DE2532568A1

DE2532568A1 - Aclacinomycine a und b und verfahren zu ihrer herstellung

Info

Publication number: DE2532568A1
Application number: DE19752532568
Authority: DE
Inventors: Masa Hamada; Toshikazu Oki; Akira Takamatsu; Tomio Takeuchi; Hamao Umezawa
Original assignee: Microbial Chemistry Research Foundation
Current assignee: Microbial Chemistry Research Foundation
Priority date: 1974-07-27
Filing date: 1975-07-21
Publication date: 1976-02-12
Also published as: NO144064B; DK317075A; DE2532568C3; ES439747A1; SE7508450L; IE42751B1; JPS5134915B2; CA1055866A; HU172209B; ZA754555B; FR2279413A1; NL7508878A; LU73063A1; YU188475A; YU37188B; DE2532568B2; FI752142A; NO144064C; DK141761B; BE831726A

Description

Die Erfindung betrifft neue Anthracyclin-Antitumor-Antibiotika sowie ihre Herstellung. Insbesondere befasst sich die Erfindung mit neuen Antitumor-Antibiotika, die als Aclacinomycin A und B bezeichnet werden, sowie mit Verfahren zu ihrer Herstellung durch Gärung eines Stammes Streptomyces galilaeus (beispielsweise MA 144-M1), mit Methoden für ihre Gewinnung und Reinigung sowie mit ihrer Anwendung als chemotherapeutische Mittel zur Bekämpfung von Krebs.

Eine Vielzahl von Anthracyclinglykosiden ist in den Kulturbrühen von Streptomyces gefunden worden. Von diesen Verbindungen werden Daunomycin und Adriamycin besonders im Hinblick auf eine Krebschemotherapie beobachtet und sind auch schon klinisch zur Bekämpfung von Krebs beim Menschen eingesetzt worden. Erfindungsgemäss wurden neue Antitumor-Antibiotika gefunden. Nach einer Charak-

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terisierung und Reinigung wurden sie unter Berücksichtigung ihrer physikalisch-chemischen Eigenschaften als Aclacinomycine A und B bezeichnet. Es handelt sich um neue Verbindungen, die eine geringe Kardiotoxizität und eine wirksame Antxtumoraktivität gegenüber verschiedenen Tiertumoren aufweisen. Ferner werden durch die Erfindung Verfahren und Methoden zur Herstellung und Isolation dieser Verbindungen zur Verfügung gestellt.

In der US-PS 3 590 028 wird Adriamycin (B-106FI; 14-Hydroxydaunomycin; INN: Doxorubicin) beschrieben und als Substanz beansprucht. Ferner wird die direkte Gärung durch S. peuceticus var. caesius angegeben. In der US-PS 3 803 124 wird die chemische Umwandlung von Daunomycin in Adriamycin beschrieben. Bezüglich der direkten Gärung von Daunomycin (als Antibiotikum FI 1762) durch S. peuceticus sei auf die GB-PS 1 003 383 hingewiesen.

Das Daunomycin gemäss der GB-PS 1 003 383 ist vermutlich das gleiche wie die Verbindung 13057 R.P. von Rhone-Poulenc (früher als Rubidomycin und nunmehr als Daunoribicin (vgl. die GB-PS 985 598, 1188 262 und 1 241 750 sowie die US-PS 3 616 242) bezeichnet. Wahrscheinlich ist diese Verbindung mit dem Danubomycin von Ciba identisch (vgl. die US-PS 3 092 550 sowie die GB-PS 901 830). Ferner ist auf die US-PS 3 686 163 hinzuweisen, in der Dihydrodaunomycin beschrieben wird.

Cinerubin A und Cinerubin B werden in der GB-PS 846 130 beschrieben. Hinzuweisen ist in diesem- Zusammenhang auch auf die US-PS 3 864 480 sowie auf "Keller-Schierlein et al. Antimicrobial Agents and Chemotherapy", Seite 68 (1970) sowie "Chemical Abstracts", 54, 1466i (1960).

Im "Index of Antibiotics from Actinomycetes", Hamao Umezawa, University Park Press, State College, Pennsylvania, USA (1967)

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sind die Anthracyclinantibiotika auf den folgenden Seiten aufgeführt:

Antibiotikum Seitenzahl

Aklavin 111

Cinerubin A 220

Cinerubin B 221

Danubomyc in 242

Daunomycin 243

Pyrromycin 542

Rhodomycin A, B 561

Rubidomycin 574

In "Antibiotics", Band 1, Mechanism of Action, herausgegeben von David Gottlieb und Paul D. Shaw, Springer-Verlag New York, Inc., N.Y., N.Y. (1967) findet sich auf den Seiten 190 bis 210 eine Arbeit von A. DiMarco, die mit "Daunomycin und verwandte Antibiotika" betitelt ist.

In "Information Bulletin", Nr. 10, International Center of Information of Antibiotics werden in Zusammenarbeit mit WHO, Dezember 1972, Belgien, Anthracycline sowie ihre Derivate behandelt.

In "Arch, für Mikrobiol.", 31, 356 (1958) sowie "International Journal of Systematic Bacteriology", 22, 298 (1972) wird Streptomyces galilaeus beschrieben.

Weiter unten wird bezüglich der Galirubine auf K. Eckardt et al hingewiesen (vgl. Chemical Abstracts, 64, 3896g und 67, 90573z.

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Durch die Erfindung werden die Antitumormittel Aclacinomycin A und B zur Verfügung gestellt. Diese Substanzen werden durch Züchten eines Aclacinomycin-erzeugenden Stammes von Streptomyces galilaeus in einer wässrigen Kohlehydratlösung, die organische stickstoffhaltige Nährmittel enthält, unter aeroben Submersbedingungen solange erzeugt, bis eine erhebliche Menge an Aclacinomycin A und B in der Lösung gebildet worden ist. Aclacinomycin A und B können aus den auf diese Weise erhaltenen Kulturbrühen extrahiert und nach herkömmlichen Methoden gereinigt werden, wie sie für die Extraktion und Reinigung von wasserunlöslichen Antibiotika angewendet werden. Die Erfindung betrifft ferner AcIamycin A und B in Form von rohen Feststoffen, in Form von gereinigten Feststoffen, in Form ihrer Salze sowie als DNA-Komplexe.

Durch die Erfindung wird das Antitumorantibiotikum Aclacinomycin A geschaffen, welches

a) in wirksamer Weise das Wachstum von Asziten und festen Formen von Ehrlich-Karzinomen, Sarcoma 180, Lymphoma 6C3HED sowie Leukemia L1210 und P388 in Mäusen, Hepatomas in Ratten und Vaccina-virus in HeLa-Zellen zu inhibieren vermag,

b) dazu in der Lage ist, das Wachsen von verschiedenen grarapositiven Bakterien und Hefen zu verhindern,

c) in Form eines gelben mikrokristallinen Pulvers isoliert werden kann,

d) in organischen Lösungsmitteln, wie Methanol, Chloroform, Äthanol, Äthylacetat, Azeton sowie Benzol löslich, etwas löslich in Wasser, jedoch, unlöslich in Äther, Hexan und Petroläther ist,

e) einen Schmelzpunkt von 129 bis 135°C besitzt und optisch aktiv ist [V| ^⁴ « +29⁰C (C: 1,0, CHCl₃),

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f) UV-Maxima und Maxima im sichtbaren Bereich besitzt, wie sie aus der beigefügten Fig. 1 hervorgehen,

g) charakteristische Maxima in dem IR-Absorptionsspektrum gemäss Fig. 2 aufweist,

h) bei einer Säurehydrolyse Rhodosamin, 2-Desoxyfukose, Cinerulose A, 1-Desoxypyrromycin und Aklavinon liefert und

i) ein schwach basisches Anthracyclinglykosxd der empirischen Formel ^C42^H5

Ferner wird durch die Erfindung das Antitumorantibiotikum Aclacinomycin B geschaffen, das

a) in wirksamer Weise das Wachstum von Leukemia L1210 und P388 in Mäusen sowie Vaccinia-Virus in HeLa-Zellen zu hemmen vermag,

b) in wirksamer Weise das Wachstum von grampositiven Bakterien und Hefen hemmt,

c) in Form eines gelben mikrokri stallinen Pulvers isoliert werden kann,

d) in Methanol, Äthylacetat, Chloroform, Äthanol, Azeton und Benzol löslich und etwas löslich in Wasser, jedoch unlöslich in Äther, Cyclohexan, Hexan und Petroläther ist,

e) einen Schmelzpunkt von 135 bis 145°C besitzt und optisch aktiv ist [oo] Q⁴ = +3⁰C (C: 1,Q, CHCl₃),

f) ÜV-Absorptionsmaxima und Maxima im sichtbaren Bereich gemäss Fig. 4 aufweist,

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g) charakteristische Maxima in dem IR-Infrarotspektrum gemäss Fig. 5 besitzt,

h) Aklavinon, Rhodosamin, 2-Desoxyfukose, 1-Desoxypyrromycin und das gleiche methylierte Disaccharid wie Cinerubin B bei einer Säurehydrolyse oder bei einer partiellen Hydrolyse in Methanol liefert und

i) ein schwach basisches Anthracyclinglykosid der empirischen Formel ^C ₄2^H52^NO15 ^ist·

Durch die Erfindung wird ferner ein Verfahren zur Herstellung der Antitumorantibiotika-Aclacinomycine A und B geschaffen, welches darin besteht, einen Aclacinomycin-erzeugenden Stamm von Streptomyces galilaeus (ATCC Nr. 31133) unter aeroben Submersbedingungen in einem Nährmedium zu züchten, das Kohlenstoff quellen sowie stickstoffhaltige Nährmittel enthält, bis eine erhebliche Menge an Aclacinomycin A und B durch den Organismus in dem Nährmedium erzeugt worden ist, wobei das Züchten vorzugsweise in einem Nährmedium bei einer Temperatur zwischen 20 und 35⁰C oder in noch zweckmässigerer Weise bei einer Temperatur zwischen 25 und 30⁰C durchgeführt wird und der pH-Wert 5 bis 8 beträgt, worauf gegebenenfalls die AcIacinomycine aus dem Kulturmedium nach einem Verfahren gewonnen werden, welches beispielsweise aus einer Lösungsmittelextraktion, einer Lösungsmittelausfällung, einer Konzentrierung, einer Gelfiltration, einer Gegenstromverteilung, einer Chelierung unter Verwendung von Metallionen und/oder einer Adsorption besteht, worauf sich eine Eluierung von einem Anionenaustauscherharz, einem adsorbierend wirkenden kieselsäurehaltigen Material oder einem synthetischen Adsorbens anschliesst.

Erfindungsgemäss ist auch ein Verfahren vorgesehen, bei dessen Durchführung die Lösung, welche die Aclacinomycine enthält, gefriergetrocknet wird, sowie ein Verfahren, bei dessen Durchführung die

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Lösung, welche die Aclacinomycine enthält, nach der Zugabe wenigstens einer Substanz gefriergetrocknet wird, die aus der Gruppe ausgewählt wird, welche aus Desoxyribonukleinsäure, Glyzerin, Zuckern, Aminosäuren, anorganischen oder organischen Säuren besteht .

Die Fig. 1 zeigt das UV-Absorptionsspektrum, von Aclacinomycin A, wobei A dasjenige in Methanol, B dasjenige in 0,1η HCl/Methanol und C dasjenige in 0,1η NaOH/Methanol wiedergibt.

Fig. 2 zeigt das Infrarotabsorptionsspektrum von Aclacinomycin A, wenn es in Kaliumbromid pelletisiert ist.

Fig. 3 ist das NMR-Spektrum von Aclacinomycin A in CDCl- (100 MHz, innerer Standard: TMS).

Fig. 4 ist ein UV-Absorptionsspektrum von Aclacinomycin B, wobei A dasjenige in Methanol, B dasjenige in 0,1η HCl/Methanol und C dasjenige in 0,1η NaOH/Methanol wiedergibt.

Fig. 5 zeigt das IR-Absorptionsspektrum von Aclacinomycin B, welches in Kaliumbromid pelletisiert ist.

Fig. 6 ist das NMR-Spektrum von Aclacinomycin B in CDCl-, (100 MHz, innerer Standard: TMS).

Aclacinomycin A und B verlängern merklich die Lebensdauer und verbessern den Zustand von Mäusen, die mit Leukemia L1210- und P388- sowie Lymphoma 6C3HED-Zellen beimpft worden sind. Die letale Dosis (LD₅-.) im Falle von Ratten, Mäusen und Kaninchen ist sehr hoch. Im Falle von Hamstern wird eine geringe Kardiotoxizität festgestellt. Insbesondere bewirken die Substanzen eine merkliche inhibierende Wirkung auf das Wachstum von verschiedenen Tumorzellen in einer Kultur, welche von einer spezifi-

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sehen Inhibierung auf eine RNA-Synthese resultiert, wobei ferner eine starke antimikrobiell Aktivität gegenüber Bakterien und Hefen festgestellt wird.

Aclacinomycin A und B werden als gelbe mikrokristalline Pulver erhalten, welche die empirischen Formeln ^C42^H54°i5^N ^^zw· C₄₀Hc₀O₁ c-N besitzen. Aklavinon, Rhodosamin, 2-Desoxyfukose, 1-Desoxypyrromycin und Cinerulose A werden aus Aclacinomycin A und Aklavinon, Rhodosamin, 2-Desoxyfukose, 1-Desoxypyrromycin sowie das gleiche methylierte Disaccharid wie Cinerubin B aus Aclacinomycin B bei einer Säurehydrolyse oder einer partiellen Hydrolyse in Methanol erhalten. Die Verbindungen sind in Methanol, Äthanol, Chloroform, Azeton, Äthylacetat, Benzol oder dergleichen löslich und etwas in Wasser löslich, jedoch unlöslich in Hexan, Cyclohexan, Äther und Petroläther. Sie zeigen charakteristische Adsorptionsmaxima in dem UV-Bereich, wenn sie mit Kaliumbromid pelletisiert werden, sowie im UV-Licht und im sichtbaren Licht, wie aus den Fig. ^,2,4 und 5 hervorgeht. Die NMR-Absorptionsspektren sind im wesentlichen diejenigen, wie sie aus den Fig. und 6 ersichtlich sind. Die Verbindungen zeigen eine spezifische Drehung in Chloroform, sowie einen Schmelzpunkt von +29° bzw. 129 bis 135°C (Aclacinomycin A) und + 3° bzw. 135 bis 145°C (Aclacinomycin B).

Durch die Erfindung wird ferner ein Verfahren zur Herstellung der Antitumorantibiotika Aclacinomycin A und B geschaffen, welches darin besteht, einen Stamm von Streptomyces galilaeus in einem wässrigen Medium, das Kohlenstoffquellen sowie Stickstoffquellen enthält, unter aeroben Bedingungen solange zu züchten, bis eine erhebliche Menge an Aclacinomycinen in der Lösung angereichert worden ist und dann die Aclacinomycine aus der Lösung zu gewinnen, wobei Adsorptionen an Ionenaustauschern, adsorbierend wirkenden Kieselerdematerialien sowie synthetischen Adsor-

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bentien, Lösungsmittelextraktionen, Lösungsmittelausfällungen, Gegenstromverteilungen etc. oder Kombinationen derartiger Methoden angewendet werden.

Es ist eine Anzahl von Anthracyclinglykosid-Antibiotika bekannt, beispielsweise Adriamycin, Daunomycin, Carminomycin, Rhodomycin, Pyrromycin, Aklavin etc. Die nach dem erfindungsgemässen Verfahren hergestellten Aclacinomycine unterscheiden sich deutlich von den bekannten bezüglich der Molekülformel, der Zersetzungsprodukte bei der Säurehydrolyse, der Spektren im UV, im sichtbaren Bereich sowie der NMR-Absorptionsspektren oder dergleichen, wie vorstehend angegeben worden ist. Darüber hinaus sind ihre hohe Antitumoraktivität sowie ihre merkliche geringe Kardiotoxizität Eigenschaften, welche bei den anderen Anthracyclinglykosid-Antitumorantibiotika nicht festgestellt werden.

Der Organismus, welcher die Antibiotika-AclacinomycineA und B gemäss vorliegender Erfindung erzeugt, wurde aus einer Erdenprobe isoliert, die bei Osaki, Shinagawa-ku, Tokio, Japan gesammelt wurde. Eine Kultur von MA144-M1 wurde bei der American Type Culture Collection, Rockwille, Maryland sowie bei dem Fermentation Research Institute _tin Japan hinterlegt und deren ständigen Sammlungen von Mikroorganismen als ATCC Nr. 31133 bzw. PERM NR. 2455 angefügt.

Der Stamm Nr. MA144-M1 besitzt folgende Eigenschaften: 1) Morphologische Eigenschaften:

Unter dem Mikroskop werden offene Spiralen beobachtet, die sich gut aus verzweigten Substratmyzeln entwickeln. Es werden keine Windungen festgestellt. Die reife Sporenkette ist massig lang und weist mehr als 10 Sporen auf. Die Sporen sind ellipsoid und messen 0,4 bis 0,8 μ χ 0,8 bis 1,6 μ. Die Oberfläche ist glatt.

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2) Eigenschaften auf verschiedenen Medien:

Die Angaben in den Klammern entsprechen dem "Color Harmony Manual", veröffentlicht von der Container Corporation of America, USA.

a) Auf Glukose/Asparagin-Agar, inkubiert bei 27⁰C: leicht gelblich-braunes Wachstum (3gc, Lt.Tan), keine Luftmyzel, kein lösliches Pigment.

b) Auf einem Rohrzucker/Asparagin-Agar, inkubiert bei 27⁰C: farbloses oder leicht gelblich-braunes Wachstum (3gc, Lt.Tan), keine Luftmyzel, kein lösliches Pigment.

c) Auf einem Glyzerin/Asparagin-Agar (ISP-Medium Nr. 5), inkubiert bei 27°C: gelblich-oranges (4ic, SUntan) bis braunes (51 g, Cocoa Brown) Wachstum, weisse bis hellgraue (2fe, Covert Gray) Luftmyzel, braunes lösliches Pigment.

d) Auf einem Stärke/anorganische Salze-Agar (ISP-Medium Nr. 4), inkubiert bei 27⁰C: helloranges (3ea, Lt. Melon Yellow) bis hellgelblich-braunes (3ie, Camel) Wachstum, leicht graue (2fe, Covert Gray) bis graue (e, Gray) Luftmyzel, braunes lösliches Pigment.

e) Auf einem Tyrosin-Agar (ISP-Medium Nr. 7), inkubiert bei 27⁰C: bräunlich-graue (31i, Beaver) bis braune (41g, Toast Tan) Luftmyzel, schwarzes lösliches Pigment.

f) Auf einem Nährmittelagar, inkubiert bei 27°C: farbloses bis gräulich-braunes Wachstum, keine Luftmyzel, braunes lösliches Pigment.

g) Auf einem Hefeextrakt/Malzextrakt-Agar (ISP Nr. 2), inkubiert bei 27°C: leicht braunes (41e, Maple) bis braunes (4ng, Lt. Brown) Wachstum, leicht graue (3fe, Silver Gray) bis graue

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(3ih, Beige Gray) Luftmyzel, braunes lösliches Pigment.

h) Auf einem Hafermehlagar (ISP-Medium Nr. 2), inkubiert bei 27⁰C: farbloses bis hell gelblich-braunes (2gc, Bamboo) Wachstum, hellgraue (3fe, Silver Gray) Luftmyzel, braunes lösliches Pigment.

i) Auf einem Glyzerin/Nitrat-Agar, inkubiert bei 27⁰C: farbloses bis hell gelblich-braunes (3gc, Lt. Tan) oder leicht olivgraues (2db, Parchment) Wachstum, keine Luftmyzel, kein lösliches Pigment.

j) Auf einem Stärkeagar, inkubiert bei 27°C: hell gelblich-braunes (3gc, Lt. Tan) Wachstum, graue (e, Gray) Luftmyzel, leicht braunes lösliches Pigment.

k) Auf einem Kalzium/Malat-Agar, inkubiert bei 27⁰C: farbloses Wachstum, gräulich-weisse (b, Oyster-Weiss) bis leicht bräunlichgraue (3dc, Natural) Luftmyzel, kein lösliches Pigment.

1) Auf einem Gelatineansatz, inkubiert bei 20⁰C: hellbraunes bis hell gelblich-braunes Wachstum, weisse Luftmyzel, braunes lösliches Pigment.

m) Auf einem Glukose/Pepton/Gelatine-Ansatz, inkubiert bei 27⁰C: hellbraunes bis braunes Wachstum, keine Luftmyzel, braunes

lösliches Pigment.

n) Auf Magermilch, inkubiert bei 37°C: hellbraunes bis braunes Wachstum, keine Luftmyzel, braunes lösliches Pigment.

3) Physiologische Eigenschaften:

a) Die Wachstumstemperatur wird an einem Maltose/Hefeextrakt-Agar untersucht (1,0 % Maltose, 0,4 % Hefeextrakt, 3,5 % Agar,

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pH 6,0), und zwar bei 20, 24, 27, 30, 37 und 50⁰C. Die optimale Temperatur für das Wachstum beträgt 27 bis 37⁰C. Bei 50⁰C erfolgt kein Wachstum.

b) Gelatineverflüssigung auf einem 15 %igen Gelatineansatz bei 20⁰C und einem Glukose/Pepton/Gelatine-Ansatz bei 27⁰C: Auf dem ersteren Medium wird eine Gelatineverflüssigung nach einer 14-tätigen Inkubation kaum festgestellt, während auf dem letzteren Medium eine schwache oder massige Verflüssigung nach einer 7-tägigen Inkubation zu erkennen ist.

c) Stärkehydrolyse auf einem Stärke/anorganische Salze-Agar bei 27⁰C: Es wird eine schwache Hydrolyse nach einer 5-tägigen Inkubation festgestellt.

d) Peptonisierung und Gerinnung von Magermilch bei 37⁰C: Eine massige bis starke Peptonisierung beginnt 5 Tage nach der Inkubation und ist nach etwa 17 Tagen beendet. Keine Gerinnung.

e) Melaminbildung auf einem Tyrosinagar (ISP-Medium Nr. 7), auf einer Tyrosin/Hefeextrakt-Brühe (ISP-Medium Nr. 1) und einem Pepton/Hefeextrakt/Eisenagar (ISP-Medium Nr. 6) bei 27⁰C: positiv auf allen Medien.

f) Verflüssigung von Kalziummalat auf einem Kalziummalatagar bei 27⁰C: stark positiv.

g) Nitratreduktion auf einem Peptonagar, das 1,0 % Natriumnitrat enthält (ISP-Medium Nr. 8) bei 27⁰C: positiv.

h) Verwendung von Kohlehydraten von Pridham-Gottlieb-Grundmedium (ISP-Medium Nr. 9), inkubiert bei 27°C: Reichliches Wachstum mit L-Arabinose, D-Xylose, Glukose, D-Fruktose, Rohrzucker, Inosit,

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L-Rhamnose und Raffinose, kein Wachstum mit D-Mannit.

Fasst man die vorstehenden Eigenschaften des Stamms Nr. MA144-M1 zusammen, so ist festzustellen, dass der Stamm zu dem Genus Streptomyces (chromogener Typ) gehört, wobei braune lösliche Pigmente auf verschiedenen Agarmedien erzeugt werden. Luftmyzel bilden offene Spiralen, jedoch keine Windungen. Die Sporenoberfläche ist glatt. Das Wachstum auf verschiedenen Medien ist im allgemeinen hellgelblich-braun bis braun, bei einigen Medien oliv. Die Luftmyzel sind leicht grau. Nitrat wird zu Nitrit reduziert. Die proteolytische Wirkung ist schwach bis massig, die Stärkehydrolyse ist relativ schwach. Melamin wird auf Tyrosinagar, Tyrosin/Hefeextrakt-Brühe sowie Pepton/Hefeextrakt/Eisen-Agar erzeugt.

Von den bekannten Spezies von Streptomyces ähnelt der Stamm Nr. MA 144-M1 Streptomyces galilaeus (Hinweis 1: Archiv für Mikrobiologie, 31, 356, 1958, Hinweis 2: International Journal of Systematic Bacteriology, 22, 298, 1972). Unter besonderer Berücksichtigung der Differentierung auf der Grundlage der Morphologie, der Farbe der Luftmyzel sowie anderer physiologischer Eigenschaften lassen sich folgende Unterschiede zwischen dem erfindungsgemässen Stamm und dem Stamm von S. galilaeus ISP 5481 anhand von parallelen Kulturen feststellen:

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	Sporenoberfläche	MA 144-M1	Streptomyces	Hinweis	glatt	braun-leicht oliv	positiv	hellbraun	Hinweis	glatt
	Sporenkette		galilaeus	1	Spiralen	grau	positiv		2	Spiralen
	.Luftmyzel		ISP 5481		gräulich-weiss	braun	schwach	positiv		grau
		glatt	glatt	bis grau			positiv
	Wachstum	offene Spiralen	Spiralen	hellgelb bis	positiv			gräulich-gelb-
		leicht grau	leicht grau	tief rubinrot	positiv wahrscheinlich positiv	schwach	positiv	gelblich-braun
					schwach bis	schwach	oliv
		hell gelblich	hell gelblich	positiv	massig
	Lösliches Pigment	braun bis braun,	braun-gräulich-	schwach		schwach	hellgelb
	Mela^minbildung:	manchmal leicht
	ISP-Medium Nr. 1	oliv			positiv
	ISP-Medium Nr. 6	braun	schwach		positiv
			schwach bis
fts	ISP-Medium Nr. 7	positiv	massig	positiv
φ	Stärkehydrolyse	*
do	Verflüssigung von
-4	Gelatine:	*
-ν.	Gelatineansatz
-*	Glukose/Pepton-
CO	Gelatineansatz

I >J

* keine Werte

on ο to

Peptisierung von Milch

Gerinnung von Milch Nitratreduktion

Verbrauch von Kohlehydraten:

L-Arabinose

D-XyIose

Glukose

D-Fruktose

Rohrzucker

Inosit

L-Rhamnose

Raffinose

D-Mannit

* keine Werte

MA144-M1	Streptomyces	Hinweis	negativ
	galilaeus	1
	ISP 5481		schwach
massig bis	massig	* *
stark
negativ	negativ
positiv	positiv
positiv	positiv
positiv	positiv
positiv	positiv
positiv	positiv
positiv	positiv
positiv	positiv
positiv	positiv
positiv	positiv
negativ	negativ

Hinweis 2

positiv positiv positiv positiv positiv positiv positiv positiv negativ

ro

cn

OJ

ro cn

CO

Aus den vorstehenden Ergebnissen ist zu ersehen, dass der erfindungsgemässe Stamm bezüglich Morphologie und Farbe des Wachstums sowie der Myzeln auf verschiedenen Medien sowie der physiologischen Eigenschaften sehr ähnlich S. galilaeus ISP 5481 ist. Ferner existiert eine Ähnlichkeit beider Stämme bezüglich der Gärungsprodukte. Cinerubin, welches von S. galilaeus erzeugt werden kann, ist eines der Nebenprodukte des erfindungsgemässen Stammes. Daher kann der Stamm Nr. MA144-M1 als Streptomyces galilaeus identifiziert werden.

Da die Streptomyces leicht mutierbar sind, und zwar natürlich oder künstlich, umfasst der erfindungsgemässe Stamm S. galilaeus Nr. MA144-M1 erfindungsgemäss den vorstehend beschriebenen typischen Stamm sowie alle natürlichen und künstlichen Varianten und Mutanten davon. Dies bedeutet, dass S. galilaeus Nr. MA144-M1 gemäss vorliegender Erfindung alle Aclacinomycin-erzeugenden Stämme umfasst. Wie im Falle der bekannten Antibiotika kann eine grössere Produktion des Aclacinomycins durch die Auswahl höherproduktiver Stämme nach einer einzigen Kolonieauswahl durch Behandlung eines Aclacinomycin-erzeugenden Stamms mit verschiedenen Mutagenen oder durch genetische Rekombinations-, Umwandlungsoder Überführungsmethoden erzielt werden.

Aclacinomycine werden durch das Züchten von S. galilaeus unter geeigneten Bedingungen erzeugt. Die zum Züchten von anderen Actinomycetes angewendeten allgemeinen Methoden sind auf das Züchten von S. galilaeus anwendbar. Eine Gärbrühe, welche Aclacinomycin enthält, wird durch Aufimpfen von Sporen oder Myzeln des Aclacinomycin-erzeugenden Organismus auf ein geeignetes Medium und anschliessendes Züchten unter aeroben Bedingungen hergestellt. Wenn auch ein Züchten auf einem festen Medium zur Erzeugung von Aclacinomycin möglich ist, so ist dennoch eine aerobe Submerskultur besonders vorteilhaft zur Herstellung von grossen Mengen der Antibiotika. Medien, die aus den bekannten Nährmittelquellen

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für Actinomycetes bestehen, sind geeignet. Das Medium enthält vorzugsweise im Handel erhältliche Produkte, wie Glyzerin, Glukose, Stärke, Dextrin, Maltose, Melassen, öle, Fette, Lipide oder dergleichen als Kohlenstoffquellen entweder in gereinigter oder in roher Form sowie als Stickstoffquellen die im Handel erhältlichen Produkte, wie Sojabohnenmehl, Malzextrakt, Pepton, Hefeextrakt, Distillers Solubles, Fischmehl, Glutenmehl, Maiswasser, Baumwollsamenmehl, Kasein, hydrolysierte Proteinsubstanzen, Nitrate, Ammoniumsalze, Harnstoff oder dergleichen, ferner anorganische Salze, wie Natriumchlorid, Kaliumchlorid, Kaliumphosphat, Magnesiumsulfat, Kaliumcarbonat sowie Spurenmengen an Schwermetallsalzen, wie Kupfer-, Zink-, Mangan-, Eisen- oder ähnlichen Salzen. In der belüfteten Submerskultur wird ein Antischaummittel, wie beispielsweise flüssiges Paraffin, Sojabohnenöl, ein Fett oder ein Silikon verwendet. Jede Gärungstemperatur innerhalb eines Bereiches von 20 bis 35⁰C, bei welcher ein Aclacinomycin-erzeugender Organismus wachsen kann, kann eingehalten werden, wobei jedoch der bevorzugteste Temperaturbereich zwischen 25 und 30⁰C liegt. Der pH-Wert des Züchtungsmediums schwankt zwischen 5,0 und 8,0.

Sofern nichts anderes angegeben ist, werden, das Züchten sowie die Untersuchungen wie folgt durchgeführt:

1) Schüttelkultur: 100 ml des Mediums in einem Sakaguchi-Kolben oder 50 ml des Mediums in einem Erlenmeyer-Kolben mit einem Fassungsvermögen von 500 ml werden bei 120⁰C während einer Zeitspanne von 15 Minuten sterilisiert. Sporen oder Myzeln eines Aclacinomycin-erzeugenden Organismus werden auf das sterilisierte Medium von einer Agarschrägkultur mittels einer Platinschlaufe aufgeimpft, worauf bei 28⁰C während einer Zeitspanne von 4 Tagen auf einem sich hin- und herbewegenden oder sich drehenden Schüttler gezüchtet wird.

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2) Tankkultur: 1OO 1 des Mediums werden in einem 200 1-Gärungsgefäss hergestellt und bei 120⁰C während einer Zeitspanne von 15 Minuten sterilisiert. Das sterilisierte Medium wird mit 2 einer Kulturbrühe beimpft, die zuvor durch Schütteln während einer Zeitspanne von 2 Tagen gezüchtet worden ist. Die Gärung in dem Tank erfolgt unter Belüften mit 50 ml einer sterilen Luft pro Minute sowie unter Rühren mit 160 üpm während einer Zeitspanne von 2 Tagen. Silikonöl sowie flüssiges Paraffin werden als Entschäumer eingesetzt.

3) Untersuchung auf Aclacinomycin: Dünnschichtchromatographie-Farbtastmethode. Die aus der Kulturbrühe, den Myzeln oder dem KuIturfiltrat durch Azeton, Äthylacetat oder durch eine Mischung aus Chloroform und Methanol extrahierten Aclacinomycine A und B werden auf eine Kieselgelplatte (Kieselgel 6OF₃₅₄, Merck Co.) in Form eines Fleckens mit einem Durchmesser von 5 mm aufgebracht. Nach einer 15 Minuten dauernden Sättigung in dem Entwicklungsgefäss wird die Dünnschichtchromatographieplatte in Azeton aufsteigend bis zu einer Höhe von 15 cm bei Zimmertemperatur entwickelt. Flecken, welche Aclacinomycin A und B entsprechen, werden durch die optische Dichte bei 430 nm unter Einsatz eines Shimadzu Dual-Wave length TLC-Scanner, Modell CS-900, unter bestimmten Bedingungen, einer Zig-Zag-Methode bei 430 nm-700nm, 1,25 χ 1,25 nm-Schlitz, 10 mm/Minute-Abtastund Kartengeschwxndigkext, bestimmt. Die Standardkurven von gereinigtem Aclacinomycin A und B werden zuvor erstellt und schwanken von 0,2 bis 15 mcg/Fleck.

Der Aclacinomycin-erzeugende Stamm wird zuerst in dem folgenden Medium durch Schütteln gezüchtet.

Das Grundmedium besteht aus 1 % Glukose, 1 % Kartoffelstärke, 1,5 % "Prorich" (Sojabohnenmehl, Produkt der Ajinomoto Co.),

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0,1 % KH₂PO₄, 0,1 % MgSO₄.7H₂O, 0,3 % NaCl, 0,0007 % CuSO₄.5H₂O, 0,0001 % FeSO₄.7H₂O, 0,0008 % MnCl₂.4H₂O und 0,0002 % ZnSO₄-SH₃O. Der pH-Wert wird auf 7,0 eingestellt.

In der Kulturbrühe wird nach dem 4. Tag eine Anreicherung von 45 mcg/ml Aclacinomycin A und 15 mcg/ml Aclacinomycin B festgestellt.

Aclacinomycine A und B werden in Medien, die verschiedene Kohlenstoff- und Stickstoffquellen enthalten, unter Schütteln hergestellt. Nachfolgend werden verschiedene Beispiele angegeben:

1) Verschiedene Kohlenstoffquellen werden dem Grundmedium zugesetzt, das aus 1,5 % "Prorich" sowie anderen Salzen, wie angegeben, besteht:

509887/1042

Zu dem angegebenen Zeitpunkt vorliegendes Aclacinomycin A

Tage 3 Tage - 4 Tage

pH meg/ml pH meg /ml pH meg/ml

27 7,4 38 8,0 41

15 6,0 28 7,0 32

32 7,7 39 8,2 40

35 7,4 28 7,9 33

36 7,6 33 8,1 42 '

32 7,7 34 8,3 43 ο

26 6,7 28 7,7 30

26 7,6 30 7,8 32

37 7,9 37 8,4 39

% Glukose + 1 % Glyzerin 4,9 36 6,3 36 8,1 41

	2 \	7,3
	2 ;	6,6
	2 \	7,3
cn	2 i	7,4
CD	2 '■	7,2
dB OD	1 i	6,3
■%*	1 \	7,4
O	1 ί	7,3
Jf* IO	1 5	7,1
6 Glukose
i Maltose
h Rohrzucker
i lösliche Stärke
i Kartoffelstärke
h Glukose + 1 % Kartoffel stärke
i Glukose + 1 % Maltose
h Glukose + 1 % Rohrzucker
i Glukose + 1 % lösliche Stärke

cn. co

2) Verschiedene Stickstoffquellen werden dem Grundmedium zugesetzt, das aus 1 % Glukose, 1 % Kartoffelstärke sowie anderen Salzen besteht:

Zu dem angegebenen Zeitpunkt vorliegendes Aclacinomycin A

1,5 %"Prorich" (Sojabohnenmehl,

Aj inomoto Co.)

1,5 % "Fleisch" (Sojabohnenmehl,

Aj inomoto Co.)

1,5% Malzextrakt

1,5% Hefeextrakt

1,5 % Kasaminosäure

1,5 % Rinderextrakt

1,5 % Polypepton

2	PH	Tage	3	pH	Tage	4	pH	Tage
6,3	mcg/ml	7,0	mcg/ml	8,0	mcg/ml
5,8	34	7,1	48	8,1	45
6,2	37	6,6	54	6,6	48
5,4	9	7,7	7	8,5	13
6,9	45	8,0	43	8,3	40
5,6	18	'.7,2	21	8,2	22
6,2	9	8,2	32	8,6	36
38	28	23

3) Werden die Konzentrationen der Kohlenstoff- und der Stickstoffquellen in dem Grundmedium variiert, dann werden Aclacinomycin A und B wie folgt angereichert:

Kohlenstoffquelle %

Glukose	*	"Prorich" 1,5 %	1	A	B	A	2	B	A	3
Kartoffelstärke	2,5 %	1	33	23	36	2	19	-	3
"Fleisch" 1,5 %	31	39	39		28	51
2,5 %	32	19	48		31	-
17	24	43		28	58

34 29 *Aclacinomycin A oder B: mcg/ml.

Die vorstehenden Ergebnisse stellen lediglich Beispiele dar. Kohlenstoff quellen, wie Glukose, Stärke, Maltose und Rohrzucker, eignen sich für die Herstellung von Aclacinomycin.Stickstoffquellen, wie Sojabohnenmehl, Hefeextrakt, Rinderextrakt und Pepton, sind ebenfalls geeignet.

Wird die Gärung bei 28⁰C unter Schütteln unter Einsatz eines geeigneten Mediums mit einem pH-Wert von 6,9 aus beispielsweise 2 % Glukose, 2 % Kartoffelstärke, 2,5 % "Fleisch", 0,1 % KH₃PO₄, 0,1 % MgSO₄.7H₂O, 0,0007 % CuSO₄.5H₂O, 0,0001 % FeSO₄^H₃O, 0,0008 % MnSO₄.4H₂O und 0,0002 % ZnSO₄-OH₂O durchgeführt, dann fällt der pH-Wert des Mediums in 20 Stunden auf 5,25 bis 5,10, wobei das Myzelwachstum 10 Stunden nach der Beimpfung zunimmt.

Nach 3 Tagen steigt der pH-Wert von 7,0 auf 7,5, wobei die Menge an Aclacinomycin A und B in der Brühe ein Maximum erreicht, d.h. 46 mcg/ml A und 23 mcg/ml B. Um das Aclacinomycin zu isolieren, kann das Antibiotikum mit einem geeigneten Lösungsmittel entweder

509887/1042

aus der Kulturbrühe "in toto" ohne Filtrieren der Myzelmasse oder aus der Myzelmasse sowie der zuvor durch Filtration abgetrennten Kulturflüssigkeit extrahiert werden. Die Hauptmenge der Antibiotika liegt in dem Filtrationskuchen vor, der aus den Myzeln besteht, die mit Diatomeenerde vermischt sind. Anschliessend wird der Filtrationskuchen angeteigt und in einem organischen Lösungsmittel zur Extraktion der Antibiotika gerührt. Geeignete Lösungsmittel sind Alkohole, wie Methanol, Äthanol oder Butanol, Ketone, wie Azeton oder Methylethylketon, halogenierte Kohlenwasserstoffe, wie Chloroform oder Methylenchlorid, Benzol oder wässrige Lösungen von organischen oder anorganischen Säuren, wie Essigsäure, Chlorwasserstoff säure oder Schwefelsäure. Bevorzugt werden Azeton, Äthylacetat, Mischungen aus organischen Lösungsmitteln, wie Alkoholen und mit Wasser nicht mischbaren Ketonen, sowie wässrige Lösungen von anorganischen oder organischen Säuren.

Um die Antibiotika in dem Filtrat zu extrahieren, ist es vorteilhaft, dem schwach angesäuerten oder neutralisierten Filtrat ein doppeltes Volumen eines mit Wasser nicht mischbaren organischen Lösungsmittels, wie Butanol, Chloroform, Äthylacetat, Butylacetat oder Benzol, zuzusetzen. Von den Abtrennungsmethodednfür Aclacinomycin sind die wirksamsten eine Gegenstromverteilung, eine Chromatographie unter Verwendung von Kieselsäure, Aluminiumoxyd, Sephadex LH 20 (Pharmacia Fine Chemicals AB, Uppsala, Schweden) oder synthetischen Adsorbentien, eine Adsorption an Aktivkohle oder dergleichen oder eine Kombination aus einer Lösungsmittelextraktion und diesen Methoden.

Die Antibiotika können direkt aus der Kulturbrühe nach den vorstehend genannten Methoden ohne Abtrennung der Myzeln extrahiert werden.

Nach einer Konzentrierung im Vakuum werden die Extrakte auf einen

509887/ 1042

pH-Wert zwischen 5 und 7 eingestellt und erneut mit einem mit Wasser nicht mischbaren Lösungsmittel, beispielsweise n-Butanol, Amylalkohol, Äthylacetat, Chloroform, Benzol, Methylenchlorid, Methylpropylketon oder dergleichen, extrahiert. Aus der mit Wasser nicht mischbaren organischen Lösung wird die aktive Rohsubstanz in Form eines gelben Pulvers durch Konzentrieren im Vakuum auf ein kleines Volumen und Ausfällung mit niedrig-polaren Lösungsmitteln, beispielsweise gesättigten Kohlenwasserstoffen, wie n-Hexan, Cyclohexan oder Petroläther, oder Äthern, wie Diäthyläther oder Dipropylather, erhalten,

Zur Entfernung von anderen pigmentierten Substanzen, wie Cinerubin A und B, aus der aktiven Rohsubstanz sowie zur Gewinnung von reinem Aclacinomycin A und B kann eine weitere Reinigung durch Säulenchromatographie unter Einsatz von verschiedenen Adsorbentien, wie Kieselsäure, Aluminiumoxyd, Sephadex LH20, Ionenaustauschern, wie schwach sauren Harzen sowie Polystyrol-Divinylbenzol-vernetzten Matrixharzen, wie Amberlite XAD, durch Chelierung mit verschiedenen Metallen, wie Kupfer(II)-, Eisen(II)-, Eisen(III)-, Kalzium- und Magnesiumionen, sowie durch Kombinationen aus wenigstens zwei oder mehreren Verfahren, ausgewählt aus einer Chelierung mit Metallionen, einer Lösungsmittelausfällung, einer Lösungsmittelextraktion, einer Gegenstromverteilung etc., durchgeführt werden.

Werden beispielsweise rohes Aclacinomycin A und B in einer kleinen Menge Chloroform gelöst, auf eine Kieselsäuresäule aufgegeben und dann mit einer Mischung aus Chloroform und Methanol eluiert, dann wird zuerst eine Aclacinomycin B-Fraktion mit einer Mischung aus Chloroform und Methanol (50:1) eluiert, worauf das Aclacinomycin A mit der vorstehenden Mischung mit einem Mischungsverhältnis von 30:1 bis 20:1 eluiert werden kann. Die Eluate von Aclacinomycin A und B werden getrennt im Vakuum konzentriert und weiter vollständig von Cinerubin A und B und einer kleinen Menge an pigmentierten Sub-

S0-98B7/ 1 ΓΙ42

stanzen als Verunreinigungen unter Anwendung einer Säulenchromatographie unter Einsatz eines synthetischen Adsorbenses abgetrennt, wobei als Adsorbens beispielsweise Column Lite (Al₂O₃.MgO^SiO₃.4H₂O, Fuji Chemical Co.)/ Floridil (aktiviertes Magnesiumsilikat, Floridin Co.) oder Hydroxylapa verwendet werden kann. Ferner kann

— ~i —2

man 1 χ 10 bis 1 χ 10 m CuSO., FeCl₃, FeSO. oder MgSO₄ zur

Herstellung eines Chelatkomplexes von Cinerubin A und B zusetzen und anschliessend eine Säulenchromatographie mit Sephadex LH20 durchführen. Die erhaltenen Lösungen aus reinem Aclacinomycin A und B können im Vakuum zur Trockne konzentriert werden, sie können ferner allein oder mit wenigstens einer Substanz gefriergetrocknet werden, die aus Serumalbumin, Globulin, Gelatine, Glyzerin, einem Zucker, einer Aminosäure, einer organischen oder anorganischen Säure etc. bestehen kann.

Das durch eine Kombination der vorstehend erwähnten Methoden erhaltene Aclacinomycin A und B, wobei diese Methoden in den folgenden Beispielen beschrieben werden, ist rein und gleichmässig und zeigt einen einzigen Flecken bei der Dünnschichtchromatographie unter Verwendung von verschiedenen Lösungsmittelsystemen. Ferner wird ein konstanter Schmelzpunkt sowie eine konstante Rechtsdrehung festgestellt. Die Ergebnisse der Elementaranalyse, charakteristische Peaks im UV und im Sichtbaren sowie die NMR- und IR-Absorptions-Spektren werden nachfolgend angegeben:

Aclacinomycin A:

Schwach basisches und lipophiles gelbes Pulver oder mikrokristallines Pulver. Die Elementaranalyse ergibt folgende Werte:

Berechnet für ^C42^H5

Gefunden C = 62,37 % C = 62,05 %

H = 6,67 % H= 6,69 %

O = 29,38 % 0 = 29,52 %

N = 1,82 % N = 1,72 %

Molekulargewicht = 813.

Der Schmelzpunkt und die Rechtsdrehung ([V] _D ) einer 1 %igen Lösung in Chloroform betragen 129 bis 135°C bzw. +29°. Die Absorptionsspektren im UV und im sichtbaren Bereich (Fig.1) zeigen Banden bei den folgenden Wellenlängen:

In Methanol bei 229,5	nm,	^E1 cm	= 540
258	nm,	Il	= 301
290	nm,	Il	= 128
434	nm,	Il	= 147
In 0,1η HCl/Methanol
bei 229,5	nm,	E^{1 %} 1 cm	= 578
258	nm,	Il	= 329
290	nm,	Il	= 141
434	nm,	Il	= 164

In 0,1η NaOH/Methanol

bei 239,5 nm, e] ^% = 678

1 cm

288	nm,	Il	= 232
314	nm,	Il	= 156
523	nm	Il	= 170

Bei einer Pelletisierung mit Kaliumbromid werden charakteristische Absorptionsbanden im IR-Spektrum (Fig. 2) bei folgenden Wellenzahlen (in cm"¹) festgestellt: 3300, 3080, 2940, 2860, 2760, 1740, 1640, 1620, 1540, 1460, 1450, 1415, 1385, 1295, 1250, 1220, 1195, 1165, 1125, 1105, 1090, 1010, 960, 930, 890, 840, 815, 760, 730, 580 und 450. Ein Protonen-NMR-Spektrum wird auf einem Varian XL-100-15-Spektrophotometer aufgezeichnet, der bei 100 MHz nach der Fourierümwandlungsmethode arbeitet (vgl. Fig. 3) .

509887/1042

Das Antibiotikum Aclacinomycin A ist löslich in Methanol, Äthanol, Chloroform, Äthylacetat, Azeton, Benzol, Dimethylsulfoxyd (DMSO) und Methylcellosolve, schwach löslich in Wasser und unlöslich in Äthyläther, Hexan, Cyclohexan und Petroläther. Die wässrige Lösung ist gelb und schlägt in konzentrierter Schwefelsäure in rötlich-braun um. Mit alkoholischem Magnesiumacetat zeigt diese Lösung eine purpurrote Färbung und schlägt bei der Alkalinisierung in purpurrot um.

Aclacinomycin B:

Schwach basisches, lipophiles und gelbes Pulver oder mikrokristallines Pulver. Die Elementaranaly^se ergibt folgende Werte:

Berechnet für C.-Hr-NO., _c

Gefunden C = 62,21 % c = 61,87 %

H = 6,46 % H= 6,29 %

0 = 29,60 % 0 = 29,80 %

N = 1,73 % ν = 1/89 %

Molekulargewicht = 811.

Der Schmelzpunkt liegt bei 135 bis 145°C. Die Rechtsdrehung in 1 %igem Chloroform) wird zu +3° ermittelt. Die Ab

sorptionsspektren im UV sowie im sichtbaren Bereich (Fig. 4) zeigen Banden bei folgenden Wellenlängen:

1 α
In Methanol bei 229,5 nm, E₁ = 452

257,5 nm, " = 261 290 nm, " =120 433 nm, " =120

509887/1042

in 0,1n Hcl/Methanol	5	nm,	cm	Il	= 465
bei 229,	5	nm,	Il	= 261
257,		nm,	Il	= 125
290		nm,		= 134
433

in 0,1 η NaOH/Methanol

bei 238 nm, eI * = 440

I Olli

268-	nm,	Il	= 142
	nm,	Il	= 97
	nm,	Il	= 135
-289
315
525

Charakteristische Absorptionsbanden im IR-Spektrum (Fig. 5) werden bei folgenden Wellenzahlen (in cm , KBr) festgestellt: 3300, 3070, 2940, 2850, 2750, 1740, 1640, 1620, 1540, 1465, 1445, 1410, 1380, 1290, 1245, 1215, 1160, 1120, 1095, 1050, 1010, 960, 920, 880, 840, 820, 750, 725, 700, 600, 580 und 450.

Das NMR-Spektrum von Aclacinomycin B geht aus Fig. 6 hervor.

Das Antibiotikum ist in Methanol, Äthanol, Chloroform, Äthylacetat, Azeton und angesäuertem Wasser löslich, schwach löslich in Wasser, jedoch unlöslich in Hexan, Cyclohexan und in Äthern. Die wässrige Lösung ist gelb und schlägt in konzentrierter Schwefelsäure in ein tief rötliches Purpur um. Diese Lösung ist in alkoholischem Magnesiumacetat purpurrot und geht bei der Alkalinisierung in ein rotes Purpur über.

Aclacinomycin A und B besitzen folgende Rf-Werte auf Kieselgeldünnschichtchromatogrammen beim Einsatz verschiedener Lösungsmittel systeme:

609807/1042

Rf-Werte von Aclacinomycin A B

Chloro form:Methanol	Azeton	0,36	0,71
20:1	Azeton:Hexan	0,88	0,90
5:1	1:1	0,43	0,72
Benzol:Methanol
1:1	0,15	0,49

0,86	0,93

Bei einer partiellen. Hydrolyse oder Methanolyse mit verdünnter Chlorwasserstoffsäure oder in Methanol, das 5 % Chlorwasserstoffsäure enthält, während einer Zeitspanne von 1 bis 2 Stunden bei Zimmertemperatur ergeben Aclacinomycin A und B methylierte Disaccharide und 1-Desoxypyrromycin. Die physikalisch-chemischen Eigenschaften, wie die IR-Absorptionsspektren, UV-Absorptionsspektren, Absorptionsspektrum im sichtbaren Bereich und NMR-Absorptionsspektren, der Schmelzpunkt sowie die Rechtsdrehung des methylierten Disaccharids, das aus Aclacinomycin B erhalten wird, fallen vollständig mit den entsprechenden Eigenschaften des methylierten Disaccharids zusammen, das aus Cinerubin B durch partielle saure Hydrolyse (Helvetica Chimica Acta, 55, 467-480, 1972) erhalten wird. 1-Desoxypyrromycin wurde mit den Werten von Rhodomycin (Chem. Ber. 38, 1762, 1955, Naturwiss. 48, 716, 1961), Cinerubin (Chem.Ber. 92, 1868, 1959) und Pyrromycin (Chem. Ber. 92, 1904, 1959) auf der Grundlage des NMR Spektrums, des Massenspektrums des Aglykons/ sowie des Vorliegens von Rhodosamin in dem sauren Hydrolysat identifiziert.

Aclacinomycin A und B zersetzen sich in ein neutrales Aglykon und zwei oder drei reduzierende Zucker bei der Hydrolyse mit einer 0,3n Schwefelsäure während einer Zeitspanne von 3 Stunden bei 85°C.

5098«7/ KU2

Die Aglykone bilden orange-gelbe Kristalle, die bei 171 bis 174⁰C schmelzen, und enthalten Sauerstoff, Kohlenstoff und Wasserstoff. Die Elementaranalyse, das Infrarotspektrum, das UV-Spektrum sowie das NMR-Spektrum, Fragmentxonenpeaks im Massenspektrum sowie andere Eigenschaften zeigen, dass das Aglykon von Aclacinomycin A und B aus Aklavinon (Tetrahedron Letters 8, 28, 1960, Naturwiss. 47, 135, 1960, Naturwiss. 42, 154, 1955, Naturwiss. 50, 92, 1963) besteht. Eine vergleichende Analyse von Zuckern in den sauren Hydrolysaten von Aclacinomycin A und B sowie Cinerubin A und B durch Dünnschichtchromatographxe zeigt, dass Aclacinomycin A das gleiche Rhodosamin, die gleiche 2-Desoxyfukose und die gleiche Cinerulose A wie Cinerubin A und das Aclacinomycin B das gleiche Rhodosamin und die gleiche 2-Desoxyfukose wie das Cinerubin B hat.

Aus den vorstehenden Ergebnissen gehen die Strukturen von Aclacinomycin A und B gemäss vorliegender Erfindung wie folgt hervor:

509887/1042

Struktur von Aclacinomycin:

OH 0

COOCH-

R =

Aclacinomycin A

509897/1042

Aclacinomycin B

Aclacinomycin A und B gehören im Hinblick auf ihre physikalischchemischen Eigenschaften und Strukturen, wie sie vorstehend beschrieben worden sind, sowie aufgrund eines Vergleichs mit bekannten Antibiotika zu der Gruppe der Anthracyclinglykoside und ähneln Cinerubin A und B, Rutilantin, Aklavin, Requinomycin sowie den Galirubinen.

Cinerubin und Rutilantin unterscheiden sich von den erfindungsgemässen Antibiotika bezüglich des Aglykons, und zwar C* -Pyrromycinon (Tetrahedron Letters, 16, 17, 1959). Von den Antibiotika mit einem

509887/1 Π u2

Aklavinonaglykon sind Requinomycin (J. Antibiotics, 25, 393, 272) und Aklavin (J. Bacteriol. 72, 90, 1956) nicht identisch mit den erfindungsgeraässen Antibiotika im Hinblick auf den Zuckeranteil sowie die Molekülformel, die auf der Basis von Elementaranalysen basiert. Galirubine, die durch Streptomyces galilaeus erzeugt werden, ähneln den erfindungsgemässen Antibiotika am meisten. K. Eckardt hat berichtet, dass vier Komponenten von Galirubin (Galirubin D, C, B und A) von den Myzeln von S. galilaeus isoliert worden sind, und dass Galirubin A das ^-Pyrromycinonglykosid, B das Aklavinonglykosid, Galirubinon C £ -Pyrromycinon und Galirubinon D 7-Desoxyaklavinon ist. Im Zusammenhang mit den physikalisch-chemischen Eigenschaften von Galirubin B, welches Aklavinon als Aglykon aufweist, gibt der Bericht nicht eine ins Detail gehende Reinigungsmethode an. Ferner fehlen Angaben über das chromatographische Verhalten, den Schmelzpunkt, die Elementaranalyse, die Absorptionsspektren im infraroten, im UV sowie im sichtbaren Bereich sowie über das NMR-Absorptionsspektrum. Es wird nur angegeben, dass zwei Zuckerflecken in dem sauren Hydrolysat von Galirubin B auf dem Papierchromatograram entdeckt wurden.

Aclacinomycin A und B mit dem Aklavinonaglykon und drei Zuckern unterscheiden sich daher deutlich von Galirubin B bezüglich der vorstehend angegebenen Eigenschaften. Die erfindungsgemässen Antibiotika sind neue Substanzen.

Therapeutisch wertvolle nicht-toxische Salze und Desoxyribonukleinsäure (DNA)-Komplexe der Antibiotika Aclacinomycin A und B können aus organischen und anorganischen Säuren, beispielsweise Chlorwasserstoffsäure, Phosphorsäure, Schwefelsäure, Essigsäure, Propionsäure, ölsäure, Palmitinsäure, Zitronensäure, Bernsteinsäure, Glutaminsäure, Pantothensäure und DNA, erhalten aus Kalbsbries, HeLa-Zellen, menschlichen Embryozellen, E. coli sowie anderen Tieren und Mikroorganismen, her-

5098A7/1 η Α 7

gestellt werden.

Die biologischen Aktivitäten von Aclacinomycin A und B sind wie folgt:

1) Das antimxkrobielle Spektrum von Aclacinomycin A und B wird nach der Kulturbrüheverdünnungsmethode wie folgt bestimmt:

Antxmikrobxelles Spektrum von Aclacinomycin A und B

Testorganismus minimale inhibierende Kon

zentration, mcg/ml

A B

Bacillus subtilis ATCC 6633 B. cereus ATCC 9634 B. megaterium

Staph. aureus FDA 209P Staph. aureus Smith Sar. lutea ATCC 9341 Mic. flavus

Cory, bovis 1810 Mycobact. smegmatis ATCC

Strept. faecalis

St. pyogenes NY 5 Diplo. pneumoniae Typ 1 Diplo. pneumoniae Typ 3

E. coli K12

Kl. pneumoniae ATCC 10031 Ps. aeruginosa A20229 Can. albicans IAM 4905 Can. tropicalis IAM 4924

<0,2	<0,2
< 0,2	<0,2
<0,63	<0,2
/ 0,63	<0,2
<0,2	<0,2
/0,2	<0,2
< 0,2	<0,2
< 0,2	<0,2
2,5	5
2,5	2,5
1,25	1,25
0,63	0,63
0,63	0,63
>100	>100
>100	>100
->ioo	>100
10	10
20	20

5098*7/ 1fU2

2) Antitumorwxrkungen: Die Antibiotika Aclacinomycin A und B zeigen eine ausgeprägte inhibierende Wirkung auf experimentelle Tiertumore (aszitische und feste Tumore). Diese Antitumorwirkung lässt sich am signifikantesten im Falle von Leukämien von Mäusen und Hepatomen von Ratten zeigen. Werden beispielsweise BDF.-Mäuse, die 18 bis 22 g wiegen, mit 1x10 P388-Zellen oder 5 χ 10 -L1210-Zellen intraperitoneal beimpft, und werden Aclacinomycin A und B sowie der Aclacinomycin A-DNA-Komplex intraperitoneal einmal täglich während einer Zeitspanne von 10 Tagen aufeinanderfolgend alle 24 Stunden nach der Beimpfung verabreicht, dann wird die Oberlebenszeit der Mäuse merklich bei einer Dosierung von 0,5 bis 5 mg/kg Körpergewicht pro Tag in einem Ausmaß von mehr als 150 % verlängert, und zwar im Vergleich zu Vergleichsmäusen, die keine Antibiotika erhalten, wie aus der folgenden Tabelle hervorgeht:

Antibiotikum

Aclacinomycin A

Aclacinomycin B

Aclacinomycin A-DNA-Komplex

Dosis, Mittlere mg/kg/Tag Überlebenszeit,

Taap

4,0
2,0
1r0
0,5
4,0
2,0
1,0
0,5
4,0
2,0
1,0
0,5

Vergleich

Tage 21,5

30,0 28,0 23,0 8,5 17,5 19,0 14,7 19,0 30,0 30,0 27,3

10,0

T/C, Tiere, die 30 % Tage überleben

215 1/4

300 4/4

280 3/4

230 2/4

85 0/4

175 0/4

190 1/4

147 0/4

190 1/4

300 4/4

273 3/4

0/8

509'887/1(U 2

Werden CH3/He-Mäuse₇ die 20 bis 23 g wiegen, mit 1x10 -Lymphoma 6C3HED/OG-Zellen intraperitoneal oder mit 5x10 -Lymphoma
6C3HED/OG-Zellen subkutan beimpft, und wird Aclacinomycin A intraperitoneal einmal täglich während einer Zeitspanne von 10 Tagen aufeinanderfolgend 3 Stunden nach der Beimpfung verabreicht, dann zeigt das Aclacinomycin A eine merkliche Hemmung des Wachstums des aszitischen oder festen 6C3HED/OG-Tumors, wie aus der folgenden Tabelle hervorgeht:

509887/1ΓΗ2

Aclacinomycin A, Dosis: mg/kg/Tag

Fester Typ: Tumorgewicht, mg

Tumorgewicht Körpergewicht, %

Inhibierung, % Tiere, die 21 Tage überleben

Aszitischer Typ: MST, Tage *

T/C, % ** Tiere, die 62 Tage überleben

4	2
5023	4633
19,5	15,1
28,7	34,2
0/3	3/3
20,1	31 ,8
98	155
0/3	0/3

1	0,5
2501	3695
9,5	12,4
64,5	47,6
3/3	3/3
37,5	15,0
183	73
1/3	0/3

Vergleich
7045
29,6

7/9
20,5

0/3

♦Mittlere Überlebenszeit ♦♦Überlebensverhältnis: Getestete Tiere/Vergleichstiere

Mäuse werden intraperitoneal mit einer Suspension von L1210-Leukämiez eilen beimpft und mit Lösungen mit verschiedenen Konzentrationen an Aclacinomycin A 1, 5 bzw. 9 Tage anschliessend an die Tumorimplantation behandelt. Aus der folgenden Tabelle gehen die dabei erhaltenen Ergebnisse hervor. Die Tabelle zeigt, dass Aclacinomycin A bei einer Verabreichung in Dosen von 6 und 3 mg/kg/Tag beträchtlich die mittlere Überlebenszeit der behandelten Mäuse erhöht.

Tiere, die 30 Tage überleben

0/5 2/5 2/5 0/5 0/10

Donryu-Ratten, die mit aszitischem Hepatoma AH44 beimpft worden sind, wurden intraperitoneal während 10 aufeinanderfolgenden Tagen mit 2 mg/kg/Tag Aclacinomycin A behandelt. Während die Vergleichsratten eine durchschnittliche Überlebenszeit von 14,5 Tagen nach der Tumorimplantation zeigten, lebten alle behandelten Ratten 30 Tage nach dem Versuch.

3) Akute Toxizität: Die LD_5Q-Werte nach einer einzigen Injektion von Aclacinomycin A oder B sind in der folgenden Tabelle zusammengefasst:

Dosis,	Mittlere	Überlebensz ext,
mg/kg/Tag	Tage
12		16,1
6		21,7
3		23,3
1,5		12,6
Vergleich		10,4

509837/1042

Tierart	Weg	^LD50'	mg/kg
		A	B
Maus	intravenös	33,7	16,4
Maus	intraperitoneal	22,6	13,7
Ratte	intravenös	32,5	15,0
Ratte	intraperitoneal	25-50	10-15

Akute Herzveränderungen bei der Durchführung von Elektrokardiogrammen von Hamstern werden nicht durch eine einzige intravenöse Verabreichung von 25 mg/kg Aclacinomycin A oder B induziert.

4) Die Antibiotika hemmen vollständig das Wachstum von gezüchteten Säugetier-Tumorzellen, Vaccinia-Viren in HeLa-Zellen und in spezifischer Weise die RNA-Synthese bei einer extrem geringen Konzentration. Werden L1210-Zellen auf ein Medium aufgeimpft (Rosewell Memorial Park Institute 1640), das 10 % Kalbsserum enthält, und setzt man verschiedene Konzentrationen an Aclacino-

14
mycin α und B sowie als Vorläufer C-Thymidxn, -Leucin oder -Uridin zu und inkubiert bei 37⁰C während einer Zeitspanne von

1 4 60 Minuten bei der Durchführung des C-Inkorporierungsversuchs sowie während einer Zeitspanne von 3 Tagen bei der Durchführung des Wachstumsversuchs, dann stellt man fest, dass die Nukleinsäurebiosynthese sowie das Zellenwachstum über 50 % unterhalb 1 mcg/ml Aclacinomycin in dem Medium inhibiert werden, wie aus der folgenden Tabelle hervorgeht:

5098S7/1042

	Li210-Zellen:	Aclacmomycm A	Aclacinomycin A/
	Wachstum		DNA-Komplex *
	DNA-Synthese
	RNA-Synthese	0,12	0,08
	Proteinsynthese	1,1	-
	Vaccinia-Virus:	0,1	0,2
cn		6,3	-
ο co	<10	—
00

ID₅₀, mcg/ml

Aclacinomycin B

0,24
4

0,2
12

*Kalbsbries DNA; Typ V (Sigma Co.) wird verwendet.

Durch die vorstehenden Eigenschaften von Aclacinomycin A und Aclacinomycin B wird bestätigt, dass diese Substanzen neue Antibiotika sind, die sich von bekannten Antibiotika unterscheiden.

Gemäss einem dritten Merkmal der Erfindung wird ein Verfahren zur therapeutischen Behandlung von lebenden Tieren, einschliesslich Menschen, welche an Leukämie leiden, geschaffen. Dieses Verfahren besteht darin, Aclacinomycin A und/oder Aclacinomycin B in einer Dosis zu verabreichen, die dazu ausreicht, die Leukämie zu reduzieren.

Ein viertes Merkmal der Erfindung ist darin zu sehen, dass eine pharmazeutische Zubereitung zur Verfügung gestellt wird, die Aclacinomycin A und/oder Aclacinomycin B in einer Menge enthält, die dazu ausreicht, Leukämiezustände in vivo zu reduzieren, wobei das Aclacinomycin A und/oder das Aclacinomycin B in Kombination mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger vorliegen. Die tatsächlich vorzugsweise eingesetzten Mengen des Aclacinomycins schwanken in Abhängigkeit von der jeweils eingesetzten Verbindung, der jeweils formulierten Zubereitung, der Verabreichungsart sowie der jeweils zu behandelnden Stelle sowie dem jeweils zu behandelnden Organismus. Viele Faktoren, welche die Wirkung des Wirkstoffes modifizieren, sind zu berücksichtigen, beispielsweise das Alter, das Körpergewicht, das Geschlecht, die aufgenommene Nahrung, die Verabreichungszeit, der Verabreichungsweg, die Ausscheidungsgeschwindigkeit, Wirkstoffkombinationen, Reaktionssensitivitäten sowie die Schwere der Krankheit. Die optimal zu verabreichenden Mengen lassen sich für die gegebenen Umstände leicht unter Anwendung von üblichen Dosierungsbestimmungstests unter Berücksichtigung der vorstehenden Richtlinien ermitteln.

Nachfolgend werden Beispiele für die Herstellung und Reinigung von Aclacinomycin A und B beschrieben. Diese Beispiele erläutern die Erfindung, ohne sie zu beschränken.

609887/1(142

Beispiel 1

Ein wässriges Medium mit folgender Zusammensetzung wird hergestellt:

Kartoffelstärke 1

Glukose 1

"Prorich" 1,5

KH₂PO₄ 0,1

K₃HPO₄ 0,1

MgSO₄.7H₂O 0,1

NaCl 0,3

Mineralien * 0,125

Silikon (KM75) 0,05

pH 7,0

♦Mineralien: CuSO₄. 5HO (2,8 g) , FeSO₄^H₃O (0,4 g) , MnCl .4H 0 (3,2 g) , ZnSO₄^H₃O (0,8 g) in 500 ml Wasser.

100 ml dieses Mediums werden bei 120⁰C während einer Zeitspanne von 15 Minuten in einem 500 ml-Sakaguchi-Schüttelkolben sterilisiert, der von einer Agar-Schrägkultur von Streptomyces galilaeus MA144-M1 mittels einer Platinschleife beimpft worden ist.

Die Inkubation verläuft während einer Zeitspanne von 48 Stunden bei 28⁰C auf einem sich hin- und herbewegenden Schüttler. 10 1 des zuvor sterilisierten Mediums in einem Gärungsgefäss mit einem Fassunasvermögen von 20 1 aus rostfreiem Stahl werden aseptisch mit 200 ml der vorstehenden Impfkulturen beimpft. Die Gärung erfolgt bei 28⁰C während einer Zeitspanne von 32 Stunden unter Rühren (240 Upm) und Belüftung (5 l/Minute). Die erhaltene Kulturbrühe wird auf einen pH-Wert von 4,5 gebracht, mit adsorbierend wirkender Kieselerde vermischt und von den Myzeln abfiltriert. Das Filtrat sowie der erhaltene Kuchen werden getrennt extrahiert.

509887/1 η

Der Kuchen wird in Azeton (3 1 pro kg des feuchten Kuchens) suspendiert, während einer Zeitspanne von 2 Stunden gerührt und filtriert. Der Kuchen wird nochmal mit Azeton extrahiert. Die auf diese Weise erhaltenen Extrakte werden auf 1/10 ihres Volumens im Vakuum eingedampft. Das Kulturfiltrat wird auf einen pH-Wert von 6,8 gebracht und zweimal mit 1/3 Volumen Äthylacetat extrahiert. Die Äthylacetat-Extrakte werden auf 1/10 ihres Volumens im Vakuum konzentriert.

20 g der erhaltenen öligen Substanzen werden mit 20 g Kieselsäure (Mallinckrodt Chem. Co.) vermischt, auf eine Säule mit einer Länge von 40 cm und einem Durchmesser von 4,5 cm, gefüllt mit Kieselsäure, aufgebracht und mit einer Benzol/Azeton/Methanol-Mischung eluiert. Das erste Eluat, welches mit einer 1:1:0-Mischung eluiert wird, wird verworfen. Die aktiven Fraktionen werden mit 1:3:0-und 1:3:0,3-Mischungen eluiert und gesammelt und im Vakuum zur Trockne eingedampft. 11,5 g dieser rohen Substanz werden dann in einer kleinen Menge Äthylacetat aufgelöst und auf die gleiche Kieselsäuresäule wie sie vorstehend beschrieben worden ist, aufgebracht. Nach einem Verwerfen der anfänglichen Eluate, die durch die 1:1- und 2:1-Benzol/Azeton-Mischungen erhalten worden sind, werden Aclacinomycin B-Fraktionen zuerst mit den vorstehenden Mischungen in einem Verhältnis von 1:3 und 1:5 und Aclacinomycin A-Fraktionen mit 1:5:0,5-und 1:5:1-Benzol/Azeton/Methanol-Mischungen eluiert. Die Eluate werden über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und im Vakuum zur Trockne konzentriert. 4,8 g eines rohen Aclacinomycin A und 3,5 g Aclacinomycin B werden in Form eines gelben Pulvers erhalten.

Beispiel 2

2,0 g des gemäss Beispiel 1 erhaltenen rohen Aclacinomycins B werden mit 3 g Kieselsäure vermischt und einer Säulenchromato-

5O9887/1(U2

graphie in einer Säule mit einer Länge von 15 cm und einem Durchmesser von 2 cm, gefüllt mit 25 g Kieselsäure, unterzogen. Die Aclacinomycin B-Fraktion wird mit Chloroform eluiert, das 1 % Methanol enthält, und auf ein kleines Volumen im Vakuum konzentriert. Aus der konzentrierten Lösung werden durch Zugabe von etwas n-Hexan 40 mg Aclacinomycin B in Form eines gelben Pulvers erhalten.

Beispiel 3

2,0 g rohes Aclacinomycin A, erhalten gemäss Beispiel 1, werden in einer kleinen Menge Chloroform aufgelöst und auf eine Säule mit einer Länge von 20 cm und einem Durchmesser von 2,0 cm, gefüllt mit 30 g Kieselsäure, aufgebracht. Nach einem Wegeluieren der Aglykon-enthaltenden Pigmente, von Aclacinomycin B sowie anderer Verunreinigungen mit Chloroform und 1,5 % Methanolenthaltendem Chloroform werden Aclacinomycin Α-Fraktionen mit 2 % Methanol-enthaltendem Chloroform eluiert, worauf im Vakuum zur Trockne eingedampft wird. 53 mg eines gelben Pulvers aus Aclacinomycin A werden erhalten.

Beispiel 4

Rohes Aclacinomycin A oder B, erhalten gemäss Beispiel 1, wird in Chloroform aufgelöst und mit CuSO. sowie ÄDTA (Äthylendiamintetraessigsäure) behandelt. Dann wird die Chloroformphase abgetrennt und mit Wasser zweimal unter Schütteln gewaschen. Der Chloroformextrakt wird über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und im Vakuum konzentriert. Die Zugabe von etwas n—Hexan hat eine Ausfällung von reinem Aclacinomycin A zur Folge.

9887/104

Beispiel 5

Ein wässriges Medium mit folgender Zusammensetzung wird hergestellt:

Kartoffelstärke 2

Glukose 2

"Fleisch" 2,5

KH₃PO₄ 0,1

K₂HPO₄ 0,1

MgSO₄.7H₂O 0,1

NaCl 0,3

MnCl₂.4H₂O 0,0005

FeSO₄.7H₂O 0,0005

Silikon 0,05

pH 7,2

50 ml dieses Mediums werden bei 120⁰C während einer Zeitspanne von 15 Minuten in einem 500 ml-Erlenmeyerkolben sterilisiert, der mit 1 ml einer gefrorenen Kulturbrühe von Streptomyces galilaeus MA144-M1 beimpft wird. Die Inkubation wird während einer Zeitspanne von 48 Stunden bei 30⁰C in einem Rotationsschüttler durchgeführt. 10 1 des gleichen Mediums in einem Gärungsgefäss aus rostfreiem Stahl mit einem Fassungsvermögen von 20 1 werden aseptisch mit 200 ml der vorstehenden Kulturen beimpft. Nach einer Inkubation bei 30⁰C während einer Zeitspanne von 18 Stunden unter Rühren (300 Upm) und Belüftung (5 l/Minute) werden 10 1 der Kulturbrühe zu 600 1 des in der vorstehend beschriebenen Weise sterilisierten Mediums in einem 1 Kiloliter-Tank aus frostfreiem Stahl gegeben, worauf bei 30⁰C während einer Zeitspanne von 48 Stunden unter Belüftung (20 l/Minute) und Rühren (180 Upm) inkubiert wird. Die in einer Menge von 57Q 1 erhaltene Kulturbrühe wird auf einen pH-

509687/1042

Wert von 5,0 durch Zugabe von 250 ml einer 30 %igen H₃SO₄ gebracht, die mit adsorbierend wirkender Kieselerde vermischt ist. Die 53,5 kg des auf diese Weise erhaltenen Kuchens werden in 70 1 Azeton suspendiert, während einer Zeitspanne von 3 Stunden gerührt und filtriert. Der Kuchen wird nochmals mit 85 1 Azeton extrahiert. Die Extrakte werden im Vakuum auf 40 1 eingedampft und 25 1 Äthylacetat zugesetzt. Die Äthylacetatphase wird abgetrennt und auf 1 1 im Vakuum konzentriert. Die rohe AclacinomycinMischung, die durch Zugabe von 1 1 η-Hexan zu dem vorstehend geschilderten Konzentrat ausfällt, wird gesammelt und mit einer Mischung aus η-Hexan und Äthylacetat (50:1) zweimal gewaschen. Man erhält 15,5 g eines orange-gelben Pulvers.

Dieses rohe Pulver wird in 200 ml Äthylacetat aufgelöst und auf eine Säule mit einer Länge von 35 cm und einem Durchmesser von 7 cm, die mit 700 g Column Lite gefüllt ist, aufgebracht. Es wird mit einer Mischung aus Äthylacetat und Methanol (1:1) eluiert. Gelbe Fraktionen, welche Aclacinomycin A enthalten, werden im Vakuum zur Trockne eingedampft. 12,4 g eines rohen Aclacinomycin A werden in 100 ml Chloroform aufgelöst und zu 50 ml einer 10 m ÄDTA in einem 0,01m Phosphatpuffer (pH 6,8) gegeben. Nach einem kräftigen Schütteln zur Entfernung von restlichen Metallionen wird die Chloroformphase zweimal unter Schütteln mit Wasser gewaschen, unter wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und im Vakuum zur Trockne eingedampft. Man erhält 11,1 g Aclacinomycin A in Form eines gelben Pulvers.

509837/ 1042

Claims

Patentansprüche

f 1. Verbindung der Formel:

COOCH,

OH

worin R für

oder

steht, oder ein nicht-toxisches Säureadditionssalz davon oder ein Komplex davon mit Desoxyribonukleinsäure.

509887/1042
2. Verbindung der Formel:

COOCH.

OH 0 OH H

worin R für

oder

steht.
3. Verbindung der Formel:

5098*7/1042

COOCH₅

OH

0 OH H 0

0==

oder ein nicht-toxisches Säureadditionssalz davon oder ein Komplex davon mit Desoxyrxbonukleinsäure.
4. Verbindung der Formel:

609887/1042

COOCH-

ο==
5. Verbindung der Formel:

5096Q7/ 1 η 42

COOCBÜ

OH 0 OH H 0

N-CH₅ ·

oder ein nicht-toxisches Säureadditionssalz oder ein Komplex davon mit Desoxyribonukleinsäure.

509887MfH2
6. Verbindung der Formel:

H- ö '0HH 0
7. Verfahren zur Herstellung des Antxtumorantxbxotikums AcIacinomycin, dadurch gekennzeichnet, dass ein Aclacinomycin-erzeugender Stamm von Streptomyces galilaeus mit der ATCC Nr. 31133 unter aeroben Submersbedingungen in einem Nährmittel gezüchtet wird, das eine Kohlenstoffquelle und ein stickstoffhaltiges Nährmittel enthält, bis eine erhebliche Menge an AcIacinomycin durch den Organismus in dem Nährmittelmedium erzeugt worden ist.

509887/ 1fU2
8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass Streptomyces galilaeus ATCC Nr. 31133 oder ein Mutant davon in einem Nährmedium bei einer Temperatur zwischen 20 und 35°C gezüchtet wird.
9. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass Streptomyces galilaeus ATCC Nr. 31133 oder ein Mutant davon in einem Nährmedium bei einer Temperatur zwischen 25 und 30⁰C sowie bei einem pH zwischen 5 und 8 gezüchtet wird.
10. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass das Aclacinomycin aus dem Kulturmedium gewonnen wird.
11. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass das in der Kulturbrühe erzeugte Aclacinomycin nach einem Verfahren extrahiert und gereinigt wird, welches aus einem Verfahren aus der Gruppe ausgewählt wird, die aus einer Lösungsmittelextraktion, einer Lösungsmittelausfällung,einer Konzentrierung, einer Gegenstromverteilung, einer Chelierung mit Metallionen, einer Adsorption an einem Adsorbens, und einer Adsorption, gefolgt von einer Eluierung von einem Ionenaustauscherharz, einer absorbierenden Kieselerde oder einem synthetischen Adsorbens, besteht.
12. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass die Aclacinomycin-enthaltende,Lösung zur Trockne konzentriert oder gefriergetrocknet wird.
13. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass die Aclacinomycin-enthaltende Lösung nach einer Zugabe wenigstens einer Substanz, ausgewählt aus der Gruppe, die aus Serum, Serumalbumin, -globulin, Glyzerin, Gelatine, Zuckern, Aminosäuren, Desoxyribonukleinsäure, organischen und anorganischen Säuren, wie Chlorwasserstoffsäure, Phosphorsäure, Schwefel-

509887/

säure, Essigsäure, Propionsäure, ölsäure, Palmitinsäure, Zitronensäure, Bernsteinsäure und Pantothensäure besteht, zur Trockne konzentriert oder gefriergetrocknet wird.
14. Verfahren zur Herstellung des Antitumorantibiotxkums Aclacinomycin A, dadurch gekennzeichnet, dass ein Aclacinomycin A-erzeugender Stamm von Streptomyces galilaeus mit der ATCC Nr. 31133 unter aeroben Submersbedingungen in einem Nährmedium, das eine Kohlenstoffquelle und ein stickstoffhaltiges Nährmittel enthält, solange gezüchtet wird, bis eine erhebliche Menge an Aclacinomycin A von dem Organismus in dem Nährmedium erzeugt worden ist.
15. Verfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass Streptomyces galilaeus ATCC Nr. 31133 oder ein Mutant davon in einem Nährmedium bei einer Temperatur zwischen 20 und 35⁰C gezüchtet wird.
16. Verfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass Streptomyces galilaeus ATCC Nr. 31133 oder ein Mutant davon in einem Nährmedium bei einer Temperatur zwischen 25 und 30⁰C sowie bei einem pH-Wert zwischen 5 und 8 gezüchtet wird.
17. Verfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass das Aclacinomycin A aus dem Kulturmedium gewonnen wird.
18. Verfahren nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, dass das in der Kulturbrühe erzeugte Aclacinomycin A nach einem Verfahren extrahiert und gereinigt wird, welches aus wenigstens einem Verfahren besteht, das aus der Gruppe ausgewählt wird, die aus einer Lösungsmittelextraktion, Losungsmxttelausfällung, Konzentrierung, Gegenstromverteilung, Chelierung mit Metallionen, Aisorption an einem Adsorbens und einer Adsorption, gefolgt von

6 09887/ 1 04?

einer Eluierung von einem Ionenaustauscherharz, einer absorbierenden Kieselerde oder einem synthetischen Adsorbens, besteht.
19. Verfahren nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, dass die Aclacinomycin Α-enthaltende Lösung zur Trockne konzentriert oder gefriergetrocknet wird.
20. Verfahren nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, dass die Aclacinomycin Α-enthaltende Lösung nach der Zugabe wenigstens einer Substanz, ausgewählt aus der Gruppe, die aus Serum, Serumalbumin, -globulin, Glyzerin, Gelatine, Zuckern, Aminosäuren, Desoxyribonukleinsäure, organischen und anorganischen Säuren, wie Chlorwasserstoffsäure, Phosphorsäure, Schwefelsäure, Essigsäure, Propionsäure, ölsäure, Palmitinsäure, Zitronensäure, Bernsteinsäure und Pantothensäure besteht, zur Trockne konzentriert oder gefriergetrocknet wird.
21.Verfahren zur Herstellung des Antitumorantibiotikums Aclacinomycin B, dadurch gekennzeichnet, dass ein Aclacinomycin B-erzeugender Stamm von Streptomyces galilaeus mit der ATCC Nr. 31133 unter aeroben Submersbedingungen in einem Nährmedium gezüchtet wird, das eine Kohlenstoffquelle und ein stickstoffhaltiges Nährmittel enthält, bis eine .erhebliche Menge an Aclacinomycin B durch den Organismus in dem Nährmedium erzeugt worden ist.
22. Verfahren nach Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, dass Streptomyces galilaeus ATCC Nr. 31133 oder ein Mutant davon in einem Nährmedium bei einer Temperatur zwischen 20 und 35⁰C gezüchtet wird.
23. Verfahren nach Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, dass Streptomyces galilaeus ATCC Nr. 31133 oder ein Mutant davon in einem Nährmedium bei einer Temperatur zwischen 25 und 30⁰C sowie

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— ο / — bei einem pH zwischen 5 und 8 gezüchtet wird.
24. Verfahren nach Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, dass das Aclacinomycin B aus dem Kulturmedium gewonnen wird.
25. Verfahren nach Anspruch 24, dadurch gekennzeichnet, dass das in der Kulturbrühe erzeugte Aclacinomycin B nach einem Verfahren extrahiert und gereinigt wird, welches aus wenigstens einem Verfahren besteht, das aus der Gruppe ausgewählt wird, die aus einer Lösungsmitellextraktion, Lösungsmittelausfällung, Konzentrierung, Gegenstromverteilung, Chelierung mit Metallionen, Absorption an einem Adsorbens und einer Adsorption, gefolgt ^von einer Eluierung von einem Ionenaustauscherharz, einer absorbierenden Kieselerde oder einem synthetischen Adsorbens, besteht.
26. Verfahren nach Anspruch 24, dadurch gekennzeichnet, dass die Aclacinomycin B-enthaltende Lösung zur Trockne konzentriert oder gefriergetrocknet wird.
27. Verfahren nach Anspruch 24, dadurch gekennzeichnet, dass die Aclacinomycin B-enthaltende Lösung nach einer Zugabe wenigstens einer Substanz, ausgewählt aus der Gruppe, die aus Serum, Serumalbumin, -globulin, Glyzerin, Gelatine, Zuckern, Aminosäuren, Desoxyribonukleinsäure, organischen und anorganischen Säuren, wie Chlorwasserstoffsäure, Phosphorsäure, Schwefelsäure, Essigsäure, Propionsäure, ölsäure, Palmitinsäure, Zitronensäure, Bernsteinsäure und Pantothensäure besteht, zur Trockne konzentriert oder gefriergetrocknet wird.

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