CH657778A5 - Das antibiotikum bbm-1644, verfahren zu dessen herstellung und dessen verwendung in arzneimitteln. - Google Patents

Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf das neue Antibiotikum BBM-1644, auf ein Verfahren zu dessen Herstellung, auf eine biologisch reine Kultur des Mikroorganismus als Mittel zur Ausführung des Verfahrens und auf pharmazeutische Zubereitungen, welche das Antibiotikum BBM-1644 als aktive Komponente enthalten.

Das Antitumor-Antibiotikum BBM-1644 der vorliegenden Erfindung ist ein neues Glied der Protein-Antitumor-Antibiotika der durch Neocarzinostatin, Macromomycin und Auromomycin versinnbildlichten Klasse.

Neocarzinostatin, das auch Zinostatin genannt wird, ist ein saures Protein-Macromolekül mit Molekulargewicht 10 700, bestehend aus einer einfachen Polypeptidkette aus 109, durch zwei Disulfidbrücken vernetzten Aminosäuren. Die Produktion von Neocarzinostatin durch Fermentation von Stämmen von Streptomyces carzinostaticus var. neocar-zinostaticus ist offenbart in der US-PS 3 334 022 und in «J.Antibiotics», 18,68 — 76 (1965). Die Aminosäure-Reihen-folge von Neocarzinostatin ist offenbart in «Cancer Treatment Reviews», 6,239—249 (1979).

Macromomycin ist ein neutrales oder schwachsaures Polypeptid mit einem Molekulargewicht von annähernd 15 000. Die Produktion von Macromomycin durch Fermentation von Streptomyces macromomyceticus (NIHJ MC-8-42) ist offenbart in der US-PS 3 595 954 und in «J.Antibio-tics», 21,44—49 (1968). Die Reinigung von Macromomycin und Kenndaten der gereinigten Verbindung sind offenbart in «J-Antibiotics», 29,415-423 (1976).

Auromomycin ist ein schwachsaures Polypeptid mit einem Molekulargewicht von etwa 12 500 und einem isoelektrischen Punkt von pH-Wert 5,4. Es besteht aus 16 verschie-40 denen Aminosäuren. Isolierung von Auromomycin aus der Kulturbrühe von Streptomyces macromomyceticus und Kenndaten des gereinigten Produktes sind offenbart in «J.Antibiotics», 32, 330—339 (1979).

BBM-1644 kann durch physikochemische Eigenschaften, 45 wie Molekulargewicht, Aminosäuregehalt und Papier-Elektrophorese, von bekannten Polypeptid-Antitumor-Antibioti-ka, wie Neocarzinostatin, Macromomycin und Auromomycin, unterschieden werden.

so Gegenstände der vorliegenden Erfindung sind:

(I) Das im Patentanspruch 1 definierte Antibiotikum BBM-1644;

(II) das im Patentanspruch 2 definierte Verfahren zur Herstellung des Antibiotikums BBM-1644;

55 (III) die im Patentanspruch 6 definierte, biologisch reine Kultur des Mikroorganismus Actinomadura sp.

ATCC 39 144 als Mittel zur Ausführung des Herstellungsverfahrens, und (IV) die in den Patentansprüchen 7 und 8 definierten phar-60 mazeutischen Zubereitungen mit antibakterieller bzw. antibakterieller, tumorinhibierender Wirkung, welche das Antibiotikum BBM-1644 als aktive Komponente enthalten.

Im nachstehenden wird die Erfindung unter Bezugnahme 65 auf die Zeichnungen beispielsweise erläutert. In den Zeichnungen zeigen:

Fig. 1 das IR-Absorptionsspektrum von BBM-1644 in KBr-Pellets;

3

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Fig. 2 UV-Absorptionsspektren von BBM-1644 in Wasser, dargestellt durch die ausgezogene Kurve, in 0,0IN HCl, dargestellt durch die gestrichelte Kurve, und in 0,0IN NaOH, dargestellt durch die Strichpunkt-Kurve.

Die Erfindung bezieht sich auf ein neues Protein-Antitu-mor-Antibiotikum der hier verwendeten Bezeichnung BBM-1644 und auf dessen Herstellung durch Fermentation eines neuen Stamms von Actinomadura der Bezeichnung Actinomadura sp. Stamm H710-49. Der genannte Organismus wurde aus einer in Westdeutschland gesammelten Bodenprobe isoliert. Eine biologisch reine Kultur des Organismus wurde am 1. Juli 1982 bei der American Type Culture Collection als «,12 301 Park Lawn Drive, Rockville, Maryland 20 852, USA» deponiert und dort der permanenten Sammlung von Mikroorganismen unter der Nr. ATCC 39 144 hinzugefügt.

BBM-1644 verhindert das Wachstum von verschiedenen grampositiven und säurebeständigen Bakterien. Das Antibiotikum zeigt auch Phage erzeugende Eigenschaften in lyso-genen Bakterien und verhindert das Wachstum von lymphatischen und festen Tumoren, wie P388-Leukämie in Mäusen. Das neue Antibiotikum kann daher als antibakterielles Mittel oder als Antitumormittel für die Bekämpfung von Tumoren in Säugetieren verwendet werden.

Der Actinomycetes-Stamm Nr. H710-49 wurde aus einer Bodenprobe isoliert und nach konventionellen Methoden in Form einer biologisch reinen Kultur für die Kennzeichnung hergestellt. Der Stamm H710-49 bildet sowohl Substrat- wie auch Luftmycele. Das Substratmycelium ist lang, verzweigt und nicht zu kurzen Filamenten fragmentiert. Kurze Sporenketten entstehen an der Spitze oder an monopodialen Zweigen des Luftmyceliums. Die Sporenketten enthalten 2—15 Sporen in einer Kette, meist 4—8 Sporen, und sind von gerader, gebogener oder verschlaufter Form. Die Sporen zeigen eine warzige Oberfläche und sind von ovalem oder elliptischem Querschnitt einer Abmessung von 0,5—0,6 x 0,7—1,2 |xm mit abgerundetem oder spitzigem Ende. Ausgewachsene Sporen sind oft durch leere Mycelfaden abgetrennt. Terminalquellungen von Mycelfaden werden am Substratmycelium in Czapek's- und Bennett's Agar oft beobachtet. In keinem der untersuchten Medien konnten bewegungsfähige Sporen, Sporangia oder sclerotische Körnchen festgestellt werden.

Im Gegensatz zu gewöhnlichen Spezies des Genus Streptomyces wächst der Stamm H710-49 langsam und bildet in chemisch definierten und natürlichen organischen Medien ein schwaches Luftmycelium. Die Färbung des Luftmyceliums ist weiss und verändert sich nach der Sporenbildung in Hafermehlagar, anorganische Salze/Stärkeagar und Glyce-rin/Asparaginagar zu einer rosarötlichen Tönung. Die Massenfärbung des Substratmyceliums ist farblos, gelb, rötlichbraun oder dunkel-gräulichbraun. Es wird kein Melanoid-pigment produziert, jedoch wird in Glycerin/Asparaginagar, Tyrosinagar und in mit Glycerin, L-Arabinose, D-Xylose, L-Rhamnose, D-Glucose, D-Fructose, Trehalose oder D-Mannit ergänztem Pridham-Gottlieb's Basalagar ein zitronengelbes, diffusionsfähiges Pigment festgestellt. Der Stamm H710-49 wächst bei 20 °C, 28 °C und 37 °C, nicht jedoch bei 10 °C oder 41 °C. Er ist empfindlich gegen NaCl bei 10%, nicht jedoch bei 7% und beständig gegen Lysozym bei 0,001%. D-Galactose, D-Mannose, Sucrose, Raffinose und Inosit werden von diesem Stamm nicht verbraucht. Kulturmerkmale und physiologische Merkmale des Stamms H710-49 sind in den Tabellen 1 und 2 angeführt. Das Verbrauchsmuster der Kohlenstoffquelle durch den Stamm ist in Tabelle 3 dargestellt.

Tabelle 1

Kulturmerkmale des Stamms 710-49*

T rypton/Hefeextrakt-

Q**

schlecht bis mässig;

s brühe (IPS Nr. 1)

flockig, sedimentiert

und nicht pigmentiert

Sucrose/Nitratagar

G

knapp

(Czapek's Agar)

R

farblos bis hell-

orangegelb (73)***

10

A

knapp, weiss (263)

D

keines

Glucose/Asparaginagar

G

schlecht

R

gelblichweiss (92) bis

tieforangegelb (69)

15

A

sehr knapp, weiss (263)

D

keines

Glycerin/Asparaginagar

G

schlecht bis mässig

(ISP Nr. 5)

R

hellgelb (89) bis dunkel-

orangegelb (72)

20

A

gering, weiss (263) bis

hellgelblichrosa (31)

D

brilliantgelb (83)

Anorganische Salze/

G

schlecht bis mässig

Stärkeagar (ISP Nr. 4)

R

farblos bis tiefgelb (85)

25

A

gering, rosastichiges

Weiss (9) bis hell

gelblichrosa (31)

D

keines

Tyrosinagar (ISP Nr. 7)

G

mässig

30

R

bräunlichorange (54) bis

mässig rötlichbraun (43)

A

gering, weiss (263) bis

hellgelb (89)

D

starkes gelb (84)

35 Nährstoffagar

G

schwach bis mässig

R

gelblichweiss (92) bis

mässig gelblichbraun (77)

A

gering, weiss (263)

D

keines

40 Hefeextrakt/Malzex-

G

mässig traktagar (ISP Nr. 2)

R

dunkelgelb (88) bis

dunkelbraun (59)

A

knapp, weiss (263)

D

schwach olivbraun (94)

45 Hafermehlagar

G

gering

(ISP Nr. 3)

R

farblos

A

gering, weiss (263) bis

rosastichiges Weiss (9)

D

keines so Bennett's Agar

G

mässig

R

gräulich-gelblichbraun

(80) bis dunkelgräulich-

braun (62)

A

sehr knapp, weiss (263)

55

D

mässig olivbraun (95)

Pepton/Hefeextrakt/

G

gering

Eisenagar (ISP Nr. 6)

R

gräulichgelb (90) bis

gräuchlichbraun (62)

A

gering, weiss (263)

60

D

keines bis mässig

gelblichbraun (77)

*festgestellt nach Inkubation während 3 Wochen bei 28 °C. **Abkürzungen: G = Wachstum, R = Umkehrfärbung, A = Luftmycelium, D = diffundierbares Pigment 65 ***färbung und deren Nummer in Klammern entsprechen dem Farbstandard in «Kelly, K.L. & D.B. Judd: ISCC-NBS Farbbezeich-nungstafeln, illustriert mit Centroidfarben. U.S. Dept. of Comm. Circ. 553, Washington, D.C., Nov., 1975».

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Tabelle 2

Physiologische Merkmale des Stamms H710-49

Test

Reaktion

Methode und Medium

Wachstumstemperaturbereich

Gelatineverflüssigung Stärkehydrolyse Reaktion in Magermilch

Melanoidbildung

Nitratreduktion Beständigkeit gegen NaCI

Lysozym pH-Wert maximales Wachstum bei 28 °C; mässiges Wachstum bei 20 °C und 37 °C; kein Wachstum bei 10 °C und 41 °C verflüssigt hydrolysiert nicht coaguliert und vollständig peptonisiert keine positiv mässig beständig, Wachstum bei 7% jedoch nicht bei 10%

beständig, Wachstum bei 0,001 % Wachstum bei 6,0 nicht jedoch bei 5,0

Bennett's Agar

Glucose/Pepton/Gelatinemedium Stärke/Agarplatte Difko/Magermilch

Trypton/Hefeextrakt-Brühe,

Tyrosin/Agar und Pepton/Hefeextrakt/ Eisenagar

Czapek's Glucose/Nitratbrühe und Glucose/

Hefeextrakt/Nitratbrühe

Trypton/Hefeextraktagar

Trypton/Hefeextraktagar Trypton/Hefeextraktagar

Tabelle 3 Verbrauch von Kohlenstoffquellen durch Stamm H710-49*

Glycerin +

D(—)-Arabinose —

L(+)-Arabinose +

D-Xylose +

D-Ribose +

L-Rhamnose +

D-Glucose +

D-Galactose —

D-Fructose +

D-Mannose —

L(—)-Sorbose —

Sucrose —

Lactose —

Cellobiose +

Melibiose —

Trehalose +

Raffinose —

D(+)-Melezitose —

lösliche Stärke +

Cellulose —

Dulcit —

Inosit —

D-Mannit +

D-Sorbit —

Salicin —

*festgestellt nach Inkubation während 3 Wochen bei 28 °C. Basalmedium: Pridham-Gottlieb's anorganisches Medium

Gereinigte Zellwand von Stamm H710-49 enthält Meso-diaminopimelinsäure, jedoch kein Glycin. Das Gesamtzel-len-Hydrolysat zeigt die Anwesenheit von Madurose (3-0-Methyl-D-galactose), Glucose, Ribose und eines geringen Mengenanteils Mannose. Der Zellwandaufbau und die Zuckerkomponenten der Gesamtzelle des Stamms H710-49 weisen daraufhin, dass der Stamm zum Zellwandtyp IIIB gehört.

Die vorstehenden Kennmerkmale des Stamms H710-49 gleichen denjenigen des Genus Actinomadura. Nach der numerischen Taxonomie von Actinomadura und verwandten

25 Actinomyceten werden von Goodfellow et al. in «J.Gen.-Microbiol.», 112,95 — 111 (1979) die meisten Actinomadura Spezies, die aus dem Boden stammen, in den Haufen Nr. 7 der 14 beschriebenen Haufen klassifiziert. Der Stamm Nr. H710-49 ist der Spezies von Haufen Nr. 7 am nächsten ver-30 wandt. Nonomura und Ohara beschrieben in «J.Ferment Technol.», 49, 904—912 (1971) 5 saprophytische Species des Genus Actinomadura und Nonomura in «J.Ferment.Tech-nol.», 52, 71—77 (1974) und Preobrazhenskaya et al. beschrieben in «Actinomycetes and Related Organisms», 12, 35 30—38 (1977) die Identifizierung und Klassifizierung von Actinomaduraspezies. Als Resultat des Vergleichs mit bekannten, in der Literatur beschriebenen Actinomaduraspezies, wird Stamm H710-49 als zu einer neuen Spezies von Actinomadura gehörend erachtet, ähnlich dem in der vorste-40 henden Referenz von Preobrazhenskaya et al und in der JP-OS 55/94 391 beschriebenen A.Roseola, A.Salmonea, A.Vi-nacea bzw. A.Corallina.

Es ist zu beachten, dass für die Produktion von BBM-1644 die vorliegende Erfindung, obwohl sie detailliert erläu-45 tert wird unter Bezugnahme auf den besonderen Stamm Actinomadura sp. H710-49 (ATCC 39 144), nicht auf diesen Mikroorganismus oder auf durch die hier offenbarten Zuchteigenschaften vollständig beschriebenen Mikroorganismen eingeschränkt ist, sondern neben dem Stamm H710-50 49 alle BBM-1644 produzierenden, natürlichen und künstlichen Varianten und Mutanten davon umfassen soll.

Das erfindungsgemässe Antibiotikum BBM-1644 wird hergestellt durch Kultivierung eines BBM-1644 produzieren-55 den Stamms des Genus Actinomadura, vorzugsweise eines Stamms von Actinomadura sp. mit den Identifizierungsmerkmalen von ATCC 39 144 oder einer Mutante davon in einem konventionellen, wässrigen Nährmedium. Der Organismus wird in einem Nährmedium gezüchtet, das bekannte 60 Nährquellen für Actinomycetes enthält, d.h. assimilierbare Quellen von Kohlenstoff und Stickstoff und gegebenenfalls zusätzlich anorganische Salze und/oder andere bekannte Wachstumsfaktoren. Für die Produktion von grossen Mengen des erfindungsgemässen Antibiotikums, erfolgt die Kul-65 tivierung vorzugsweise unter submersen, aeroben Bedingungen, kann jedoch für die Produktion von geringen Mengen auch in Oberflächenkulturen und Flaschen ausgeführt werden. Für die Kultivierung kann das allgemein für andere Ac-

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tinomyceten allgemein angewandte Vorgehen zum Einsatz gelangen.

Das Nährmedium enthält als assimilierbare Kohlenstoffquelle beispielsweise Glycerin, L(+)-Arabinose, D-Xylose, D-Ribose, D-Glukose, D-Fructose, lösliche Stärke, D-Mannit oder Cellobiose. Als Stickstoffquellen können Ammoniumchlorid, -sulfat, -nitrat, Harnstoff, Natriumnitrat und dgl., entweder allein oder in Kombination mit anderen organischen Stickstoffquellen, wie Pepton, Fleischextrakt, Hefeextrakt, Maisbrühflüssigkeit, Sojabohnenpulver, Baumwollsamenmehl und dgl., zum Einsatz gelangen. Nötigenfalls können auch zusätzliche anorganische Nährsalze zur Schaffung von Quellen für Natrium, Kalium, Kalzium, Ammonium, Phosphat, Sulfat, Chlorid, Bromid, Carbonat, Zink, Magnesium, Mangan, Kobalt, Eisen und dgl., eingesetzt werden.

Die Produktion des BBM-1644 Antibiotikums kann bei jeder beliebigen Temperatur erfolgen, die ein befriedigendes Wachstum des produzierenden Organismus ergibt, z. B. 20—37 °C, zweckmässig bei 27—32 °C. Gewöhnlich wird optimale Produktion in Schüttelflaschen nach Inkubation während 6—1 à erzielt. Bei Tankfermentation ist es zweckmässig, eine vegetative Impfung in einer Nährbrühe zu erzeugen durch Impfung der Brühenkultur mit einer Schräg- oder Bodenkultur oder einer lyophilisierten Kultur des Organismus. Nach derartiger Herstellung eines aktiven Impfstoffs wird dieser aseptisch in das Tank-Fermentationsmedium überführt. Die Produktion des Antibiotikums kann durch den Papierscheiben/Agar-Diffusionstest unter Verwendung von Bacillus subtilis M45, beschrieben als Ree "Mutant in «Mutation Res.», 16,165—174 (1972), als Testorganismus überwacht werden.

Nach Abschluss der Fermentation liegt BBM-1644 zur Hauptsache im flüssigen Teil der fermentierten Brühe nach Abtrennung des festen Anteils durch Filtration oder Zentri-fugation vor. Die gewonnene Brühe kann somit durch Zen-trifugation in Mycelkuchen und überstehende Brühe getrennt werden. Das Filtrat wird dann konzentriert und über eine semipermeable Membran, z.B. ein Rohr aus «Cello-phan», zur Entfernung von permeablen Verunreinigungen gegen Leitungswasser dialysiert werden. Die im Rohrinneren nach Entfernung von unlöslichen Materialien verbliebene Lösung, welche das BBM-1644 enthält, kann dann mit einem Aussalzmittel, wie Ammoniumsulfat, gesättigt werden, um BBM-1644 in Form eines rohen Festkörpers auszufällen. Der erhaltene Festkörper kann in Wasser gelöst und durch Dialyse gegen Leitungswasser entsalzt werden.

Weitere Reinigung des rohen BBM-1644 kann nach konventionellem, mit anderen sauren Polypeptiden angewandtem Vorgehen, ausgeführt werden. Beispielsweise kann die wässrige, BBM-1644 enthaltende Lösung auf einem Ionenaustauscher, wie DEAE- oder CM-«Sephadex» oder DEAE-oder CM-Cellulose, adsorbiert und mit einer neutralen Salzlösung eluiert werden. Vorzugsweise werden chromatographische Schritte mit ansteigender Salzkonzentration der als Eluierungsmittel verwendeten Lösung angewandt. Wässrige, gereinigtes BBM-1644 enthaltende Fraktionen werden dann zur Trockene konzentriert, beispielsweise durch Lyophilisie-rung.

Durch Lyophilisierung wird BBM-1644 in Form eines amorphen, weissen Pulvers isoliert. Bei Prüfung durch Hochspannung-Papierelektrophorese bei 4500 V in 0,05M Barbitalpuffer bei pH-Wert 8,6, migriert BBM-1644 in Form einer Säure innert 1 h um 8,7 cm gegen die Anode hin. BBM-1644 zeigt keinen definierten Schmelzpunkt und zersetzt sich graduell oberhalb 240 °C. Es ist wasserlöslich, jedoch praktisch unlöslich in üblichen organischen Lösungsmitteln, wie Methanol, Ethanol, Aceton, Ethylacetat und n-Hexan. Das Antibiotikum zeigt in 0,25 gew.%iger wässriger Lösung eine optische Drehung von [oc]26D = — 75,6°. Wie in Fig. 2 darge-5 stellt, zeigt das UV-Spektrum von BBM-1644 Absorptions-maxima bei 275 nm (E1%lcm 8,2) und 310 nm (E1%icm4,6, Schulter) in wässriger Lösung. Es zeigt ein nahezu identisches UV-Spektrum in wässriger und in 0,0 IN Salzsäure, jedoch nur ein einziges Maximum bei 285 nm (E1%lcm 8,9) in io 0,01N Natronlauge. Das IR-Spektrum von BBM-1644, bestimmt in KBr, ist in Fig. 1 dargestellt. Dieses Spektrum zeigt die Anwesenheit von NH- und OH-Gruppen (3300—2980 cm-1) und Amidgruppen (1650 und 1540 cm-1). Das Antibiotikum ergibt positive Reaktion mit 15 Folin-Lowry-, Xanthoprotein-, Biuret- und Ninhydrin-Reagenzien und entfärbt Kaliumpermanganatlösung. Es ist negativ in der Anthron- und Sakaguchi-Reaktion. Bei Co-chromatographie auf «Sephadex» G-75 mit Ovalbumin, Molekulargewicht 43 000, Chymotrypsinogen, Molekularge-20 wicht 25 000 und Ribonuclease A, Molekulargewicht 13 700, eluiert BBM-1644 unmittelbar nach Chymotrypsinogen und sein Molekulargewicht wird daher auf bei 22 000 geschätzt. Elementaranalyse von BBM-1644 ergibt gewichtsmässig 46,60% C, 6,45% H, 13,34% N und 0,20% S. Die Anwesen-25 heit von 13 Arten Aminsäuren im BBM-1644-Molekül ergibt sich aus der Analyse auf Aminosäuren gemäss Tabelle 4. BBM-1644 enthält keine basischen Aminosäuren, wie Lysin, Histidin und Arginin.

30

Tabelle 4

Aminosäurenmässige Zusammensetzung von BBM-1644

Aminosäure relativer Gehalt an Aminosäuren*

Alanin

8,8

Asparaginsäure

6,0

Halbcystin

1,0

Glutaminsäure

5,7

Glycin

8,7

Isoleucin

2,3

Leucin

1,0

Phenylalanin

1,4

Prolin

4,1

Serin

1,6

Threonin

7,2

Tyrosin

0,6

Valin

11,1

*Der Gehalt an Leucin wurde willkürlich auf 1,0 festgesetzt.

BBM-1644 ist im pH-Bereich von 2—9 ziemlich stabil, jedoch fällt die Stabilität unterhalb dieses Bereichs scharf ab. 55 Bei 50 °C und neutralen pH-Wert ist eine wässrige Lösung von BBM-1644 während 2 h stabil. Unter Einwirkung von UV-Strahlung ist die antibiotische Aktivität von BBM-1644 innert 20 min verloren.

Aus den vorstehend angeführten physikochemischen Ei-60 genschaften von BBM-1644 ist zu entnehmen, dass es ein Glied der Protein-antitumor-antibiotischen Gruppe ist, welche Neocarzinostatin, Macromomycin und Auromomycin einschliesst. BBM-1644 kann jedoch von diesen bekannten Protein-Antitumor-Antibiotika auf Grund dessen Moleku-65 largewicht, Aminosäurengehaltes und Papierelektrophorese unterschieden werden. Die Mobilitäten von BBM-1644 und vergleichsweise Neocarzinostatin und Macromomycin in der Papierelektrophorese sind in Tabelle 5 zusammengefasst.

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Tabelle 5 Papierelektrophorese*

Antibiotikum Mobilität mm vom Aufgabepunkt aus

BBM-1644 +87

Neocarzinostatin +31 Macromomycin —20

*4 500 V, 1 h, Barbitalpuffer pH-Wert 8,6

Die Neocarzinostatin-Gruppe von Antibiotika zeigt üblicherweise 2 UV-Absorptionsmaxima bei etwa 275 und 350 nm, während BBM-1644 die UV-Absorptionsmaxima bei 275 und 310 nm aufweist. Letzthin wurde in «Biochem. Res. Commun.», 95,1351 —1356 (1980) berichtet, dass das Absorptionsmaximum bei 350 nm der Neocarzinostation-Antibiotika auf die nicht-Protein-Chromophoren zurückgeführt werden könnte, welche für die biologische Aktivität essentiell sind. Es ist zu beachten, dass BBM-1644 einen von denjenigen bekannter Antibiotika der Neocarzinostatin-gruppe unterschiedlichen Chromophoren aufweist.

Die antibakterielle Aktivität von BBM-1644 wurde durch die serienmässige Zweifach-Agar-Verdünnungsmetho-de bestimmt. Nähragarmedium wurde für grampositive und gramnegative Bakterien verwendet, Nähragarmedium, enthaltend 4 Gew.% Glycerin für säurebeständige Bakterien und Sabourau-Agarmedium für Pilze. Die Aktivität wurde ausgedrückt als minimalinhibierende Konzentration (mie) im Agarmedium und die erhaltenen Resultate sind zusammen mit denjenigen von Neocarzinostatin als Vergleichsmaterial in Tabelle 6 zusammengefasst. BBM-1644 zeigte potente inhibierende Aktivität gegen grampositive und säurebeständige Bakterien, verhinderte jedoch das Wachstum von gramnegativen Bakterien und Pilzen nicht. Das antibakterielle Spektrum von BBM-1644 ist ähnlich demjenigen von Neocarzinostatin, während die Eigenaktivität von BBM-1644 in einigen der Testorganismen potenter ist als diejenige der letztgenannten Vergleichssubstanz.

Tabelle 6 In vitro antimikrobielle Aktivität

Testorganismus MIC in |xg/ml

BBM-1644 Neocarzinostatin

Staphylococcus aureus

FDA209P

0,4

1,6

Staphylococcus aureus

Smith

0,2

0,8

Streptococcus pyogenes

A20201

6,3

3,1

Micrococcus luteus

PCI 1001

1,6

1,6

Micrococcus flavus Dl 2

1,6

1,6

Bacillus subtilis PCI 219

0,8

3,1

Escherichia coli NIHJ

>100

>100

Klebsiella pneumoniae

D-ll

>100

>100

Proteus vulgaris A9436

>100

>100

Pseudomonas aeruginosa

A9930

>100

>100

Mycobacterium

smegmatis 607 D87

12,5

50

Mycobacterium phlei

D88

3,1

12,5

Candida albicans

IAM4888

>100

>100

Die Fähigkeit von BBM-1644 zur Erzeugung von Pro-phage in lysogenen Bakterien (ILB) wurde nach der von Lein et al in «Nature», 196,783—784 (1962) beschriebenen Methode unter Verwendung von Neocarzinostatin als Bezugsverbindung, bestimmt. Die Plaqueauszählung erfolgte auf Agarplatten, enthaltend Testmaterial (T) und Bezugsmaterial (C). Ein T/C-Verhältnis der Plaqueauszählung von mehr als 3 wurde als signifikant erachtet und die ILB-Aktivi-tät wurde als minimale erzeugende Konzentration der Testverbindung ausgedrückt. Die Resultate sind in Tabelle 7 angeführt, aus welcher hervorgeht, dass die ILB-Aktivität von BBM-1644 ähnlich derjenigen von Neocarzinostatin ist, wobei die minimale erzeugende Konzentration 1 (xg/ml beträgt.

Tabelle 7

Erzeugung von Prophage in lysogenen Bakterien

ILB-Aktivität, T/C*

Konzentration, (ig/ml

100 10 1 0,1

BBM-1644 10,4 10,3 6,0 1,2

Neocarzinostatin 28,6 20,4 10,8 0,7

*signifikante Aktivität T/C = >3,0

Die Antitumor-Aktivität von BBM-1644 gegen lymphozytische P388-Leukämie wurde an Mäusen vom BDFr Stamm bestimmt. Jede der Mäuse wurde intraperitoneal mit 3 x 105 Zellen des Tumors geimpft. Den Mäusen wurden 24 h nach der Inplantation des Tumors graduierte Dosierungen des Antibiotikums intraperitoneal verabreicht. Die Verabreichungen erfolgten einmal täglich an den Tagen 1,4 und 7 nach dem Plan q3d x 3 bzw. täglich an 9 aufeinanderfolgenden Tagen nach dem Plan qd 1 ->9. Als Vergleichssubstanz wurde Neocarzinostatin auf gleiche Art eingesetzt und die Dosierungen sowie die damit erhaltenen Resultate sind in Tabelle 8 zusammengefasst. In beiden Verabreichungsplänen war BBM-1644 in einem Dosierungsbereich von 0,03—1,0 mg/kg/d gegen die Leukämie der Mäuse hochwirksam. Die Antitumor-Aktivität von BBM-1644 war, ausgedrückt als wirksame Minimaldosierung, nach dem Verabreichungsplan qd 1 -»9 etwa gleich bzw. nach dem Verabreichungsplan q3d x 3 dreifachpotenter als diejenige der Vergleichssubstanz Neocarzinostatin.

Tabelle 8

Antitumor-Wirksamkeit gegen P388-Leukämie

T/C, %,in MST*

Dosierung q3d x 3, mg/kg/d

1

0,3

0,1

0,03

0,01

BBM-1644

188

188

138

125

113

Neocarzino

statin

163

150

125

113

T/C, %, in MST Dosierung qd l->9, mg/kg/d

0,3

0,1

0,03

0,01

BBM-1644

125

175

138

113

Neocarzino

statin

163

138

125

113

♦mittlere Überlebensdauer: signifikante Aktivität T/C= ^ 125%.

6

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

7

657 778

Die Antitumor-Aktivität von BBM-1644 wurde auch durch einen zweiten Test gegen P388-Leukämie in Mäusen ermittelt. Einzelheiten der angewendeten Testmethode sind beschrieben in «Cancer Chemother. Rep.», 3, 1 — 87, Teil 3 (1972). Die Bedingungen und dabei erhaltenen Resultate sind in Tabelle 9 zusammengefasst.

Tabelle 9

Wirkung von BBM-1644 auf P388-Leukämie

Testverbindung

Behandlungsplan

Dosierung,

MST

Wirkung

AWC

Überle

IP, mg/kg/Inj.

d

MST

%T/C

g d 6

bende, d 5(30)

D.l,4&7

1,6

8,0

89

-4,8

6/6

0,8

10,5

117

-4,3

6/6

0,4

15,5

172

-3,2

6/6

0,2

15,0

167

-2,5

6/6

0,1

13,5

150

-1,2

6/6

0,05

12,0

133

-1,7

6/6

D.l

2,56

9,0

100

4/6

1,28

14,0

156

-4,1

6/6

0,64

14,5

161

-4,9

6/6

0,32

16,5

183

-4,8

6/6

0,16

14,0

156

-4,1

6/6

0,08

12,0

133

-2,8

6/6

0,04

10,5

117

-2,7

6/6

0,02

11,0

122

-2,5

6/6

D.l,4&7

1,28

23,5

261

-3,3

6/6

0,64

19,0

211

-3,5

6/6

0,32

18,5

206

-4,3

6/6

0,16

14,5

161

-3,8

6/6

0,08

12,0

133

-3,3

6/6

0,04

12,0

133

-2,9

6/6

0,02

10,0

111

-2,5

6/6

0,01

10,0

111

-1,9

6/6

QD l->9

0,64

8,0

89

-5,2

6/6

0,32

10,0

111

-4,2

6/6

0,16

19,0

211

-4,3

6/6

0,08

18,0

200

-4,2

6/6

0,04

15,5

172

-3,5

6/6

0,02

13,0

144

-3,3

6/6

0,01

12,0

133

-2,2

6/6

0,005

11,0

122

-1,1

6/6

107

Salzlösung

8,0

-

-

10/10

106

Salzlösung

9,0

-

-0,3

20/20

105

Salzlösung

11,0

-

-

10/10

10*

Salzlösung

14,0

-

-

10/10

Neocarzinostatin

BBM-1644

Kontrolle

Tumorimpfstoff: 10® Ascitenzellen, intraperitoneal (plus Titration)

Testtier: CDFj Ç Mäuse

Toxizität: <4/6 Mäuse lebend am Tag 5

Auswertung: MST = mittlere Überlebensdauer

Aktivität: % T/C = (MST behandelt/MST Kontrolle) x 100

Kriterien: % T/C 2: 125 als signifikante Antitumor-Aktivität erachtet

Die akute Toxizität von BBM-1644 wurde an Mäusen vom Stamm dd Y durch einfache intraperitoneale Verabreichung bestimmt und die LD50 mit 5,8 mg/kg errechnet.

Wie im vorstehenden dargestellt, zeigt BBM-1644 potente antibakterielle Aktivität gegen grampositive und säurebeständige Bakterien und ist somit nützlich für die therapeutische Behandlung von Säugetieren und anderen Tieren, die von durch solche Bakterien induzierten infektiösen Erkrankungen befallen sind. Ausserdem kann es für andere konventionelle Verwendungszwecke für antibakterielle Mittel, wie zur Desinfektion von medizinischer und zahnärztlicher Ausrüstung, verwendet werden.

Die Erzeugung von Prophage in lysogenen Bakterien und die ausgesprochene Antitumor-Aktivität gegen P388-Leuk-

55 ämie in Mäusen weisen daraufhin, dass BBM-1644auch therapeutisch nützlich ist zur Verhinderung des Wachstums von Tumoren in Säugetieren.

Die vorliegende Erfindung ermöglicht somit die therapeutische Behandlung eines von einer bakteriellen Infektion so oder einem bösartigen Tumor befallenen Tiers durch Verabreichung einer antibakteriell oder tumorverhindernd wirksamen Dosierung von BBM-1644 oder einer dieses enthaltenden pharmazeutischen Zubereitung.

Weitere Gegenstände der Erfindung sind pharmazeuti-65 sehe Zubereitungen, die einen antibakteriell oder tumorverhindernd wirksamen Mengenanteil BBM-1644 in Kombination mit einem inerten, pharmazeutisch annehmbaren Träger oder Verdünnungsmittel enthalten. Derartige Zubereitungen

657 778

können in jeder beliebigen, für parenterale Verabreichung geeigneten, pharmazeutischen Form hergestellt werden.

Zubereitungen für parenterale Verabreichung sind beispielsweise sterile wässrige oder nicht-wässrige Lösungen, Suspensionen und Emulsionen. Sie können auch in Form von sterilen festen Zubereitungen hergestellt werden, die dann in sterilem Wasser, physiologischer Salzlösung oder einem anderen sterilen injizierbaren Medium, unmittelbar vor Gebrauch gelöst werden können.

Es ist offensichtlich, dass der jeweils bevorzugte Mengenanteil BBM-1644 Antibiotikum in Abhängigkeit der Zubereitungsform, der Art der Anwendung, der besonderen Lage, des befallenen Subjekts und der zu behandelnden Erkrankung variiert. Vom Fachmann werden viele Faktoren, welche die Wirkung des Arzneimittels modifizieren, in Betracht gezogen, beispielsweise Alter, Körpergewicht, Geschlecht, Nahrungsart, Zeit und Art der Verabreichung, Excretionsra-te, Zustand des Patienten, Kombinationen von Arzneimitteln, Reaktionsempfindlichkeit und Ausmass der Erkrankung. Die Verabreichung kann kontinuierlich oder periodisch im Ausmass der maximal tolerierbaren Dosierung erfolgen. Optimale Verabreichungsraten für einen bestimmten Satz an Bedingungen kann durch den Fachmann unter Anwendung von konventionellen Dosierungsbestimmungstests unter Beachtung der vorstehenden Richtlinien ermittelt werden.

In den nachstehenden Beispielen wird die Erfindung weiterhin erläutert. Die angeführten Substanzen sind: DEAE-Cellulose: Diethylaminoethyl-ionenaustauschercellulose; «SEPHADEX» G-50: Ein Filtrationsgel und DEAE «SEPHADEX» A-50: Ein Diethylaminoethyl-anionenaus-tauschergel, wobei «SEPHADEX» eine eingetragene Handelsmarke von Pharmacia Fine Chemical, Inc. ist. Die prozentualen Konzentrationsangaben sind gewichtsmässig.

Beispiel 1 Fermentation von BBM-1644

Für die Impfung von 100 ml eines Saatmediums in einem 500 ml Erlenmyer Kolben, enthaltend 1 % Mannit, 2% Pepton und 1% Hefeextrakt, dessen pH-Wert vor Sterilisation auf 7,2 gestellt worden war, wurde eine Agar-Schrägkultur mit gutem Wachstum von Actinomadura sp. H710-49 verwendet. Die Saatkultur wurde auf einer rotierenden Schüttelmaschine bei 250/min während 72 h bei 32 °C inkubiert und danach wurden 5 ml der Kultur in 100 ml eines zweiten, gleich wie das erste zusammengesetzten Saatmediums überführt und in diesem unter gleichen Bedingungen kultiviert, wie die erste Saatkultur. Je 5 ml des erhaltenen Impfstoffs wurden verwendet, um die Fermentation von je 100 ml Fermentationsmedium in 500 ml Erlenmyer Kolben, enthaltend je 2,5% Mannit, 0,5% Glukose, 1% Sojabohnenmehl, 0,5% Pepton, 1% Fleischextrakt, 0,3% CaC03 und 0,2% NaCl, die Fermentation in Gang zu setzen. Die Fermentation wurde auf einer rotierenden Schüttelmaschine bei 250/min bei 28 C ausgeführt. Die Produktion des Antibiotikums wurde durch Papierscheiben/Agar-Diffusionstest unter Verwendung von Bacillus subtilis M45, Ree "Mutant als Testorganismus überwacht.

Die antibiotische Aktivität in der Kulturbrühe nahm mit fortschreitender Fermentation graduell zu und erreichte nach 6—7 d etwa 300 jig/ml.

Beispiel 2

Die im Fermentationsverfahren nach Beispiel 1 gewonnenen 181 Brühe wurden unter Verwendung eines Zentrifu-gierapparates «Kokusan Nr.4A» in einen Mycelkuchen und überstehende Brühe getrennt. Das Filtrat wurde unterhalb 40 °C auf '/io des ursprünglichen Volumens konzentriert und das Konzentrat mittels rohrförmigem «Cellophan» der Union Carbide in einem kalten Raum gegen Leitungswasser dialysiert. Die im Rohr verbliebene Lösung wurde auf etwa 1,51 konzentriert und bei 8000 g zur Entfernung von unlöslichen Materialien zentrifugiert. Die klare, überstehende Lösung wurde mit Ammoniumsulfat gesättigt und bei 5 °C während 5 h stehengelassen. Die gebildete Ausfällung wurde durch Zentrifugation gewonnen, in 300 ml Wasser gelöst und durch Dialyse gegen Leitungswasser entsalzt. Die erhaltenen 700 ml dialysierte Lösung enthielten 22 g rohes, festes BBM-1644, was sich durch Lyophilisierung eines Teils der Lösung ergab. Der Rest der Lösung wurde für nachfolgende Reinigung ohne Konzentration zwecks Vermeidung von Zersetzung verwendet. Die Lösung des Antibiotikums wurde durch eine Säule von 400 ml DEAE-Cellulose (Cl ~) geleitet und die Säule mit 11 Wasser gewaschen und mit 1/15 M Phosphatpuffer mit pH-Wert 7,0, enthaltend 0,3 M Natriumchlorid, entwickelt. Die 300 ml aktiven Fraktionen wurden vereinigt, während 18 h gegen Leitungswasser dialysiert und auf einer Säule von 400 ml DEAE-Cellulose, die mit 1/15M Phosphatpuffer mit pH-Wert 7,5 equilibriert worden war, chromatographiert. Die Kolonne wurde mit der gleichen Pufferlösung mit von 0 auf 0,2 M ansteigender Konzentration Natriumchlorid, entwickelt. Das aktive Eluat wurde durch Dialyse entsalzt und auf eine Säule von 17 ml DEAE-«SEPHADEX» A-50 gegeben. Die Säule wurde mit 1/15M Phosphatpuffer mit pH-Wert 7,5, enthaltend von 0 auf 0,3 M ansteigende Konzentration von Natriumchlorid, entwickelt. Die aktiven Fraktionen wurden mittels B. subtilis M45-Test bestimmt, vereinigt und während 18h gegen flies-sendes Wasser dialysiert. Die entsalzte Lösung wurde auf einer Säule von 18 ml DEAE-«SEPHADEX» A-50 unter Verwendung von 1/15M Phosphatpuffer mit pH-Wert 7,0 und von 0 auf 0,3 M ansteigendem Gehalt an Natriumchlorid als Eluierungsmittel chromatographiert. Die zweckentsprechenden Fraktionen wurden gesammelt, auf 10 ml konzentriert und zwecks Entsalzung durch eine Säule von «SEPHADEX» G-50 geleitet. Die Säule wurde mit entionisiertem Wasser eluiert und das aktive Eluat lyophilisiert, wobei 120 mg eines weissen Pulvers erhalten wurden. Das solcherart erhaltene Muster von BBM-1644 war homogen, was sich durch Polyacrylamidgel-elektrophorese ergab.

8

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

1 Blatt Zeichnungen

Claims (6)

1. 657 778

   PATENTANSPRÜCHE

   1. Das Antibiotikum BBM-1644, gekennzeichnet durch die Merkmale:

   a) Verhinderung des Wachstums von grampositiven und säurebeständigen Bakterien,

   b) Verhinderung des Wachstums von P388-Leukämie in Mäusen,

   c) Erzeugung von prophagen Eigenschaften in lysogenen Bakterien,

   d) Wasserlöslichkeit, jedoch praktisch unlöslich in Methanol, Ethanol, Aceton, Ethylacetat und n-Hexan,

   e) IR-Absorptionsspektrum in KBr. gemäss Fig. 1,

   f) UV-Absorptionsspektra in Wasser, 0,01N HCl und 0,01N NaOH gemäss Fig. 2,

   g) optische Drehung in 0,25 gew.%iger wässriger Lösung von [a]26p —15,6°,

   h) keinen definierten Schmelzpunkt, jedoch graduelle Zersetzung oberhalb 240 °C,

   i) Verschiebung um etwa 8,7 cm gegen die Anode hin während Papier-Elektrophorese bei 4500 V während 1 h unter Verwendung von 0,05M Barbitalpuffer von pH-Wert 8,6,

   j) Elementaranalyse in Gew.%: C 46,60%, H 6,45%, N 13,34%, S 0,20% und O durch Differenz 33,41 %,

   k) hochmolekulares Peptid mit angegebenem Molekulargewicht von etwa 22 000,

   1) entfärbt Kaliumpermanganatlösung und ergibt positive Folin-Lowry-, Xanthoprotein-, Biuret- und Ninhydrin-Reaktion und negative Anthron- und Sakaguchi-Reaktion, und n) ergibt bei Hydrolyse die nachstehende relative Aminosäurezusammensetzung, bezogen auf den willkürlich als 1,0 festgesetzten Gehalt an Leucin: Alanin 8,8, Asparaginsäure 6,0, Halb-Cystin 1,0, Glutaminsäure 5,7, Glycin 8,7, Isoleu-

   cin 2,3, Leucin 1,0, Phenylalanin 1,4, Prolin 4,1, Serin 1,6, Threonin 7,2, Tyrosin 0,6, und Valin 11,1.
2. 2. Verfahren zur Herstellung des Antibiotikums BBM-1644 nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man

   5 einen BBM-1644 produzierenden Stamm von Actinomadura sp. in einem wässrigen Nährmedium, enthaltend assimilierbare Quellen von Kohlenstoff und Stickstoff solange kultiviert, bis durch den genannten Organismus im Kulturmedium ein wesentlicher Mengenanteil BBM-1644 produziert io ist.
3. 3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass man BBM-1644 aus dem Kulturmedium gewinnt.
4. 4. Verfahren nach Anspruch 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, dass der verwendete BBM-1644 produzierende Or-

   15 ganismus die Identifizierungsmerkmal von Actinomadura sp. H710-49, ATCC 39 144, aufweist.
5. 5. Verfahren nach einem der Ansprüche 2—4, dadurch gekennzeichnet, dass man die Kultivierung unter submersen, aeroben Bedingungen ausführt.

   20 6. Biologisch reine Kultur des Mikroorganismus Actinomadura sp. ATCC 39 144 als Mittel zur Ausführung des Verfahrens nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Kultur dazu befähigt ist, bei Kultivierung in einem wässrigen, assimilierbare Quellen von Kohlenstoff und Stickstoff

   25 enthaltenden Nährmedium einen gewinnbaren Mengenanteil des Antibiotikums BBM-1644 zu produzieren.
6. 7. Pharmazeutische Zubereitung, enthaltend einen antibakteriell wirksamen Mengenanteil BBM-1644 nach Anspruch 1 als aktive Komponente.

   30 8. Pharmazeutische Zubereitung, enthaltend einen antibakteriell tumorinhibierend wirksamen Mengenanteil BBM-1644 nach Anspruch 1 in Kombination mit einem pharmazeutischen Träger oder Verdünnungsmittel.