате элюат пропускают через ДиаионНР-20 , который обрабатывают, водным раствором хлористого натри и элюирвание провод т с помощью водного раствора хлористого натри , содержащего метанол. Обе,ссоливание элюата провод т с использованием хроматографировани через активированный уголь , тем же способом, что описан выше. Полученный в результате элюат концентрируют и концентрат подвергают колоночной хроматографии с использованием Диаион НР-20 (50-100 меш) и фракциоино элюируют водой Активные фракции сливают и 4 концентрируют и концентрат подвергают хроматографированию на колонке с использованием фазы QAE Сефадекс А-25 iCt -форма), которую обрабатывают 0,02 М раствором хлористого натри -. Фракционирование провод т с использованием 0,04 М водного раствора хлористого натри и активные фракции обессоливают

тем же способом, что описан выше с .использованием хроматографии через активированный уголь. Элюат концентрируют и концентрат подвергают .хроматографированию на колонке с использованием Avice Э (кристаллическа целлюлоза) - и колонку элюируют и фракционируют 90%-ным водным .раствором пропанола. Полученный элюат концентрируют и концентрат подвергают хроматографированию на колонке с XAD-11 (100-200 меш), I по.сле чего провод т элюирование и акционирование водой. Активные фракции концентрируют и концентрат подвергают препаративной жидкостной хроматографии, после чего осущесгв л ют элюирование и фракционирование с помощью метаиолсодержащего фосфат ного буффера. Фракции,. дающие на xpOMaTorpaiv№ie один пик, объедин ют и концентрируют и концентрат подвергают хроматографированию на колонке с использованием НР-20 (100-200 меш), после .чего провод т элюирование водой дл удалени буфера, Элюированные активные фракции кйнцентрируют при пониженном давлении при низкой температуре и концентрат сушат вымораживанием с получением С-19393 Еу в виде белого порсшка.

Соединени изобретени могут обрзовывать соль металла и аммонийную соль. Примерами солей металла могут служить натриева соль, калиева .соль, литиева соль и т.п.

Динатрнева соль С-19393 S, полученна в примере 1, имеет следующие физические и химические свойства: внешний вид - белый порошок; удельное вргицение: (,5, в воде),

Элементарный анализ, % (образец сушили над п тиокисью фосфора при в течение б ч): С 36,29f1,0; Н 3,72tO,5; N ,5; Na 9,70-t il,0; Q 31,09tl,0; S 13,1311,0.

Количество кислорода расчитано . по балансу, т.е. вычитанием содержаний других компонентов.

Молекул рный вес (вычисленный в расчете на содержание 2 атомов Na/на молекулу) 528-429 молекул рна формула,С Н Ы Ыа2Од32. УФ-спектр: спектр, сн тый в воде и максимальные значени длин волн были следующие: Д 240 f 12 нм/Е.2 296120/ и 285±2 нм/Е2 245420)

ИК-спектр; спек.тр измер ли с ;образцами в таблетках КВг и имеет основные пики (волновые числа) бы ли слеАук аими: 3450, 3220, 3000, -1770, 1700, 1630, 1515, 1395,

65 1240-1260, 1100, 1050, 1010, 980, 950, 915, 900j 860, 815, 795, 760 715, 670, 625, 590, 530. (см ). Тонко-слойна хроматографи CeCeueose F. Система растворителей. Значение R а)пропана: вода (4:1) 0,3310,1 б)бутанол:уксусна кислота:вода ( 2:2:1)0,54±0,1 с) пропанол:этанол-вода ( 5:2:3)0,62tO,l Растворимость: нерастворимы в хлороформе, этилацетате, ацетоне; частично растворимыв этаноле, вутаноле , пиридине; растворимы в метаноле , диметилсульфоксиде, уксусной кислоте; легко растворимы в воде. Цветные реакции: положительна реакци Эрлиха и с перманганатом кали ; отрицательна - реакции с нинги-дрином, Грейг-Либака, Драгендорфа , с хлорным железом и реакци Сакагуши. Натриева соль С-19393 Hj, полученна в примера 2,представленно ниже, имеет следующие физические и химические свойства. Внешний вид - белый порошок. Элементарный анализ (определенный дл образца высушенного над п тиокисью фосфора при 40°С в течение 6 ч): С 45,34±1,0; Н 4,98±0,5; N 7,48±0,5; Na 6,15tl,0; 6 8,51ll,0. Молекул рный вес (вычислено в расчете на содержание одного атома Na на молекулу) 426-322. Молекул рна формула NaSOg. Удельное вращение: fo(3.° 134° (с 0,156, в воде). УФ-спектр: измеренный спектр имеет следующие максимальные значен длин волн: Амакс.НО/Е 242+ ±2 нм/395±20) и 28912 нм (314f20) ИК-спектр: спектр, измеренный в таблетке из КВг имеет следующие основные пикН (волновые числа): 3400, 298,0, 2940, 1770, 1630, 1530 1390, 1265, 1215,1130, 1090, 1065 1040, 1000, 920, 840, 820, 790, 7 620, 540, 450/см. Циркул рный dichroism спектр (в вОдеЗ: положительный эффект Кот на при 234 нм и отрицательный эффект Коттона при 206, 258, 292 мм. Тонко-слойна хроматографи (с использованием целлюлозы). Система растворителей. Значение R а)пропанол:вода (4:1) 0,45tO,l б)бутанол:уксусна кислота:вода ( 2:1:1)0,67,tO,l с) бутанол:пиридин: уксусна кислота: вода (15:3:2:12), верхний слой 0,5510,1 Цветные реакции: положительные Эрлиха реакции и с перманганатом кали ; отрицательные - с нингидрином, Грейг-Либака, Драгендорфа с хлорным железом и реакции Сакагуши. Растворимость: нерастворим в хлороформе, этилацетате; умереннорастворим в ацетоне, этаноле, и бутаноле; растворим в метаноле и воде. Антибиотики С-19393 S, и Нл относ тс к антибиотикам /5 -лактального типа. Антимикробный спектр натриевой соли антибиотика С-19393 82 представлен в табл.2. Таблица 2 Escherichia coti NIHJ 12,5-25 SafmonefSa typhimurium IFO 1252912,5 KEebsieCea pnenmoniae IFO 331812,5 Proteus vuCgaris IFO 3045100 Proteus mirabiCis IFO 384550 Serratia marcescens IFO 1264825 ACcaKigenes faccatis IFO 1311150 Pseudomonas aerugino- sa IFO 30801100 Comamonas ternigend IFO 132996,25 Staphydococcus aureus 209P12,5 Sarcina t utea IFo 323212,5

Продолжение табл.2

subtilis

12,5

i

cereus

100

Среда - бульонный агар.

Антибиотик С-19393 S обладает также сильной бета-лактамаэной ингибирующей активностью и, поэтому, он значительно повышает чувствителность различных бактерий, которые устойчивы к действию производных пинициллина и/или цефалоспорина, к действию этих.агентов.

Антибиотик обладает активностью против грамположительных играмотрицательных бактерий и поэтому он может быть использован при лечении бактериальной инфекции у млекопитащих , например мышей, крыс,собак, людей.

Дл использовани С-19393 82 при лечении инфицировани микроорганизмом вида E.coti антибиотик раствор ют в физиологическом растворе с целью приготовлени раствор дл инъекций,который можно примен ть парентерально, например подкожно или внутримышечно при дозе 2-200 мг/кг/день, предпочтительно, 5-50 мг/кг/день. В случае ораль-ного применени антибиотик С-19393 S смешивают с лактозой и капсулируют с целью получени капсульного препарата , который можно примен ть с дозой 10-500 мг/кг/день, предпочтительно , 20-200 мг/кг/день.

Кроме того, антибиотик С-19393 полученный согласно изобретению, можно использовать в качестве дезинфицирук дего средства. Так, например , жидкий препарат, который может- быть получен растворением антибиотика С-19393 S в дистиллированной воде с концентрацией 0,11 ,0 вес./об.% или маз ь, содержаща 2-50 мг, предпочтительно, 5-20 мг. С-19393 S2 на 1 г белого петролатума или ланолина в качестве основ может использоватьс в качестве бактерицида или дезинфицирующего средс±ва дл обработки верхних и нижних конечностей, глаз, ушей и т.п. у указанных выше животных.

Антибиотик С-19393 Sj обладает бета-лактамазной ингибиторной активностью и поэтому, значительно повышает чувствительность пенициллин или. цефалоспорин - устойчивых бактерий к действию ампициллина и

цефотиама из-за его способности производить бета-лактамазу. В соответствии с этим, С-19393 S может использоватьс дл лечени инфицировани у млекопитающих (например,

у мышей,крыс, собак и людей), а также у птиц (например, куриц, уток), особенно бактериальных инфекций , об занных действию беталактам-антибиотическиС устойчивых

0 бактерий в комбинации с пенициллином или цефалоспорином.

В том случае, когда антибиотик С-19393 S, используетс в комбинации с другими средствами бета-лак5 тамного типа дл лечений инфекционных заболеваний,вызываемых, например , бета-лактамантибиотик - устойчивой E.coEi, равные количества С-19393 S и ампициллина раствор ют .

Q в физиологическом растворе с целью получени инъекционного раствора, который может примен тьс парантерально , например подкожно или внутримышечно с дозой 0,1-20 мг/кг/день

5 предпочтительно, 0,5-5 мг/кг/дснь. С-15393 S. может также примен тьс орально с дозой 1-200 мг/кг/день, предпочтительно, 5-100 мг/кг день, ввиде капсул, кажда из которых содержит равное количество С-19393 S и цефалексин.а.

Если антибиотик С-19393 S используетс в качестве дезинфицирующего средства, жидкий препарат, например водный раствор, содержащий ан5 тибиотик С-19393 S .с концентрацией 0,1-10 вес/об.% и бензилпенициллин с концентрацией 0,1-1,0 вес/об.%, или мазь, содержаща 5-20 мг С-19393 S и 5-20 мг бензилпенйцил0 лина на 1 г белого петролатума или ланолина,.в качестве основани , могут использоватьс в качестве бактерицида или дезинфецирующего средства дл обработки верхних и ниж5 них конечностей, глаз, ушей и т.п. у указанных выше животных.

Антибиотик С-19393 S. вл етс также весьма полезным промежуточным Q соединением дл синтеза новых типов фармацевтических препаратов. Антибиотик устойчив в водном растворе в области нейтральны значений рН. .

Физиологические свойства

5

С-19393 Н описаны ниже.

Антимикробиальный спектр натриевой соли С-19393 Е ПРОТИВ различных микроорганизмов представлен в

табл.3 и, как следствие из результатов , представленных в-табл.3, антибиотик С-19393 Н про вл ет антибактериальную активность против грамположительных и грамотрицательных бактерий. Антивактериальнь й спектр дей вий натриевой соли антибиотика С-19393 Н, представлен а табл.3 Т а б л и Минима Микроорганизм на ин рукнца центра мг/мл Escherlchia cof i. NIHJ О,§8 Sa$mon& ea typhimu ,rivun IFO 125290,31 Kfiebsiefiea pneiiraonlae IFO 33810,31 Proteus vujgaris IFO 3045 Proteus mirabiCis IFO 38455 Serratia marcescens IFO 126480,31 Afcatigenes faecaPis IFO 131115 Pseudomonas aeruginosa IFO 308010 Coraamonas terrigena IFO 132990,16 StaphyEococcusaureus 209P.0,63 Sarclna €utea IFO 3232 .0,31 Bac±Uus subtle is IFO 3S130,31 Bade(Jus cereus IFO 3460 10 Среда - бульонный агар. Как следует из табл.3 антибио С-19393 Hjj , полученный в соотве ствии с изобретением, обладает тимикробной активностью против грамположительных и грамотрицат ных бактерий и, таким образом, жет использоватьс дл лечени бактериальных инфекций у млекопитак цих , например у мышей, крыс, собак , людей и пр., а также у птиц, например у куриц, уток и т.п. Дл . использовани С-19393 Н в качес уве средства дл лечени например , инфекц.ировани E., С-19393 Н. раствор ют в физиологическом растворе с целью получени раствора дл инъекций, который может примен тьс паренгерально, например подкожно или внутримышечно , с дозой 0,1-50 мг/кг/день, предпочтительно, 0,5-20 мг/кг/день. В случае о рального применени антибиотик С-19393 2 смешивают с лактозой и капсулируют с целью получени капсульного препарата, который может примен тьс с дозой 1-100 мг/кг/день7 предпочтительно 5-50 мг/кг/день. Антибиотик С-19393 Н2, полученный согласно изобретению, может . использоватьс в качестве дезинфецирующего средства4 Так, например, жидкий препарат, полученный растворителем С-19393vH2 в дистиллированной воде с концентрацией 0,010 ,1 вес/об.% или мазь, содержаща 0,2-20 мг, предпочтительно, 1-10 мг С-19393 Н на 1 г белого петролатума или ланолина, в качестве основани ., может использоватьс как бактерицид или дезинфицирующий агент дл верхнихи нижних конечностей; глаз, ушей, и т.п. у указанных выше животных. Антибиотик С-19393 Н может быть полезным в качестве промежуточного агента дл синтеза новых типов фармацевтических препаратов. Антибиотик изобретени устойчив в водном растворе при нейтральном значении рН. Пример. Культуру штамма Streptomyces С-19393 (1 FO 13886, АТС С 31486) выращивают в 200 мл культуральной среды, помещенной в 1 л Эрленмейровскую колбу с образованием спор. Затем полученные споры суспендируют в стерильной воде с концентрацией 1,210 живых клеток/мл . Споровую суспензию разбавл ют стерильной.водой до объема в 10 раз большего, чем начальный объем и 1 мл разбавленной суспензии используют дл инокулировани 40 мл посевной среды в 200 мл Эрленмейровской колбе. Инокулироваиную пЬсевную среду затем культивируют в ротационной тр сучке при в течение 2 дней. Полученную в резуль- тлте культуру используют, дл инокулировани 500 мл посевной среды, помещенной в 2 л колбу Сакагуши и инокулированную посевную среду культивируют в тр сучке при в течение . 2 дней. Полученную,таким образом , посевную культуру перенос т в 50 л ферментатор из нержавеющей стали, содержащий 30 л посевной среды, содержащей 15 мл Актокола и культивируют при в течении 3 дней, при аэрации со скоростью 30 л/мин и при скорости перемешивани 280 об/мин. Культуральный бульон перенос т в ферментатор емкостью 2 м, содержащий 1,2 основной культуральной среды и провод т культивацию при 30°С в течение 5 дней при скорости аэрации 840 мл/мин и скорости перемешивани 180 об/мин. Засе нную среду, используемую выше, дополн ют 20 г глюкозы, 30 г растворимого крахмала , 10 г сырой соевой муки, 10 г кукурузного экстракта, 5 г полипептона , 3 г хлористого натри и 5 г осажденного карбоната кальци на 1 л среды, рН которой устанавливают равным 7,0 перед стерилизацией , а основную культуральную сред используемую выше, дополн ют Зо г глюкозы, 30 г растворимого крахмала , 15 г обезжиренной соевой муки , 15 г муки хлопкового семени, 0,25 г первичного кислого фосфата кали , 0,6 г кислого фосфата кали , 0,02 г хлористого кобальта и 0,5 г Актокола на 1 л среды, рН которой устанавливают равным 7,0 перед стерлизацией . Все среды, используемые выше, подвергают стерилизации при

в течение 20 мин.

i

Полученный, таким образом, ферментационный бульон фильтруют с использованием Hyf2о-Superce с получением 1230 л фильтрата, рН которого затем устанавливают равным 6,3 и пропускают через колонку, набитую 100 л активированного угл . Затем антибиотик С-19393 82 и Н элюируют из колонки с помощью 300 л воды и 700 л 7%-ного водного раство pa изобутанола, соответственно.Элюа содержащий С-19393 82, пропускают через колонку с Dowex 1-2 (СЕ-форма , 2 л) и колонку промывают б л вгды и элюируют 32 л 5%-ного водного раствора хлористого натри . Элюат довод т до рН, равного 5 и пропускают через колонку с 4 л активированного угл . После промывани 12 л воды антибиотик элюируют 7 л 8%-ного водного изобутанола и 12 л смеси 8%-ного изобутанола - N/20 . водного аммиака и полученный элюат концентрируют до объема в 150 мл при пониженном давлении. К концентрату добавл ют 1350 мл метанола и осадок, образовавшийс в результате , удал ют фильтрацией. Фильтрат концентрируют до объема 200 мл и пропускают через колонку с фазой из 300 мл DEAE-Сефадекса ; А 25 (С -форма).Колонку последовательно промывают 0,1 М и 0,2 М водными растворами хлористого натри , (по 900 мл) и после этого антибиотик элюируют 1500 мл 0,4 М водного раствора хлористого натри . рН элюата устанавливают равным 5 и пропускают через колонку с 500 мл активированного угл . После промывани 1,5 л воды колонку элюируют 2,5 л смеси изобутанола N/20 водного аммиака (8:92) и элюат концентрируют досуха и к остатку добавл ют ацетон с образованием 2,4 г светло-желтого порошка-. После растворени порошка в небольшом количестве воды,полученный раствор пропуска1ют через колонку,набитую 1,2 л Ам-. берлита XAD-11 (100-200 меш),и элюируют (фракци ми) водой.Фракции,имеjoщиe антибиологическую активность, собирают и концентрируют и концентрат пропускают через колонку |с 200 МП ЦАЕ-Сефадексом А 25 (СГ:форма ). После промывани 600 мл 0,1 М водного раствора хлористого натри , колонку элюируют 1,2 л 0,2 М водного раствора хлористого натри . Элюат довод т до рН равного 5 и пропускают через колонку с 600 МП активированного угл . После промывани колонки 1,8 л воды, колонку элюируют 3 л смеси 8%-ного изобутанола - N/20 водного аммиака. Элюат концентрируют досуха и добавл ют ацетон к остатку с получением 1,07 г порошка. 620 мг полученного, таким образом, порошка раствор ют в небольшом количестве воды и полученный раствор пропускают через колонку, набитую 360 мл Амберлита XAD-11 (100200 меш). Затем колонку элюируют и фракционируют водой и каждую из фракций, обнаруживающую антибиологическую активность, анализируют методом жидкостной хроматографии как описано выше, дающие один пик, объедин ют и концентрируют досуха и к концентрату добавл ют ацетон с получением 136 мг антибиотика С-19393 82 (динатриевой соли) в виде белого порошка.

П.р им е р 2. Элюат антибиотика С-19393 Н2, полученный в примере 1, пропускают через колонку с Доунксом 1-2 (сС -форма, 12 л) и колонку промывают 6 л воды и элюируют 180 л 5%-ного раствора водного хлористого натри . Полученный элюат пропускают через колонку, набитую 25 л активированного угл . После

промывани 75 л воды желаемый антибиотик элюируют 175 изобутанола с водой (7:93) и элюат концентрируют до объема в 2-3 л при пониженном давлении. К концентрату добавл ют 15 л метанола и полученный, таким образом, осадок удал ют фильтрацией . Полученный фильтрат концентрируют до объема в 2 л и пропускают через колонку с 5 л Диаиона НР-20 (50 меш). Затем колонку элюируют и фракционируют 5 л водаз и 10 л смеси метанол: вода (1:9). Активные фракции объедин ют и концентрируют и концентрат пропускают через колонку с 3 л ДЕАЕ-Сефадекс

А-25 (СЕ -форма). Затем колонку промывают 9 л 0,02 М водного раствора хлористого натри и антибиотик элюируют и фракционируют 12 л 0,05 М раствора хлористого натри . Активные фракции пропускают через колонку, набитую 2 л Диаиона НР-20 (50 меш), который обрабатывают 4 л водного раствора хлористого натри , активное вещество элюируют и .фракционируют 10 л смеси метанол: 5%-ный водный раствор хлористого натри (5:95) и 10 л смеси метанол: 5%-ный водный раствор хлористого натри (1:9). Активные фракции пропускают через колонку с 500 мл активированного угл и, после промывани 1,5 л воды, элюируют 2,5 л 7%-ного водного изобутанола. Элюат концентрируют и концентрат пропускают через колонку с 1 л Диаион НР-20 (50-110 меш) и злюируют и фракционируют водой. Фракции, обладающие антибиолргической активностью , объедин ют и концентрируют и концентрат пропускают через колонку, снабженную 200 мл фазы QAE-Свфадекс А-25 (СЕ -форма ) , которую предварительно обрабатывают .400 мл 0,02 М водного раствора хлористого натри . Затем клонку последовательно промывают О,.02 М, 0,03 М И 0,04 М водными растворами хлористого натри (по 1 л). Активные фракции пропускают через колонку с 200 мл активированного угл и, после промывани 0,6 л воды, элюируют 1 л 7%-ного водного бутанола. Элюат концентрируют и пропанол добавл ют к концентрату с целью получени 90%-ного водного пропанола, который затем подвергают хроматографированию на колоке с Авицелем, который обрабатывают 90%-ным водным раствором пропанолом . Затем колонку элюируют 90%-ным водным пропанолом. Активные фракции концентрируют и концентрат подвергают хроматографированию на колоке с 350 мл Амберлита XAD-11 (100-200 меш) и колонку элюируют

водой. Активные фракции концентрируют и концентрат подвергают препаративной жидкостной хроматографии высокого давлени с использованием РР-18 в качестве носител и провод т элюированием 10%-ного метанола в 0,02 М фосфатном буффере (рН 6,3). Активные фракции пропускают через колонку с 40 мл Диаиона НР-20 (100200 меш) и фракционно элюируют водой.

О Каждую фракцию, обнаруживающую ан-. тимикробиальную активность, подвергают жидкостному хроматографическому анализу, описанному выше. Фракции , дающие один пик, объедин ют и

5 сушат вымораживанием с получением 12 мг С-19393 2 в виде белого порошка .

Примерз. 1150 л фильтрата бульонной культуры получают по ме0 тодике аналогичной описанной в примере 1 и его рН устанавливают равным 50 г, пропускают через колонку с100 л активированного угл . После промывани 300 л воды,

5 колонку, элюируют 350 л смеси раствора изобутанола с 0,02 N гидроокисью натри (8:92).

Полученный элюат пропускают че0 рез колонку, набитую 10л Диаиона SA-21A (еГ -форма) и, после промывани 30 л воды колонку элюируют 100 л 5%-ного водного раствора хлористого натри . Затем элюат про5 пускают через колонку с 20 л Диаиона НР-20 (50 меш), которую обрабатывают 40 л 5%-ного водного раствора хлористого натри и колонку элюируют 20 л 5%-ного водного раст0 вора NaCE. Затем антибиотик

С-19393 S и Н элюируютjC колонки 40 л и 60 л смеси метанол: 5%-ный водный раствор NaCg (5:95). Полученный элюат, содержащий анти5 биотик С-19393 S2, довод т до рН равного 5 и пропускают через колонку , набитую 2 л активированного угл . После промывани 6 л воды, колонку элюируют 10 л смеси 8%-ного изобутанола N/20 водного аммиака и полученный элюат концентрируют. Концентрат пропускают через колонку, , набитую 200 мл АЕ-Сефадекса А-25 (Ct -форма), и после промывани 1 л 0,02 М водного раствора хлористого

5 натри колонку элюируют 1 л 0,4 М водного раствора хлористого натри . После обессоливани элюита хроматографированием с использованием активированного угл , его под0 вергают хроматографированию через Амберлит XAD-11 и обрабатывают таким жь способом, как и в примере 1 с получением 100 мг динатриевой соли антибиотиком С-19393 в виде бе5 лого порошка.

П р и м е р 4. Йлюат антибиотика С-19393 Hg, полученный з примере 3, довод т до рН равного 5 и пропускают через колонку/ набитую 2 л активированного угл . После промывани б л вощг, колонку элюируют 10 л смеси изобутанол N/20 водный аммиак (8:92) и элюат концентрируют . Концентрат пропускают через колонку с 200 мл фазы QAEСефадёкс А-25 (Ci -форма) и после промывани 1 л 0,02 М водного раствора хлористого натри , колонку элюируют 1 л -0,04 М водного раствра хлористого натри . После обессоливани элюата xpo 4aтoгpaфиpoвaнием через активированный уголь, его подвергают хроматографированию на колонке с 200 мл Диаион НР-20 (100-200 меш) и колонку элюируют и фракционируют водой. Фракции, дающие единственный пик на жидкостной хроматограмме, объедин ют и концентрируют и концентрат сушат вымораживанием с образованием 48 мг С-19393 Н натриевой соли в виде белого порошка .

Предложенный способ позвол ет получить новый антибиотик, который найдет широкое применение: в медиtS цине.

Claims

Способ получения антибиотика общей формулы

СН₃I ⁴

сн₃-е

3 р

к-о

О"

1Г ^хинеосн₃соон

где -К-ЗО₃Н -антибиотик С-19393 и/или К-Н - антибиотик С-19393 Н₂/·'

'заключающийся в том, что штамм 5-ЬгерЪотусез С-19393 (ΪΒΌ 13,886) культивируют в питательной среде, содержащей источники углерода и азота, и выделяют целевой продукт из жидкой фракции культуральной среды в виде смеси и/или отдельных антибиотиков .

Приоритет

02.02.79 при ка С-193933₂;

06.06.79 при ка С-19393Н₂.

по признакам; получении антибиотиполучении антибиоти-

*

1075984 А

1

1075984
2