DE2638766C2 - Antibiotika,Verfahren zu ihrer Herstellung und diese enthaltende Arzneimittel - Google Patents

Antibiotika,Verfahren zu ihrer Herstellung und diese enthaltende Arzneimittel

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Description

das als kupferfreies Formiatsalz im KBr-Preßling im wesentlichen das in der Fig. 3 gezeigte Infrarotspektrum ergibt und in D2O in einer Konzentration von 10% gelöst, das im wesentlichen in F i g. 4 gezeigte NMR-Spektrum ergibt;
und sowohl in der kupferfreien Form als auch in der Form des Kupfer-Komplexes das Wachstum von Bakterien und Pilzen wirksam inhibiert,
wobei die Fig. 3 und 4 Bestandteil dieses Anspruchs sind.
4. Das mit Bu-2231 B bezeichnete Antibiotikum gemäß Anspruch 3 in Form des Formiatsalzes oder Hydrochloridsalzes der freien Base.
5. Verfahren zur Herstellung der Antibiotika nach Anspruch 1 und 3, dadurch gekennzeichnet,
daß man Streptoalloteichus hindustanus ATCC 31158 in einem wilßrigen Nährmedium, das assimilierbare Stickstoff- und Kohlenstoffquellen enthält, unter submersen aeroben Bedingungen kultivi- ., den Komplex Bu-2231 aus dem Kulturn-ediuni durch
Abtrennen des wasserlöslichen antibiotischen Komplexes von dem Mycel, Adsorbieren des Komplexes an einem Kationenaustauscherharz, Abtrennen des koproduzierten Aminoglykosid-Komplex. 3 von dem Glykopeptid Bu-2231-Komplex durch Eluieren des Aminoglykosid-Komplexes mit einer verdünnten Base und Eluieren des Bu-2231-Komplexes von dem Adsorbens mit einer Mineralsäurelösung gewinnt,
den Komplex Bu-2231 einer Chromatographie unter Eluierung im Gradienten zur Aufspaltung des Komplexes in die Einzelbestandteile Bu-2231 A und B in Form der Kupfer-Kompiexe unterzieht und ggf. die Kupfer-Komplexe mit Schwefelwasserstoff in Methanol behandelt, um die entsprechenden kupferfreien Formen zu erhalten.
6. Verfahren gemäß Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Kupfer-II-chloridlösungdes Komplexes Bu-2231 über einen Kationenaustauscher aus einem modifizierten Polysaccharid-Dextranderivat mit funktioneilen Carboxymethylgruppen Chromatographien, wobei man als Eluiermittel wäßriges Ammoniumformiat in Konzentrationen von 1 bis 7% verwendet.
7. Arzneimittel, enthaltend mindestens eine Verbindung nach den Ansprüchen 1 bis 4 zusammen mit einem pharmazeutisch brauchbaren Träger und/oder pharmazeutisch brauchbaren Zusätzen.
Die Erfindung betrifft Antibiotika, ein Verfahren zu ihrer Herstellung und diese Antibiotika enthaltende Arzneimittel.
Die erfindungsgemäßer. Antibiotika, die im folgenden als Bu-2231 A und B bezeichnet sind, sind die Haupt-GIykope,)tidkomponente eines wasserlöslichen basischen Glykopeptidkomplexes, der mit Bu-2231 bezeichncl ist.
Die erfindungsgemäßen Antibiotika kann man durch Fermentation eines Streptoalloteichus-Stammes herstellen, der in der Bristol-Banyu-Kultursammlung als E 465-94 bezeichnet ist. Dieser Organismus ist ein Actinomycetcs-Bacterium, dt") aus einer indischen Bodenprobe isoliert wurde. Eine Kultur des Organismus wurde in der American Type Culture Collection, Washington, D.C., hinterlegt und in die dortige Sammlung von Mikroorganischen als ATCC 31158 aufgenommen.
Gegenstand der Erfindung sind somit die in den Ansprüchen 1 und 3 näher gekennzeichneten Antibiotika, das im Anspruch 5 genannte Verfahren zu deren Herstellung und das mit dem Anspruch 7 definierte Arzneimittel. Die Ansprüche 2, 4 und 6 nennen Ausgestaltungen der Erfindung.
Die erfindungsgemäßen Antibiotika und auch der genannte Glykopeptiükomplex Bu-2231 inhibieren das Wachstum von Mikroorganismen, d. h. sowohl von Bakterien, als auch von Fungi, die pathogen lür Tiere und Pflanzen sind. Diese Antibiotika sind daher nützlich zur Therapie bakterieller Infektionen des Menschen oder von Tieren sowie zur Vorbeugung bzw. Behandlung von Reis, Erbsen, Wei;.en oder anderen Pflanzen, die durch pflanzenpathogene Organismen infiziert werden oder infiziert worden sind. Der Komplex und seine Einzelbestandteile sind auch geeignet zur Behandlung verschiedener Tumorsysteme an Nagetieren einschließlich des ho Walker 256-Karzinosarkoms (Aszitesform) und des Lewis-Lungenkarzinoms.
Die beigefügte Fig. 1 zeigt das Infrarot-Absorptionsspektrum von Bu-2231 A in Form des kupferfreien Hydrochloridsalzes als Preßling in Kaliumbromid.
Die Fig. 2 zeigt das protonenmagnetische Resonanzspektrum von Bu-2231 A als kupferfreies Hydrochloridsalz, gelöst in D2O unter Anwendung von 2,2-Dimcthyl-2-silapentan-5-sulfonat (DSS) als innerer Standard, bestimmt mit einem '.EOL 60 MHz NMR-Spektrometer (Typ TNM-C-60 HL).
Die Fig. 3 zeigt das Infrarot-Absorptionsspektrum von Bu-2231 B in Form des kupferfreien Formiatsalzesals Preßling in Kaliumbromid.
Die Fig. 4 zeigt das protonenmagnetische Resonanzspektrum von Bu-2231 B in Form des kupferfreien Formiatsaizes, gelöst in D2O unter Anwendung von 2,2-Dimethyl-2-silapentan-5-sulfonat (DSS) als innerer Standard, bestimmt mit einem JEOL 60 MHz NMR-Spektrometer (Typ TNM-C-60 HL).
Im folgenden werden die morphologischen Charakteristika, Kulturcharakteristika und physiologischen Cha- * rakteristika des Stammes E 465-94 aufgeführt:
Der Stamm E 465-94 erzeugt auf den meisten Agar-Medien im an der Luft befindlichen Mycel Trauben bzw. Bündel und ein Sklerotium. Die Traube bzw. das Bündel ist eine dominante bzw. vorherrschende sporenbildende Struktur und die Bildung von Sklerotien ist etwas unberechenbar. Die Traube bzw. das Bündel bestehtaus kurvenförmigen oder L-förmigen kurzen Sporenketten mit vielen Zweigen und entwickelt sich häufig zu einer IO dicken Masse. Einige Sporenketten erstrecken sich aus der Trauben- bzw. Bündelstruktur heraus und bilden häufig offene Spiralen. Die Form des Sklerotiums ist oval oder gelegentlich unregelmäßig. Eine Fragmentbildung des vegetativen Mycels tritt nicht auf. Windungen bzw. Ringe werden nicht gebildet.
Der Stamm E 465-94 erzeugt an der Luft befindliche bzw. wachsende Mycelien auf den meisten untersuchten Agar-Medien. Die Farbe des reifen, an der Luft gewachsenen Mycels ist hellgelb, beige oder schwach blaßrosa-15 gelb bzw. blaßrötlich-gelb. Ein verbreitbares Pigment wird nicht erzeugt. Die Tyrosinase-Reaktion verläuft negativ. Der Stamm ist wärmebeständig und wächst reichlich bei 500C. Die Kulturcharakteristika und physiologischen Charakteristika sowie die Kohlenhydratverwertung des Stammes E 465-94 sind in den Tabellen 1, 2 und 3 angegeben.
Tabelle
Kulturcharakteristika des Stammes E 465-94
Hefeextrakt-Malzextrakt-Agar (ISP Nr. 2 Medium) Pridham et al., 1956-57
Hafermehl-Agar (ISP Nr. 3 Medium) Küster, 1959
Anorganische Salze-Stärke-Agar (ISP Nr. 4 Medium) Küster. 1959
Glycerin-Asparagin-Agar (ISP Nr. 5 Medium) Pridham und Lyons, 1961
Pepton-Hefeextrakt-Eisen-Agar (ISP Nr. 6 Medium) Tresner und Danga, 1958
Tyrosin-Agar
(ISP Nr. 7 Medium)
Shinobu, 1958
Bennett-Agar
Nähr-Agar
G: Reichlich
R: Blaßgelblich-braun bis hellbraun
A: Dick, samtartig, hellgelblich-beige oder blaßrötlichbeige
D: Keines
G: Mäßig
R: Farblos, teilweise blaßgelblich-braun
A: Pulverförmig bis samtartig, gelegentlich mit Flecken,
blaßrötlich-beige
D: Keines
G: Mäßig
R: Farblos bis biaßgeibiich-bfäun
A: Pulverförmig bis samtartig, blaßrötlich-gelb
D: Keines
G: Beschränkt
R: Farblos bis blaß olivfarben-gelb
A: Pulverförmig mit Flecken, weißlich bis blaßgelblichbeige
D: Keines
G: Dürftig
R: Braun
A: Dürftig, weiß
D: Blaß-braun
G: Mäßig
R: Blaßgelb bis blaßgrünlich-gelb
A: Samtartig bis baumwollartig, weiß, später leicht
rötlich-gelb
D: Keines
G: Mäßig
R: Blaß olivfarben-gelb bis hellbraun
A: Samtartig, hellgelblich-beige
D: Keines
G: Beschränkt
R: Blaßbräunlich-gelb
A: Dürftig, weiß
D: Blaßgeib
Bodenextrakt-Agar
Tomatenpaste-Hafermehl-Agar
G: Mäßig
R: Farblos
A: Dünn, blaßgelblich-beige, Flecken
D: Keines
G: Mäßig
R: Hellgelblich-braun
A: Samtartig, blaßrötlich-gelb
D: Keines
Abkürzungen· G = Wachstum; R = Färbung der Rückseite (reverse color); A = an der Luft befindliches bzw. gewachsenes Mycel; D = verbreitbares bzw. diffusionsfähiges Pigment
E 465-94
Tabelle 2
Physiologische Charakteristika des Stammes
Gelatineverflüssigung
Stärkehydrolyse
Milch
Melanin aus L-Tyrosin Nitrit aus Nitrat
Wachstumstemperatur
Fluoreszierendes Licht NaCl-Toleranz
Kartoffelstempel-Säuretoleranz
Katalasereaktion
Oxidase
Erzeugte Antibiotika
Tabelle 3
Kohlenhydrat-Verwertung des Stammes E 465-94
D(-J-Arabinose
L(+)-Arabinose
D-Xylose
D-Ribose +
L-Rhamnose
D-Glucose ++
D(+)-Galactose ++
D-Fructose ++
D-Mannose ++
L(-)-Sorbose
Saccharose ++
Lactose ++
Cellobiose ~~
Di+)-Melibiose -
Positiv; rasch verflüssigt
Positiv
Beträchtliche Koagulation und leichte Peptonisierung. pH-Wert ins Alkalische verschoben. Gelbliches Ringwachstum
Negative Tyrosinase
Positiv
Reiches Wachstum bei 32-5O0C, mäßig bei 25-300C, beschränkt bei 230C und 520C, dürftig bei 200C und 54°C, kein Wachstum bei 120C und 56°C
Keine deutliche Inhibierung der Mycelbildung an der Luft unter einer fluoreszierenden Lampe von 15 W während 14 Tagen
Beschränktes Wachstum und Mycelbildung an der Luft in Leudemann's Agarmedium bei 5% NaCl. Kein Wachstum bei 7% NaCl
Normales Wachstum und Mycelbildung an der Luft beim Leudemann-Kartoffelstempeltest
Positiv
Negativ
Bu-2231-Komplex und Nebramycin-Faktoren
10
15
20
30
35
40
45
50
55
60
65
|§ Trehalose ++
Raffinose -
D(+)-Melezitose
Lösliche Stärke ++
Cellulose
Glycerin ++
Inosit
D-Majir/it
D-Sorbit
ίο Dulcit
Salizin
Basalmcdiunv Pridham-Gottlieb Salze-Medium,
ergänzt mit 0,1% Difco Hefeextrakt
Inkubationstemperatur: 37°C
Zusammensetzung der Zellwand
Die Präparation der Zeil wand wurde nach der von T. Yamaguchi in J. Bactenol. W: 444-453 (ivo5) bcschricbenen Methode durchgeführt. Die Analyse der Aminosäuren wurde wie folgt durchgeführt: 10 mg gereinigte Zellwand wurde in 1 ml6n-HCI in einem verschlossenen Rohr bei 1200C während 18 Stunden hydrolysiert. Das Hydrolysat wurde mit einem gleichen Volumen von destilliertem Wasser verdünnt, filtriert und anschließend im Vakuum zur Trockne verdampft. Die Hälfte des Endprodukts wurde erneut in 1 ml destilliertem Wasser gelöst und durch zweidimensionale Dünnschichtchromatographie untersucht. Die andere Hälfte wurde in 2 ml Citratpuffer (pH-Wert 2,2) gelöst und durch Flüssig-Chromatographie analysiert. Ein Teil von 5 ul des Hydrolysats wurde auf eine Siliciumdioxidgel-Dünnschichtplatte (60F254) aufgetragen und mit Phenol-Wasser (4:1) in einer Richtung und anschließend mit n-Butanol-Essigsäure-Wasser (3:1:1) senkrecht zum ersten Lauf entwickelt. Die Flecken wurden durch Aufsprühen von 0,2% äthanolischem Ninhydrin-Reagens, gefolgt von Erwär- hj men der Platte während 5 Minuten auf 1100C sichtbar gemacht. Zur Unterscheidung von meso- und/oder Bj
DD-DAP von LL-DAP wurden 5 al des Hydrolysats auf eine Cellulosepulver-Dünnschichtplalte aufgetragen. j|
Die Platte wurde.mit dem Lösungsmittelsystem Methanol-Wasser- 10n-HCl-Pyridin (80 : 17,5 : 2,5 : 10)während 24 Stunden entwickelt und anschließend mit 0,2% Ninhydrin-Reagens besprüht. In diesem Dünnschichtchromatographie-System bewegte sich LL-DAP rascher als das als Bezugsstandard verwendete meso-DAP. Die Aminosäuren in dem Zellwandpräparat wurden auch in einem Aminosäuren-Analysatorbestimmt. Die Aminosäurenanalyse des Zellwandpräparates von Stamm E 465-94 zeigte die Anwesenheit von meso-a,c-Diaminopimelinsäure (meso-DAP), Alanin und Glutaminsäure (Tabelle 4). Die Kohlenhydrate in der Zellwand wurden
„ wie folgt bestimmt: Eine Probe von 50 mg der rohen Zeliwand wurde in 3 rnl 2n-H2SO4 gelöst und in einem verschlossenen Rohr während zwei Stunden bei 12O0C hydrolysiert. Das Hydrolysat wurde mit gesättigter Ba(OH )2-Lösung neutralisiert, das ausgefällte BaSO4 wurde durch Zentrifugieren entfernt und die überstehende Flüssigkeit wurde lyophilisiert. Das so erhaltene Material wurde trimethylsilyliert und das Produkt wurde gaschromatographisch untersucht und mit verschiedenen Bezugszuckem verglichen. Die Kohlenhydratanaiyse de. Zellwand von E 465-94 zeigte die Anwesenheit von Rhamnose, Mannose, Galactose und Glucosamin an (Tabelle 5).
M Tabelle 4 ra
m Aminosäuren-Zusammensetzung der Zellwand
DAP (isomer) Glycin Glutaminsäure Asparaginsäure Alanin
++ (meso) ± ++ Spuren +++
Tabelle 5
Kohlenhydrat-Zusammensetzung der Zellwand
Arabinose Rhamnose Mannose Galactose Glucose Glucosamin
Vergleich mit Actinomyceten-Stämmen Herstellung von Antibiotika vom Bleomycin-Typ
Der Stamm E 465-94 erzeugt einen neuen antibiotischen Komplex Bu-2231, von dem angenommen wird, daß er aus Antibiotika vom Bleomycin-Typ besteht. Es wuraen daher Vergleiche mit verschiedenen Actinomycetes-Stämmen durchgeführt, von denen bekar «it ist, daß sie Bleomycin oder mit dem Bleomycin verwandte Antibiotika erzeugen. Die Ergebnisse sind in der Tabelle 6 aufgeführt. Der Stamm E 465-94 unterscheidet sich deutlich von jedem dieser Mikroorganismen.
'lnlic-lli- ί.
jj Vergleich des Stammes E 465-94 mit sechs Actinomyceten-Stämmen, die Antibiotika der Bleomycin-Gruppe erzeugen
j Name des Mikroorganismus Erzeugtes Antibiotikum Hauptunterschied zum Stamm E 465-'-4
Streptomyces verticillus Phleomycine Ringbildung. Positive Ausnutzung von
Nr. 843-1') Inosit, Mannit, RafTinose und Rhamnose.
Negative Verwertung von Galactose
Streptomyces verticillus Bleomycine Ringbildung. Negative Verwertung von
B 80-Z 22) Galactose, Lactose und Saccharose
Streptomyces bikiniensis Zorbamycine Luftwachstum grau bis grauartig-gelb.
Variation zorbonensis3) Sporophor gerade. Verwertung ++:
D-Xylose, L-Arabinose, Rhamnose,
Cellobiose.
Verwertung +: RafTinose, Duicit,
D-Mannit, D-Sorbit und Inosit
Streptomyces humidus YA-56 Komplex Luftmycel: Heilbräunlich-grau und 2"
Variation aütitumoris hygroskopisch.
MCRL-O387J) Positive Verwertung von Arabinose,
Xylose, Rhamnose, Mannit und Inosit
Streptosporangium Victomycin Bildung von sphärischem Sporangium,
violaceochromogenes Luftmycel: Muschel- bzw. Shell-rosa.
MK-495) Positive Verwertung von Xylose.
Negative Verwertung von Lactose
Streptosporangium Platomycine Bildung von sphärischem Sporangium,
violaceochromogenes Luftmycel weiß bis rötlich-weiß.
ΜΚ-Τδ*1) Positive Verwertung von Xylose.
Negative Verwertung von Lactose und
Glycerin
') K. Maeda et al. (Institute Microbial Chemistry): Japan. Patent 34-2598, April 17, 1959.
2) H. Umezawa et al.: New antibiotics, bleomycin A and B. J. Antibiotics 19: 200-209, 1966.
3) The Upjohn Company: British Patent 12 77 150, 7. Juni 1972.
4) T. Furumai et al.: The antibiotic YA-56 komplex: Taxonomy and production of the producing strain, j. Antibiotics 26: 70-76, 1973.
5) I. Kawamoto et al.: A new antibiotic victomycin (XK 49-1-B-2). J. Antibiotics 28: 358-3/1, 1975. '1I T. Nara et al. (kyowa-Hakko Kogyo Co., Ltd.): Japan. Kokai, 49-108292, 15. Oktober 1974.
Taxonomie-Klassifizierung
Der Actinomyceten-Stamm E 465-94 erzeugte auf Agar-Medium ein Büschel bzw. eine Traube und Sklerotium im an der Luft befindlichen Mycel, die morphologisch typisch für solche waren, die man bei gewissen Species von Streptomyces oder Chainia findet. Jedoch unterschieden sich die Aminosäure- und Zuckerzusammensetzung des Zellwandpräparates des Stammes E 465-94 stark von jeglicher Species der Familie Streptomycetaceae. Das Zellwandpräparat enthielt meso-a-r-Diaminopimelinsäure (meso-DAP) anstelle von LL-DAP, die als spezifischer Zellwandbaustein der Genera Streptomyces und Chainia berichtet wurde. Darüber hinaus waren die Hauptzuckerbestandteile des Stammes Galactose, Mannose und Rhamnose, die sich von den für Streptomyces oder Chainia berichteten stark unterscheiden. Aufgrund der vorstehenden Fakten wird vorgeschlagen, einen neuen Genus Streptoalioteichus (Strepto-ein Streptomyces-ähnlicher Organismus, allo-geändert und teichos-Wand, d. h. ein streptomycesartiger Organismus mit ungewöhnlicher Zellwandzusammensetzung) unter der Familie Streptomycetaceae zu schaffen, um Actinomycetenstämme, die Streptomyces in der Morphologie ähneln, die jedoch die Zellwandzusammensetzung des Stammes E 465-94 vom Typ meso-DAP, Alanin und Glutaminsäure als Hauptaminosäuren und Galactose, Mannose und Rhamnose als diagnostisch neutrale Zucker aufweisen, zu unterscheiden. So ist Streptoalioteichus ein alleiniger Genus unter den Genera der Familie Streptomycetaceae, der meso-DAP anstelle von LL-DAP in der Zellwandzusammensetzung aufweist. Es wird auch vorgeschlagen, den Stamm E 465-94 als Streptoalioteichus hindustanus gen.nov. und sp.nov. zu bezeichnen, da der Organismus in Nordindien isoliert wurde. Der Stamm E 465-94 erscheint deutlich unterschiedlich von den Mikroorganismen, die zur Herstellung von Bleomycinen und zum Bleomycin verwandten Antibiotika bekannt sind.
Herstellung der Antibiotika
Der Antibiotikakomplex Bu-2231 wird durch Kultivieren von Streptoalioteichus hindustanus E 465-94, ATCC 31158 unter submersen aeroben Bedingungen in einem wäßrigen Nährmedium erzeugt. Der Organismus
wird in einem Nährmedium gezüchtet, das eine Quelle für assimilierbaren Kohlenstoff, beispielsweise ei., assimilierbares Kohlenhydrat enthält. Beispiele für geeignete Kohlenstoffquellen umfassen Glucose, Ribose, Galactose. Fructose, Mannose, Saccharose, Lactose, lösliche Stärke und Glycerin. Das Nährmedium sollte auch eme Quelle für assimilierbaren StickstofFenthalten wie beispielsweise Fischmehl, Sojabohnenmehl, Mais- bzw. Kornquellwasser. Peptone, Fleischextrakt, Erdnußmehl, Hefeextrakt oder Ammoniumsalze. Anorganische Salze wie Natriumchlorid, Kaliumchlorid, Magnesiumsulfat, Calciumcarbonat, Phosphate usw. können gegebenenfalls zugesetzt werden. Spurenelemente wie Kupfer, Mangan, Eisen, Zink usw. werden dem Medium gegebenenfalls zugesetzt oder können als Verunreinigungen anderer Bestandteile des Mediums zugeführt werden. Die Inkubationstemperatur kann jegliche Temperatur sein, bei der ein Bu-223 !-erzeugender Stamm wachsen kann, |
ίο ζ. B. 20 bis 54°C. Vorzugsweise wird die Fermentation bei 25 bis 35°C und besonders bevorzugt bei 27 bis 32°C *
durchgeführt. In dem Medium wird vorzugsweise ein neutraler oder fast neutraler pH-Wert, z. B. pH etwa 6-7, angewendet und die Erzeugung des Antibiotikums wird im allgemeinen während etwa zwei bis sieben Tagen durchgeführt. Gewöhnlich wird eine optimale Produktion in drei bis fünf Tagen erzielt Zur Herstellung von relativ geringen Mengen können Schüttelkolben- und Oberflächenkulturen angewendet werden, jedoch wird für die Herstellung großer Mengen die submerse aerobe Kultur in sterilen Tanks bzw. Bottichen bevorzugt. Wird eine FeTnentation im Bottich durchgeführt, so ist es günstig, ein vegetatives Inokulum in einer Nährbrühe durch Inokulieren der Kulturbrühe mit einer Spore des Organismus herzustellen. Hat man ein junges aktives vegetatives Inokulum erhalten, so führt man dieses aseptisch in das Medium des Fermentationsbottichs über. Die Belüftung in Bottichen und Flaschen kann durch Einleiten von steriler Druckluft durch oder auf die Oberfl 20 fläche des Fermentationsmediums erfolgen. Darüber hinaus wird in den Bottichen mit einem mechanischen Flügelrührer gerührt. Gegebenenfalls kann ein Antischaummittel wie Specköi zugesetzt werden.
Die Erzeugung von Bu-2231 in dem FermentMionsmedium kann leicht im Verlaufder Fermentation durch die Papierscheiben-Agar-Diffusionsmethode unter Anwendung von Bacillus subtilis PCl-219 und Mycobacterium 607 Stamm M6-3 als Testorganismus verfolgt werden.
Bu-2231 A und B sowie die Nebramycin-Faktoren, von denen man annimmt, daß sie koproduziert werden, sind jeweils aktiv gegen B.subtilis PCI-219, jedoch zeigten lediglich die Komponenten Bu-2231 A und B eine Wirksamkeit gegen M.607 M 6-3. Bei der Fermentation im Schüttelkolben erzeugte der Stamm E 465-94 50-100 meg Bu-2231-Komplex/ml nach drei bis fünf Tagen.
Isolierung und Reinigung des Bu-2231-Komplexes
Nachdem die Nährbrühe ihr optimales Leistungsvermögen erreicht hat (wie beispielsweise durch die vorstehende Untersuchung bestimmt) werden das Mycel und die ungelösten Rückstände von der Fermentationsbrühe auf übliche Weise durch Filtrieren oder Zentrifugieren abgetrennt. Die antibiotische Aktivität ist im Filtrat enthalten und kann daraus durch Anwendung üblicher Adsorptionstechniken gewonnen werden. Die Adsorbentien. die man für die Gewinnung besonders bevorzugt verwendet, sind Kationenaustauscherharze, beispielsweise Harze vom Typ 5RC-5O, die im Handel unter dem Handelsnamen »Amberlite IRC-50« erhältlich sind. Das nötigenfalls auf den pH-Wert 7 neutralisierte Filtrat wird durch eine mit einem Kationenaustauscherharz wie Amberlite IRC-50 in der Ammoniumform gefüllte Säule geleitet. Es wird anschließend mit Wasser gewaschen. 40 Zusätzlich zudem Komplex Bu-2231 produziert der Organismus E 465-94 auch einen antibiotischen Aminogly-
kosidkomplex. der aus Nebramycinfaktoren besteht. Diese Aminoglykosidverunreinigung kann von dem Komplex Bu-2231 gemäß der Erfindung durch Eluieren mit einer verdünnten Base, z. B. O,25n-Ammoniumhydroxid abgetrennt werden. Der gewünschte Komplex Bu-2231. der auf dem Harz adsorbiert verbleibt, kann anschließend mit einer Mineralsäurelösung, z. B. Chlorwasserstoffsäure vom pH-Wert 2 eluiert werden und die Fraktionen von Bu-2231 des Eluats werden gesammelt und vereint.
Eine partielle Reinigung des Komplexes kann durch Chromatographie der vereinten Fraktionen von Bu-2231 an einem geeigneten Adsorbens wie Aktivkohle und Eluieren mit beispielsweise wäßrigem Butanol bei saurem pH-Wert erzielt werden Die Bütanolschicht wird abgetrennt und die wäßrige Schicht wird lyophilisiert oder im Vakuum konzentriert, wobei man den festen Bu-2231-Komplex erhält. Der Komplex, kann weiter chromatographiert und/oder einer Gelfiltration unterzogen werden, wobei man den gereinigten, kupferenthaltenden festen Komplex erhalt
Trennung der Komponenten Bu-2231 A und B
Die ülykopeptid-komponenten Bu-2231 A und B können von dem Komplex durch Gradienten-Elutions-Chromatographie über einem modifizierten Dextranderivat als Kationenaustauscher abgetrennt werden. Beispielsweise kann ein modifiziertes Polysacchariddextran des im Handel unter dem Namen CM-Sephadex C-25 üblichen Typs verwendet werden. Eine wäßrige Lösung des Komplexes Bu-2231, der vorzugsweise wie vorstehend beschrieben gereinigt wurde, wird in eine Säule gefüllt, die den modifizierten Dextranionenaustauscher enthalt. Wie im Falle der Bleomycine (J. Antibiotics, 19, 210-21 [1966]) ist es leichter, die Komponenten auf diese Weise abzutrennen, wenn der Komplex mit Kupfer ausreichend cheliert ist. Die bevorzugte Herstcllungsweise umfaßt so das Auflösen des Komplexes in einer Kupfcr-II-Chloridlösung, um sicherzustellen, daß er in einer ausreichend chclicrtcn Form mit Kupfer vorliegt und das Einbringen dieser Lösung in die Säule. Die Komponenten werden anschließend stufenweise mit wäßriger Ammoniumformiatlösung in von 1 bis 7% variieren-
c.s den Konzentrationen eluiert. In den ersten Fraktionen erscheint das Bu-2231 B, während das Bu-2231 A in den letzten Fraktionen des Eluats enthalten ist. Die die gleichen Komponenten enthaltenden Fraktionen werden vereint, durch Gelfiltration entsalzt, konzentriert und lyophilisiert, wobei man die gereinigten Komponenten Bu-2231 Λ und B in Form ihrer Kupfcrkomplexe erhält.
Cu-A 0,22
Cu-B 0,41
Freies A 0,16
Freies B 0,31
Bleomycine 0,34, 0,44, 0,69
Phleomycine 0,37, 0,54, 0,72
Die Anwendung von Ammoniumforraiat als Eluiermittel bei der chromatographischen Trennung, die vorstehend beschrieben wurde, führt dazu, daß man die Komponenten beim Lyophilisicren als Formialsal/e erhält. Zur Umwandlung der Formiatsalze in die jeweiligen freien Basen und/oder /ur Umwandlung der Formialsal/e oder der freien Basen in andere gewünschte SäureaddilionssaUe, /. B. die llydrochloridsal/e, können dem Fachmann bekannte bzw. übliche Standardiechniken verwendet werden. >
Die Glykopeptid-Komponenten Bu-2231 A und B weisen wie die Bleomycine die Eigenschaft auf, mit Kupfer Chelate zu bilden und die Komponenten und ihre Säureadditionssalze können daher entweder in der Kupferkomplexform oder in der kupferfreien Form vorliegen. Die kupferfreien Formen von Bu-2231 A und B können aus den Kupferkomplexen durch Anwendung von H2S in Methanol, wie in der US-Patentschrift 36 46 197 beschrieben, hergestellt werden.
Die beiden Glykopeptid-Antibiotikakomponenten können voneinander und von den verwandten Bleomycinen und Phleomycinen entweder in Form des Kupferkomplexes oder in der kupferfreien Form durch die in der nachstehenden Tabelle 7 gezeigten Dünnschichtsysteme S-102 und S-123 unterschieden werden.
Tabelle 7 is
Rf-Werte
S-102 S-123
0,05 0,11 0,04
0,09 25
0,21,0,50,0,79 0,22, 0,41, 0,59
S-102: SiO2-PIaUe, CHjOH-10% CH3COONH4 (1 : 1)
S-123: SiO2-PIaUe, CH,OH-10% CH3COONH4-IO0Zo NH4OH (10 : 9 : 1)
Daten zur Charakterisierung von Bu-2231
Antibioti-sche Komponenten ,5
Die antibiotischen Substanzen Bu-2231 A und B sind jeweils amorphe Basen, die in der Form des Kupferkomplexes als blaue Feststoffe und in der kupferfreien Form als weiße Feststoffe vorliegen. Beids Substanzen sind in Wasser und Methanol löslich, gering löslich in Äthanol und praktisch unlöslich in anderen organischen Lösungsmitteln.
Bu-2231 A und B können mit Säuren Salze bilden und die pharmazeutisch brauchbaren Säureadditionssalze der Antibiotika werden von der vorliegenden Erfindung umfaßt. Beispiele für geeignete pharmazeutisch brauchbare Säureadditionssalze umfassen die nicht-toxischen Salze mit organischen und anorganischen Säuren wie beispielsweise Chlorwasserstoffsäure, Schwefelsäure, Phosphorsäure, Essigsäure, Ameisensäure, Stearinsäure, Propionsäure, Weinsäure, Maleinsäure, Benzoesäure, Bernsteinsäure und dergleichen.
Die Elementaranalysen des Kupferkomplexes und der kupferfreien Verbindungen Bu-2231 A und B sind im folgenden angegeben:
Bu-2231 A (Kupferkomplex):
CwH,,:N:uO,2S,Cu ^
ber.: C 42,68. H 6,27, N 15,56, S 3,56
gef.: C 42,66, H 6,16, N 15,31. S 3,14
Bu-221·! A (kupierfrei):
C64H H2N2nO12S;
ber.: C 44,24. H 6,50, N 16,12, S 3,69
gef: C 45,10, H 6,51, N 16,05, S 3,55
Bu-2231 B (Kupferkomplex):
C^H100N18O31S2Cu «'
ber.: C 41,63, H 6,02, N 15,07, S 3,83
gef.: C 40,96, H 5,61, N 14,78, S 3,39
Bu-2231 B (kupferfrei): ()5
C58H100N18O31S2
ber.: C 43,27, H 6,26, N 15,66, S 3,98
gef: C 43,01, H 6,22, N 14,81, S 3,6i
Der Kupfergehalt wurde in einer vereinten Probe von Bu-2231 A und B durch Atomabsorptionsspektrometrie als etwa 3% bestimmt.
Die Ultraviolettabsorptionsmaxima und die optische Drehung der Komponenten sind im folgenden aufgeführt:
Verbindung UV Absorption (c 0,5, H2O)
ft° in m;x (£!'ot) +50°
Bu-2231 A (Kupferkomplex) 243 (125), 291 (98) -21
Bu-2231 A (kupferfrei) 235 (Sch), 290 (67) +76
Bu-2231 B (Kuprerkomplex) 243(134), 291 (109) -19
Bu-223 ί Β {kupferfrei) 235 (Sch), 289,5 (77) -
Bleomycin A (Kupferkomplex) 212(149), 291 (121) +84,5
Phleomycin (Kupferkomplex) 244(138), 301 (49)
(Literatur ref.)
Das Verhai«nis der UV-Absorptionsvermögen der beiden Absorptionsmaxima für Bu-2231 (relatives Absorptionsvermögen bei 240 rna und 2% rnto.: 1,2-1,3) läßt eher auf die Ähnlichkeit der neuen Komplexe mit Antibiotika der Bleomycin-Gruppe schließen als mit solchen der Phleomycin-Gruppe.
Die Infrarot- und kernmagnetischen Resonanz-Spektren des kupferfreien Hydrochloridsalzes von Bu-2231 A und des kupferfreien Formiaisalzes von Bu-2231 B sind in den beigefügten F i g. 1 bis 4 angegeben.
Beide antibiotischen Komponenten ergeben positive Reaktionen mit dem Ninhydrin-Reagens.
Strukturmerkmale der Komponenten von Bu-Z^l
Die nahe strukturelle Ähnlichkeit von Bu-2231 A und B mit Bleomycin wurde durch die vorstehend beschriebenen physikalisch-chemischen Eigenschaften aufgezeigt. Die kupferfreien Präparate der beiden Komponenten sowie Bleom: ein A2 wurden in einem verschlossenen Rohr mit 6n-HCl während 20 Stunden bei 1050C hydrolysiert. Jedes der Hydrolysate wurde im Vergleich durch Hochspannungs-Papierelektrophorese untersucht. Die Lokalisation der Aminosäuren wurde mit Ninhydrin-Reagens sowie auch durch UV-Licht bestimmt.
Wie in der Tabelle 8 gezeigt, wurde jede der sechs Aminosäuren (I bis VI) und ein Aminrest (VlI) des Bleomyeins A2, der in der Literatur best-jirieben wird (J. Antibiotics 21: 79,1968) durch Papierelektrophorese identifiziert. Die Hydrolyseprodukte von Bu-2231 A und B zeigten positive Ninhydrin-Zonen, die den Aminosäuren I, II, IV and V des Bleomycins A2 entsprachen. Die Identität jeder der vier aus Bu-2231 A und B isolierten Aminosäuren mit den Aminosäuren J, II, IV und V aus Bleomycin A2 wurde chemisch und spektroskopisch bewiesen. Die Aminosäure III (Zone bei 13,5 cm) des Bleomycins A2 war in Bu-2231 A und B nicht vorhanden. Dieses zeigte indessen eine zusätzliche Ninhydrin-positive Zone bei 14,8 cm (bezeichnet als Aminosäure VIII). Die Struktur der Aminosäure VIII wurde als 4-Amino-3-hydroxy-n-valeriansäure bestimmt, die das Desmethylanalogon der Aminosäure III ist.
Die Aminosäure VI (Zone bei 8,5 cm, UV-Absorptionsmaximum bei 290 nw) des Bleomycins A2 war in Bu-2231 A und B nicht vorhanden. Jedoch wurde eine saure Verbindung (IX) mit einem UV-Absorptionsmaximum bei 283 m-i (£jan = 280) als Ausfällung aus dem sauren Hydrolysat von Bu-2231 A und B isoliert.
Der endständige Aminorest (VII der Tabelle 8) von Bleomycin A2 erschien in der Zone 31,5 cm. Bu-2231 A und B ergaben dieselbe Zone wie das Amin VII des Bleomycins A2,jedoch zeigen verschiedene Aminoreste des Bleomycin-Komplexes eine vergleichbare Mobilität bei dieser Papierelektrophorese-Methode.
Die anschließende Analyse zeigt tatsächlich, daß der endständige Aminorest von Bu-2231 A und B Spermidin (X), der Aminorest von Bleomycin A5 ist. Bu-2231 A ergab eine zusätzliche Ninhydrin-positive Zone bei 23,0 cm (XJ der Tabelle 8), die im Bleomycin A2 und Bu-2231 B nicht vorhanden war. Die verbindung XI wurde alsjS-Lysin identifiziert.
Die Strukturen der vorstehend beschriebenen Aminosäuren und Aminoreste sind im nachfolgenden aufgeführt:
Aminosäuren und Amin-Bestandteile von Bleomycin A2 und Bu-2231 A und B
I CH1-CH-CH-COOH
OH NH2
L-Threonin
Η,Ν
"Vn
Π CH3-<ζ V-CH-CH2-COOH
jS-Amino-^ß-(4-amino-6-carboxy-5-methyl-pyrimidin-2-yl !-propionsäure
m CHj—CH—cH—CH—cooH ίο
I I I
NH2 OH CH,
4-Amino-3-hydroxy-2-methyl-n-valeriansäure
N—π—CH-CH-COOH
iv I Π Ι
VN/ OH NH2
H 20
yj-Hydroxyhistidin
V NH2-CH2-CH-COOH
NH2 L-jS-Aminoalanin
r N—π—COOH
VI N-^Ji15)
NH2-CH2-CH2-^5
2'-(2-Aminoäthyl)-2,4'-bithiazol-4-carbonsäure 35
NH2-(CHj)3-S+(CHj)2 · X"
3-AminopropyIdimethyIsulfoniumsalz
CH3-CH-CH-CH-COOH NH2 OH
45
4-Amino-3-hydroxy-n-valeriansäure
IX Unbekannte Struktur (/£"iOH 283 mu)
X NH2-(CH3V-NH- (CHj)4-NH2 (Spermidin) 50
XI NH2—(CH2)j—CH — CH2—COOK (/J-Lysin)
NH2 55
Die Zuckerkomponente von Bu-2231 A und B wurde auch im Vergleich mit Bleomycin untersucht. Eine Mischung der Komponenten A and B wurde in Methanol mit einem stark sauren Harz (Amberlyst 15) während 20 Stunden unter Rückfluß erwärmt. Basische Fragmente der Hydrolyse wurden an dem Harz adsorbiert und neutrale Produkte, die in der Lösung freigesetzt wurden, wurden im Vakuum zu einem klebrigen Sirup konzen- 60 triert. Dieses Material wurde trimethylsilyliert und anschließend gaschromatographisch analysiert. Bleomycin ergab Peaks, die Glucose und Mannose zuzuordnen waren, und die Bu-2231-Komponenten zeigten Fast das gleiche Eluierungsmuster wie das Bleomycin, was die gleiche Struktur des Kohlenhydratteils der Antibiotika
anzeigte.
Tabelle 8
Papierelektrophorese von Produkten der sauren Hydrolyse
Aminosäuren und Amin*)
Lokalisierung von Ninhydrin-positiven Zonen (Entfernung vom Ausgangspunkt)**)
Bleomycin A2 Bu-2231 A Bu-2231 B
(cm)
VI
II
III
VIII
IV
XI
VII(X)
8,5
9,7
12,0
13,5
16.0
31,5
9,7 12,0
14,8 16,0 18,5 23,0 31,5
9,7 12,0
14,8 16.0
31,5
*) Die Strukturen der Aminosäure- und Amin-Komponenten sind im Text angegeben. *) Toyo Filterpapier Nr. 51, PulTerliisung: Ameisensäure-Essigsäure-Wasser
(25 : 75 : 900).
Antimikrobielle Wirksamkeit
Die minimalen inhibitorischen Konzentrationen (MIC) von Bu-2231 A und B wurden gegenüber einer Vielzahl von Bakterien und Fungi nach der zweifachen Agar-Verdünnungsmethode untersucht. Es wurde ein Müller-Hinton-Agar-Medium zur Bestimmung der bakteriellen MIC-Werte (grampositiv und gramnegativ) verwendet. Für säurefeste Bakterien wurde ein Medium Nr. 1001 verwendet [Glycerin (3%;, Natriumglutamat (0,3%), Pepton (0,2%), Na2HPO4 (0,31%), KH2PO4 (0,1%), Ammoniumeitrat (0,005%), MgSO4 ■ 7 H2O (0,001%), Agar (1,5%)]. Für Fungi wurde ein Sabouraud-Agar verwendet.
Die Ergebnisse sind in den Tabellen 9 und 10 im Vergleich mit Bleomycin und Phleomycin aufgezeigt. Die antibakteriellen Wirksamkeiten und Antifungus-Wirksamkeit von Bu-2231 A und B liegen über denen der Vergieichsantibiotika. Bu-223 i A zeigte eine etwas stärkere antibakteriell Wirksamkeit als das Bu-2231 B5 war jedoch in seiner Antifungus-Wirksamkeit geringer.
40 Tabelle 9
Antibakterielle Spektren von Bu-2231 A und B
Testorganismus
Bu-2231 A
Cufrei
Cu-Komplex
Bu-2231 B
Cufrei
Cu-Komplex
Bleomycin NIHJ
Phleomycin Nr. 616
gramnegativ
E.coiiNIHJ 0,025 0,025 0,2 0,1 0,8 0,8
E.coli Juhl A15119 0,1 0,1 0,2 0,2 1,6 1,6
E.coli K-12 A9632 0,05 0,05 0,1 0,2 0,8 1,6
E.coli A20665 0,05 0,05 0,05 0,25 0,2 0,4
EcoliA20683 6,3 25 12,5 50 >100 >100
E.coli A20732 0.05 0,05 0,2 0,1 1,6 1,6
E.cloacae A21006 1.6 1,6 6,3 12,5 >100 50
K.pneumoniae DIl <0.0063 0,0125 0,025 <0,0063 0,2 0,4
fCpneumoniae A9678 0.2 0,4 0,4 0,4 6,3 12,5
K.pneumoniae A20680 6,3 50 25 100 > 100 >100
K.pneumoniae A20328 0.8 0,8 1.6 1,6 25 >100
P vulgaris A9436 0.2 0.4 0,2 0,2 6,3 0,8
P morp.mii .-W53 0,4 0.4 1.6 1.6 >100 6,3
l'mir.ihili. \«>Svj (i.| rj.l 0.2 0,2 50 1,6
l'iYiigcn AIMi.1 i!.4 0.4 0.8 0.8 > 100 3.1
l'siiKirtii \:nsi4 (1.4 0,4 0.4 0.8 3.1 0.8
I* siiiarln A2O7.U 0.4 0.4 0.8 0.8 >I00 1.6
Fortsetzung
Testorganismus
Bu-2231 A
Cu-Irei
Cu-Komplex
Bu-2231 B
Cufrei
Cu-Komplex
Bleomycin NlHJ
Phleomycin Nr.
grar>:iegativ S.marcescens A20019 S.marcescens A20460 S.marcescens A20333 S.marcescens A21235 P.aeruginosa A9923 P.aeruginosa A9930 P.aeruginosa H9, D P.aeruginosa A20741
grampositiv S.aureus 209P S.aureus Smith A9537 S.aureus Nr. S.aureus 209P, R4 S aureus A20239 S.aureus BX-1633, A9606 S.lutea PCI-1001 M.flavus D12 B.mycoides »0« B.sphaericus Nr. B.cjreus ATCC 10702A B.subtilis PCI-219 B.anthracis
säurefest Mycobacterium 607, D87 Mycobacterium 607. D46 Mycobacterium 607, D47 Mycobacterium phlei, D88 Mycobacterium ranae, ATCCIlO
0,4 0,4 0,8 0,8 >100 0,8
0,4 0,4 0,8 0,8 >100 0,8
0,2 0,2 0,8 0,4 >100 0,8
0.2 0,4 1,6 1,6 100 0,8
50 >100 >100 >100 >100 >100
0,4 0,4 0,8 1,6 >100 3,1
>100 >100 >100 >100 >100 >100
0,2 0,2 0,2 0,2 12,5 6,3
0,1 0,2 0,4 0,4 6,3 0,2
0,1 0,1 0,05 0,05 3,1 0,1
0,1 0,2 0,4 0,4 12,5 0,2
0,4 0,4 0,8 0,8 12,5 0,4
0,2 0,2 0,8 0,8 12,5 0,4
0,2 0,2 0,8 0,2 6,3 0,4
0,2 0,2 0,4 0,8 100 0,4
0,2 0,2 0,4 0,8 50 0,2
0,2 0,1 0,2 0,2 12,5 0,2
<0,0063 <0,0063 0,2 0,2 6,3 0,4
0,2 0,2 0,2 0,1 1,6 0,2
<0,0063 <0,0063 <0,0063 <0,0063 <0,0063 <0,0063
0,05 0,05 0,1 0,2 12,5 0,4
0,2 0,1 0,1 0,05 0,8 0,4
0.1 0.1 0,1 0,05 0,2 0,2
0,1 0,1 0,05 0,025 0,4 0,2
0,05 0,05 0,05 0,025 0,2 0,1
0,1 0,1 0,1 0,05 0,8 0,4
Tabelle
Antifungus-Spektrum von Bu-2231 A und B
BBRI Code-Nr.
Testorganismus
Bu-2231 A
Cufrei
Cu-Komplex
Bu-2231 B
Cufrei
Cu-Kompiex
Bleomycin NIHJ
Phleomycin Nr.
Ck-2
Cn-2
An-I
C. albicans IAM 4888 0,8 1,6 0,8 0,8 12,5 3.1
C. albicans Nystatin-R 0,8 1.6 0,8 0,8 12,5 1,6
C. albicans # 520 Yale A9540 3,1 6,3 1,6 3,1 >100 6,3
C. krusei IAM 4489 0,8 0,8 0,4 0,2 12,5 0,8
C. krusei #96 A15052 0,8 0,8 0,4 0,2 3,1 0.8
C. tropicalis IAM 4157 0,8 1.6 0,8 0,8 12,5 3,1
C. tropicalis #125 A15051 0,8 1,6 0,8 0.8 >100 6,3
C. neo formans 0,4 0,2 0,2 0,i 1,6 0,4
C. neo formans IAM 4514 0,4 0,2 0,2 0,1 1,6 0,4
S. cerevisiae ATCC 9763 0,4 0,2 0,2 0.1 0,8 0,8
S. cerevisiae IAM 4009 0,4 0,2 0,2 0,1 0,4 0,8
A. niger var Tieghem 0,2 0,2 0,2 0,2 0,4 0,4
A. fumigatus IAM 2530 0,8 0,4 0,4 0,2 0,8 0,8
Hormodendrum sp. 0,8 0,2 0,2 0,2 0,8 0,8
Sporotrichum sp. 3,1 3,1 3,1 1,6 >100 12,5
13
Fortsetzung Testorganismus Bu-2231 A Cu- Bu-2231 B Cu- Bleomycin Phleomycin
BBRI Cu- Komplex Cu- Komplex NIHJ Nr. 616
Codc-Nr. l'rei 6,3 IVe i 3,1
Verticillium sp. 3,1 6,3 1,6 3,1 6,3 6,3
Vx-I Mucor sp. 6,3 0,8 3,1 0,8 3,1 3,1
My-I F. monililbrme NRRL A2284 0,8 0,2 0,8 0,2 >100 12,5
Fm-I C. lunata ATCC 13432 0,8 1,6 0,2 0,8 0,1 0,4
Cl-I P. citrinum IAM 7008 1,6 12,5 1,6 6,3 >100 3,1
Pt-I T. mentagrophytes D-155 12,5 1,6 6,3 1,6 >100 12,5
Tm-I T. asteroides 3,1 1,6 0,8 1,6 >100 6,3
Ta-I T. rubrum D-55 3,1 1,6 0,8 1,6 >100 3,1
Tr-I M. canis D-51 3,1 0,8 >100 6,3
Mc-I
Die Aktivität in vivo des Bu-223 l-Kornplsxes wurde an experimentellen Infektionen von Mäusen gegen S.aureus Smith und E.coli NIHJ untersucht. Als Vergleichsantibiotikum wurde Bleomycin verwendet. Die Ergebnisse sind in der Tabelle 11 aufgeführt. Bu-2231 war etwa 20fach (S.aureus) bis 80fach (E.coli) wirksamer als Bleomycin, ausgedrückt als Wert der mittleren Schutzdosis (PD50).
Tabelle 11
Aktivität in vivo von Bu-2231
Dosis (se)
8 mg/kg
0,5 0,25 0,13 0,06 0,03 PD50
Dosis (se)
8 mg/kg
0,5 0,13 0,03 0,008 PD50
gegenüber S.aureus Smith-Infektion
Bu-2231(A+ B) Bleomycin
5/5 5/5 5/5 1/5 1/5 0/5 0,14 mg/kg
4/5 2/5
1/5 0/5
2,5 mg/kg
gegenüber E.coli NIHJ-Infektion
Bu-2231 (A + B) Bleomycin
0,031 mg/kg
5/5 1/5 1/5 0/5
2,55 mg/kg
Die Aktivität in vivo der einzelnen Komponenten von Bu-2231 wurde sowohl in der kupferfreien als auch in der Form des Kupfer-Komplexes bei der E.coli-Infektion untersucht. Wie aus der Tabelle 12 ersichtlich ist, war das Bu-2231 A etwas aktiver als das Bu-2231 B. Die Anwesenheit des Kupfers im Bu-2231-Molekül beeinflußte die in vivo-Wirkung nicht nennenswert.
26 38 760
Tiibeflc 12
Akliviliil ir· vivo von Bu-2231 Λ und U in der kupluri'ruicn Form sowie in der Form des Kupfcr-Kompluxcs (gugun li.coli NillJ-lnl'oktion)
Dosis (sei
Bu-2231 A
Cu-trei
Cu-Komplex
IUi-22.11 U
Cu-lrei
5/5
5/5
5/5
3/5
1/5
0,024 mg/kg
5/5 5/5 5/5 4/5 3/5 0/5 0,031 mg/kg
5/5
5/5
4/5
1/5
0/5
0,065 mg/kg
3/5
5/5
5/5
3/5
2/5
2/5
0,040 mg/kg
Die akute Toxizität des kupferfreien Bu-223i A und B wurde au Mäusen durch eine einzige subcutane Injek tion bestimmt. Für jede Dosis wurden Gruppen von drei Mäusen verwendet und das Körpergewicht wurde während 16 Tagen aufgezeichnet. Die Ergebnisse sind in der Tabelle 13 aufgeführt. Das Bu-2231 A erwies sich als etwas toxischer als das Bu-2231 B. Bei einer Dosis bis zu 50 mg/kg traten bei Bu-2231 B keine Todesfälle auf, jedoch wurde an allen untersuchten Tieren eine Abnahme des Körpergewichts festgestellt.
Tabelle 13
Akute Toxizität von Bu-2231
Dosis (se)
Arifihl der überlebenden Tiere an jedem Tag
0 4 5 9 12 16
Mittleres Körpergewicht (g) LD50
10 16
Bu-2231 A, Cu-frei J 2 1 0 0 0 19,3 15,0 - - 28 mg/kg
50 mg/kg 3 3 3 3 2 2 20,0 14,7 13,3 14,5 28 mg/kg
25 3 3 3 3 3 3 20,0 16,7 15,7 16,3 28 mg/kg
12,5 3 3 3 3 3 3 20,0 18,7 17,3 19,3 28 mg/kg
6,3
Bu-2231 B, Cu-frei 3 3 3 3 3 3 19,3 15,7 14,7 15,3 >50 mg/kg
50 mg/kg 3 3 3 3 3 3 18,7 15,7 16,7 17,3 >50 mg/kg
25 3 3 3 3 3 3 20,0 16,7 19,3 20,7 >50 mg/kg
12,5 3 3 3 3 3 3 18,7 16,0 18,7 20,3 >50 mg/kg
6,3
Tumorwirksamkeit
Es wurde auch gefunden, daß der Bu-2231-Komplex und seine Hauptkomponenten Bu-2231 A und B zusätzlich zu der vorstehend gezeigten antimikrobiellen Wiirksamkeit auch verschiedene experimentelle Tumore bei Tieren inhibieren. Im nachfolgenden sind Untersuchungen beschrieben, die an zwei transplantierten Nagetiertumorsystemen durchgeführt wurden, nämlich am Walker 256 Karzinosarkom in der Ascitesform und am Lewis-Lungenkarzinom mit intraperitonealer Tumorbreiverpflanzung. Die angewendete Methodologie entsprach im allgemeinen der vom National Cancer Institute in Cancer Chemotherapy Reports 3 (2): 1-103 (1972) beschriebenen. Die wesentlichen Einzelheiten der Untersuchungen sind in den nachfolgenden Tabellen I bis III aufgeführt.
15
Tabelle I
Wirkung von Bu-2231 auf den Walker 256-Ascites-Tumor
Versuch-Nr. 5439
Verbindurm
Dosis
MST
racg/kg/Tag Tage
Bleomycin
Bu-2231
2560
640
160
2560
640
160
40
10
Kontrollsalzlösung
>44,0
17,5
10,0
26,0
>44,0
>44,0
wirkung
MST
%T/C		 _ Durchschnitt
liche Gewichts
änderung/g		 Überlebende
Tag
5		 Tag
44
>489 + 10 6/6 4/6
194 +9 6/6 1/6
111 + 11 6/6 0/6
288 +7,5 6/6 0/6
>489 +18 6/6 5/6
>489 + 19 6/6 4/6
100 + 19,5 6/6 1/6
94 + 18 6/6 1/6
+34 10/10 0/10
Tumor: 1O6 Asciteszellen, i.p. in weibliche SD-Ratten implantiert.
Behandlung: Einmal täglich während acht Tagen, beginnend mit dem ersten Tag i.p.
Bewertung: MST = Mittlere Überlebenszeit in Tagen.
Wirkung: %T/C = MST behandelt/MST Kontrolle x 100.
Kriterien: T/C > 125 bedeutet eine beträchtliche Inhibierung des Tuntors (Verlängerung der Lebensdauer
des Wines).
Überlebende: Bewertung der Toxizität und der Gewichtsänderung arn 5. Tag; am 44. Tag wurde die Untersuchung abgeschlossen. Die Überlebenden waren »geheilt«. Die anderen Tiere starben am Tumor.
Tabelle II
Wirkung der Bu-223 !-Fraktionen auf den Walker 256-Ascites-Tumor - Untersuchung Nr. 5501
Verbindung
Dosis
mcg/kg/Tag
Wirkung MST
%T/C
Blecmvcin
Bu-2231 A
Bu-2231 B
Kontrollsalzlösung
640
160
640
160
40
10
640
160
40
10
179 157 250 179 157 129 186 186 157 114
Durchschnitt Überlebende
liche Gewichts
änderung/g lag
5
+4,5 6/6
+7,8 6/6
+7,2 6/6
+28,8 6/6
+6,0 6/6
+5,5 6/6
+ 10,7 6/6
+36,5 6/6
+8,3 0/6
+36,5 6/6
+38,4 10/10
Tumor: 106 Asciteszellen, implantiert i.p. in weibliche SD-Ratten.
Behandlung: Einmal täglich i.p. während acht Tagen, beginnend am ersten Tag.
Bewertung: MST = Mittlere Überlebenszeit in Tagen.
Wirkung: %T/C = MST behandelt/MST Kontrolle X 100.
Kriterien: T/C > 125 bedeutet eine beträchtliche Inhibierung des Tumors (Verlängerung der Überlebenszeit des Wirtes).
Überlebende: Toxizitätsbewertung und Aufzeichnung der Gewichtsänderung am 5. Tag.
Tabelle III
Wirkung der Bu-223 !-Fraktionen auf das Lewis'sche Lungenkarzinom - Untersuchung Nr. 55
Verbindung
Dosis
mcg/kg/Tag
MST
Tage
Wirkung MST
Bleomycin
Bu-2231 A
B u-223 i B
Bu-2231 B
Kontrollsalzlösung
8
4
2
1
8
4
2
1
0,5
O
O
4
2
1
0,5
10,5 12,5 24,0 24,0 6,0 7,0 25,0 27,0 26,5 6,0 10,5 30,0 29,5 22,5 22,0
109
109
114
123
120
48
136
134
102
Durchschnitt Überlebende 6/6
liche Gewichis- T-ip 6/6
änderung/g Uli, 6/6
5 6/6
-i,i 6/6
-2,3 6/6
-1,5 6/6
-1,3 6/6
-3,3 6/6
-3,1 5/6
-1,3 6/6
-2,3 6/6
-1,1 6/6
-1,8 6,6
-1,4 10/10
-1,8
-0,8
-1,1
-0,8
Tumor:
Behandlung:
Bewertung:
Wirkung:
Kriterien:
20
25
2 x 10" Zellen aus zerkleinertem Tumorbrei implantiert i.p. in männliche C57 Bl/6 Mäuse. Einmal täglich i.p. während neun Tagen, beginnend am ersten Tag.
MST = Mittlere Überlebenszeit in Tagen.
%T/C = MST behandelt/MST Kontrolle x 100.
T/C > 125 bedeutet eine beträchtliche Inhibierung des Tumors (Verlängerung der Lebenszeit des Wirtes).
Überlebende: Bewertung der Toxizität und Aufzeichnung der Gewichtsänderung am 5. Tag.
Die in den Tabellen aufgerührten Ergebnisse sind folgendermaßen zu interpretieren:
Tabelle I
Die Untersuchungen wurden am Walker 256-Ascites-Tumor mit dem Komplex Bu-2231 sowie mit dem Bleomycin-Komplex zum Vergleich durchgeführt. Die Dosis von 2560 mcg/kg ist wirksam, jedoch toxisch, da der Wert T/C unter der nächstniedrigeren Dosis lag und keine langzeitigen Überlebenden (44 Tage) festgestellt wurden. Die minimal wirksame Dosis (MED) des Bleomycms betrug 640 mcg/kg, wohingegen die MED von Bu-2231 160 mcg/kg betrug, was anzeigte, daß Bu-2231 etwa viermal stärker wirksam als Bleomycin ist.
Tabelle II
Bu-2231 A und B wurden in Form ihrer kupferfreien Formiatsa'ze am Walker 256-Ascites-Tumor untersucht. Die wahrscheinlich minimal wirksame Dosis (MED) beträgt bei dieser Untersuchung 160 mcg/kg. Ein vergleichsweiser Anstieg der Überlebenden (T/C = 157) wurde bei beiden Komponenten bei 40 mcg/kg festgestellt, was anzeigt, daß die Wirksamkeit von 3u-2231 A und B vierfach überlegen ist. Die Komponente A kann leicht wirksamer sein als die Komponente B (Wirksamkeit bei 10 mcg/kg), jedoch kann der Unterschied nicht als bedeutend angesehen werden.
Tabelle III
Bleomycin zeigte gelegentlich bei der Untersuchung am Lewis-Lungenkarzinom starke Grenzwirkungen. Bei dieser Untersuchung lag Bu-2231 A bei einer Verabreichung von 1 mg/kg (T/C = 123) gerade unter dem aktiven Niveau, wohingegen Bu-2231 B bei Dosierungen von 2 Und 1 mg/kg aktiv war.
Die folgenden Beispiele dienen zur Erläuterung der Erfindung. CM-Sephadex C-25 ist ein Handelsname für ein trockenes unlösliches Pulver, bestehend aus mikroskopischen Kügelchen, die synthetische organische Verbindungen sind und funktionell Carboxymethylgruppen enthalten, und sich von Polysaechariddextran ableiten. Amberlyst 15 ist ein Handelsname für ein Ionenaustauscherharz. Amberlite XAD-2 ist ein Warenzeichen für ein adsorbierendes Harz, das aus einem Styrol-divinylbenzol-Copolymeren besteht.
40
45
50
60
65
15
Beispiel 1
Fermentation des Komplexes
Eine gut gewachsene Agar-Schrägkultur des Bu-2231 produzierenden Organismus E 465-94 (= ATCC 31158) wurde zum Inokulieren eines flüssigen wachstumfördernden Mediums aus folgenden Bestandteilen verwendet· 1 5% Glucose, 0,5% Polypepton,0,2% Hefeextrakt, 0,05% K2HPO4 und 0,05% MgSO4 - 7 H2O. Die Impfkultur wurde bei 28°C während zwei Tagen auf einem Rotationsschüttler (250 Upm) inkubiert und 2 ml der Kultur wurden in 100 ml des Fermentationsmediums in einem 500 ml Erlenmeyer-Kolben gefügt, das folgende Zusammensetzung aufwies: 2% Glycerin, 1% Pharmamedien, 1% Maisquellwasser, 0,3% (NH,)2SO4, 0,003% ZnSO4 · 7 H2O und 0,4% CaCO,. Die Erzeugung des Antibiotikums erreichte nach drei- bis fünftägigem Schütteln bei 28°C ein Maximum.
Beispiel 2
Extraktion und Reinigung
Die gewonnene Brühe (etwa 101,50 mcg/ml), die gemäß Beispiel 1 hergestellt wurde, wurde filtriert und das bioaktive Material im Filtrat wurde beim pH-Wert 7 an Amberlite IRC-50 (NH4 +-Form, 900 ml) adsorbiert. Das Harz wurde mit 5 1 Wasser und anschließend mit 4 10,25n-NH4OH-Lösung gewaschen, um Nebramycin-Faktoren zu eluieren. Der Bu-2231-Komplex wurde anschließend mit dreimal ein Liter HCl-Lösung vom pH-Wert 2 eluiert Die· "Ju-2231-Fraktionen wurden vereint, an 30 g Kohle adsorbiert und mit dreimal ein Liter wäßrigem Butar.o! vom pH-Wert 2 eluiert. Die Butanolschicht wurde abgetrennt und die wäßrige Schicht wurde im Vakuum zur Trockne konzentriert. Der so erhaltene rohe Feststoff (1,2 g) wurde durch Chromatographie an Amberlite XAD-2 und anschließend an Sephadex LH-20 gereinigt, wobei man ein schwach-grünliches Pulver des Bu-2231-Komplexes (150 mg in Form des Kupferkomplexes) erhielt.
25
Beispiel 3
Trennung der Komponenten
Zur Trennung jeder Komponente wurden 140 mg des Bu-2231-Komplexes in 3 ml 0,7% Kupfer-II-chloridlösung gelöst und auf eine Säule von 85 ml CM-Sephadex C-25 aufgetragen, die im Gradienten mit wäßriger Ammoniumfonniatlösung von 1-7% eluiert wurde. Bu-2231 B wurde mit 3% Ammoniumformiatlösung und Bu-2231 A bei einer Konzentration von 5% eluiert. Jede Fraktion wurde durch Chromatographie an Sephadex LH-20 entsalzt, im Vakuum : onzentriert und lyophilisiert, wobei man die jeweiligen Formiatsaize von Bu-223 1 A (84 mg) und B (21 mg) (Kupfer-Komplexformen) erhielt. Die kupferfreien Formiatsalzpräparate wurden durch Behandeln der Kupter-Kt iiplexformen mit H2S in Methanol nach der allgemeinen Arbeitsweise des Beispiels 1 der US-Patentschrift 36 46 197 erhalten.
Beispiel 4 Bu-2231 A-Hydrochloridsalz
40
Eine Lösung von 750 mg des kupferfreien Bu-2231 A-Formiats in 100 ml Methanol wurde durch Zusatz von 2n-methanolischer Chlorwasserstofflösung auf den pH-Wert 2,0 eingestellt. Die Lösung wurde anschließend unter Rühren zu 300 ml Aceton getropft. Die Ausfai;ung, die sich bildete, wurde durch Filtrieren abgetrennt und im Vakuum getrocknet, wobei man 673 mg des rohen Bu-2231 A-Hydrochloridsalzes als weißes Pulver erhielt. Ein Teil von 140 mg dieses Pulvers wurde auf eine Säule aufgetragen, die 70 ml Sephadex LH-20 (Handelsname für ein modifiziertes alkyliertes Dextrangel), eingefüllt in 98% Methanol, enthielt. Die Säule wurde rail 98% Methanol entwickelt und die bioaktiven Fraktionen wurden gesammelt, im Vakuum konzentriert und lyophilisiert, wobei man 105 mg des kupferfreien Hydrochlorids von Bu-2231 A erhielt.
Hierzu 4 BIaU Zeichnungen
55
60

Claims (3)

Patentansprüche:
1. Antibiotikum mit der Bezeichnung Bu-2231 A oder seine pharmazeutisch brauchbaren Säureadditionssalze,
das in Form eines Glykopeptidkomplexes vorliegt;
das eine Base ist, die sowohl in einer Kupfer-Komplexform als· auch in einer kupferfreien Form vorliegen kann;
das bei der sauren Hydrolyse die Aminosäuren L-Threonin, J3-Amino-_/H4-amino-6-carboxy-5-methylpyrimidin-2-yl)-propionsäure, jg-Hydroxyhistidin, L-jS-Aminoalanin, ^Amino-S-hydroxy-n-valeriansTure, IU jS-Lysin und eine Aminosäure, die im Ultraviolett-Absorptionsspektrum ein Maximum bei 283 um (£'],„, 2SO) aulweist, als terminales Amin Spermidin und die Kohlenhydrate Mannose und Gulose ergibt; das in der Form des Kupferkomplexes
a) ein bläulicher amorpher Feststoff ist, der in Wasser und Methanol löslich ist, gering löslich ist in Äthanol und praktisch unlöslich ist in anderen organische Lösungsmitteln,
b) eine positive Reaktion mit Ninhydrin ergibt,
O die folgende Elementaranalyse (in %) ergibt:
C 42,66, H 6,16, N 15,31 und S 3,14,
d) eine Lltraviolett-Absorption /"£ 243 und 291 um (E[^ = 125 und 98) aufweist,
e) eine spezifische Drehung von [α]" = +50° (c 0,5; H2O) aufweist und
f) bei der Dünnschichtchroftiatögraphic unter Verwendung von Süiciumdsoxidgel und Methanol/10%-Ammoniumacetat (1:1) einen Rf-Wert von 0,22 und bei Verwendung von Siliciumdioxidgel und Methanol/10% Ammoniumacetat/10% Ammoniumhydroxid (10 : 9 : 1) einen Rf-Wert von 0,05 aufweist;
25
das in der kupferfreien Fom
a) ein weißer amorpher Feststoff ist,
b) eine spezifische Drehung von [α\ο = -21° (c 0,5; H2O) aufweist,
c) die folgende Elementaranalyse (in %) ergibt:
C 45,.0, H 6,51, N 16,05 und S 3,55,
d) Ultraviolett-Absorptionen ;.$« 235 und 290 um (.E\cm Schulter und 67) aufweist und
e) bei der Dünnschichtcnromatographie unter Verwendung von Siliciumdioxidgel und Methanol/10%-Ammoniumformiai (1 : ' i einen Rf-Wert von 0,16 und unter Verwendung von Siliciumdioxidgel und Methanol/10% Ammoniumacetat/10% Ammoniumhydroxid (10 : 9 : 1) einen Rf-Wert von 0,04 aufweist;
das in der kupferfreien Form als Hydrochloridsalz im KBr-Preßling im wesentlichen das in der Fig. 1 gezeigte Infrarotspektrum besitzt;
das in D3O in einer Konzentration von 10% gelöst im wesentlichen das in der F i g. 2 gezeigte NMR-Spektrum besitzt; und
das sowohl in der kupferfreien Form als auch in Form des Kupfer-Komplexes das Wachstum von Bakterien und Pilzen wirksam inhibiert,
wobei die Fig. 1 und 2 Bestandteil dieses Anspruchs sind.
2. DasmitBu-2231 A bezeichnete Antibiotikum gemäß Anspruch 1 als Formiatsalz oder Hydrochloridsalz der freien Base
3. Antibiotikum mit der Bezeichnung Bu-2231 B oder seine pharmazeutisch brauchbaren Säureadditionssalze, das in Form eines Glykopeptids vorliegt;
das eine Base ist, die sowohl in der Form eines Kupfer-Komplexes als auch in einer kupferfreien Form vorliegen kann;
das bei der sauren Hydrolyse die Aminosäuren L-Threonin, jS-Aminooß-(4-amino-6-carboxy-5-methylpyrimidin-2-yl (-propionsäure, jS-Hydroxyhistidin, L-/-Aminoalanin, 4-Amino-3-hydroxy-n-valeriansäure und eine Aminosäure, die im Ultraviolettabsorptionsspektrum ein Maximum bei 283 um (£jtm = 280) aufweist, als endständiges Amin. Spermidin und die Kohlenhydrate Mannose und Gulose ergibt;
das in Form des Kupfer-Komplexes
a) ein bläulich-amorpher Feststoff ist, der in Wasser und Methanol löslich, gering löslich in Äthanol und praktisch unlöslich in anderen organischen Lösungsmitteln ist,
b) eine positive Reaktion mit Ninhydrin ergibt,
cj d^ folgen Ie Elementaranalyse (in "O) ergibt:
C 40,96, H 5,61, N 14,78 und S 3,39,
d) die Ultraviolett-Absorptionen ;.&« 243 und 291 am (E\';m 134 und 109) zeigt,
e) eine spezifische Drehung von [a],} = +76° (c 0,5; H2O) ergibt und
f) bei der Dünnschichtchromatographie unter Verwendung von Siliciumdioxidgel und Methanol/10% Ammoniumacetat (1:1) den Rf-Wert 0,41 und unter Verwendung von Siliciumdioxidgel und Methanol/10% Ammoniumacetat/10% Ammoniumhydroxid (10 : 9 : 1) den Rf-Wert 0,11 ergibt;
das in der kupferfreien Form
a) ein weißer amorpher Feststoff ist,
b) eine spezifische Drehung von [ar]" = -19° (c 0,5; H2O) aufweist,
c) folgende Elementaranalyse (in %) ergibt:
C 43,01, H 6,22, N 14,81 und S 3,61,
d) die Ultraviolett-Absorptionen 맣 235 und 289,5 am (El Um Schulter und 77) ergibt und
e) bei der Dünnschichtchromatographie unter Verwendung von Siliciumdioxidgel und Methanol-10% Ammoniumformiat (1:1) den Rf-Wert 0,31 und unter Verwendung von Siliciumdioxidgel und MethTol/10% Ammoniumacetat/10% Ammoniumhydroxid (10 : 9 : 1) den Rf-Wert 0,09 ergibt;
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