DK141761B - Fremgangsmåde til fremstilling af antibiotika aclacinomycin A og/eller B eller salte eller deoxyribonucleinsyrekomplekser deraf. - Google Patents

Description

(11) FREMLÆGGELSESSKRIFT 141761 ΠΔΝΜΔΡΚ (51) ,ntCI·3 C 12 Ρ 19/56 UMIMIVIMnlS. C 07 Η 17/04 // C 12 R 1/465 §(21) Ansøgning nr. 5170/75 (22) Indleveret den 11. Jul. 1975 (23) Løbedeg 11. jul. 1975 (44) Ansøgningen fremlagt og fremlæggelsesskriftet offentliggjort den 9· jun. 1 98Ο DIREKTORATET FOR ...... u t , PATENT- OG VAREMÆRKEVÆSENET <3°) ΜθΓ,ίβ* ^891^ den

27. Jul. 1974, 86590/74, JP

(71) ZAIDANHOJIN BISEIBUTSU KAGAKU KENKYUKAI, 25-go, 14-ban, 5-chome, TCamloeakl, Shinagawa-ku, Tokyo, JP.

(72) Opfinder: Hamao Umezawa, 25-banchi, 4-chome, Toyotamaklta, Nerima-ku, Tokyo-to, JP: Tomio Takeuchi, 5-1-11 , Higashi-gotanda, Shinagawa-ku, Tokyo-to, JP: Masa Hamada, 1-7-5-4, Fujl-raachi, Hoya-shi, Tokyo-to, JP: Akira Takamatsu, Bream Heights 7-go, 206-go, 1405-banchi, Matano-cho, Totsuka-ku, Yokohama-shi, Kanagawa-ken, JP: Toshikazu Oki, Nishikama= kura Coop. 602, 1292-1, Tebiro, Kamakura-shl, Kanagawa^ken, JP.

(74) Fuldmægtig under sagens behandling:

Dansk Patent Kontor ApS.

(54) Fremgangsmåde til fremstilling af antibiotika aclacinomycin A og/eller B eller salte eller deoxyribonucleinsyrekomplekser deraf.

Den foreliggende opfindelse angår en fremgangsmåde til fremstilling af de hidtil ukendte forbindelser aclacinomycin A og B, der er anthra-cycline glycoside antitumor-antibiotika eller salte eller deoxyribonucleinsyrekomplekser deraf.

I kulturvæsken fra Streptomyces har man fundet forskellige anthra-cyclinske glycosider. Blandt disse er daunomycin og adriamycin særligt blevet undersøgt med henblik på anvendelse indenfor cancerkemoterapien, og de er allerede blevet anvendt klinisk mod menneskecancer.

I den fortsatte søgen efter antitumor-antibiotika har man nu fundet 2 141761 nogle forbindelser, der efter rensning baseret på deres fysisk-kemiske egenskaber og karakterisering har vist sig at være hidtil ukendte. Disse forbindelser, der kaldes aclacinomycin A og B, har lav cardio-toksicitet og stærk antitumorvirkaing på forskellige tumorer hos dyr.

Fra USA-patentskrift nr. 3*590.028 kendes produktet adriamycin (B-106FI; 14-hydroxy-daunomycin; IM er Doxorubicin) samt en fremgangsmåde til dets direkte fremstilling ved dyrkning af S. peuce-ticus var. caesius. Fra USA-patentskrift nr. 3*803*124 er det endvidere kendt kemisk at omdanne daunomycin til adriamycin og fra britisk patentskrift nr. 1.003*383 at fremstille daunomycin (som antibiotikum FI 1762) ved dyrkning af S. peuceticus.

Det i det britiske patentskrift nr. 1.003*383 omhandlede daunomycin kan være samme stof som Ehone-Poulenc's 13057 R-R* (tidligere rubido-mycin, nu Daunoribicin (britisk patentskrift nr. 985*598, 1.188.262, 1.241.750 og USA-patentskrift nr. 3*616.242)) og er antagelig identisk med Ciba's danubomycin (USA-patentskrift nr. 3*092.550 og britisk patentskrift nr. 901.830). For oplysninger om dihydrodaunomycin henvises også til USA-patentskrift nr. 3*686.163.

Oinerubin A og cinerubin B er kendt fra britisk patentskrift nr. 846.130 samt USA-patentskrift nr. 3*864.480 og omtales af Keller-Schierlein et al., Antimicrobial Agents and Chemotherapy, side 68 (1970) og Chemical Abstracts, 54, 1466i (I960).

Supplerende og sammenfattende om anthracyclinske antibiotika kan henvises til Index of Antibiotics from Actinomycetes, Hamao Umezawa, redaktør, University Park Press, State College, Pennsylvania, USA (1967) som følger:

Antibiotikum Side

Aklavin 111

Cinerubin A 220 C inerubin B 221

Danubomycin 242

Daunomycin 243

Pyrromycin 542

Rhodomycin A,B 561

Rubidomycin 574 3 141761 Lærebogen Antibiotics, bind 1, Mechanism of Action, redigeret af David Gottlieb og Paul D. Shaw, Springer-Verlag New York, Inc·» N.Y., N.Y. (I967),har på siderne 190-210 en artikel af A. DiMarco benævnt Daunomycin og beslægtede antibiotika.

Information Bulletin, nr. 10, International Center of Information of Antibiotics, in collaboration with WHO, December 1972, Belgien,omhandler anthracycliner samt deres derivater.

Nærværende beskrivelse henviser på side 19 til K.Eckardt et al.'s oplysninger vedrørende galirubiner, jvf. Chemical Abstracts 64, 3896g og 62., 90573z.

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen er ejendommelig ved det i kravets kendetegnende del anførte.

Aclacinomycin A og B kan ekstraheres og renses efter de sædvanlige metoder, der anvendes ved ekstraktion og rensning af vanduopløselige antibiotika. Aclacinomycin A og B fås som rå eller rensede faste stoffer eller i form af deres salte eller ENA-komplekser.

En beskrivelse af Streptomyces galilaeus findes i Arch, flir Mikrobiol., 31, side 356 (1958), og International Journal og Systematic Bacteriology, 22, side 298 (1972).

Ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen dyrkes der fortrinsvis ved en temperatur på mellem 25 og 30°C under en pH på fra 5 til 8. Efter dyrkningen udvindes aclacinomycineme fra kulturvæsken efter en metode, der omfatter et af følgende trin: ekstraktion med opløsningsmiddel, udfældning med opløsningsmiddel, koncentrering, gel-filtrering, modstrømsfordeling, chelatering med metalioner og adsorption på en ionbytterharpiks, en absorberende kiseljord eller en syntetisk adsorbent efterfulgt af eluering.

Efter fremgangsmåden ifølge opfindelsen kan man også frysetørre opløsningen, der indeholder aclacinomycineme, eller tilsætte mindst et af følgende stoffer desoxy-ribonucleinsyre, glycerol og sukkerstoffer til opløsningen indeholdende aclacinomycineme og derefter frysetørre.

4 141761

Pig. 1 viser det ultraviolette absorptionsspektrum af aclacinomycin A, hvoraf A er optaget i methanol, B i 0,1 I HCl-methanol, C i 0,1 H UaHO-methanol, fig. 2 er det infrarøde ahsorptionsspektrum af aclacinomycin A tabletteret i kaliumbromid, fig. 3 er MR-spektret af aclacinomycin A i CDCl^ (100 MHz, indre reference IMS), fig. 4 er det ultraviolette absorptionsspektrum af aclacinomycin B, hvor A er optaget i methanol, Bi 0,1 Ϊ HCl-methanol og C i 0,1 1 FaOH-methanol, fig. 5 viser det infrarøde absorptionsspektrum af aclacinomycin B tabletteret i kaliumbromid, fig. 6 er HMR-spektret af aclacinomycin B i CDCl^ (100 MHz, indre reference IMS).

Organismen, der producerer de omhandlede antibiotika, aclacinomycin A og B, er isoleret fra en jordprøve, indsamlet ved Osaki, Shinagawa-ku Tokyo,.Japan. Kulturen MA144-M1 er deponeret i .American Type Culture Collection, Rockville, Maryland,og i Fermentation Research Institute, Japan, og findes i deres permanente mikroorganismesamlinger under nummeret ATCC nr. 31133 henholdsvis ΡΕΕΙ nr. 2455.

Stammen MA144-M1 har følgende egenskaber: 1) lorphologiske egenskaber:

Undermikroskop ses åbne spiraler at udvikle sig godt fra forgrenet substratmycelium. Der forekommer ikke vindinger, og de modne spore- k.æder er moderat lange med mere end ti sporer. Sporene er ellipsoide og måler 0,4 til 0,8 μ x 0,8 til 1,6 μ,og deres overflade er glat, 2) Egenskaber på forskellige medier:

Karakteriseringen i parenteserne nedenfor er på grundlag af den af Container Corporation of America, U.S.A., publicerede farvestandard "Color Harmony Manual".

a) På glucose-aspargin-agar fås ved dyrkning ved 27°C let gulligbrun vækst (3gc, Lt. Tan); intet luftmycelium; intet opløseligt pigment.

b) På sucrose-aspargin-agar fås ved dyrkning ved 27°C farveløs eller let gulligbrun vækst (3gc, It. Tan); intet luftmycelium; intet opløseligt pigment.

c) På glycerol-aspargin-agar (ISP-medium nr. 5) fås ved dyrkning ved 27°C gulligorange (4ic, Suntan) til brun (51g, Cocoa Brown) vækst; 5 141761 hvidt til let gråb(2fe, Covert Cray) luftmycelium; brunt opløseligt pigment.

d) På stivelsesagar med uorganiske salte (ISP-medium nr. 4) fås ved dyrkning ved 27°C bleg orange (3ea, Lt. Melon Yellow) til bleg gulligbrun (3ie, Camel) vækst; let gråt(2fe, Covert Gray) til grå (e, Gray) luftmycelium; brunt opløseligt pigment.

e) På tyrosinagar (iSPnnedium nr. 7) fås ved dirkning Ved 27°C birun- : liggråt (3li, Beaver) til brun (4lg, Toast Tan) luftmycelium; sort opløseligt pigment.

f) På næringsagar fås ved dyrkning ved 27°C farveløs til gråligbrun vækst; intet luftmycelium; brunt opløseligt pigment.

g) På gær ekstrakt-malt ekstraktagar (ISP-medium nr. 2) fås ved dyrkning ved 27°C let brun (41e, Maple) til brun (4ng, Lt. Brown) vækst; let gråt " (3fe, Silver Gray) til gråt (3ih, Beige Gray) luftmycelium; opløse- . ligt brunt pigment.

h) På hvedemelsagar (ISP-medium nr. 3) fås ved dyrkning ved 27°C farveløst til bleg gulligbrun (2gc, Bamboo) vækst; let gråt (3fe,

Silver Gray) luftmycelium; brunt opløseligt pigment, i) På glycerol-nitratagar fås ved dyrkning ved 27°C farveløs til bleg gulligbrun (3gc, Lt. Tan) eller let olivengrå (2db, Parchment) vækst; intet luftmycelium; intet opløseligt pigment.

j) På stivelsesagar fås ved dyrkning ved 2?°C bleg gulligbrun (3gc, Lt. Tan) vækst; gråt (e, Gray) luftmycelium; let brunt opløseligt pigment.

k) På calciummalatagar fås ved dyrkning ved 27°C farveløs vækst; grålighvidt (b, Oyster white) til let brunliggråt (3dc, Natural) luftmycelium; intet opløseligt pigment.

l) På gelatinestik fås ved dyrkning ved 20°C blegbrun til bleg gulligbrun vækst; hvidt luftmycelium; brunt opløseligt pigment.

m) På glucose-peptongelatinestik fås ved dyrkning ved 27°C blegbrun til brun vækst; intet luftmycelium; brunt opløseligt- pigment.

n) På skummetmælk fås ved dyrkning ved 37°C blegbrun til brun vækst; intet luftmycelium; brunt opløseligt pigment.

3) Fysiologiske egenskaber: a) Væksten er undersøgt på maltose-gærekstraktagar (1,0$ maltose, 0,4$ gærekstrakt og 3,5$ agar, pH 6,0) ved temperaturerne 20, 24, 27, 30, 37 og 50°C. Den optimale væksttemperatur er 27°C til 37°C, og der forekommer ikke vækst ved 50°C.

6 141761 b) Gelatinesmeltning på 15$1 s gelatinestik ved 20°C og på glucose-peptongelatinestik ved 27°C iagttages med det første medium efter 14 dages inkubation som svag, medens smeltningen ved det andet medium er svag eller moderat efter 7 dages inkubation.

c) Stivelseshydrolyse på stivelsesagar med uorganiske salte ved 27°C: Der iagttages svag hydrolyse efter 5 dages inkubation.

d) Peptonisering og koagulering af skummetmælk ved 37°C: Moderat til stærk peptonisering begynder efter 5 dages inkubation og er tilendebragt på ca. 17 dage. Der forekommer ikke koagulering.

e) Melanindannelse på tyrosinagar (ISP-medium nr. 7), tyrosin-gær-ekstraktvæske (ISP-medium nr. l) og pepton-gærekstrakt-;]' emagar (ISP-medium nr. 6) ved 27°C: Positiv på alle medier.

f) Smeltning af calciummalat på calciummalatagar ved 27°C; Tydeligt positiv.

g) Nitratreduktion på peptonagar indeholdende 1,0$ natriumnitrat (ISP-medium nr, 8) ved 27°C: Positiv.

h) Udnyttelse af carbonhydrater på Pridham-Gottlieb-grundmedium (ISP-medium nr. 9) ved dyrkning ved 27°C: Rigelig vakst med L-arabinose, D-xylose, glucose, D-fructose, sucrose, inositol, I-rhamnose og raf-finose-, men ingen vækst med D-mannitol.

Af de ovenstående karakteristika ses det, at stammen MA144-M1 tilhører slægten Streptomyees og er af den kromogene type, da den producerer brunt opløseligt pigment på forskellige agarmedier, luftmyceliet danner åbne spiraler, men ingen vindinger. Sporeoverfladen er glat .Taksten på forskellige medier er i almindelighed bleg gulligbrun til brun, men er i nogle få medier olivenfarvet, og luftmyceliet er let gråt. Nitrat reduceres til nitrit. Den proteolytiske virkning er svag til moderat, og stivelseshydrolysen relativt svag. Melanin produceres på tyrosinagar, tyro sin-gær ekstrakt væske og pept on-gær ekstrakt-jernagar.

Blandt de kendte arter af Streptomyees ligner stammen MA144-M1 Stre-tomyces galilaeus.

Reference 1: Archiv fur Mikrobiologie, 31, side 356, 1958.

Reference 2; International Journal of Systematic Bacteriology, 22, side 298, 1972. Med særlig henblik på at adskille den foreliggende stamme og standardstammen S. galilaeus ISP 5481 ved hjælp af morfologi, farve og luftmyceliet og andre fysiologiske egenskaber er de undersøgt i parallelle kulturer. Resultaterne er som følger: 7 141761 i

hO

•Η £Zj Η Ρ Η d

Sod I φ φ Η !> ο d 2 ·Η Ρ _ ^ d φ hOH Η ί> > > Φ Η fcio Ο Ρ ·Η ·Η ·Η d cd ή I hO Ρ Ρ Ρ Φ(Μ +3 d Ρ Η d hO ·Η ·Η ·ιΗ * .

ch cd ·η -cd »cd 3 ω tn tn cq * * Φ h ft d d d H o o o

Ph ho t n hQ hQ,Q fi ft ft ft -p »cd d ho Η Ρ •H 1¾

+3 XJ

-P ri

Ti ·Η Φ ·Η +3 P> 0 d > Ti d d φ ,d H ta p >1>> Φ H hO pi d ίπ Ή ·Η Ή d cd ·η hop fi -ρ -ρ -ρ hn

Φ ri +3 ρ rH hO-Η ho *Η ·Η ·Η hO

ch cd -Η »cd φ £ι φ mmratdro φ Η ft d Η Ρ Η ΟΟθ!>Ρ Ρ3 hO tn ho Ρ S Ρ ftftfttQtn B p i d Φ |> Φ CD PH -H td φ hO I P o

Φ ·Η d *ri S

>3 cq Η p »cd tn

g p ri d Ρ H d d Ol H

οφοο d»cdp-cnh0 >ft!> -H

pcd^f H d hO ho d -H -H p ft H ip cd hO -h æ ρ P hO P . „ Φ ·Η P d hOrl > d ·Η 'Η Ή hO W) fn H o) ή ρ φ ®g5 *ri p tn H tn cd ro ro p pcdco H ft φ H d H Ih . o p o > > >cd CO hOH W Jl H PtlOO fil ft g ft CQ CQ CQ d -ρ i

Ih d Φ Φ φ I ρ Η ρ τί H hOd φ o cd p fi d fc> g

Ih Η Φ h

H -HPHHTitd H

S ft »cd Ρ ·η ·η Ch > !> > -H

1 CQ in hop Ρ ρ ·Η ·Η -Η Ρ

'd- ho d Φ Ρ Ρ Ρ P

+3φ hO d φ !> d ·η ·Η ·Η ho hOhO

Η cd fj ρ Φρΐ-Η 3 cq cq εο cd cd cdp <1 η Ρ φ HddH d o o o > !> > cd g hO»cdH p^npOrO ftftftco tn tn d dl 4J G) ·· 0 d cq ho ho φ ·. h vo r- >3 ρ , d g Φ ri ·Η I ·Η φ ho cq · · · o d ρ d

Ti -H H d d d d P o ra cd g ftro d d d ti H M p Pcj ί>3 i—lp d ^ Φ ri Piri ri

Ch ri PdBggrSHgProP ft

d Φ ri hOcdPPPCQCQCQ ft 02 O

Φ Ti φ -H Ti -ri -ri -Η Φ Φ Φ I Φ > S o HpTiTiTiCQddtnd d O ,¾ t»j Φ -Η Φ Φ Φ H ri -ri CQ ri Φ φ φ g p CQdaSS^PP op ho ddP tn taSTTT^cdcdocd d O O ft ,id HHftftP-l'rlHrlpH ·η ft ft p 18 Ρ,ΦΓΟεΟΕΟΡΦΦΗΦ .

CQ CQ l-P > OgHHHtOOtpeihO * 141761 8 φ d >>!>!>ί>ί>!>κ’1> (U -Η ·Η ·Ρ ·Η ·Η ·Η ·Η ·Η ·Η c, ΡΡΡΡΡΡΡΡ-Ρ φ CM φ Φ Φ -ri ·Ρ ·Ρ ·γΙ ·Ρ ·Ρ ·Η ·Η Cd α_ι mmmmOimmmw 0) ΟΟΟΟ ΟΟΟΟΦ

Cd PkftRPtftRRRifl φ β > Φ ·Η ^ +3 φ Η cd ίιΟ

Ch tjb C8 Φ * φ φ ί> Ρη β 01 ω φ ο >3 m ο φ» ρ > > >>!>!>ί>!>Ι>ί>!> -Ρ cd 'φ cd ·Η ·η ·ρ -Ρ ·ρ ·ρ ·η ·η ·η ·η ·ρ ftHLTi Ρ Ρ Ρ ΡΡΡΡΡΡΡΡΡ Φ ·Η Φ cd ·Η ·Η ·Η ·Ρ -Η -Η ·Ρ -Ρ ·Η ro tj r—I Ρ-ι rjj^QtQ mmmmaimcaaiw •ρ cåm ο φ ο οοοοοοοοφ CQ 6flH gfjPi ftPiftPiftPiftftfj Ρ m Γ“ί •Η -Ρ g Ρ ί> !> I (d ·γϊ ·η ·η ·η ·ρ ή ·ρ ·γΙ ·Η ·γ) ·η <φ Ρ Ρ Ρ ΡΡΡΡΡΡΡΡ+3 *φ Φ Gd ·Η Ή ·Ρ ·Ρ ·Ρ ‘Ρ 'Ρ 'Ρ ·Ρ Φ

Η rdwra mmtnmoiaitambD

<Η ΟΦΟ ΟΟΟΟΟΟΟΟΦ g g 3 μ, ftftPiPiPiPiPiftPl Μ φ

rH CQ

83 ,Μ Η £} S Η Φ £, 83 Ρ ^ Ρ S Ρ β cd β -ρ Ρ ο β β Μ d ·Ρ ΰ Ρ

β Ρ β PS

•Η β Μ ρ Φ , Η

S4 ο ρ cd cq φ φ HR

φ-ηΌΡηΟ ΰΐ to ω ο ο

02 Ρ Φ β3 β Φ O HOCQP

HCdfc^a'PlQCDPOOgO-P β βΗΡ,β,β ΟΦΟΦΡΗββ g) o3cdocdHo2o-rira-P§ Μ ρδ^^Ο ^Μί^Ι® β ftdP!i<!XdftoottltHS ·Ρ Φ Ο ·Ρ Gd I ΙΗΙββΙβΙ RMSORResRCGHRiSR Φ 141761 9

Det ses af resultaterne, at egenskaberne for den foreliggende stamme meget nær stemmer overens med egenskaberne for S. galilaeus ISP 5481 med hensyn til morfologi og farve af vækst og mycelium på forskellige medier samt fysiologiske egenskaber. De to stammer ligner endvidere hinanden i deres fermentationsprodukter, idet det af S.galilaeus producerede cinerubin er et af de af den foreliggende stamme dannede bipr odukter. Stammen MA144-M1 kan således identificeres som tilhørende arten Streptomyces galilaeus.

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen omfatter også anvendelse af sådanne naturlige og kunstige varianter og mutanter af S. galilaeus MA144-M1, som har væsentlig samme egenskaber som denne og producerer aclacinomycin. Ligesom ved de kendte antibiotika kan man få en højere produktion af aclacinomycin ved udvælgelse af højproduktive stammer ifølge enkelkoloniudvælgelse, ved behandling af en aclacinomyein-producerende stamme med forskellige mutagener eller efter genetiske genkombinations-, transformations- eller transduktionsmetoder.

Aclacinomyciner dannes ved dyrkning af S. galilaeus under egnede forhold. De sædvanligvis til dyrkning af andre actinomyceter anvendte metoder er også anvendelige ved dyrkningen af S. galilaeus. Man fremstiller en dyrkningsvæske indeholdende aclacinomycin ved i et egnet medium at indpode sporer eller mycelium af den aclacinomycinproduce-rende organisme og derefter dyrke dem under aerobe betingelser. Til fremstilling af aclacinomycin kan man dyrke på et fast medium, men submers aerob dyrkning er særlig fordelagtig ved produktion af store mængder af antibiotikaerne. Nyttige er medier, der indeholder de for actinomyceter kendte arter næringskilder. Mediet indeholder fortrinsvis som carbonkilder i handelen tilgssigelige produkter, såsom glycerol, glycose, stivelse, dextrin, maltose, melasse, olie, fedtstoffer og lipider, enten i renset eller rå tilstand, og som nitrogenkilder i handelen tilgængelige produkter, såsom sojabønnemel, maltekstrakt, pepton, gærekstrakt, "distiller's solubles", fiskemel, glutenmel, majsstøbevæske, bomuldsfrømel, kasein, hydrolyserede proteinstoffer, nitrater, ammoniumsalte og urinstof, samt uorganiske salte, såsom natriumchlorid, kaliumchlorid, kaliumphosphat, magnesiumsulfat og calciumcarbonat, og spor af tungmetalsalte, såsom af kobber, zink, 141761 10 mangan og jem. I den beluftede submerse kultur kan anvendes et-anti-skummiddel, såsom paraffinolie, sojabønneolie, fedtstof og silicone.

Man kan anvende en vilkårlig ferment eringst emper atur indenfor et område fra 20 til 35°C, i hvilket den aclacinomycinproducerende organisme kan vokse, skønt det foretrukne temperaturområde ligger fra 25 til 30°C. pH af kulturmediet ligger mellem 5 og 8,0.

Med mindre andet angives,er dyrknings- og prøvemetoden som følger: 1) Bystekultur: 100 ml medium i en Sakaguchikolbe eller 50 ml medium i en 500 ml's Erlenmeyerkolbe steriliseres ved 120°C i 15 minutter. Sporer eller mycelium af en aclacinomycinproducerende organisme indpodes i det steriliserede medium fra en skråagarkultur ved hjælp af en platinløkke, og der dyrkes ved 28°C i 4 dage på en frem- og tilbagegående eller roterende omryster.

2) Tankkultur: I et 200 liters fermenteringapparat fremstilles 100 liter medium, og der steriliseres ved 120°C i 15 minutter. Det steriliserede medium podes med 2 liter af kulturvæsken, der forud var rystedyrket i 2 dage. Fermenteringen i tanken udføres under beluft-ning med 50 liter steril luft pr. minut og under omrøring med 160 rpm. i 2 dage. Som antiskummiddel anvendes siliconeolie og paraffin-olie.

3) Aclacinomycin-prøve: TIC-kromat-scanner-metode; en 5 mm bred plet af det fra kulturvæskemyceliet eller kulturfiltratet med acetone, ethylacetat eller en chloroform-meihanol-blanding ekstraherede aclacinomycin A og B anbringes på en kiselplade (Kiselgel fiOFg^, Merck Co.). Efter 15 minutters mætning i fremkaldelseskarret fremkaldes TIC-pladerne véd stuetemperatur i acetone, der løber 15 cm op. Pletterne svarende til aclacinomycin A og B bestemmes gennem den optiske tæthed ved 430 nm under anvendelse af en Shimadzu Dual-Wave length TIC Scanner, Model CS-900; betingelserne er følgende: z i g-zag-s canning ved 430-700 nm, 1,25 x 1,25 nm slids, 10 mm/min. scanning og papirhastighed. Standardkurveme for renset aclacinomycin A og B med fra 0,2 til 15 t-ig/plet er forud fremstillet.

Den aclacinomycinproducerende stamme rystedyrkes først i følgende medium: Grundmediet består af 1$ glucose, 1$ kartoffelstivelse, 1,5$ ’'Prorich" (sojabønnemel, et produkt fra Ajinomoto Co.) 0,1$ KHgPO^, 0,1$ MgS04.7H20, 0,3$ Had, 0,0007$ CuS04-5H20, 0,0001$ FeS04.7H20, 0,0008$ MhCl2.4H20 og 0,0002$ ZnS04.5H20 og er indstillet til pH 7,0.

Kulturvæsken udviser på den fjerde dag en akkumulation på 45 ug/ml aclacinomycin A og 15 ug/ml aclacinomycin B, 141761 11

Som vist i de følgende tabeller produceres aclacinomycin A og B under omrystning i medier, der indeholder forskellige carbon- og nitrogenkilder: 1) Forskellige carbonkilder sættes til grundmediet bestående af 1,5$ "Prorich" og de andre ovennævnte salte som følger:

Aclacinomycin A-mængde på angivne tidspunkt 2 dage 3 dage 4 dage pH ug/ml pH ug/ml pH ug/ml 2$ glucose 7,3 27 7,4 38 8,0 41 2$ maltose 6,6 15 6,0 28 7,0 32 2$ sucrose 7,3 32 7,7 39 8,2 40 2$ opløselig stivelse 7,4 35 7,4 28 7,9 33 2$ kartoffelstivelse 7,2 36 7,6 33 8,1 42 1$ glucose + l<f0 kartoffelstivelse 6,3 32 7,7 34 8,3 43 1$ glucose + 1$ maltose 7,4 26 6,7 28 7,7 30 1$ glucose + 1$ sucrose 7,3 26 7,6 30 7,8 32 1$ glucose + 1$ opløselig stivelse 7,1 37 7,9 37 8,4 39 1$ glucose + 1$ glycerol 4,9 36 6,3 36 8,1 41 2) Forskellige nitrogenkilder sættes til grundmediet bestående af 1$ glucose, 1$ kartoffelstivelse og de andre ovennævnte salte som følger:

Aclacinomycin A-mængde på angivne tidspunkt 2 dage 3 dage 4 dage pH ug/ml pH ug/ml pH ug/ml 1,5$ "Prorich" (sojabønnemel, Ajinomoto Co.)6,3 34 7,0 48 8,0 45 1,5$ "Meat" (sojabønnemel, Ajinomoto Co.) 5,8 37 7,1 54 8,1 48 1,5$ maltekstrakt 6,2 9 6,6 7 6,6 13 1,5$ gærekstrakt 5,4 45 7,7 43 8,5 40 1,5$ casaminosyre 6,9 18 8,0 2i 8,3 22 1,5$ kødekstrakt 5,6 9 7,2 32 8,2 36 1,5$ polypepton 6,2 38 8,2 28 8,6 23 141761 12 3) Mr koncentrationerne af carbon- og nitrogenkildeme varieres i grundmediet, akkumuleres aelacinomycin A og B som følger:

CarbonkilcLe $

Glucose 123

Kartoffelstivelse 1 2 3

* A_B__ A_B A_B

"Prorich" 1,5/° 33 23 36 19 2,5$ 31 39 39 28 51 34 "Meat” 1,536 32 19 48 31 2,5$ 17 24 43 28 58· 29 * aelacinomycin A eller B: pg/ml.

Resultaterne ovenfor må betragtes som eksempler, men det kan siges, at i carbonkilder, såsom glucose, stivelse, maltose og sucrose er fordelagtige og .nitrogenkilder, såsom sojabønnemel, gærekstrakt, kødekstrakt og pepton er egnede til fremstillingen af aelacinomycin.

Kår fermenteringen udføres ved 28°0 under omrystning og i et af de egnede medier med pH 6,9, f.eks. i 2$ glucose, 2$ kartoffelstivelse, 2,5$ "Meat", 0,1$ KH2PC>4, 0,1$ MgS04,7H20, 0,0007$ CuS04.5H20, 0,0001$ PeS04.7H20, 0,0008$ MhS04.4H20 og 0,0002$ ZnS04.5H20, falder mediets pH til 5,25 til 5,10 i løbet af 20 timer,og væksten af myceliet forøges 10 timer efter podningen.

Derefter forøges pH-værdien til 7,0 til 7,5 i løbet af tre dage, og indholdet af aelacinomycin A og B i væsken når et maksimum, nemlig henholdsvis 46 ug/ml og 23 ug/ml. Til isolering af aclacinomycinet kan antibiotikaet med et passende opløsningsmiddel ekstraheres enten fra kulturvæsken "in toto" uden frafiltrering af myceliummassen eller fra myceliet og kulturvæsken, der forud er adskilt ved filtrering.

Det meste antibiotikum forekommer i filterkagen bestående af mycelium sammenblandet med diatoméjord. Filterkagen kan knuses og udrøres i et organisk opløsningsmiddel til ekstraktion af antibiotikaeme. Passende opløsningsmidler er alkoholer, såsom methanol, ethanol og butanol, ketoner, såsom acetone og methylethylketon, halogenerede carbonhydrider, 141761 13 såsom chloroform og methylenchlorid,benzen eller vandige opløsninger af organiske eller uorganiske syrer, såsom eddikesyre, saltsyre og svovlsyre.

Foretrukket er acetone, ethylacetat, blandinger af organiske opløsningsmidler, såsom alkoholer og vandblandbare ketoner, og vandige opløsninger af uorganiske eller organiske syrer.

Når man skal ekstrahere antibiotikaerae fra filtratet, kan man til filtratet, der er gjort svagt surt eller neutraliseret,fordelagtigt sætte det dobbelte rumfang af et vandubl andbart organisk opløsningsmiddel, såsom butanol, chloroform, ethylacetat, butylacetat eller benzen. Blandt separationsmetoderne for aclacinomycin er de virksomme modstrømsfordeling, kromatografi under anvendelse af kiselsyre, aluminiumoxid/'Sephadex® ΙΉ20" (tværbund ne dextr angel er, Pharmacia Fine Chemicals AB, Sverige) eller syntetiske adsorbenter-, adsorption til aktivt kul samt kombinationen af opløsningsekstraktion og disse metoder.

Antibiotikaeroe kan direkte ekstraheres fra kulturvæsken efter de ovennævnte metoder uden fraskillelse af myceliet.

Efter inddampning under vakuum indstilles ekstrakternes pH på mellem 5 og 7, og der genekstraheres med et vandublandbart opløsningsmiddel, f.eks. n-butanol, amylalkohol, ethylacetat, chloroform, benzen, methylenchlorid eller methylpropylketon. Fra den vandublandbare organiske opløsning fås det virksomme råstof som et gult pulver ved inddampning under vakuum til lille'rumfang og udfældning med lavpolære opløsningsmidler, f.eks. mættede carbonhydrider, såsom n-hexan, cyclohexan eller petroleumsether, eller ethere, såsom diethylether eller dipropylether.

Til fjernelse af de andre pigmenterede stoffer, såsom cinerubin A og B, fra det virksomme råstof, og til opnåelse af rent aclacinomycin A og B kan man yderligere rense ved søjlekromatografi under anvendelse af forskellige adsorbenter, såsom kiselsyre, aluminiumoxid, "Sephadex 1H20", ved hjælp af ionbyttere, såsom svagt sure harpikser og polystyren-divinylbenzen-tværbundne matriksharpikser, såsom "Amberlite XAD", ved chelatering med forskellige metalatomer, såsom cupri-, ferro-, ferri-, calcium- og magnesiumioner, samt ved 141761 14 udfældning med opløsningsmiddel, ekstraktion med opløsningsmiddel eller modstrømsfordeling eller kombinationer af disse metoder indbyrdes eller med chelatering med metalioner.

Mr f.eks. de rå aclaeinomyciner opløses i lidt chloroform og hældes på en kiselsyresøjle, og søjlen derefter elueres med chloroform-methan-ol-blandinger, kan aclacinomycin B-fraktionen elueres først med en 50:1 chloroform-methanol-blanding og aclacinomycin A derefter med blandingen i forholdet 30:1 til 20:1. Eluateme af aclacinomycin A og B inddampes hver for sig under vakuum og isoleres yderligere fuldstændigt fra cinerubin A og B samt lidt urene pigmenterede stoffer ved hjælp af kromatografi i en søjle med en syntetisk adsorbent, f. eks. "Column Lite" (Al2O2.MgO.2SiO2.4H20> Huj i Chemical Co.), "Flori-dil" (aktiveret magnesiumsilicat, Floridin Co.), hydroxylapatit eller ved tilsætning af 1 x 10~^ til 1 x 10-^ M CuSO^, FeCl^, FeSO^ eller MgSO^ til dannelse af et chelatkompleks af cinerubin A og B efterfulgt af søjlekromatografi på "Sephadex LH20”. De opnåede opløsninger af rent aclacinomycin A og B kan inddampes til tørhed under vakuum eller også lyofiliseres for sig eller med mindst et af følgende stoffer: serumalbumin, globulin, gelatine, glycerol, sukkerstoffer, aminosyrer, uorganiske eller organiske syrer.

Det aclacinomycin A og B, der opnås efter en kombination af de ovennævnte i eksemplerne nedenfor nærmere beskrevne metoder, viste sig at være rent og ensartet, idet det havde en enkelt plet på tyndtlags-kromatogrammet, selv om der blev anvendt forskellige opløsningsmiddel-systemer, fast smeltepunkt, dextrorotation og grundstof analyse, samt karakteristiske spidser i absorptionsspektrene: ultraviolet, synligt lys, mm og infrarødt.

Aclacinomycin A har følgende egenskaber:

Svagt basisk og lipofilt gult pulver eller mikrokrystallinsk pulver. G-rundst of analysen giver følgende resultater:

Beregnet for G^Ec^0^ C 62,14 H 6,58 0 29,56 N 1,730

Fundet C 62,37 H 6,67 0 29,38 Έ 1,820

Molekylevægt 812.

15

Ut761

Smeltepunktet er 129-135°^ og dextrorotationen ([a ]^) i en 1%' opløsning deraf i chloroform +29°. Absorptionsspektret i det ultra-violette og synlige område (fig.l) har bånd ved følgende bølgelængder: i methanol i 229 »5 Em* E^ - 540 258 nm, " " = 301 290 nm, " " = 128 434 nm, " " = 147 i 0,1 I HOl-methanol: 229.5 nm, E^%cm = 578 258 nm, " " = 329 290 nm, " " = 141 434 nm, " " = 164 i 0,1 N NaOH-methanol: 239.5 nm, E^%cm = 678 288 nm, " " = 232 314 nm, " " = 156 523 nm, " " = 17Ο Når der tabletteres med kaliumbromid findes karakteristiske absorptionsbånd i det infrarøde spektrum (fig.2) ved følgende bølgetal (cm-1): 3300, 3080, 2940, 2860, 2760, 1740, 1640, 1620, 1540, 1460, 1450, 1415, 1385, 1295,1250, 1220, 1195, 1165, 1125, 1105, 1090, 1010, 960, 93Ο, 890, 840, 815, 760, 73Ο, 580 og 450. Proton-NMR-spektret ved 100 MHz er optegnet på et Varian XL-100-15 spektrofo-tometer, der tangerer efter Eourier-transformationsmetoden, og er som vist i fig. 3.

Antibiotikumet aclacinomycin A er opløseligt i methanol, ethanol, chloroform, ethylacetat, acetone, benzen, dimethylsulfoxid (DMSO) og methylcellosolve, tungt opløseligt i vand og uopløseligt i ethylether, hexan, cyclohexan og petroleumsether. Den vandige opløsning er gul og bliver rødligbrun i koncentreret svovlsyre. Med alkoholisk magnesiumacetat har denne opløsning en purpurrød farve, der bliver rød-purpur ved alkalisation.

Aclacinomycin B har følgende egenskaber:

Svagt basisk, lipofilt og gult pulver eller mikrokrystallinsk pulver.

16 141761

Grundstofanalysen giver følgende værdier:

Beregnet for °42B5LH015 G 62,29 Ξ 6,35 0 29,63 N 1,73$

Sundet 0 62,21 Ξ 6,46 0 29,60 ΪΓ 1,73$

Molekylvægt 810.

Smeltepunkt er 135 til 145°C, og dextrorotationen ([α]^ . Ί0/ η i i/o cnio- roform) + 3 · Absorptionsspektret i det ultraviolette og synlige område (fig.4) bar bånd ved følgende bølgelængder: i methanol: 229,5 33m, ^x^cm = 452 257.5 nm, " '* = 261 290 nm, " " = 120 433 nm, " " = 120 i 0,1 ΪΓ HCl-methanol: 229.5 Dm, E^cm = 465 257.5 Dm, " " = 261 290 nm, " " = 125 433 Dm, " " = 134 i 0,1 B UaOH-methanol: 238 nm, = 440 286-289 nm, " " = 142 315 nm, " " - 97 525 nm, " " = 135

Karakteristiske absorptionsbånd i det infrarøde spektrum (fig.5) findes ved følgende bølgetal (cm"^) (KBr): 33®0> 3070, 2940, 2850, 2750, 1740, 1640, 1620, 1540, 1465, 1445, 1410, 1380, 1290, 1245,1215, 1160, 1120, 1095, 1050, 1010, 960, 920, 880, 840, 820, 750, 725, ' 700, 600, 580 og 45Ο. EMR-spektret for aclacinomycin B er vist i fig.

6.

Antibiotikumet er opløseligt i methanol, ethanol, chloroform, ethyl-acetat, acetone og syrnet vand, tungtopløseligt i vand og uopløseligt i hexan, cyclohexan og ethere. Den vandige opløsning er gul og bliver dyb rødlig purpur i koncentreret svovlsyre. Denne opløsning er purpurrød i alkoholisk magnesiumacetat og bliver rødpurpur ved alkalisation.

17 141761

Aclacinomycin A og B har i nedenstående opløsningsmiddelsysterner følgende Ef-værdier på silicagel-tyndtlagskromatogrammet;

Ef-værdi af aclacinomycin A B

Chlorof orm:methanol 20:1 0,36 0,71 5:1 0,88 0,90

Acetone 0,4- 3 0,72

Acetone:hexan 1:1 0,15 0,49

Benzen:methano1 1:1 0,86 0,95

Ved delvis hydrolysering med fortyndet saltsyre eller methanolyse-ring med methanol indeholdende 5% saltsyre i 1 til 2 timer ved stuetemperatur af aclacinomycinerne A og B fås methylerede disaccha-rider og 1-deoxypyrromycin. De fysisk-kemiske egenskaber, såsom absorptionsspektrene i det infrarøde, ultraviolette og synlige område samt KME-spektrene, smeltepunktet og dextrorotationen af det methylerede disaccharid, opnået fra aclacinomycin B, stemmer til fulde overens med egenskaberne af det methylerede disaccharid der opnås fra cinerubin B ved delvis sur hydrolyse (Helvetica Chimica Acta 55) P* 467-480, 1972); 1-deoxypyrromycin er også identificeret gennem data for rhodomycin (Chem.Ber. 8, 1762, 1955) Naturwiss., 48, 716, 1961), cinerubin (Chem.Ber. $2, 1868, 1959) og pyrromycin (Chem.Ber. 5*2, 1904, 1959) ? på grundlag af ISME-spektret, massespektret af aglycon og nærværelsen af rhodosamin i det sure hydrolysat.

Aclacinomycin A og B sønderdeles til en neutral aglycon og tre reducerende sukkerstoffer ved hydrolyse med 0,3 I svovlsyre i 3 timer ved 85°C. Aglyconet danner orangegule krystaller, der smelter ved 171 til 174°C og indeholder oxygen, carbon og hydrogen. Grundstofanalyse, det infrarøde, ultraviolette og MME-spektret, fragment-ionspidser i massespektret og andre egenskaber viser, at aglyconet fra.aclacinomycin A og B er aklavinon (Tetrahedron letters, 8, 28, I960, Naturwiss., 4£, 135, I960, ETaturwiss. 42, 154·, 1955, Naturwiss. 50, 92, 1963).

18 141761

Ifølge sammenligningsanalyse af sukkerstofferne i det sure hydrolysat fra aclacinomycin A og B og cinerubin A og B gennem tyndtlags-kromatografi giver aclacinomycin A endvidere den samme rhodosamin, 2-deoxyfucose og cinerulose A som cinerubin A og aclacinomycin B den samme rhodosamin og 2-deoxyfucose som cinerubin B.

Ud fra resultaterne ovenfor synes strukturen af de omhandlede forbindelser aclacinomycin A og B at være som følger:

Strukturen af Aclacinomycin.

0 COOCH^ gh2ch3

Ti li T r0H

vvvv OH 0 OH H 0

E

E = __0 <*> n et-ce, ck3

o ? I

0=<^T\J °H

Aclacinomycin A

141761 19

ίΓ—CHj O

o—L

c>

H*C I 5 O

Aclacinomycin B

Som det ses af strukturen ovenfor,tilhører aclacinomycin A og B gruppen af anthracyclinske glycosider. Ved sammenligning med kendte antibiotika viser de sig i deres fysisk-kemiske egenskaber at ligne cinerubin A og B, rutilantin, aklavin, requinomycin og galirubiner.

Cinerubin og rutilantiner adskiller sig fra de omhandlede antibiotika ved deres aglyCon, e-pyrromycinonon (Tetrahedron letters 16, p.

17» 1959)· Blandt de antibiotika, der har aklavino-aglycon, er requinomycin (J. Antibiotics 25, ρ·393, 1972) og aklavin (J.Bacteriol, 72, p. 90, 1956), men de adskiller sig fra de omhandlede antibiotika i sukkerdelen og ved den på grundstofanalyse baserede molekyleformel. De af Sfcreptomyces galilaeus producerede galirubiner ligaer' mest de omhandlede antibiotika. E. Eckhardt har rapporteret, at der er isoleret fire bestanddele af galirubin (galirubin D,C,B og A) fra myceliet af S. galilaeus, og at galirubin A er et e-pyrromycinon-glycosid, B et aklavinon-glycosid, C et ξ-pyrromycinon og D 7-deoxy-aklavinon. Med hensyn til de fysisk-kemiske egenskaber af galirubin B, hvis aglycon er aklavinon, omtaler rapporten ikke klart den nærmere rensningsprocedure, kromatografisk opførsel, smeltepunkt, grundstofanalyse, absorptionsspektre i de infrarøde, ultraviolette og synlig område samt MMR-spektret og oplyser kun, at der i det sure hydro- 20 141761 lysat af galirubin B på papirkromatogrammet bestemmes to pletter fra sukkerstoffer.

Aclacinomycin A og B, livis aglycon er aklavinon, og som giver tre sukkerstoffer, adskiller sig således klart fra galirubin B med hensyn til de ovenfor anførte egenskaber. Det er godtgjort, at de omhandlede antibiotika er hidtil ukendte stoffer.

Terapeutisk nyttige, ugiftige salte og deoxyribonucleinsyre-komplek-ser (DEA-komplekser) af antibiotikaerne aclacinomycin A og B kan fås med organiske og uorganiske syrer, f.eks« saltsyre, phosphorsyre, svovlsyre, eddikesyre, propionsyre, oliesyre, palmitinsyre, citronsyre, ravsyre, glutaminsyre, pantothensyre og DHA opnået fra kalve-thymus, HeLa-celler, menneske-embryoniske celler, E.coli og andre dyr og mikroorganismer.

De biologiske virkninger af aclacinomycin A og B er som følger: 1) Det antimikrobielle spektrum af aclacinomycin A og B bestemmes efter væskefortyndingsmetoden til følgende:

Antimikrobielle spektrer af aclacinomycin A og B

E or s ø gs organisme Minimal inkuberende koncentration ^g/ml)

A B

Bacillus subtilis ATCC 6633 <0,2 <0,2 B. eereus ATCC 9634 <0,2 <0,2 B.. megaterium <0,63 <0,2

Staph, aureus EDA 209? <0,63 <0,2

Staph, aureus Smith <0,2 <0,2

Sar. lutea ATCG 93^1 <0,2 '<0,2

Mic. flavus <0,2 <0,2

Gory, bovis 1810 <0,2 <0,2

Mycobact. smegmatis ATCC 607 2,5 5

Strept. faecalis 2,5 2,5

St. pyogenes MX 5 1,25 1,25

Diplo. pneumoniae Type 1 0,63 0,63

Diplo. pneumoniae Type 3 0,63 0,63 E. coli K12 > 100 > 100

El. pneumoniae ATCC IOO31 > 100 > 100

Ps. aeruginosa A20229 > 100 > 100

Can. albicans IAM 4905 10 10

Can. tropicalis IAM 4924 20 20 141761 21 2) Antitumorvirkninger:

Antibiotikaerne aclacinomycin A og B bar endvidere væsentlig inhi-berende virkning på eksperimentelle ascitiske og faste tumorer i dyr. Denne antitumorvirkning kan tydeligst vises på leukemi i mus og på hepatomis i rotter. Når f.eks. BDi^-mus på 18 til 22 g indpodes med 1 x 10® celler af P388 eller 5 x 10^ celler af L1210 intra-peritonealt 24 timer efter indpodningen og intraperitonealt får aclacinomycin A og B og aclacinomycin A-DNA-kompleks en gang dagligt i 10 efter hinanden følgende dage, forlænges deres overlevelsestid væsentligt, over 150% ved en dosis på mellem 0,5 og 5 mg/kg kropsvægt pr. dag sammenlignet med kontrolmus, der ikke får antibiotika, således som det fremgår af følgende tabel:

Antibiotikum Dosis Middeloverlevel- T/C Overlevende ,

(Mg/kg/dag) sestid (%) efter JO

(dage) dage

Aclacinomycin A 4,0 21,5 215 1/4 2.0 30,0 300 4/4 1.0 28,0 280 3/4 0,5 23,0 230 2/4

Aclacinomycin B 4,0 8,5 85 0/4 2.0 17,5 175 0/4 1.0 19,0 190 1/4 0,5 14,7 147 0/4

Aclacinomycin A- 4,0 19,0 190 1/4 DNA-kompleks 2j0 30,0 30O 4/4 1.0 30,0 300 4/4 0,5 27,3 273 3/4

Kontrol - 10,0 - 0/8 Når CH3/He-mus på 20 til 23 g indpodes med 1 x 10? celler af lymfo-ma 6C3HED/OG intraperitonealt eller med 5 x 10® celler af lymfoma 6C3HED/OG subcutant og aclacinomycin A administreres intrapérito-nealt en gang dagligt i 10 efter hinanden følgende dage tre timer efter indpodningen, virker aclacinomycin A væsentlig hæmmende på væksten af ascitisk og fast tumor, således som det fremgår af nedenstående tabel.

22 1417 61

Aclacinomycin A, dosis: mg/kg/dag 4 2 1 0,5 Kontrol

Fast type i Tumorvægt (mg) 5023 4633 2501 3095 7°4$ lumorvægt

Kropsvægt (%) 19,5 15,1 9,5 12,4 29,6

Inhibering (%) 28,7 34,2 64,5 47,6

Overlevende efter 21 dage 0/3 3/3 5/5 3/3 7/9

Ascitisk type: MST (dage)* 20,1 31,8 37,5 15,0 20,5 T/C (%)** 98 155 183 73

Overlevende efter 62 dage 0/3 0/3 1/3 0/3 0/3 * Hiddeloverlevelsestid ** Overlevelsesforhold: Testet/kontrol

Mus indpodes intraperitonealt med en suspension af L1210 leukemi-celler og behandles derefter samt 1, 5 og 9 dage efter tumorimplatio-nen med aclacinomycin A-opløsninger i forskellige koncentrationer.

De i nedenstående tabel sammenfattede opnåede resultater viser, at aclacinomycin A administreret i doser på 6 og 3 mg/kg/dag væsentlig forøger de behandlede mus middeloverlevelsestid.

Dosis Middeloverlevelsestid Overlevende efter (mg/kg/dag) (dage) 30 dage 12 16,1 0/5 6 21,7 2/5 3 23,3 2/5 1,5 12,6 0/5

Kontrol 10,4 0/10

Donryo-rotter podet med ascitisk hepatomi AH644 behandles intraperitonealt i 10 på hinanden følgende dage med 2 mg/kg/dag aclacinomycin A. ledens kontrolrottemes gennemsnitlige overlevelsestid er 14,5 dage efter tumorimplantationen, er alle de behandlede rotter i live 30 dage efter forsøgets begyndelse.

3) Akut toksicitet: LD^-værdien ved en enkel injektion af aclaci nomycin A eller B er anført i nedenstående tabel:

Dyreart Indgivelsesmåde LD^q (mg/kg)

A B

Mus intravenøst 33,7 16,4

Mus intraperitonealt 22,6 13,7

Hotte Intravenøst 32,5 15,0

Rotte intraperitonealt 25-50 10-15 23 141761

Akutte kardiale bølger i elektrokardiogrammet for hamstere induceres ikke ved en enkel intravenøs administration på 25 mg/kg aclacinomycin A eller B.

4) Antibiotikaeme inhiberer fuldstændigt væksten af dyrkede modertumorceller, vaccinevirus i HeLa-celler og specielt RNA-syntesen ved særdeles lave koncentrationer. Når L12l0-celler indpodes i mediet Rosewell Memorial Paa?k Institute 1640, indeholdende 10$ kalveserum, og der tilsættes aclacinomycin A og B i forskellige koncentrationer samt precursor ^C-thymidin, -leucin eller uridin og derefter inkuberes ved 37°C i 60 minutter ved -inkorporationsforsøget og 3 dage ved vækstforsøget, inhiberes nuclejrngyrebiosyntesen og cellevæksten over 50$ med mindre end lug/ml aclacinomycin i mediet, såled'es som det fremgår af nedenstående tabel:

Aclacinomycin A ID^ihg/ml) Aclacinomycin

Aclacinomycin A- B DNA-kompleks*

Ll2l0-celler: Vækst 0,12 0,08 0,24 DNA-syntese 1,1 - 4 RNA-syntese 0,1 0,2 0,2

Protein-syntese 6,3 - 12

Vaccinevirus: <10 - <10 * kalve-thymus-DNA, type V (Sigma Co.) anvendes.

Under hensyn til de ovennævnte egenskaber af aclacinomycin A- og aclacinomycin B-stoffer er det blevet bekræftet, at disse stoffer er hidtil ukendte antibiotika, der adskiller sig fra de hidtil kendte antibiotika. De kan anvendes til terapeutisk behandling af levende dyr, herunder mennesket, der lider af leukæmi, idet et aclacinomycin A-stof og/eller aclacinomycin B-stof administreres til dyrene i en dosis, der er tilstrækkelig til at formindske leukæmilidelsen. Et farmaceutisk præparat dertil indeholder aclacinomycin A-stof og/eller aclacinomycin B-stof i en mængde, der er tilstrækkelig til at formindske leukæmilideIsen in vivo, sammen med en farmaceutisk acceptabel bærer. Det bør bemærkes, at den faktisk foretrukne maaigde af aclacino-mycin-stoffet afhænger af den særlige blanding, der anvendes, det 24 141761 særlige formulerede præparat, applikationmåden og det særlige sted og organismem, der behandles. Mange faktorer, som ændrer lægemidlets virkning må tages i betragtning af fagmanden, f.eks, alder, kropsvagt, køn, diæt, administrationstidspunkt, administrationsvej, udskillelseshastighed, lægemiddelkombinationer, reaktionsfølsomheder og sygdommens alvor. Optimale applikationsbetingelser for et givet betingelsessæt tilvejebringes af fagmanden under anvendelse af sædvanlige dosisbestemmende forsøg og under hensyn til retningslinierne ovenfor.

De nedenstående udførelseseksempler, der viser fremstillingen af og rensningen af aclaeinomycin A og B, illustrerer fremgangsmåden ifølge opfindelsen.

Eksempel 1.

Der fremstilles et vandigt medium med følgende sammensætning: * kartoffelstivelse 1 glucose 1 "Prorich" 1,5 kh2po4 0,1 K2KP04 0,1

MgS04.7H20 0,1

HaCl 0,3 mineraler* 0,125 silicone (KM75) 0,05 pH 7,0 «Mineraler: 2,8 g CuS04.5H20, 0,4 g PeS04.7H20, 3,2 g MhCl2.4H20, 0,8 g ZnS04.7H20 i 500 ml vand. 1 ml af dette medium steriliseres i en 500 ml Sakaguchi-rystekolbe ved 120^1 15 minutter, og fra en skråagarkultur podes med Strepto-myces galilaeus MA144-M1 ved hjælp af en platinløkke. Der inkuberes i 48 timer ved 28°C i et frem- og tilbagegående rysteapparat. 10 liter forud steriliseret medium i en 20 liters fermenteringskar af rustfrit stål podes antiseptisk med 200 ml af podekulturen ovenfor. Der fermenteres 25 141761 ved 28®C i 32 timer under omrøring (240 rpm.) og beluftning (5 l/min.). pH-en af den opnåede kulturvæske indstilles på 4,5» der blandes med et adsorberende kiseljordsmateriale, og myceliet frafiltrepes, Derved fås et filtrat og en filterkage, der ekstraheres hver for sig.'Kagen suspenderes i acetone (3 liter acetone pr. kg våd kage), suspensionen omrøres^ i 2 timer og filtreres, og filterkagen ekstraheres endnu en gang med acetone. De således opnåede ekstrakter inddampes under vakuum til l/lO rumfang. Kulturfiltratets pH indstilles på 6,8, filtratet ekstraheres to gange med l/3 rumfang ethylacetat, og ethylacetat-ekstrakteme inddampes under vakuum til l/lO rumfang.

20 g af det vundne olieagtige stof blandes med 20 g kiselsyre (Mal-linckredt Chem. Oo.), blandingen hældes på en 40 em lang og 4,5 cm tyk søjle fyldt med kiselsyre, og der elueres med benzen-acetone-methanol-blandinger. Den med en 1:1:O-blanding eluerede, første fraktion bortkastes, medens de med 1:3:0- og 1:3:0,3-biandinger eluerede fraktioner, der indeholder virksomt stof, opsamles og inddampes under vakuum til tørhed. Derefter opløses 11,5 g af det opnåede rå stof i lidt ethylacetat, og opløsningen hældes på sapune kiselsyresøjle som ovenfor. De først med 1:1- og l:2-benzen-acetone-blandinger eluerede fraktioner bortkastes, og derefter elueres med 1:3- og 1:5-benzem-acetone-blandinger og 1:5:0,5- Og 1:5:l-benzen-acetone-meth$nol-blandinger fraktioner indeholdende henholdsvis aclacinomycin B og aclacinomycin A. Eluateme tørres over vandfrit natriumsulfat Og inddata*· pes under vakuum til tørhed. Som gult pulver fås henholdsvis 4,8 g råt aclacinomycin A og 3,5 g aclacinomycin B.

2.0 g af det opnåede rå aclacinomycin B blandeå med 3 g kisel^syre, blandingen hældes på en 15 cm lang og 2 cm tyk søjle fyldt med 25 g kiselsyre, og en aclacinomycin B-holdig fraktion elueres med chloroform indeholdende 1% methanol og inddampes under vakuum til lille rumfang.

Ved tilsætning af lidt n-hexan fås 40 mg aclacinomycin B som gult pulver fra den koncentrerede opløsning.

2.0 g af det opnåede rå aclacinomycin A opløses i lidt chloroform, og blandingen hældes på en 20 cm lang og 2,0 cm tyk søjle fyldt med 30 g kiselsyre. Efter at pigmenterne indeholdende aglycon og aclacinomycin B samt andre urenheder er bortelueret med chloroform og 1,5%' s methanolisk chloroform, elueres aclacinomycin A med 2%'s methanolisk chloroform, og fraktionen inddampes under vakuum til tørhed. Som gult pulver fås 53 mg aclacinomycin A.

141761 26

Det opnåede aclacinomycin. A og ac 1 acinomy cin B indeholder stadig små mængder af det i kulturvæsken under dyrkningen producerede cinerubin A og B. Det forurenede cinerubin A og B kan fjernes ved chelatering med forskellige metalioner.

250 mg af det . opnåede rå-pulver af aclacinomycin A opløses i 20 ml chloroform, og der tilsættes 20 ml 1%'s CuSO^-opløsning. Efter stærk omrystning og henstand i en time sættes 10“^ mol ED1A-op løsning (ethylendiamintetraeddikesyreopløsning) til den fra vandfasen separerede ehloroformfase, og blandingen omrystes kraftigt i 1 minut, hvorefter ehloroformfasen fraskilles og vaskes to gange med vand under omrystning. Chloroformekstrakten tørres over vandfrit natriumsulfat og inddampes under vakuum, hvorefter der ved tilsætning af lidt n-hexan udfældes 120 mg rent aclacinomycin A.

3OO mg af. det opnåede aclacinomycin B opløses i 10 ml methylcello-solve, og der tilsættes 1 ml CuSO^-opløsning indeholdgide 100 mg CuSO^. Efter.henstand i 16 timer udcentrifugeres lidt udfældning; den foroven stående -væske inddampes under vakuum til det halve rumfang, og koncentratet kromatograferes under anvendelse af en 100 cm lang og 4 cm tyk søjle fyldt med "Sephade^5LH20" i methanol. De først eluerede fraktioner med urenheder og det let blåligrøde cinerubin B Co-kompleks bortkastes, medens de senere gule fraktioner opsamles, tilsættes 10“^ mol EDTA-opløsning og inddampes under vakuum til 1/3 rumfang. Era dette koncentrat ekstraheres aclacinomycin B med chloroform, og chloroformekstrakten inddampes under vakuum til tørhed. Der fås 128 mg rent aclacinomycin B.

27 141761

Eksempel 2.

Der fremstilles et vandigt medium med følgende sammensætning: kartoffelstivelse 2 glucose 2

Sojabønnemel ("Meat") 2,5 kh2po4 0,1 k2hpo4 0,1 ·'

MgS04.7H20 0,1

NaCl 0,3

MnClg.4h20 0,0005

EeS04.7H20 0,0005 silicone 0,05 pH 7,2 50 ml af dette medium steriliseres i en 500. ml Erlenmeyerkolbe ved : 120°C i 15 minutter og podes med 1 ml frosset kulturvæske af Strep-tomyces galilaeus MA144-M1. Der inkuberes i 48 timer ved 30°C i et; - rotationsrysteapparat. 10 liter af samme medium i et 20 liters fer- : menteringskar af rustfrit stål podes antiseptisk med 200 ml af kulturen ovenfor. Efter inkubation ved 30°C i 18 timer under omrøring (300 rpm.) og beluftning (5 l/min. ) sættes 10 liter af kulturvæsken til 600 liter steriliseret medium af samme sammensætning som ovenfor i et 1000 liters kar af rustfrit stål, og der inkuberes ved 30°C i 48 timer under beluftning (200 l/min.) og omrøring (180 rpm.). pH-en af de opnåede 570 liter kulturvæske indstilles på 5,0 ved tilsætning af 250 ml 30$'s svovlsyre, blandet med adsorberende kiseljordsmateriale, og de således opnåede 53,5 kg kage suspenderes i 70 liter acetone, hvorefter suspensionen omrøres i tre timer og filtreres. Filterkagen ekstraheres endnu en gang med 85 liter acetone. Ekstrakterne inddampes under vakuum til 40 liter og sættes til 25 liter ethylace-tat. Ethylacetat-fasen fraskilles og inddampes under vakuum til 1 liter. Ved tilsætning af 1 liter n-hexan til koncentratet udfældes en rå aclacinomycin-blanding, der opsamles og vaskes to gange med. en 50:l-blanding af n-hexan og ethylacetat, hvorved fås 15,5 g orangegult pulver.

Claims (1)

1. 28 141781 Det rå pulver opløses i 200 ml ethylacetat, opløsningen hældes på en 35 cm lang og 7 cm tyk søjle fyldt med 700 g ,,Column-L·lte,,, og der elueres med en 1:1-blanding af ethylacetat og methanol. De gule, acla-cinomycin A-holdige fraktioner inddampes under vakuum til tørhed. 12,4 g råt aelacinomycin A opløses i 100 ml chloroform, og der tilsættes 50 ml ΙΟ*’3 mol EDTA i 0,01 mol phosphatpuffer (pH 6,8). Efter kraftig omrystning til fjernelse af resterende metalioner vaskes chloroformfasen to gange under omrystning med vand, tørres over vandfrit natriumsulfat og inddampes under vakuum til tørhed. Som gult pulver fås 11,1 g aelacinomycin A. "Sephadex LH-20" er et lyofilt, uopløseligt kromatografisk molekularsi-medium, der er fremstillet ved tværbinding af dextran og forhandles af Pharmacia, Sverige, Det i eksemplerne anvendte "Sephadex LH-20" kan erstattes af andre lignende gel-filtreringsmidler, f.eks. "Sephadex 025" til "Sephadex 0200", "Sepharose 4A" og "-4B" (Pharmacia Pine Chemicals AB, Sverige), og "Bio-Gel Al.5" (Bio Rad Co.). Foretrukne gelfiltreringsmidler indbefatter de i spalte 3 og 4 i USA-patent nr. 3.819.836 beskrevne carboxymethylsubstituerede, tværbundne dextrangeler. PATENTKRAV. Fremgangsmåde til fremstilling af antibiotika aelacinomycin A og/eller B med den almene formel 0 cooch3 1. ch2ch3 OH 0 OH H 0 R hvori R betyder