FI98739C

FI98739C - Menetelmät benanomisiinien A ja B sekä deksylosyylibenanomisiinin B valmistamiseksi

Info

Publication number: FI98739C
Application number: FI885039A
Authority: FI
Inventors: Tomio Takeuchi; Masa Hamada; Haruo Yamamoto; Masaji Sezaki; Takeshi Hara; Shinichi Kondo; Shuichi Gomi
Original assignee: Zaidan Hojin Biseibutsu
Priority date: 1987-11-02
Filing date: 1988-11-01
Publication date: 1997-08-11
Also published as: EP0315147B1; DE3887820T2; ES2063015T3; CA1339016C; AU2457988A; AR241657A1; DK608288D0; DE3887820D1; US5055453A; DK608288A; US5278052A; FI885039A; FI885039A0; DK170029B1; EP0315147A2; MX9201563A; AU612189B2; FI98739B; EP0315147A3

Description

98739

Menetelmät benanomisiinien A ja B sekä deksylosyylibenanomi-siinin B valmistamiseksi Tämä keksintö koskee uusia sientenvastaisia antibiootteja, jotka on nimetty benanomisiini A:ksi, benanomisiini B:ksi ja deksylosyylibenanomisiini B:ksi ja joista kukin on käyttökelpoinen terapeuttisena sientenvastaisena aineena ja voi esiintyä suolojen tai estereiden muodossa. Tämä keksintö koskee sekä menetelmää benanomisiinien A ja B tuottamiseksi käymisteitse että menetelmää deksylosyylibenanomisiinin B tuottamiseksi benanomisiinista B.

Paljon antibiootteja tunnetaan jo, mutta uusia antibiootteja toivotaan kuitenkin voitavan saada farmasian alalla ja myös maatalousalalla. Nyt on tehty laajoja tutkimuksia sellaisten uusien antibioottisten aineiden löytämiseksi ja saamiseksi, joilla aineilla voidaan osoittaa olevan käyttökelpoista an-tibakteerista aktiivisuutta ja/tai sientenvastaista aktiivisuutta. Tuloksena on nyt havaittu, että kun Actinomycetes-suvun uutta mikrobikantaa, joka eristettiin keksijöiden Tokiossa, Japanissa olevan laboratorion alueelta kerätystä maanäytteestä ja jolle annettiin laboratorionimi MH193-16F4-kanta, kasvatetaan viljelyväliaineessa aerobisissa olosuhteissa, muodostuu joitain antibiootteja, joilla on sientenvastaista aktiivisuutta. Nyt on onnistuttu eristämään ja puhdistamaan kaksi sientenvastaista antibioottia MH193-16F4-kannan viljelmästä ja nämä kaksi eristettyä antibioottia on nimetty benanomisiiniksi A ja benanomisiiniksi B. Nyt on tutkittu benanomisiinien A ja B fysikaalis-kemialliset ja biologiset ominaisuudet sen toteamiseksi, että benanomisii-nit A ja B ovat uusia kaikista tunnetuista antibiooteista erotettavissa olevia aineita. Lisätutkimuksien avulla on nyt onnistuttu ratkaisemaan benanomisiinien A ja B kemialliset rakenteet. Lisäksi on onnistuttu syntetoimaan uusi yhdiste, nimittäin deksylosyylibenanomisiini B, benanomisiinin B kemiallisella muuntamisella ja on todettu, että deksylosyyli- 2 98739 benanomisiinilla B voi olla myös hyödyllistä sientenvastais-ta aktiivisuutta.

Nyt on edelleen todettu, että keksinnön mukaisesti valmistettavat uudet antibiootit, benanomisiinit A ja B ovat fy-sikaalis-kemiallisilta ja biologisilta ominaisuuksiltaan kuten myös kemiallisilta rakenteiltaan enemmän tai vähemmän samanlaisia kuin tunnetut kolme antibioottia, nimittäin KS-619- 1-aine {Matsuda et ai: "Journal of Antibiotics" 40., 1104-1114 (1987)}; ja G-2N-aine ja G-2A-aine {Gerber et ai: "Canad. J. Chem." 62., 2818-2821 (1984)}, mutta että benanomisiinit A ja B voidaan erottaa selvästi yllä mainituista kolmesta tunnetusta antibiootista niiden fysikaalis-kemial-listen ja biologisten ominaisuuksien ja myös niiden kemiallisten rakenteiden perusteella.

Tähän asti on jo tunnettu monenlaisia mikro-organismien tuottamia antibiootteja. Tunnettujen antibioottien joukossa on kuitenkin vain vähän sellaisia antibiootteja, joilla on käyttökelpoinen sientenvastäinen aktiivisuus, mutta alhainen toksisuus imettäväisille. Tästä johtuen on aina tarvetta löytää ja hyödyntää uusi sientenvastainen antibiootti, joka on käyttökelpoinen erilaisten sieni-infektioiden terapeuttisessa käsittelyssä eläimillä, ihminen mukaan lukien. Nyt on havaittu, että benanomisiinilla A ja B samoin kuin deksy-losyylibenanomisiinilla B on alhainen toksisuus eläimelle ja että ne voidaan kuvata jäljempänä esitetyllä yleisellä kaavalla (I) .

Tämän keksinnön tarkoitus on tarjota uusia antibiootteja, joilla on käyttökelpoisen korkea sientenvastainen aktiivisuus mutta alhainen toksisuus imettäväisille, ja yksityiskohtaisemmin benanomisiini A, benanomisiini B ja deksylosyy-libenanomisiini B sekä niiden farmaseuttisesti hyväksyttävät suolat ja esterit. Keksintö koskee menetelmiä näiden uusien antibioottien valmistamiseksi. Keksinnölle tunnusomaiset seikat ilmenevät oheisista patenttivaatimuksista.

li 3 98739

Ensiksi tässä keksinnössä on saatu aikaan yhdiste, jolla on yleinen kaava (I) ch3 conh!;hcooh i (R> H0 JL CH3 O HO Il (1)

OH O OH

;sv

R -o OH

jossa R on hydroksyy li ryhmä tai aminoryhmä ja R1 on vetyatomi tai ksylosyyliryhmä edellyttäen, että kun R on hydroksyyli-ryhmä, R1 ei ole vetyatomi, ja kaavan (I) mukaisen yhdisteen suola tai esteri.

Tällainen yleisen kaavan (I) mukainen yhdiste, jossa R on hydroksyyliryhmä ja R1 on kaavan HO ^Vs^O\ HO^-—

OH

mukainen ksylosyyliryhmä, on kaavan (Ia) mukainen benanomi-siini A

4 98739 CHo

CONHCHCOOH

OH

KoJ^CIl g 0 HO T if ’’PÄX ""

OH O* 1 OH O

HO CH3 /

OH OH

Sellainen yleisen kaavan (I) mukainen yhdiste, jossa R on amino-ryhmä ja R on keylosyyliryhmä, on kaavan (Ib) mukainen benanomi-siini B

CHo I 3

CONHCHCOOH

Äh 3

H0^>>vn^CH3 O HO j H

<lb>

OH O OH O

Η2^ CH3 / O 0 /

OH OH

Sellainen yleisen kaavan <I) mukainen yhdiste, jossa R on amino-ryhmä ja R on vetyatomi, on kaavan (Ie) mukainen deksylosyyli-benanomisiini B

li 5 98739 CHo I 3

CONHCHCOOH

Ah3

OH 0 OH O

h2n / isKv7

OH

Benanomysiini A ja benanomyeiini B voidaan yhdessä kuvata yleisellä kaavalla (I'> 3 ' CHo I 3

CONHCHCOOH

Λ, HO I CHt

0 HO VV

< I ' > OH 0 OH ^0

HoX^V ' θ\ / ΌΗ OlX' jossa R on hydroksyyliryhmä benanomisiini 11 e A ja R on aminoryhmä benanomisiini 11e B.

6 98739

Ennen benanomisiini A:n kemiallisen rakenteen selvittämistä ben- anomisiini A oli saatu ja identifioitu sellaisena antibioottisena aineena, jolla on seuraavat tunnusmerkit: se on hapan punaruskean jauheen muodossa oleva aine, sen empiirinen kaava on C39H41N019* maeeaspektri (FD-MS) on m/z 827 (M ), sulamispiste korkeampi kuin o 220 C, ultravioletti- ja näkyvän valon absorptiospektri (raetano- lissa) kuten on esitetty kuviossa 1 oheisissa piirustuksissa, infrapunaabeorptiospektri <pelletoitu kaliumbromidissa) kuten on esitetty kuviossa 2 oheisissa piirustuksissa, H-NMR-spektri (400 o MHz, DMSO-dg, 40 C) kuten on esitetty kuviossa 3 oheisissa pii-1 3

Tuetuksissa ja C-NMR-spektri (100 MHz, DMSO-dg) kuten on esitetty kuviossa 4 oheisissa piirustuksissa, ja se liukenee vain vähäisessä määrin metanoliin, kloroformiin, etyyliasetaattiin ja asetoniin ja se liukenee dimetyy1isulfoksidiin, dimetyyliformami-diin ja alkaliseen veteen, mutta on liukenematon veteen.

Ennen benanomisiinin B kemiallisen kaavan selvittämistä, benano-misiini B saatiin ja identifioitiin ensin sellaisena antibioottisena aineena, jolla on seuraavat tunnusmerkit: benanomisiini B:n hydrokloridi on amfoteerinen punertavan ruskean jauheen muodossa oleva aine, sillä on empiirinen kaava CggH^^^iB · HC1, massa- spektri (SI-MS) on m/z 827 (MH ), sulamispiste korkeampi kuin o 22 o 220 C, ominaiskierto Cal + 360 C (c 0,05, H O), D 2 ultravioletti- ja näkyvän valon absorptiospektri (metanoliesa) kuten on esitetty kuviossa 5 oheisissa piirustuksissa, infrapuna-abeorptiospektri (pelletoitu kaiiumbromidiin) kuten on esitetty kuviossa 6 oheisissa piirustuksissa, H-NMR-spektri (400 MHz, o DMSO-dg, 40 C^, kuten on esitetty kuviossa 7 oheisissa piirustuksissa ja C-NMR-spektri (100 MHz, DMSO-dg) kuten on esitetty kuviossa 8 oheisissa piirustuksissa, ja se liukenee vain vähäisessä määrin kloroformiin, etyyliasetaattiin ja asetoniin ja liukenee metanoliin, dimetyy1isulfoksidi in, dimetyy1iformamidiin ja veteen.

7 98739 1. Benanomieiinin A yllä mainitut ominaisuudet ja muut fysikaalis-kemialliset ominaisuudet on lueteltu alla yksityiskohtaisemmin: <1) Väri ja ulkonäkö: Punertavan ruskea jauhe (2) Empiirinen kaava: C3gH41NOig ( 3) Massaspektri (FD-MS): m/z 827 (M ) o

(4) Sulamispiste: >220 C

22 (5) Ominaiskierto: C a3 Ei mitattavissa

D

(c 0,05, DMSO) (6) Ultravioletti-^ja näkyvän valon abeorptiospektri λ max, nm ( E j cm>: ' {Metanolissa}: 206(718), 230sh(600), 288(482), 302sh(390), 400sh(120), 476(197) fc,l N HCl-metano Iisaa} : 207(649), 233(629), 298(561 ), 395eh(140), 457(223) {0,1 N NaOH-metanolissa}: 214(1270), 249(637), 320(289), 498(287) -1 (7) Infrapunaabsorptiospektri (KBr, cm >: 3350, 2970, 2890, 1720, 1620, 1600, 1485, 1440, 1425, 1390, 1375, 1330, 1295, 1255, 1235, 1205, 1160, 1130, 1070, 1040, 1000, 970, 900, 870, 830, 800, 750 1 o (8) H-NMR-spektri (400 MHz, DMSO-d6:ssa, 40 C:ssa): <5( ppm) : 1.14C3H, d), 1,35(3H, d), 2,34(3H, s), 3.09C1H, dd), 3, 1 3(1H, dd), 3,17(1H, dd), 3,32(1H, ddd), 3,56(1H, dd), 3,62(2H, m), 3,72(1H, dd), 3,74(1H, br), 3,92(3H, s), 4,43 (1H, d), 4,4 3(1H, d), 4,43(1H, dq), 4,53(1H, d), 4,57(1H, d), 4,65( 1H, d), 4,90(2H, br), 5,61(1H, br), 6,05(1H, br), 6,86(1H, d), 7,21(1H, s), 7,24(1H, d), 8,05(1H, s), 8,45 (1H, d), 12,47 (1H, br), 12,77 (1H, s) 13,69 (1H, br) 13 o (9) C-NMR-spektri (100 MHz, DMSO-d6:ssa, 40 C:ssa): 6(ppm): 187,3 s, 184,9 s, 173,9 s, 166,9 s, 165,9 s, 164,7 s, 156,8 s, 151,1 s, 147,7 s, 138,1 s, 137,4 s, 134,2 s, 131,3 s, 127,5 s, 125,6 s, 118,6 d, 115,5 s, 115,4 d, 113,7 s, 110,0 s, 107,5 d, 106,8 d, 105,2 d, 104,4 d, 83,0 d, 81,7 d, 76,0 d, 73,6 d, 71,9 d, 70,3 d, 70,1 d, 70,1 d, 69,4 d, 65,6 t, 56,3 q, 47,6 d, 19,1 q, 16,9 q, 16,3 q 8 98739 (Signaalit kohdissa 72,9, 81,7, 115,4 ja 118,6 ppm ovat le veät ) .

(10) Liukoisuus: Liukenee vain vähäisessä määrin metanoliin, kloroformiin, etyyliasetaattiin ja asetoniin, liukenee dimetyy-1isulfoksidiin, dimetyy1iformamidiin ja alkaliseen veteen, mutta liukenematon veteen.

(11) Aineen jaottelu luonteen perusteella emäksiseksi, happamaksi ja neutraaliksi: Hapan aine.

2. Benanomisiini B hydrokloridin yllämainitut ominaisuudet ja muut fysiokaa1iskemia11iset ominaisuudet on lueteltu alla yksityiskohtaisemmin : (1) Väri ja ulkonäkö: Punertavan ruskea jauhe (2) Empiirinen kaava: · HC1 <3> Massaspektri (SI-MS): m/z 827 (MH ) o

(4) Sulamispiste: >220 C

22 o (5) Ominaiskierto: [ a) + 360

(c 0,05, H20> D

(6) Ultravioletti-^ja näkyvän valon absorptiospektri,

Amax, nm ( E ^ cm>: ' ffetanolissa}: 205(587), 233(526), 296(426), 390sh(100), 458(169) {0,1 N HCl-metanolissa}: 207(514), 235(530), 295(442), 400sh(114), 457(173) {0,1 N NaOH-metanolissa} : 214( 1219), 247(518), 317(238), 496(215) -1 (7) Infrapunaabsorptiospektri (KBr, cm ): 3350, 2980, 2900, 1720, 1610, 1485, 1350, 1430, 1395, 1380, 1330, 1300, 1260, 1240, 1210, 1160, 1080, 1045, 970, 955, 900, 885, 840, 820 1 o (8) H-NMR-spektri (400 MHz, DMSO-dg:ssa, 40 C:ssa): 1,2 0(3H, d), 1,36(3H, d), 2,35(3H, s), 3,09(1H, dd), 3,17(1H, m), 3,19(1H, m), 3,34(1H, ddd), 3,44(1H, br), 3,65(1H, br>, 3,75(1H, dd), 3,90(1H, br q), 3,94(3H, s), 3,97(1H, dd), li 9 98739 4,44(1H , dq), 4,57(1H, d), 4,57(1H, br d), 4,62(1H, br d), 4,75(1H , d), 6,90(1H, d), 7,27(1H, d), 7,27(1H. br s), 7,99 <3H, br), 8,06 ( 1H, br s), 8,45<1H, d), 8,45<1H, br) , 12,79 <1H, e), 13,81(1H, br), 4,1-6,3(5H, br) 13 o (9) C-NMR-epektri (100 MHz, DMS0-d6:esa, 40 C:ssa): 6(ppm): 187,4 8, 184,9 e, 173,9 s, 166,9 s, 165,9 s, 164,7 s, 156,8 s, 151,0 s, 148,0 s, 137,8 s, 137,4 s, 134,2 e, 131,2 s, 127,5 s, 125,7 s, 118,9 d, 115,9 d, 115,5 s, 113,7 s, 110,0 e, 107,6 d, 106,8 d, 104,4 d, 104,1 d, 81,0 d, 77,4 d, 75,9 d, 73,3 d, 71,5 d, 69,8 d, 69,4 d, 67,0 d, 65,7 t, 56,3 q, 54,2 d, 47,6 d, 19,1 q, 16,9 q, 16,3 q (Signaalit kohdissa 71,5, 81,0, 113,7, 115,9, 118,9 ja 125,7 ppm ovat leveät).

(10) Liukoisuus: Liukenee vain vähäisessä määrin kloroformiin, etyy1iaeetaattiin ja asetoniin, ja liukenee metanoliin dimetyylisulfoksidiin, dimetyy1iformamidiin ja veteen.

(11) Aineen jaottelu luonteen perusteella emäksiseksi, happamaksi ja neutraaliksi: Amfoteerinen aine.

3. Deksylosyylibenanomisiini B hydrokloridin fysikaa1iskemia11is-kemialliset ominaisuudet on lueteltu alla.

(1) Väri ja ulkonäkö: Punertavan ruskea jauhe (2) Empiirinen kaava: C34H34N20^^.HC1 (3) Massaepektri (SD-MS): m/z 696 (M+2) o (4) Sulamispiste: >180 C (hajoaa) 24 o (5) Ominaiekierto: C a] + 396 (c 0,05, 0,05 N HC1)

D

(6) Ultravioletti- ja näkyvän valon absorptiospektri,

1K

Xmax, nm ( E < „„.) : ' l cm ' ^etanolissa) : 204(569), 234(517), 290(431 ), 300sh(395), 400sh(110), 463(170) (0,1 N HCl-metanolissa} : 209(522), 234(557), 296(487), 400sh(130), 459(196) 10 98739 {0,1 N NaOH-metanolieeaj: 213(1205), 249(575), 258sh(520), 319(259), 496(251) -1 (7) Infrapunaabaorptioepektri (KBr, cm ): 3400, 29Θ0, 2910, 1730, 1610, 1515, 1490, 1450, 1435, 1395, 1380, 1340, 1300, 1260, 1240, 1210, 1170, 1130, 1090, 1030, 1005, 980, 880, 835 1 o (8) H-NMR-spektri (400 MHz, DMSO-dg-.ssa, 40 C:ssa): δ (ppm) : 1,18 (3H, d), 1,34 (3H, d), 2,33 (3H, s), 3,26 (1H, br s), 3,47 (1H, br), 3,74 (1H, br dd), 3,86 (1H, br q), 3,96 (3H, s), 4,43 (1H, dq), 4,53 (1H, br d), 4,60 (1H, br d) 4,68 (1H, d), 6,94 (1H, d), 7,25 (1H, br e), 7,31 (1H, d), 7, 87 (3H, br), 8,08 (1H, s), 8,45 (1H, d), 8,60 (1H, br), 12,82 (1H, e), 13,81 (1H, br) 13 o (9) C-NMR-spektri (100 MHz, DMSO-dg:ssa, 40 C:sea): δ (ppm) : 187,4 s, 184,9 s, 173,8 e, 166,8 s, 165,9 e, 164,7 s, 156.8 s, 150,9 s, 147,9 e, 137,9 s, 137,2 s, 134,2 s, 131,2 s, 127,4 s, 125,7 8, 118,8 d, 115,5 d, 115,5 8, 113,6 s, 110,0 8, 107,5 d, 106,8 d, 104,6 d, 81,1 d, 71,5 d, 70,5 d, 69.8 d, 67,1 d, 56,4 q, 54,6 d, 47,6 d, 19,1 q, 16,8 q, 16,3 q (Signaalit kohdissa 115,5 ja 118,8 ppm ovat leveät).

(10) Liukoisuus: Liukenee vain vähäisessä määrin kloroformiin, etyyliasetaattiin ja asetoniin, ja liukenee veteen, metano-liin, dimetyy1ieulfoksidiin ja dimetyy1iformamidiin.

Viitaten mukana seuraaviin piirustuksiin:

Kuvio 1 on benanomisiinin A UV- ja näkyvän valon absorptiospektri metanolissa (20 /ug/ml); kuvio 2 on benanomisiinin A absorptiospektri pelletoituna ka-1iumbromidi in; kuvio 3 on benanomisiinin A H-NMR-absorptiospektri mitattuna 400 MHz:seä deuterodimetyylisulfoksidissä (DMSO-dg);

II

11 98739 13 kuvio 4 on benanomieiinin A C-NMR-absorptiospektri mitattuna 100 MHz:ssä deuterodimetyylieulfoksidissa <DMSO-dg); kuvio 5 on benanomieiini B -hydrokloridin UV- ja näkyvän valon abeorptiospektri metanolieea (20 yug/ml); kuvio 6 on benanomisiini B -hydrokloridin IR-abeorptiospektri pel-letoituna kaiiumbromidiin; kuvio 7 on benanomisiini B -hydrokloridin abeorptiospektri mitattuna 400 MHz:ssä deuterodimetyy1isulfokaidisea; ja kuvio 8 on benanomisiini B -hydrokloridin abeorptiospektri mitattuna 100 MHz:8sä deuterodimetyy1isulfoksidissa; kuvio 9 on deksylosyylibenanomisiini B -hydrokloridin UV- ja näkyvän valon abeorptiospektri mitattuna metanolieea <20 ^ug/ml) (joka spektri on esitetty kiinteällä viivalla), 0,1 N kloorivetyhap-Poetanolieea (20 /Ug/ml)(joka spektri on esitetty katkoviivalla) ja 0,1 N natriumhydroksidietanolissa (20 yg/ml)(joka spektri on esitetty pisteviivalla; kuvio 10 on deksylosyylibenanomisiini B -hydrokloridin IR-absorp-tioepektri pelletoituna kaliumbromidiin; kuvio 11 on deksylosyylibenanomisiini B -hydrokloridin H-NMR-abeorptiospektri mitattuna 400 MHz:ssä deuterodimetyylieulfoksidissa; ja 1 3 kuvio 12 on deksylosyylibenanomisiini B -hydrokloridin C-NMR-absorptiospektri mitattuna 100 MHz:ssä deuterodimetyy1isulfoksi-dissa .

Yleisen kaavan (I) mukaisen yhdisteen, nimittäin benanomisiinien A ja B ja dekeylosyylibenanomisiinin B suolat käsittävät farmaseuttisesti hyväksyttävät suolat (karboksylaatti) farmaseuttisesti hyväksyttävän metallin kanssa, erityisesti farmaseuttisesti hyväksyttävän alkalimetallin kuten natriumin ja kaliumin kanssa ja farmaseuttisesti hyväksyttävän maa-alkalimetallin kuten kalsiumin ja magnesiumin kanssa, ja ammoniumryhmän kanssa, samoin kuin farmaseuttisesti hyväksyttävän happoadditiosuolan (yhdisteen karbokeyyiiryhmässä) farmaseuttisesti hyväksyttävän orgaanisen emäksen kanssa, erityisesti amiinin kuten alemman (Ci~Cg)-alkyy1i- 12 98739 amiinin, erityisesti trietyy1iamiinin, etanoliamiinin ja disyklo-heksyyliamiinin kanssa ja myös benanomieiinin B ja deksylosyyli-benanomisiinin B kyseessä ollessa farmaseuttisesti hyväksyttävä happoadditioeuola (aminoryhmässä) farmaseuttisesti hyväksyttävän epäorgaanisen hapon kuten kloorivetyhapon, rikkihapon, fosforiha-pon ja typpihapon kanssa tai farmaseuttisesti hyväksyttävän orgaanisen hapon kuten etikkahapon, propionihapon, maleiinihapon ja alkyylisulfonihapon kanssa. Yleisen kaavan (I) mukaisen yhdisteen esterit käsittävät farmaseuttisesti hyväksyttävän esterin (kar-bokeylaatti) farmaseuttisesti hyväksyttävän esteriä muodostavan radikaalin kanssa, kuten alemman (Cj-Cg)—aikyyliryhmän, erityisesti metyylin tai etyylin kanssa; alemman <C2-Cg)-aikaiinoyy-lioksi-alempi (C^-Cg)-aikyyliryhmän kuten asetoksimetyylin, 1-ase-toksietyyIin ja pivaioyy1ioksimetyy1 in kanssa; tai alemman (Cj-Cg) -alkoksikarbonyyliokei-alempi (Cj-Cg)-alkyyliryhmän kuten l-(etok-8 ikarbonyy1i oks i)etyyli ryhmän kanssa.

4. Benanomieiinin A, benanomieiinin B ja deksy1oeyy1ibenanomi-eiinin B (hydrokloridina> bakteerien ja sienten vastaiset aktiivisuudet on kuvattu seuraavassa.

Benanomisiinien A ja B minimiestokonsentraatiot (MIC., ^ug/ml) eri bakteereita ja sieniä vastaan on määritetty standardisarja-laimennusmenetelmän avulla ja esitetty seuraavissa taulukoissa 1 ja 2.

Deksy1oeyylibenanomisiini B -hydrokloridin minimiestokonsentraa-tiot (MIC, /ug/ml) eri sieniä vastaan on määritelty samalla lailla ja esitetty seuraavassa taulukossa 2. Kuten taulukosta 2 käy ilmi benanomisiinit A ja B kuten myös deksylosyylibenanomisiini B omaavat melkoisen sientenvastaisen aktiivisuuden monenlaisia sieniä vastaan.

Taulukko 1 13 98739

Testattu mikro-organismi MIC (^ug/ml)

(bakteerit) Benanomisiini A Benanomisiini B

Staphylococcus aureus FDA209P 100 >100

Staphylococcus aureus Smith >100 >100

Micrococcus luteus FDA16 12,5 3,12

Bacillus subtilis PCI219 >100 >100

Corynebacterium bovis 1810 12,5 3,12

Mycobacterium smegmatis >100 >100 ATCC607

Escherichia coli NIHJ >100 >100

Escherichia coli K-12 >100 >100

Shigella dysenteriae JS11910 > 50 >100

Salmonella typhi T-63 >100 >100

Proteus vulgaris 0X19 >100 >100

Pseudomonas aeruginosa A3 > 50 >100

Klebsiella pneumoniae PCI602 >100 >100

Taulukko 2

Testattu mikro- MIC (/ug/ml) organismi (sienet) Benanomi- Benanomi- Deksylosyyli-

siini A siini B benanomisiini B

Candida tropicalis F-l 25 >100 6,25

Candida pseudotropicalis 6,25 6,25 3,13 F-2

Candida albicans 3147 25 25 6,25

Candida Yu-1200 12,5 12,5 6,25 14

Taulukko 2 (jatkoa) 98739

Testattu mikro- MIC (^ug/ml) organismi (sienet) Benanomi- Benanomi- Deksylosyy1i-

siini A siini B benanomisiini B

Candida krusei F-5 6,25 6,25 12,5

Saccharomyces cerevisiae 6,25 12,5 6,25 F-7

Cryptococcus neoformans 3,12 1,56 3,13 F-10

Cochliobolus miyabeanus >100 >100 50

Pyricularia oryzae 25 50 25

Pellicularia sasakii 25 50 25

Xanthomonas citri >100 >100 100

Xanthomonas oryzae >100 >100 100

Aspergillus niger 50 >100 25

Trichophyton asteroides 50 25 50 429

Trichophyton mentagro- 50 25 50 phytes (ΘΘ3) 5. Benanomieiinien A ja B ja dekeylosyylibenanomisiinin B myrkyllisyys

Tutkittaessa tämän keksinnön mukaisten uusien antibioottien akuuttia myrkyllisyyttä imettäväisellä eläimellä suonensisäisellä antotavalla todettiin, että tämän keksinnön uusilla antibiooteilla on alhainen akuutti myrkyllisyys. Akuutin myrkyllisyyden kokeessa, jossa benanomisiineja A ja B ja deksylosyylibenanomisii-nia B annettiin erikseen suonensisäisesti Jc1:ICR-kannan hiirille (uros, ruumiinpaino 19-20 g, 5 hiirtä/ryhmä), hiiret sietivät 600 mg/kg:n annoksen benanomisiinia A (yksikään hiiristä ei kuollut annettaessa suonensisäisesti benanomisiiniä A annoksena 600 li 15 98739 mg/kg), ja hiiret sietivät myös benanomisiiniä B tai dekeylosyy-1ibenanomieiiniä B annoksena 100 mg/kg.

6. Benanomisiinin A terapeuttiset vaikutukset eieni-infektioon

Benanomisiinin A parantavat tai terapeuttiset vaikutukset hiiriin kokeellisessa Candida-infektioesa arvioitiin rokottamalla suonensisäisesti hiivan Candida albicans vesipitoinen suspensio <0,2 ml) annoksena 10 CFU/hiiri Jcl:ICR-kannan hiiren (uros, ruumiinpaino 19-20 g, 5 hiirtä/ryhmä) ja antamalla sitten ihonalaisesti tai suun kautta benanomisiiniä A erilaisina annoksina, jotka on esitetty taulukossa 3 hiirille, jotka oli infektioitu Candida-hi ivalla.

Benanomisiinin A antaminen suoritettiin kolmasti, nimittäin suoraan sienirokotuksen jälkeen, 6 ja 24 tuntia rokotuksen jälkeen.

Saadut testitulokset on taulukoitu alla olevassa taulukossa 3.

Taulukko 3

Benanomisiinin Antotapa Eloonjää- Eloonjäänei- A annos neiden hii- den hiirien (mg/hiiri) rien luku- lukumäärän määrä suhde testat tujen hiirten lukumäärään prosentteina 0,8 3 kertaa*, ihonalaisesti 5/5 100 0,4 3 kertaa*, ihonalaisesti 1/5 20 0,3 3 kertaa*, ihonalaisesti 2/5 40 0,2 3 kertaa*, ihonalaisesti 0/5 0

Taulukko 3 (jatkoa) 16 98739

Benanomieiinin Antotapa Eloonjää- Eloonjäänei- A annos neiden hii- den hiirien (mg/hiiri) rien luku- lukumäärän määrä suhde testat tujen hiirten lukumäärään prosentteina Käsittelemä- 3 kertaa*, ihonalaisesti 0/5 0 tön (kontrolli) 12,0 3 kertaa*, suun kautta 3/5 60 6.0 3 kertaa*, suun kautta 3/5 60 3.0 3 kertaa*, suun kautta 0/5 0 1,5 3 kertaa*, suun kautta 0/5 0 Käsittelemä- 3 kertaa*, suun kautta 0/5 0 tön (kontrolli) * Annettu juuri rokotuksen jälkeen, 6 tuntia myöhemmin ja vastaavasti 24 tuntia myöhemmin.

Tämän keksinnön toisena kohteena tarjotaan menetelmä benanomisii-nin A ja/tai benanomisiinin B tuottamiseksi, joka menetelmä käsittää benanomisiiniä A ja benanomisiiniä B tuottavan Astinomy-cetes-kannan viljelemisen assimiloituvia hiililähteitä sisältävässä kasvuväliaineessa, aerobisissa olosuhteissa benanomisiinin A ja/tai benanomisiinin B tuottamiseksi ja akkumuloimiseksi syn-

II

17 98739 tyneeeeen viljelmään, ja benanomisiinin A ja benanomisiinin B tai toisen näistä talteenottamieen sitten viljelmästä.

Tämän keksinnön toisen kohteen mukaisessa menetelmässä benanomi- siiniä A ja benanomisiiniä B tuottavaa Actinomvcetes-kantaa.

jota voidaan käyttää menetelmässä, voidaan kasvattaa viljelyvä- o liaineessa aerobisissa olosuhteissa lämpötilassa 20-40 C, edulli- o eesti 25-37 C, 3-10 päivän ajan.

Sopiva esimerkki benanomisiiniä A ja benanomisiiniä B tuottamaan kykenevästä kannasta, jota voidaan käyttää menetelmässä, on Acti-nomycet es-kanta MH193-16F4, joka seuraavassa kuvataan yksityiskohta i s emmin.

<a) Actinomycetes-kannan MH193-16F4 mikrobiologiset ominaisuudet.

Tämä MH 193-16F4-kanta on Actimycetes-suvun kanta, joka eristettiin maaliskuussa 1984 laboratoriossa Zaidan Hojin Biseibutsu Kagaku Kenkyujo, tämän laboratorion maaperästä kerätystä maanäyt-teestä ja jolle annettiin laboratorionimi MH193-16F4. Tämän kannan mikrobiologiset ominaisuudet ovat seuraavat.

1 . Morf ologia : MH193-16F4-kanta muodostaa ilmamyseeleitä haarautuneista sub-straattimyseeleistä tutkittaessa mikroskoopilla. Substraattimy-seeleiden fragmentoitumista ei ole havaittu. Ilmamyseeleiden muodostumista havaitaan vain ISP-vä1laineessa 2 ja ISP-väliaineessa o 3. Itiöiden muodostus alkaa tavallisesti 27 C:eea suunnilleen 18. inkubaatiopäivästä ISP-vä1iainee1la 3. Ei pyörteiden muodostumista eikä spiraaleita eikä sporangioita ole havaittu ilmamyseeleil-lä, mutta lyhyitä sporoforeja muodostuu pääasiassa pystysuoraan ilmamyseeleihin. Tavallisesti 3-7 itiön ketju, harvemmin 2 itiön ketju muodostuu kunkin sporoforin päähän. Itiöketjut voivat olla joskus silmukan muotoisia. Yksittäisillä itiöillä on sylinteri-mäisestä (0,8x1,0-1,2 ^um) pallomaiseen oleva muoto ja niiden pinnat ovat sileitä.

18 98739 2. Viljelyominaisuudet erilaisilla väliaineilla:

Suluissa annettujen värien kuvaukset on tehty Color Harmony Manual of Container Corporation of America standardien mukaisesti.

o <1> Sakkaroosi-nitraatti-agarväliaine (viljelty 27 C:ssa):

Kasvu oli väritön. Ilmamyeeeleitä ei muodostunut. Ei myöskään liukoista pigmenttiä tuotettu. Samassa väliaineessa, jota oli täydennetty B-vitamiini 1la, kasvu oli väriltään värittömästä punertavan harmaaseen { 5ec, Dusty Peach}. Ilmamyeeeleitä ei muodostunut, mutta liukoinen pigmentti oli vain heikosti värjäytynyt punertavaksi .

o <2> Glykoosi-asparagiini-agarväliaine (viljelty 27 :ssa):

Kasvu oli väritön. Ei muodostunut ilmamysee1eitä eikä liukoista pigmenttiä. Samassa väliaineessa, jota oli täydennetty B-vitamii-nilla, kasvu oli väriltään värittömästä vaalean punaiseen} 4gc, Nude Tan}. Ilmamyeeeleitä ei muodostunut, mutta muodostui punertavaa liukoista pigmenttiä.

(3) Glyseroli-asparagiini-agarväliaine (ISP-väliaine 5, viljelty o 27 C:ssa):

Kasvu oli väritön eikä muodostunut ilmamyeeeleitä eikä liukoista pigmenttiä. Samassa väliaineessa, jota oli täydennetty B-vitamii-nilla, kasvu oli väriltään harmahtavan punaisen purppurasta {81g, Rose Mauve } himmeän punaisen purppuraan {81e, Rose Wine} , valkoisia ilmamyeeeleitä muodostui ohuelti ja himmeän punaisen purppuran {8pc, Cranberry } väristä liukoista pigmenttiä muodostui.

(4) Epäorgaaniset suolat-tärkkelye-agarväliaine (ISP-väliaine 4, o viljelty 27 Ctssa): li 19 98739

Kasvu oli väritön, ja ei muodostunut ilmamysee1eitä eikä liukoista pigmenttiä. Samalla väliaineella, jota oli täydennetty B-vitamii-nilla, muodostui lievästi punertavan väristä liukoista pigmenttiä.

o (5) Tyrosiini-agarväliaine ( ISP-väliaine 7, viljelty 27 C:ssa):

Kasvu oli väriltään värittömästä vaalean kellertävän ruskean-{3ic, Lt. Amber } Ei muodostunut ilmamyseeleitä eikä liukoista pigmenttiä. Samalla väliaineella, jota oli täydennetty B-vitamiinilla, kasvu oli väriltään värittömästä harmahtavan punaisen purppuraan. Ei muodostunut ilmamyeeeleitä, mutta muodostui liukoista pigmenttiä, joka oli hiukan punertavaa väriltään.

o (6) Ravinto-agarvä1 iaine (viljelty 27 C:ssa):

Kasvu oli vaalean keltaisen väristä {2gc, Bamboo}, ei muodostunut ilmamyeeeleitä eikä liukoista pigmenttiä. Samalla väliaineella, jota oli täydennetty B-vitamiinilla, kasvu osoitti samanlaisia ominaisuuksia.

(7) Hiivauute-mallasuute-agarväliaine (ISP-väliaine 2 viljelty o 27 C:ssa>:

Kasvu oli väriltään vaalean keltaisesta {2ec, Biscuit} tumman punaiseen {7pi, Dk. Wine-7 l/2pe, Dk. Red }harmahtavan punaiseen {7pg, Wine }. Inkuboinnin noin 14. päivästä lähtien muodostui kasvuun harmahtavan valkoista ilmamyseeliä. Vaikkakin muodostui himmeän punaieta {6 l/2pe, Tomato Red }liukoista pigmenttiä kasvun ympärille inkuboinnin alussa, liukoinen pigmentti hajosi sitten vähitellen. Kasvun ja liukoisen pigmentin väri muuttui oranssiksi reaktiolla HCl:n kanssa, mutta ei osoittanut mitään värin muutosta reaktiossa NaOH:n kanssa. Kasvu osoitti samanlaisia ominaisuuksia myös samalla väliaineella, jota oli täydennetty B-vitamiinilla .

20 98739 o (8) Kaurajauho-agarväliaine <ISP-väliaine 3, viljelty 27 C:esa):

Kasvu oli väriltään vaalean punaisesta'{4gc, Nude Tan} harmahtavan punaiseen fele, Cedar} tumman punaieeen{7pe, Cherry WineJpurppuran harmaaseen { 8ig, Mauve Gray} harmahtavan valkoisia' { 30b, Sand}il-mamyseeleitä muodostui noin 10. inkubointipäivästä. Liukoinen pigmentti oli värjäytynyt hivenen punertavaksi. Kasvun ja liukoisen pigmentin väri vaihtui oranssinväriseksi reaktiossa HCl:n kanssa, mutta ei osoittanut mitään värin muutosta reaktiossa NaOH:n kanssa. Kasvu osoitti samanlaisia ominaisuuksia myös samalla väliaineella, jota oli täydennetty B-vitamiini 1la.

o < 9) Glyseroli-nitraatti-agarväliaine (viljelty 27 C:sea):

Kasvu oli väritön ja ilmamyseeleitä ei muodostunut. Liukoista pigmenttiä ei muodostunut. Samalla väliaineella, jota oli täydennetty B-vitamiini 1la, kasvu osoitti samanlaisia ominaisuuksia.

(10) Tärkkelys-agarväliaine (viljelty 27 C:ssa):

Kasvu oli väritön. Ei muodostunut ilmamyseeleitä eikä liukoista pigmenttiä. Samalla väliaineella, jota oli täydennetty B-vitamii-nilla, kasvu oli väritön eikä ilmamyseeleitä muodostunut, mutta liukoinen pigmentti oli hieman värjäytynyt punertavaksi.

(11) Kalsiummalaatti-agarväliaine (viljelty 27 C:ssa):

Kasvu oli väritön ja ilmamyseeleitä ei muodostunut. Liukoinen pigmentti oli värjäytynyt heikosti punertavaksi. Samalla väliaineella, jota oli täydennetty B-vitamiinilla, kasvu oli väritön eikä muodostunut ilmamyseeliä eikä liukoista pigmenttiä.

li 21 98739 (12) Selluloosa (synteettinen koeliuos, joka sisälsi suodatinpa- o peripaloja, viljelty 27 C:sea):

Kasvua ei havaittu.

(13) Gelatiinipistovi1jelmä:

Kasvu oli ohutta sekä 15% yksinkertaisella gelatiinivä1 iainee1la o (viljelty 20 C:ssa) että glukoosi-peptonigelatiinivä1 iainee11 a o (viljelty 27 C:ssa). Kasvu oli väritöntä eikä muodostunut ilmamy-seeleitä eikä liukoista pigmenttiä.

o (14) Vuohenmaito (viljelty 37 C:ssa):

Kasvu oli äärimmäisen ohutta. Kasvu oli väritöntä eikä muodostunut ilmamyseeleitä eikä liukoista pigmenttiä.

3. Fysiologiset ominaisuudet: (1) Kasvun lämpötila-alue: MH193-16F4-kannan inkubointia testattiin tärkkelys-hiiva agarvä- liaineella, joka sisälsi 1,0% liukoista tärkkelystä, 0,2% hii- vauutetta ja 2,0% agaria (pH 7,0) eri inkubointilämpötiloissa o o o o o o 20 C, 24 C, 27 C, 30 C, 37 C ja 50 C. Tuloksena oli, että kanta kasvoi kaikissa muissa testatuissa lämpötiloissa paitsi 50 C:ssa.

Kuitenkin optimikasvulämpötila tälle kannalle näyttää olevan o alueella 27-37 C.

(2) Gelatiinin sulattaminen (15% yksinkertaisella gelatiinivä- o naineella, viljelty 20 C:ssa, ja glukoosipeptoni-gelatiinivä- o liaineella, viljelty 27 C:esa): 22 98739

Gelatiinin sulamista ei havaittu yksinkertaisella gelatiinivä-liaineella ja glukoosi-peptoni-gelatiinivä1 iainee1la kannan 3 kuukautta kestäneen inkuboinnin aikana.

(3) Tärkkelyksen hydrolyysi (epäorgaaniset suolat-tärkkelys agar- väliaineella ja tärkkelye-agarväliaineella, molemmat viljelty o 27 C:ssa): Tärkkelyksen hydrolyysi ei alkanut, kun kantaa inkuboitiin epäorgaaniset molat-tärkkelys-agarvä1 iaineella ja tärkkelys-agar-vä1 ia inee1la.

(4) Vuohenmaidon koaguloituminen ja peptonisoituminen (vuohenmai- o dossa, viljelty 37 C:ssa):

Kasvu oli ohutta eikä havaittu vuohenmaidon koaguloitumista eikä peptonieoitumista kannan 3 kuukautisen inkuboinnin aikana.

<5) Melanoidipigmenttien muodostuminen (tryptoni-hiivauuteliemi, ISP-väliaine 1; peptoni-hiivauute-rauta-agar, ISP-väliaine 6; o tyroeiini-agar, ISP-väliaine 7; kaikki viljelty 27 C:ssa):

Melanoidien muodostuminen oli negatiivista kaikilla väliaineilla.

(6) Hiilen lähteiden hyväksikäyttö (Pridham-Gott1ieb agarväliaine, o ISP-väliaine 9; viljelty 27 C:ssa):

Kannan kasvaessa glukoosi, L-arabinoosi, D-ksyloosi, D-frautoosi, sakkaroosi, ramnoosi, raffinoosi ja D-mannitoli ovat käytettävissä, mutta inoeitoli ei ole.

(7 > Kalsiummalaatin sulattaminen (kalsiummalaatti-agar, viljelty o 27 C:ssa): Negatiivinen.

Il 23 98739

Nitraatin pelkistys (Bacto-nitraattiliemi, ISP-väliaine Θ, iljelty 27 C:ssa): Positiivinen.

9> SelluJ-oosan hajottaminen (synteettisessä koel iuoksessa, joka eiealsi suodatinpaperipaloja, viljelty 27 C:ssa):

Kanta ei u_ *· Kasva .

Un kootaan yllämainitut mikrobiologiset ominaisuudet, on MH193-

Kannalle tunnusomaista, että muodostuu 3-7 itiön (harvemmin 2 1Qn) itiöketjuja pääasiassa pystysuoraan ilmamyseeleiden pää- r8iin ja ei havaita pyörteiden muodostusta eikä spiraalei- ta eikä eporangioita. Lisäksi ei havaita substraattimyseeleiden ragmentoitumieta Itiöiden pinnat ovat sileitä. Harmahtavan vai-ilmamyeeeleitä muodostuu ohuelti kasvustoon, joka on väriltään harmahtavan punaisesta tumman punaiseen, sekä ISP-valiaineeaea 2 että ISP-väliaineessa 3. Inkuboitaeesa MH193-16F4-kantaa Peräkkäin kaltevalla väliaineella, joka sisältää 0,2% hii-vauutetta, 1,0% solubi1isoitua tärkkelystä ja 2,0 % agaria (pH .0), saattaa joskus muodostua vaaleanpunaisia ilmamyseeleitä. Lisäksi muodostuu himmeän punaista liukoista pigmenttiä ISP-väliaineella 2. Erilaisilla muilla viljelyväliaineilla kasvu oli väritöntä eikä muodostunut ilmamyseeleitä, mutta liukoista pigmenttiä ei pääasiassa tuoteta. Sen kasvu alkaa kuitenkin lisättäessä B-vitamiinia viljelyvällaineeseen. On joitakin viljelyvä-liaineita, joilla kanta kasvaa punaisen värisenä. Kasvuston ja liukoisen pigmentin värit muuttuvat molemmat punaisesta oranssiin reaktiossa HCl:n kanssa, mutta eivät muutu reaktiossa NaOH:n kanssa. Melanoidien muodostuminen, proteolyyttinen aktiivisuus ja tärkkelyksen hydrolysoituvuus ovat kaikki negatiivisia, kun taas nitraatin pelkistys on positiivinen, kasvu voidaan saada alkuun viljelyvä1laineessa, jota on täydennetty B-vitamiini 1la joissakin tapauksissa, joten kanta näyttää vaativan vitamiineja kasvuaan varten.

24 98739 MH193-16F4-kanta sisältää mesodiaminopimeliinihappoa soluseinän komponentteina ja glykoosia, riboosia ja madurooeia sakkaridikom-ponentteina kokonaisissa soluissa, ja näyttää siltä, että solu-seinän päärakenteet ovat tyyppiä-1 I IB, jota on ehdottanut Leche-valier et ai. julkaisussa "International Journal of Systematic Bacteriology", 20. 435 (1970). Toisaalta sen fosfolipidit ovat PIV-tyyppiä (käsittäen fosfatidyylietanoliamiinin ja tuntemattomia glykosamiinia sisältäviä fosfoiipidejä, mutta ei sisällä fes-fatidyyliglyserolia). Menakinonien koostumus sisältää MK-9(Hq) pääkomponenttina ja myös MK-9<Hg>, MK-9<H4>, ΜΚ-ΘΠ^), MK-9(H10> ja GC:N määrä DNA:ssa arvioitiin 71,5%:ksi. Myseeleiden analysointi kaasukromatografialla osoittaa, että iso-haarautuneita rasvahappoja (i-16:0), anti-iso-haarautuneita rasvahappoja <a-17:0> ja 1O-metyylirasvahappo (10Me-17:0> on läsnä, antaen kannan luonteenomaiset piirteet.

Tunnetut Actinomycetes-kannat, jotka muodostavat itiöketjuja ja joilla on tyyppiä-IIIB olevat soluseinäkomponentit, kuuluvat kolmeen sukuun, Actinomadura, Microbiepora ja Microtetraspora.

MH 193-16F4-kannan ja yllä kuvattujen kolmen suvun tunnusomaiset piirteet on esitetty taulukossa 4. Menakinoniin liitetty tähti <*) osoittaa, että tällainen menakinoni on läsnä pääkomponenttina.

25 98739 ----c-1--

O · ✓'—"N · H

·» «H-H ·· vD V- C CL I

cd cd oo·*-·· cow X

* j· 4_) 4J *<— I \o ¢0 ,c- ·* Ä X —K —H *H *— >_i #S *H · £>

^ ' o «£ «e ioj ^ ^ O *h C ^ P

a^S33E ·η ο » ΓΓ 3 4J 0) 3·*

w , ^c:c: cu ·· :co O ^ CO 03 c :ct5 Cl:cO

*0 σ> σ> σ> σ> PH r·'» ή ·· co QJ »»hco U I2III ·*- CL vo -u W >.5 r—I w ·η D X * X X X 2 1 O. ·— I cn -,4 ---1-3 (O-Htn

•Ο > 2·Η 2 ? 3 ·υθ)/~Ν>ϊΙ VO >> Cd ·Η Ή CO C .H

« M CO 2 — 2 01 VOO.-U4J4J >-HC0 C

E .. 4_i „ _ _ co o ·· 4J 2 _ ,-h co -H -r-ι cn-u cu

O m o· ^ _ 4J 00 (cfl O U H) 0> «1 « «,—i C

C «,«,„«,, en -— E -— ooC^cnOo-. 3*3 ·* M - K X X S X '4 * --4. ^ "m £ °* -m -H 'S 2 ^ Γ2

4J μ-ι I_i W W ^ V-fO^QJ·* I CO Cd c0 JCO , C04-) rH

O H « · o u o 6 ·* & 'H ^ Λ * 1Γ1 rtj Qilllll cO vD ·· CO ·' n. n) d CO "H O CO .cd 4·^

1 i i i i cu *- -4 r-» ^ (to E .-4 4-> 01 J<! E -d O

g3£)aS d I --- Ό >-—icfl t—i -—i J-J -r-ι tn 2. 2. 2. 2. 2. -H ·Η I JS I -rl -rl 15 -rt -J tfl Π) 01 Q> W ^ d 2 <0 W cn d W CO > ,d d + 2 3 * " i i *

O CO CO

N H Φ £ *Z t: *o a a se S? *2 ;j .

w w >·> CdCdW

g. TOT’S T S E μ-H

s ä3i3i £ sr c 2 i_, s s s rr co) I *Ί co « - (cfl d (U CO Qj ___ I 5^ 50 CO · > Ή jj OJ OM » r- ,H « -.4 ,X (Cfl -4

O M .. S £ £ X X *f« :<0 * to3u -H

u m s ΞΞΪΞΞ i u ·η o s -4 U m m m oun m en I ce.trtr- m *o

•H iiiii ” M C 01 _ _iiä -—i O

2 cu x x x x x > to ,-1^.-1(0.-1 en “ a a a a a -h co -4 -h comm ai £.2.2.2.2, W d W CO > > ,Χ + 2 __ T-Γ- 2 i 3 .3 .s 3

* 5 « ^ en S

_ _ _ :co O ---1 co -h «o T_iT-,T·™*·· n > rt

2 x'rtx'dx^01^ rr +J

t: gUaiJa a-— Μ o o s+jgj^g I ~ c · e 5* ^.--d^co-H c <u

.3 ..... μ I «CO cfl 3 dC

« --(CO CO ·* — 4-1 CU -HOI

jJniOu-oof^upc-1 o -—id 0 m m s x a x a a ^ 3 :co d -rs -h H I-1 ' — ~ ·— m 0 1 · *cn 4-1 co -1-4--4 U M O. t^CTiCTi^iCT-CTi _u·. ---4 CU 14-1 -r4

I I I I 1 I D> J) I Γ-4-ί 1U 1—1 O -H

S XXXXXX.H^-iu en i—t coco eniw SSSSSS ΌΙΣ >. -I-4-H co-h cuo

* * £ -π 0 a- woo is > » + S E

P-1 ^ — 0 ----------------

Jii ·- - -co 3 --- d cn ---1

.—I m -e co en 4J

p S X to ---4 cn » cO ---- :co d cn cu f—- in m -η- Ο^ω j<id

II D.O 3 3-4 -—. 4—* <U

v XX O.·· cncflcO tNtOd

X 2S >. r-- ^ a u > -H

VO 4-ieo^-i deo d .—i - - . 4->i cn4->co -h d d cu 1 ----- (COCO-—- >sjc: O co 3 d ncQ>«,- EO mo-d >>a. -h Ον M M XXX ,-t » ·· . -r4 d d CO -—' fhm ---- eo n ^djdco :co c04Jd --4 X ΜΧσνσνσν 4-1··-— f^-dcfljii 4-1 jsjsco --4 2 III C0v£>l 5) M 3 -4 ^"COIU vm

XXX --4 QJ ϋ 10 E cu E-—1 O

y 5- a -3 I 2 * *-4 --4 -—I r d ¢0 cn Γ* JS -H O CU O --4 -d -r4 I CO CO 01 S'-icnww ηχ> + 2

LO

to * - ro --4 <5" ή cn 4-1 d 3

- cn " :co :co E

^ 3 -, ^d> --4 0N| 4J (CO dl 4—

-H -rvtnO^iCOdCOCO

CL- ΟΤί.'^ΒΟΙ'Ο'-ι CL--s^-v i-5-3 2>443t3 ►>.,_!

44-s O e C ^ ·τ4 «U

2 --4 4J CO 3 Cfl *4 P (U d (O

4->Ό·Η -U :OS ^ r-l 1—i 0) P« it* 'r4 C Ο 4-1 2 r- ω 5 c o- 0 a r-i a j^cc-qj c-tö

CO ;«0Q> CUW Ήι—I

x WO o T3 Ό -HCJ

w o x cd .η ή ^ ·Η B B d pLMed > w:o P-Ojoed cd> ‘ .-1 w C W I ·Η 2 *r! *H s u Vi O O Q) Cd O LJ ^ 4-)1-1 «0 C^pt^S PÖ o M PH M mm > 26 98739

Edellä olevassa taulukossa viitattu kirjallisuus: 1> Japaninkielinen kirja “Hosekin no Dotei Jikkenho (Experiments for the Identification of Actinomycetes)", julkaissut Nihon Ho-senkin Kenkyukai (1985).

2) J. Poschner, et ai., "DNA-DNA Reassociation and Chemotaxonomic

Studies on Actinomadura. Mikrobisoora. Microtetraspora. Micropolvspora and Nocardiopsis." julkaisussa "Systematic and Applied Microbiology", 6., 264-270, ( 1985).

3) A Fisher, et ai., "Molecular-genetic and Chemotaxonomic Stu dies on Actinomadura and Nocardiopsis." julkaisussa "Journal of General Microbiology", 129. 3433-3446, (1983).

4) Thiemann, et ai., "A New Genus of the Actionomycetales: Mic rotetraspora gen. nov." julkaisussa "Journal of General Microbiology", 50., 295-303, ( 1968).

5) Nonomura, et ai., japaninkielinen artikkeli “Dojochu ni okeru

Hosenkin no Bunpu (Distribution of Actinomycetes in Soil) (llth) Report) Several New Species of Act inomadura Lechevalier et al." japaninkielisessä painotuotteessa "Hakko Kogaku Kaishi", 49. 904-912, (1971).

Kuten taulukon 4 perusteella on ilmeistä, ei näytä siltä, että olisi olemassa sukua, johon MH193-16F4-kanta kuuluisi selvästi joka suhteessa. Edellä mainitut kolme sukua ovat olleet siirtyviä vaikeasti luokiteltavina. On siksi kiinnostavaa, kuinka nämä suvut määritellään seuraavassa painoksessa teosta Bergey's Manual of Determinative Bacteriology. Kuitenkin monet lajit on luettu kuuluvaksi Actinomadura-sukuun ja tällaisten lajien ominaisuudet vaihtelevat laajasti. Merkittävää samankaltaisuutta on havaittu morfologiaeea, myseeleiden rasvahappokooetumukseeea ja menakino-nien koostumuksessa MH193-16F4-kannan ja Actinomadura spadix'in välillä tällaisten Actinomadura-lajien joukossa ke. viitattua

II

27 98739 kirjallisuutta 1), 3) ja 5). Tämän keksinnön keksijät suunnitte- levat ensimmäisen vertailevan tutkimuksen suorittamista MH193-16F4 -kannan ja Actinomadura spadix'in välillä. Näyttää kuitenkin hyvin mahdolliselta, että MH193-16F4-kanta kuuluu sukuun Actinomadura ja se saattaa muodostaa uuden lajin.

MH193-16F4-kanta on talletettu japanilaiseen talletuslaitokseen "Fermentation Research Institute”, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry, Japanese Government, talletustunnuksella FERM P-9529, elokuun 21. 1987 lähtien. MH193-16F4-kanta on talletettu nyt laitoksen "Fermentation Research Institute” Budapestin sopimuksen mukaisesti talletustunnuksella "FERM BP-2051".

<b) MH193-16F4-kannan viljely:

Benanomisiinien A ja B tuotanto tapahtuu ymppäämällä benanomisii-nia A ja benanomisiinia B tuottavaa Actinomycetes-kantaa viljely vä 1 i a ineeseen , joka sisältää sellaisia ravinnelähteitä, joita tavalliset mikro-organismit voivat käyttää hyväkseen, ja inkuboi-malla sitten mainittua benanomisiinia tuottavaa kantaa aerobisissa olosuhteissa. Benanomisiinia A ja B muodostuu ja akkumuloituu ensisijaisesti vi1jely1iemeen. Kohdeantibiootit otetaan talteen syntyneestä viljemäetä, erityisesti vi1jely1iemestä tai sen suo-doksesta.

Vi1jelyvällaineessa käytettävissä olevat ravinnelähteet voivat olla mitä tahansa tavanomaisia ravinnelähteitä, jotka ovat olleet käyttökelpoisia ravinnelähteinä viljeltäessä tunnettuja Actino-mycetes-kantoja. Esimerkiksi assimiloituvat typen lähteet voivat sisältää soijapapujauhoa, peptonia, lihauutetta, maissin liotus-lientä, puuvillan siemenjauhoa, pähkinäjauhoa, kuivahiivaa, hii-vauutetta, NZ-amiinia, kaseiinia, natriumnitraattia, ammoniumsul-faattia ja ammoniumnitraattia, joita on kaupallisesti saatavilla. Assimiloituvat hiilen lähteet voivat sisältää glyseriiniä, sakkaroosia, tärkkelystä, glukoosia, galaktoosia, maltoosia, dekstrii-niä, laktoosia, melassia, soijapapuoljyä, rasvaa ja aminohappoja, 28 98739 joita on kaupallisesti saatavilla. Vi 1jelyvä1 iaine voi sisältää myös epäorgaanisia suoloja kuten natriumkloridia, fosfaatteja, kalsiumkarbonaattia, magnesiumsulfaattia, kobolttikloridia ja magnesiumkloridia. Lisäksi voidaan lisätä myös pieniä määriä me-tallisuoloja ja yhtä tai useampaa eläin-, kasvi- tai mineraaliöljyä vaahdonpoistoaineeksi. Ne voivat olla mitä tahansa aineita, joita benanomisiineja tuottavat kannat voivat käyttää hyväkseen ja jotka ovat käyttökelpoisia benanomisiinien A ja B tuottamisessa. Tunnettujen Actinomycetes-sukujen viljelyssä käytetyt tunnetut ravinneaineet ovat kaikki käyttökelpoisia.

Nestemäistä viljelymenetelmää pidetään parempana benanomisiinien A ja B tuotossa suuressa mittakaavassa. Vi 1jelylämpötila voidaan valita niissä lämpötilarajoissa, joissa benanomisiineja tuottavat mikroorganismit voivat kasvaa ja voivat tuottaa benanomisiineja o A ja B. Kasvatuslämpötila voi olla yleensä 20-40 C, edullisesti o 25-37 C. Viljely voidaan suorittaa valitsemalla edellä mainitut viljelyoloeuhteet sopivasti niiden mikro-organismien luonteen mukaan, jotka voivat tuottaa benanomisiineja A ja B.

(c) Benanomisiinien A ja B talteenotto ja puhdistus:

Benanomisiinien A ja B talteenottamiseksi mikro-organismiviljelmästä, joka tuottaa benanomisiineja A ja B, benanomisiinit A ja B voidaan uuttaa viljelmästä tai viljelmäliemen suodoksesta ja puhdistaa sitten käyttäen tavanomaisia talteenotto- ja puhdistusmenetelmiä, esimerkiksi 1iuotinuuttoa, ioninvaihtohartsimenetelmää, adsorptiivista tai jakopylväskromatografiaa, geelisuodatusta, dialyysiä, saostusta ja sen kaltaisia, joko yhdessä tai yhdistelmänä. Benanomisiinit A ja B voidaan esimerkiksi ottaa talteen in-kuboidueta myseelikakusta uuttamalla asetoni-vedellä tai metanoli-vedellä.Toisaalta benanomisiinit A ja B, jotka on tuotettu ja ak-kumuloitu vi1jelmäliemeen tai suodokseen, voidaan adsorboida ad-sorbenttiin, esimerkiksi "DIAION HP-20" (kauppanimi; synteettinen hartsimainen adsorbentti, jota tuottaa Mitsubishi Kasei Corporation, Japani). Lisäksi uutettaessa viljelmälientä tai liemisuo-

II

29 98739 dosta orgaanisella veteen liukenemattomalla liuottimena, esimerkiksi butanolilla, etyyliasetaatilla tai sen kaltaisella, benano-misiini A ja B aineet uutetaan orgaaniseen 1iuotinfaasiin.

Tämän keksinnön toisena kohteena olevan menetelmän erityisen suoritusmuodon mukaisesti MH193-16F4-kantaa (identifioitu kantana PERM BP-2051) kasvatetaan vi1jely1iemessä aerobisissa olosuhteis- o sa lämpötilassa 25-27 C, edullisesti 3-10 päivän ajan, benanomi-siinin A ja benanomisiinin B tuottamiseksi ja akkumuloimiseksi syntyneeseen vi1jely1iemeen, viljelyliemi suodatetaan ja saatu vi1jely1iemisuodos viedään adsorbenttipylvään lävitse benanomi-siinin A ja benanomisiinin B adsorboimiseksi adeorbenttiin, ben-anomisiini A ja benanomisiini B otetaan talteen erikseen eluoimal-la kromatografisesti adeorbenttipylvästä, joka sisältää benanomi-siinit A ja B adsorboituneena itseensä.

Benanomisiinien A ja B molemminpuoliseksi eristämiseksi ja puhdistamiseksi edelleen, kromatografinen menetelmä adsorbenttia kuten piihappogee1iä käyttämällä ("WAKOGEL C-300", kauppanimi, Wako Pure Chimical Industries, Ltd. tuote) ja alumiinia tai geelisuo-datusainetta "Sephadex LH-20" (kauppanimi, Pharmacia AB'n tuote) tai sen kaltaista käyttämällä voidaan suorittaa sopivasti.

Benanomisiinit A ja B tuotettuina viljelmään kuten yllä kuvattiin, voidaan eristää vapaassa muodossaan nimittäin benanomisiineina A ja B sellaisinaan.

Käsiteltäessä benanomisiineja A ja/tai B sisältävää liuosta tai sen konsentroitua liuosta emäsyhdisteella esimerkiksi epäorgaanisella emäksellä käsittäen aikaiimetal1iyhdisteen kuten natrium-hydroksidin tai kaliumhydroksidin, maa-alkalimetalliyhdisteen kuten kalsiumhydroksidin tai magnesiumhydroksidin ja ammoniumsuolan; samoin kuin orgaanisella emäksellä kuten etanoliamiini 1la, tri-etyyliamiinilla tai disykloheksyyliamiinilla jonkin talteenotto-vaiheen aikana, esimerkiksi uutto-, eristys- tai puhdistusvaiheen aikana, tapahtuu, että benanomisiinit A ja/tai B ovat tai muuttu- 30 98739 vat vastaaviksi suoloiksi, jotka voidaan sitten erottaa tai eristää sellaisten suolojen tai suolan muodossa.

Yllä kuvatulla tavalla tuotettu benanomisiinin A tai B suola voidaan muuntaa sitten vapaaseen muotoon, nimittäin benanomisiiniksi A tai B käsiteltäessä alalla sinänsä tunnetulla menetelmällä suolan muuntamiseksi hapoksi. Lisäksi vapaassa muodossa saadut ben-anomisiinit A ja/tai B voidaan muutta taas vastaaviksi suoloiksi tai suolaksi reaktiolla yllä mainitun emäksen kanssa tavanomaisella tavalla. Samoin kuin benanomisiinit A ja B tulisi niiden suolat kuten ne, jotka olivat edellä esimerkkeinä, sisällyttää esillä olevan keksinnön suojapiiriin.

Tämän keksinnön kolmantena kohteena on esitetty menetelmä deksy-1osyy1ibenanomisiinin B, nimittäin aiemmin määritellyn kaavan <Ic> mukaisen yhdisteen tuottamiseksi, joka menetelmä käsittää benanomisiinin B kemiallisen muuntamisen deksy1osyy1ibenanomisiiniksi B.

Termillä “muuntaa kemiallisesti benanomisiini B" tarkoitetaan joko benanomisiinin B hapanta hydrolyysiä tai benanomisiinin B al-koholyyeiä, mitä seuraa syntyneen deksylosyylibenanomisiini B -esterin käsittely emäksisellä yhdisteellä dekeylosyylibenanomisii-nin B muodostamiseksi. Kun benanomisiini B on hydrolysoitu hapolla, pilkotaan benanomisiini B -molekyylin keylosyyliryhmä yksinkertaisesti. Kun benanomisiini B läpikäy alkoholyysin alkoholilla, esimerkiksi alemmalla (C^-Cg>-alkanoli1la, kuten metanolilla ja etanolilla, keylosyyliryhmä pilkkoutuu ja samanaikaisesti benanomisiini B -molekyylin karboksyyliryhmä esteröityy mainitun alkoholin kanssa antaen deksylosyylibenanomisiini B -esterin, jota voidaan käsitellä sen jälkeen emäksisellä yhdisteellä alkalista hyd-rolyysiä varten niin, että tuotetaan deksylosyylibenanomisiiniä B vapaassa muodossa.

Tämän keksinnön kolmantena kohteena olevan menetelmän erään erityisen suoritusmuodon mukaisesti esitetään menetelmä deksylosyy-1ibenanomisiinin B tuottamiseksi, joka menetelmä käsittää ksylo- 31 98739 ®yy 1 iryhinän pilkkomisen b6n3.noxniexi.niet.8L 5 joko happohydrolyysin avulla tai alkoholyysin avulla, jota seuraa käsittely eroäsyhdis— teellä deksylosyy1ibenanomiaiinin B muodostamiseksi. Tässä suoritusmuodossa benanomisiinin B happohydrolyysi voidaan suorittaa antamalla epäorgaanisen tai orgaanisen hapon reagoida benanomi- o siinin B kanssa vesipitoisessa liuoksessa lämpötilassa 60-110 C, edullisesti 5-15 tunnin ajan. Kun benanomisiinin B happohydrolyy-ei on suoritettu antamalla sen reagoida tavanomaisesti käytettävän epäorgaanisen tai orgaanisen hapon kuten kloorivetyhapon, rikkihapon, etikkahapon, trifluorietikkahapon, p-tolueenisulfoni-hapon tai bentseenisulfonihapon kanssa deksylosyy1ibenanomisiiniä B on tuotettu reaktioliuokseen.

Benanomisiinin B alkoholyysi voidaan saada yleensä aikaan kuumentamalla benanomisiini B liuosta alemmassa <-Cg>-alkano1issa, edullisesti metanolissa ja etanolissa epäorgaanisen hapon kuten kloorivetyhapon, rikkihapon ja typpihapon läsnäollessa lämpöti-o lassa 60-120 C, edullisesti 5-15 tuntia sellaisen deksylosyyliben-anomisiini B -esterin <karboksylaatti) tuottamiseksi, jota muodostuu mainitun alkanolin kanssa. Näin muodostunutta deksylosyy-libenanomisiini B -esteriä voidaan käsitellä sitten hydrolyytti-sesti antamalla sen reagoida emäsyhdisteen kanssa, esimerkiksi alka1 imetä11ihydroksidin tai karbonaatin, edullisesti natrium-tai kaliumhydroksidin tai -karbonaatin kanssa vesipitoisessa liuoksessa huoneen lämpötilassa tai korotetussa lämpötilassa niin, että muodostuu deksylosyylibenanomisiiniä B. Kun benanomisiini 11e B suoritetaan alkoholyysi, esimerkiksi metanolyysi ja käsitellään sitten emäksellä kuten natriumhydroksidilla tai kaiiumhydroksi-dilla, deksylosyylibenanomisiiniä B muodostuu reaktioliuokseen.

Muodostuneen dekeyloeyylibenanomieiinin B talteenottamiseksi reaktioliuoksesta tämä tuote voidaan uuttaa siitä ja puhdistaa sitten käyttämällä tavanomaisia talteenotto- ja puhdistusmenetelmiä, esimerkiksi liuotinuuttoa, ioninvaihtohartsimenetelmää, adsorptio- tai jakopylväskromatografiaa, geelisuodatueta, dialyysiä, saostusta ja sen kaltaisia joko yksittäin tai yhdistelmänä. Esi 32 98739 merkiksi vesipitoisessa reaktioiiuoksessa oleva deksylosyy1iben-anomisiini B voidaan adsorboida adsorbenttiharteiin "DIAION HP-20” (kauppanimi; synteettinen hartsimainen adsorbentti, jota tuottaa Mitsubishi Kasei Corporation). Deksylosyylibenanomisiinin B edelleen puhdistamiseksi kromatografinen menetelmä adsorbenttia käyttäen kuten piihappogeeliä ("WAK0GEL C-300", kauppanimi, Wako Pure Chemical Industries, Ltd.:in tuote; tai sen kaltaiset) alumiinia ja geelisuodatusainetta "Sephadex LH-20" (kauppanimi; Pharmacia AB:n tuote), tai sen kaltainen voidaan suorittaa sopivasti .

Reaktiolluokseen edellä kuvatulla tavalla muodostunut deksylosyy-1ibenanomisiini B voidaan eristää vapaassa muodossa, nimittäin deksylosyy1ibenanomisiininä itsenään. Deksylosyylibenanomisiiniä B sisältävää liuosta tai sen konsentroitua liuosta voidaan käsitellä tavanomaisesti käytetyllä hapolla, esimerkiksi epäorgaanisella hapolla kuten kloorivetyhapolla, rikkihapolla, fosforiha-polla ja typpihapolla tai orgaanisella hapolla kuten etikkahapol-la ja alkyy1isulfonihapolla, tai epäorgaanisella emäksellä, esimerkiksi alkalimetalliyhdisteellä kuten natriumhydroksidi1la tai kaliumhydroksidilla; maa-alkalimetal1iyhdisteellä kuten kalsium-hydroksidilla tai magnesiumhydroksidi1la; ja ammoniumsuola1la, tai orgaanisella emäksellä kuten etano1iamiini 1la, trietyyliamii-nilla tai disykloheksyy1iamiini 1la yksivaiheisen menetelmän aikana talteenottoa ja puhdistusta varten. Deksylosyylibenanomisiini B muunnetaan sitten vastaavaksi suolaksi ja voidaan edelleen eristää suolan muodossa. Lisäksi näin tuotetut deksylosyy1iben-anomieiini B -suolat voidaan muuntaa sitten vapaaseen muotoon nimittäin deksyloeyylibenanomisiiniksi B käsiteltäessä alalla sinänsä tunnettujen menetelmien avulla. Lisäksi vapaassa muodossa saatu deksylosyylibenanomisiini B voidaan muuntaa taas suolaksi reaktiolla yllä mainitun hapon tai emäksen kanssa tavanomaisella tavalla. Edelleen annettaessa deksylosyylibenanomisiinin B reagoida alkoholin kanssa, esimerkiksi alemman alkanolin kuten meta-nolin ja etanolin kanssa, voi muodostua vastaava esteri sen kar-boksyyliryhmään.

li 33 98739 Tämän keksinnön vielä eräänä kohteena esitetään sientenvastainen koostumus sieni-infektion terapeuttiseksi käsittelemiseksi eläimellä, ihminen mukaan lukien, joka koostumus käsittää sientenvas-taisesti vaikuttavan määrän aiemmin määritellyn yleisen kaavan (I) mukaista yhdistettä, nimittäin jonkin seuraavieta aktiivisena aineosana: benanomieiini A ja B, deksylosyy1ibenanomisiini B ja niiden suolat tai esterit, yhdessä farmaseuttisesti hyväksyttävän kiinteän tai nestemäisen kantajan kanssa.

Tämän keksinnön eräänä kohteena on esitetty menetelmä sieni-infektion, erityisesti Candida-infektion hoitamiseksi eläimessä ihminen mukaan lukien, joka menetelmä käsittää sientenvastaieesti vaikuttavan määrän benanomisiiniä A, benanomieiiniä B, deksylo-syylibenanomisiiniä B tai niiden suolaa tai esteriä antamisen eläimelle, joka on infektoitunut sienellä, erityisesti suvun Candida sienellä.

Tämä keksintö sisältää myös benanomisiinin A, benanomisiinin B, deksylosyy1ibenanomi s i inin B tai niiden suolan tai esterin käytön farmaseuttisessa koostumuksessa.

Yleisen kaavan (I) mukaista yhdistettä tai sen suolaa tai esteriä sisältävä farmaseuttinen koostumus voidaan formuloida tunnetulla tavalla tavanomaiseen annosmuotoon, esimerkiksi pulveriksi, rakeiksi, tableteiksi, pillereiksi ja kapseleiksi suun kautta annettavaksi kuten myös suonensisäisesti, lihaksensisäisesti tai ihonalaisesti injektoitavaksi liuokseksi ja peräpuikoiksi käyttäen farmaseuttisesti hyväksyttävää kiinteää tai nestemäistä kantajaa, joka sopii formulointia varten. Sopiva kiinteä kantaja voi esimerkiksi sisältää sokereita kuten maltoosia ja sakkaroosia, aminohappoa, selluloosajohdannaisia kuten hydrokeipropyylisellu-loosaa ja syklodekstriinejä.

Sopiva nestemäinen kantaja voi sisältää esimerkiksi vettä, alkoholeja kuten etanolia, soijapapuöljyä ja muita eri öljyjä, samoin myös fysiologista suolaliuosta.

34 98739

Koostumus voi sisältää kaavan (I> yhdistettä yleensä suhteessa 0,1-90 paino-% riippuen koostumuksen muodosta. Injektoitava liuos voi yleensä sisältää 0,1-10 paino-% tämän keksinnön uutta yhdistettä. Tämän keksinnön uuden yhdisteen annostelusta voidaan päättää eri tekijöiden kuten potilaiden iän, ruumiinpainon, tilan, sieni-infektion lajin ja terapeuttisen käsittelyn tarkoitusten mukaan, ja pelkästään ohjeellisesti tämän keksinnön uutta yhdistettä voidaan antaa annoksena, joka on 1-300 mg/kg päivässä muutoin kuin suun kautta annosteltuna ja annoksena 5-5++ mg/kg päivässä suun kautta annosteltuna.

Tätä keksintöä kuvataan nyt viitaten eeuraaviin esimerkkeihin, joihin tätä keksintöä ei missään tapauksessa ole rajoitettu. Ben-anomisiinien A ja B ja myös deksylosyy1ibenanomisiinin b yksityiskohtaiset ominaisuudet on esitetty tässä keksinnössä ja alan ammattimiehen on mahdollista tutkia ja toteuttaa menetelmät ben-anomisiinien A ja B tai deksylosyy1ibenanomisiinin B tuottamiseksi eri tavoin ottaen huomioon näiden yhdisteiden edellä kuvatut ominaisuudet. Tästä johtuen tämä keksintö käsittää ei ainoastaan mitkä tahansa seuraavien esimerkkien mukaisten menetelmien muunnokset vaan myös kaikki sellaiset menetelmät, joilla benanomisii-neja A ja B tai deksylosyy1ibenanomisiinia B on tuotettu, konsentroitu, uutettu ja/tai puhdistettu sinänsä tunnetulla tavalla käyttäen hyväksi benanomisiinien A ja B tai deksylosyy1ibenanomi-siinin B ominaisuuksia.

Esimerkki 1

Silmukallinen MH193-16F4-kantaa (identifioitu FERM BP-2051:nä), jota oli inkuboitu vinoagarväliaineella, ympättiin 800 ml:aan nestemäistä viljelyväliainetta, joka sisälsi 1,0% tärkkelystä ja 3,0% soijapapujauhoa (pH 7,0 ennen sterilointia) ja joka oli sijoitettu Sakaguchi'n 500 ml:n tilavuiseen pulloon. Ympättyä vil-

O

jelyväliainetta inkuboitiin 28 C:ssa 3 päivän ajan ravistellen (135 rpm) ensimmäisen siemenviljemän saamiseksi. Saatu ensimmäinen siemenvi1jelmä ympättiin 3 ml:n annoksina 80 ml suuruisiin nestemäistä vi1jelyvällainetta, joilla oli sama koostumus kuin l· 35 98739 edellä, sisältäviin eriin, jotka sijoitettiin erikseen useisiin Sakaguchi-pulloihin. Ympättyjä viljelyvällaineita inkuboitiin 3 päivän ajan samoissa inkubointiolosuhteissa kuin edellä antamaan toisen siemenviljelmän. Muodostunut toinen siemenvi1jelmä (2 litraa) ympättiin sitten samaa koostumusta kuin edellä olevaan vil- o jelyvällaineeseen (50 ml), joka oli steriloitu 120 C:ssa 15 minuutin ajan ja pietettiin 100 l:n säiliöiermenttoriin. Näin ympät- o tyä viljelyväliainetta inkuboitiin 2Θ C:ssa 2 päivän ajan ilmastaen nopeudella 50 1 ilmaa minuutissa ja sekoittaen nopeudella 200 rpm., jotta saatiin aikaan MH193-16F4-kannan pinnanalainen viljelmä aerobisissa olosuhteissa ja kolmas siemenviljelmä. Muodostunut kolmas siemenvi1jelmä (12 1) ympättiin tuotantovi1jelyväl laineeseen (300 1), joka sisälsi 2,0* glyseriiniä, 1,5% soija-papujauhoa (saatavana kaupallisesti kauppanimellä "Esusan Meat", Ajinomoto Co. Ltd., Japani, tuote), 0,0025* K2HP04, 0,1125% KH2P04, 0,005* CoC12.6H20, 0,03* si1ikoniöljyä "KM72" (vaahdon-estoaine, Shinetsu Chemicals Co. Ltd., Japani, tuottaman tuotteen kauppanimi) ja 0,01* pinta-aktiivista ainetta "Adekanol" (Asahi

Denka Kogyo Co. Ltd., Japani, tuottaman tuotteen kauppanimi), jo- o ka oli etukäteen steriloitu 125 C:ssa 30 minuutin ajan ja asetet- o tiin sitten 570 l:n säi1iöfermentoriin. Viljely suoritettiin 28 C: ssa 7 päivän ajan sekoittaen nopeudella 300 rpm. ja ilmastaen nopeudella 150 1 ilmaa minuutissa ensimmäisen 24 vi1jelytunnin aikana ja sitten nopeudella 300 1 ilmaa minuutissa 24 vi1jelytunnin jälkeen. Loppuun suoritetun viljelyn jälkeen saatu viljelyliemi sekoitettiin suodatinapuaineena käytettyyn piimäähän ja suodatettiin sitten antamaan 250 1 vi1jely1iemen suodosta (pH 6,0).

Esimerkki 2

Edellä olevassa esimerkissä 1 saatu vi1jely1iemen suodos (250 1) vietiin mikrohuokoista ei-ionieta adsorbenttihartsia "DIAION HP-20" sisältävän 15 1 pylvään lävitse, jotta saataisiin aikaan aktiivisten aineiden adsorptio adsorbenttiin. Sen jälkeen kun ad-eorbenttipy1väs oli pesty 100 1:11a vettä ja 45 1:11a 50% vesipitoista metanolia, adeorbenttipylväs eluoitiin 45 1:11a 70* vesipitoista metanolia ja sitten 90 1:11a kuivaa metanolia niin, että 36 98739 eluaatin ensimmäinen fraktio <53 1), toinen fraktio (38 1) ja kolmas fraktio <27 1) saatiin erikseen. Ensimmäinen fraktio, joka sisälsi aktiivisen aineen konsentroitiin 3 l:ksi alennetussa paineessa, mitä seurasi säätö arvoon pH 3,5 laimealla kloorivetyha-polla, jolloin saatiin väriltään punainen saostuma. Saostuma koottiin suodattamalla ja kuivattiin sitten alennetussa paineessa, jolloin saatiin 152 g karkeata ruskeata jauhetta, joka sisälsi pääasiassa benanomisiinia A.

150 g karkeata jauhetta liuotettiin 600 ml:aan dimetyy1iformami-dia. Muodostuneen liuoksen kyllästämisen jälkeen vesihöyryllä huoneen lämpötilassa 3 päivän ajan kuivaajassa saatiin kiteinen saostuma. Saostuma koottiin suodattamalla ja kuivattiin sitten alennetussa paineessa, jolloin saatiin 29 g benanomisiini A -di-metyylif ormamidisolvaattia.

Ensimmäisestä fraktiosta saatu yksi gramma benanomisiini A -di-metyyliformamidia liuotettiin dimetyy1isulfoksidiin <5 ml). Muodostunut liuos lisättiin tipoittain sekoittaen samalla 300 ml:aan metanolia, mitä seurasi sekoittaminen 10 minuutin ajan punertavan ruskean saostuman saamiseksi. Saostuma suodatettiin ja kuivattiin sitten alennetussa paineessa, jolloin saatiin 935 mg puhdistettua benanomisiiniä A punertavan ruskeana jauheena.

Esimerkki 3

Esimerkissä 2 saadun eluaatin kolmas fraktio konsentroitiin 1,5 l:ksi alennetussa paineessa, mitä seurasi sen säätö pH 3,5:een laimealla kloorivetyhapolla punaisen saostuman saamiseksi. Saostuma koottiin suodattamalla ja kuivattiin sitten alennetussa paineessa, jolloin saatiin 98 g benanomisiiniä B sisältävää karkeaa ruskeata jauhetta. Yksi gramma tätä jauhetta liuotettiin 10 ml:aan o dimetyy1iformamidia 40 C:ssa ja saatu liuos vietiin 1 1 pylvään lävitse, joka sisälsi geelisuodatusainetta “Sephadex LH-20", joka oli kasteltu dimetyy1iformamidi1la, ja "Spephadex"-py1väs kehitettiin sitten dimetyy1iformamidi1la. Eluaatti koottiin 6 ml:n fraktioiksi. Fraktiot no:t 64-72, jotta sisälsivät aktiivisen ai- li 37 98739 neen, kerättiin, yhdistettiin ja konsentroitiin sitten kuivaksi alennetussa paineessa, jolloin saatiin 657 mg benanomisiini B -dimetyyliformamidisolvaattia sisältävää karkeaa ruskeaa jauhetta Kolmesataa milligrammaa tätä karkeaa jauhetta liuotettiin 100 ml:aan metanolia ja sen jälkeen, kun oli lisätty 1 ml 1 N klo0ri_ vetyhappoa, liuos konsentroitiin kuivaksi alennetussa paineessa Saatu ruskeanvärinen karkea jauhe liuotettiin 3 ml:aan dimetyyii_ sulfoksidia. Muodostunut liuos lisättiin pisaroittaan 200 mitään kloroformia sekoittaen samalla, mitä seurasi 20 minuutin sekoitus-punertavan ruskeaa saostuman saostamieeksi. Saostuma koottiin suodattamalla ja kuivattiin sitten alennetussa paineessa antamaan 258 mg benanomisiini B -hydrokloridia puhdistetussa muodossa.

Esimerkki 4 Tämä esimerkki kuvaa deksy1osyy1ibenanomisiinin B tuottamista benanomisiinin B happohydrolyysi1lä.

Benanomisiini B -hydrokloridi (130 mg) liuotettiin 10 ml:aan vettä, mitä seurasi 10 ml:n konsentroitua kloorivetyhappoa lisääminen. Saatu seos suljettiin lasiputkeen. Sen jälkeen, kun hydro- o lyysireaktion oli annettu tapahtua 110 C:esa 12 tunnin ajan, muodostunut saostuma koottiin suodattamalla. Saostuma uutettiin kolme kertaa 10 ml :11a dioksaania niin, että saatiin 47,5 mg benanomi-sinonia <benanomisiinin B aglykoni). Jäännös, joka jäi uuton jälkeen, puhdistettiin preparatiivieella piihappogeeliohutlevykroma-tografiällä (piihappogee1i "Art. 5744”, kauppanimi, Merck & Co., Inc. tuote; kehitettynä liuotinseoksella, joka sisälsi butanolie-tikkahappo-pyridiiniä = 6:1:4), jolloin saatiin erikseen deksylo-syylibenanomisiinin B sisältävä fraktio 1 ja benanomisinonin sisältävä fraktio 2. Fraktio 1 adsorboitiin 20 ml:aan adsorbenttiä "DIAION HP-20". Adsorbentin pesemisen jälkeen vedellä (60 ml), adsorbentti eluoitiin neljästi 40 ml:lla metanolia. Eluaatti konsentroitiin kuivaksi, saatu jäännös liuotettiin 3 ml:aan vettä ja muodostunut liuos säädettiin pH-arvoon pH-2 0,1 N kloorivetyha-polla. Konsentroitaessa liuos kuivaksi saatiin 17,8 mg puhdistet- 98739 3Θ tua deksylosyy1ibenanomieiini B hydrokloridia. Samalla tapaa puhdistettiin fraktio 2 kromatografiseeti käyttäen adsorbenttiä DIAION HP-20 , jolloin saatiin talteen 9,5 mg benanomisinonia.

Esimerkki 5 Tämä esimerkki kuvaa deksylosyylibenanomieiinin B tuottoa benano-misiinin B metanolyyeillä, mitä seurasi käsittely emäsyhdisteellä, natriumhydroksidilla.

40 ml liuosta, joka sisälsi 217 mg benanomisiini B -hydrokloridia o 1 HHC1—metano1issa suljettiin lasiputkeen ja kuumennettiin 90 C:ssa 12 tuntia alkoholyyein suorittamiseksi. Reaktioliuos konsentroitiin sen jälkeen kuivaksi. Jäännös liuotettiin 30 mitään vettä ja adsorboitiin 100 mitään adsorbenttiä "DIAION HP-20". Ad-sorbentti pestiin sitten vedellä <300 ml>, mitä seurasi uuttaminen neljästi 200 ml :11a metanolia. Uuteliuos konsentroitiin kuivaksi muodostuneen 125 mg:n dekeylosyylibenanomisiini B -metyy-liesteriä saamiseksi. Saatu metyyliesteri liuotettiin 20 mitään vettä ja sen jälkeen kun oli lisätty 5 ml INNaOHta, annettiin esterin alkalisen hydrolyysin tapahtua huoneen lämpötilassa 10 minuutin ajan. Sen jälkeen kun oli lisätty 7 ml IN kloorivetyhappoa reaktioiluokseen, muodostunut seos konsentroitiin kuivaksi. Jäännös liuotettiin 20 mitään vettä ja liuos adsorboitiin 100 ml tn pylvääseen, joka sisälsi adsorbenttiä "DIAION HP-20". Adsorbent-tipylvään pesun jälkeen 300 ml :11a vettä adsorbentti eluoitiin 20n ml :11a metanolia. Saatu liuos konsentroitiin kuivaksi ja vietiin sitten 650 ml tn pylvään lävitse, joka sisälsi gee1isuodatus -ainetta "Sephadex LH-20". "Sephadex" pylväs kehitettiin metano-lilla. Eluaatin aktiiviset fraktiot koottiin, yhdistettiin ja konsentroitiin kuivaksi. Muodostunut jäännös liuotettiin 10 mitään vettä, ja liuoksen pH säädettiin arvoon pH 2 IN kloorivetyhapolla. Konsentroitaessa liuos kuivaksi saatiin 109,5 mg puhdistettua dekeylosyylibenanomisiini B -hydrokloridia punertavan ruskeana jauheena.

Claims

98739

1. Menetelmä benanomisiinin A, jolla on kaava (Ia) CH3 CONHCHCOOH CH3 OFI O OH P 0H OH ja/tai benanomisiinin B, jolla on kaava (Ib) ch3 I 3 CONHCHCOOH I nh3 HO .A,. CH3 <Ib> OH 0 OH P 0H OH tuottamiseksi, tunnettu siitä, että benanomisiinia A ja be-nanomisiiniä B tuottavaa Actinomycetes-kantaa, joka on MH193-16F4-kanta, joka on tunnistettavissa kantana, joka on talletettu talletusnumerolla "PERM BP-2051" japanilaiseen talletuslaitokseen "Fermentation Research Institute" Budapestin sopimuksen ehtojen mukaisesti, kasvatetaan viljely-väliaineessa, joka sisältää assimiloituvia hiilen lähteitä ja assimiloituvia typen lähteitä, aerobisissa olosuhteissa benanomisiinin A ja/tai benanomisiinin B tuottamiseksi ja 98739 akkumuloimiseksi viljelmään, että viljelmästä otetaan talteen benanomisiinia A ja benanomisiinia B tai toista niistä, ja että haluttaessa benanomisiini B muunnetaan sen ksylosyy-liryhmän lohkaisulla joko happohydrolyysillä tai alkoholyy-sillä ja sitä seuraavalla käsittelyllä emäsyhdisteellä deksylosyylibenanomisiiniksi B, jolla on kaava (Ie) f3 CONHCHCOOH o ho y {f <IC) OH O OH P OI!

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä että MH193-16F4-kantaa (identifioitu kantana PERM BP-2051) viljellään viljelyväliaineessa aerobisissa olosuhteissa lämpötilassa 25-37°C benanomisiinin A ja benanomisii-nin B tuottamiseksi ja akkumuloimiseksi saatuun viljelylie-meen, viljelyliemi suodatetaan ja syntynyt viljelyliemen suodos viedään adsorbenttipylvään lävitse benanomisiinin A ja benanomisiinin B adsorboimiseksi adsorbenttiin, ja benanomisiini A ja benanomisiini B otetaan talteen erikseen elu-oimalla kromatografisesti adsorbenttipylvästä, joka sisältää benanomisiinit A ja B adsorboituneena itseensä.

3. Patenttivaatimuksen l mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että benanomisiinin B happohydrolyysi toteutetaan antamalla epäorgaanisen tai orgaanisen hapon reagoida benanomisiinin B kanssa vesipitoisessa liuoksessa lämpötilassa 60-110°C 5-15 tunnin ajan. li 98739

4. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että benanomisiinin B alkoholyysi toteutetaan kuumentamalla benanomisiinin B liuosta alemmassa alkanolissa kuten metanolissa ja etanolissa epäorgaanisen hapon läsnäollessa lämpötilassa 60-120°C 5-15 tunnin ajan deksylosyylibenanomi-siini B -esterin (karboksylaatti) muodostamiseksi mainitun alkanolin kanssa, ja saadun deksylosyylibenanomisiini B -esterin annetaan reagoida aikaiimetallihydroksidin tai karbonaatin kanssa vesipitoisessa liuoksessa deksylosyylibenano-misiinin B tuottamiseksi.