PT77091B

PT77091B - Process for the preparation of a new antibiotic proteinic compound of neocarzinostatine type and pharmaceutical compositions therewith

Info

Publication number: PT77091B
Application number: PT77091A
Authority: PT
Inventors: Masataka Konishi; Fumihide Sakai; Takeo Miyaky; Hiroshi Kawaguchi
Original assignee: Bristol Myers Co
Priority date: 1982-07-26
Filing date: 1983-07-25
Publication date: 1986-06-26
Also published as: ES8502161A1; HU192165B; MY8800125A; FR2530663A1; NO832689L; JPH0526799B2; AU1720083A; YU158583A; SE8304132L; GR78648B; ES524405A0; DE3326917A1; IT1163847B; JPS5948084A; SE8304132D0; AU567105B2; NZ204965A; DK339683D0; LU84930A1; NL8302610A

Description

Descrição da técnica anterior

0 antibiótico anti-tumor preparado pelo processo de acordo com a presente invenção, BBM-1644, e um membro novo dos antibióticos anti-tumor proteicos exemplificados por neocarzinostatina, macromomicina e auromomicina.

A neocarzinostatina (também denominada zinostatina) é uma macromolécula proteica ácida de P.M. 10.700 constituída por uma cadeia polipeptídica simples de 109 aminoãci dos com ligações transversais através de duas pontes de dissulfureto. A produção de neocarzinostatina mediante fermenta ção de estirpes de "Streptomyces carzinostaticus" var. "neocarzinostaticus" encontra-se descrita na patente de invenção/ norte-americana N° 3.334.022 e em "J.Antibiotics" 18 : 68-76 (1965). A sequência de aminoãcidos da neocarzinostatina encontra-se descrita em "Câncer Treatment Reviews" 6, 239-249 (1979).

A macromomicina ê um polipeptido neutro ou fracamente acido com um P.M. aproximado de cerca de 15.000. A pro

-2-

duçSo de maoromomicina mediante fermentação de "Streptomyces macromomyceticus" (NIHJ MG-8-42) encontra-se descrita na patente de invençSo norte-americana 3.595*954 e em "J, Antji biotios" 21, 44-49 (1968). A purificação da maoromomicina e os resultados da caracterização do composto puro encontram-se desoritos em "J.Antibiotios" 29, 415-423 (1976).

A auromomioina é um polipeptido fraoamente ácido oom um P.M. de oeroa de 12.500 e um ponto isoeléotrioo de pH 5,4. É constituída por 16 aminoáoidos diferentes. 0 isolamen to da auromomioina a partir do caldo de cultura de "Streptomyoes macromomyoeticus" e as propriedades de caracterização do produto puro encontram-se descritos em"J. Antibiotics", 32, 330-339 (1979).

BBM-1644 pode distinguir-se dos antibióticos anti-tumor polipeptídicos conhecidos como a neocarzinostatina_f a maoromomicina e a auromomioina por propriedades físico-químicas como peso molecular, teor de aminoáoidos e electroforese de papel.

Sumário da invenção

A presente invençSo proporciona um novo antibiótico anti-tumor proteico aqui designado por BBM-1644, sendo 0 citado antibiótico preparado mediante cultura de uma nova es tirpe de "Actinomadura" designada por "Actinomadura" sp. estirpe H-710-49 ( depositada na "American Type Culture Oollec tion" em 1 de Julho de 1982 e a que foi atribuído o número de entrada ATOO 39144) em um meio nutritivo aquoso que contém fontes assimiláveis de carbono e de azoto, sob condiçBes aeró bias submersas até que seja produzida, pelo microrganismo citado, uma quantidade substancial de BBM-1644 no citado meio

de cultura, β isolamento eventual do BBM-1644 a partir do meio de cultura. A invenção abrange o antibiótico BBM-1644 em solução diluída, sob a forma de um concentrado bruto, sob a forma de um produto sólido bruto ou sob a forma de um produ to sólido puro.

Descrição dos desenhos

A Fig. 1 mostra 0 espectro de absorção no infravermelho de BBM-1644 (pastilha de KBr).

A Fig. 2 mostra os espectros de absorção no ultravioleta de BBM-1644 em água, em ácido clorídrico 0,01 N e em hidróxido de sódio 0,01 N.

Descrição pormenorizada

A presente invenção diz respeito a um novo antibió tico anti-tumor proteico, aqui designado como BBM-1644 e à sua preparação mediante fermentação de uma nova estirpe de "Actinomadura" designada por "Actinomadura" sp., estirpe H 710-49. 0 microrganismo citado foi isolado a partir de uma amostra de solo colhida na Alemanha Federal. Uma cultura biologicamente pura do microrganismo foi depositada em 1 de Julho de 1982 na "American Type Culture Oollection", Washington, D. 0. e adicionada à sua colecção permanente de microrganismos como ATOO 39144.

BBM-1644 inibe o desenvolvimento de diversas bactérias gram-positivas e ácido-resistentes. 0 antibiótico BBM-1644 apresenta também propriedades indutoras de fago em bactérias lisogénicas e inibe 0 desenvolvimento de tumores linfa ticos e de tumores sólidos como leucemia P 388 em murganhos. Por isso, 0 novo antibiótico pode ser utilizado como agente

-4-

antibacteriano ou como agente anti-tumor para inibir tumores de mamíferos.

0 Mlororganismo

A estirpe de aotinomioeto Ne. H71O-49 foi isolada a partir de uma amostra de solo e preparada mediante técnicas convencionais sob a forma de uma cultura biologicamente pura para caracterização. A estirpe H 710-49 forma um micélio de substrato e um micélio aéreo. 0 micélio de substrato é compri do, ramificado e não fragmentado em filamentos curtos. Formam -se cadeias de esporos curtas na extremidade ou nos ramos monopódicos do mioélio aéreo. As cadeias de esporos contêm 2 a 15 esporos em cada cadeia ( na sua maior parte 4 a 8 esporos)

® são rectilíneas, em gancho ou curvilíneas. Os esporos têm uma superfície cheia de protuberâncias e são de forma oval a elíptica ( 0,5 ~ 0,6 x 0,7 ~ 1,2 yum) com uma extremidade redonda ou ponteaguda. Os esporos maduros estão muitas vezes se parados por hifas ocas. Observa-se ooasionalmente protuberâncias terminais de hifas sobre o micélio do substrato em agar de Czapek e em agar de Bennett. Não se observa esporos móveis, esporângios ou grânulos escleróticos em qualquer dos meios examinados.

Ao contrário das espécies vulgares do género "Strej> tomyces", a estirpe H71O-49 desenvolve-se lentamente e forma um micélio aéreo fraco em meios de cultura quimicamente defi nidos e em meios de cultura naturais orgânicos. A cor do micé lio aéreo é branca e toma uma cor rosada após esporulação em farinha de aveia-agar, sais inorgânicos-amido-agar e glicerol -asparagina-agar. A massa de micélio do substrato é incolor, amarela castanho-avermelhada ou castanho-acinzentada escura.

-5-

Não ae produz pigmento melanoide mas observa-se um pigmento di fusível amarelo-limSo em glicerol-asparagina-agar, tirosina-agar e agar basal de Pridham-Gottlieb suplementado com glicerol, L-arabinose, D-xilose, L-ramnose, D-glucose, D-frutose, trehalose ou D-manitol. A estirpe H710-49 desenvolve-se a 20°C, 28°0 e 37°O roas não a 10°C ou a 41°C. É sensível ao oloreto de sódio em solução a 10 % mas não a 7 % e resistente ao lisozima a 0,001 A D-galactose, a D-manose, a sacarose, a rafinose e o inositol não são utilizados pela estirpe. As oaraoterísticas culturais e fisiológioas da estirpe H71O-49 estão indicadas nos Quadros 1 e 2, respectivamente. 0 modelo de utilização da fonte de oarbono pela estirpe está indicado no Quadro 3·

Quadro 1

Oaraoterísticas culturais*da estirpe H710-49

Caldo de triptona ex-	G**	fraco ao moderado; flocoose,
tracto de levedura		sedimentado e não pigmentado.
(ISP No. 1)
S_acaro se-nitrato-agar	G	escasso
(agar de Ozapek)	R	incolor a amarelo-laranja páli
		do (73)***
-	A	escasso; branco (263)
	D	nada
Gluco se-asparagina-	G	fraco
-agar	R	branco amarelado (92) a amarelo
	A	-laranja intenso (69) muito escasso; branco (263)
	D	nada

-6-

Quadro 1 - oontinuagSo

Gli c erol-a sparagina-	G	fraco a moderado
-agar (ISP No. 5)	R	amarelo pálido (89) a amarelo-laranja intenso (72)
	A	fraco; branco (263) a rosa amarelado pálido (31)
	D	amarelo brilhante (83)
Sais inorgânicos	G	fraco a moderado
amido-agar (ISP No. 4)	R	incolor a amarelo intenso (85)
	A	fraco; branoo rosado (9) a
		rosa amarelado pálido (31)
	D	nada
Tirosina-agar (ISP No.7)	G	moderado
	R	laranja acastanhado (54) a castanho avermelhado modera do (43)
	A	fraoo; branco (263) a amarelo pálido (89)
	D	amarelo forte (84)
Agar nutritivo,,.	G	fraoo a moderado
	R	branco amarelado (92) a castanho amarelado moderado (77)
	A	fraoo; branoo (263)
Extraoto de levedura	D	nada
extracto de malte-agar	G	moderado
(ISP No. 2)	R	amarelo escuro (88) a castanho escuro (59)
	A	escasso; branco (263)

-7-

V)

Quadro 1 continuação

D

Farinha de aveia-agar (ISP No.3) G

R

A

D

Agar de Bennett G

R

A

D

Peptona-extracto de le vedura-ferro-agar G

(ISP No.6) R

A

D

oastanho-azeitona olaro (94)

fraco

incolor

fraco; hranoo (263) a branco

rosado (9)

nada

moderado

castanho amarelado acinzentado (80) a castanho acinzentado escuro (62)

muito escasso ; branco (263) castanho-azeitona moderado (95)

fraco

amarelo acinzentado (90) a castanho acinzentado escuro (62)

fraco; branco (263) nada a castanho amarelado moderado (77)

% observado após incubaçãoa28°C durante 3 semanas

Abreviaturas: G - Desenvolvimento * R - Cor do reverso; A - Mioélio aéreo;

D - Pigmento difusível

A cor e o número entre parêntesis seguem o padrão de cor em "Kelly, K, L. & D. B, Judd: ISCC-NBS quadros de cor-nome ilustrados com "Centroid Colors". U.S. Dept. of Comm. Oiro. 553»

-8-

Washington, D.0., Nov., 1975"

9

ι

ra

	r—J Φ . &
ra		1 ra
ri		c
ra		0		0
-P		-P		o
rri		Dr	ri	m
3		ra	ra	•rl
0		ft	tn	Q
		1	ra
ra	P	ra	1	0
Ό	P	(0	0	t)
	ra	0	Ό	ra
o	R	o	•rd	-P
Ή	R	ra	6	ra
ra	ra	rri	ra	R
ε	m	tn		(Ω
			ra	ra
ra	ra	ra	Ό	t)
	Ό	tJ
0			ra	ra
tl	ri	o ra	o	•P
o	ra	•ri R	ra	Ή
•p	tn	ra μ	rri	ra
vra		S -P	Pr
S

								ri	ri
							íO	ra	ra
							cn	tn	tn
							Ití	ra	ra
		1			1		1 ra	1 ra	1 ra
ra		ra			X		ri	ri	ri
ra		ri		ra	ra	o	ra	ra	ra
		ra		•ra	1	-P	t)	•ra	Ό
0		ra			ra	ra	ra	ra	ra
-P	ra	ra		o	tn	ri	>	>	>
0		t>		rP	0	•P	ra	ra	ra
ra	ri	ra		ra	o	•ri	rri	rri	rri
ri	ra	I—1		ri	ra	fi
•P	tn			•P	rri	1	ra	ra	ra
X	ra	ra		•H	tn	ra	tl	t)	tl
ra		Ί3		R		ri
1	ra			1	ra	ra	0	o	o
ra	R	0		ra	Ό	t)	•P	P	•P
R	•ri	•P		cn		ra	o	o	0
0	U)	o		0	0	>	ra	ra	ra
•P	0	ra		o	t}	ra	ri	ri	ri
a	ri	ri		ra	rri	1—1	•P	-P	-P
•rl	•rd	•P	ri	r—1	ra			X	X
ri	•P		ra	tP	0	ra	ra	ra	ra
-P		ra	tn			t)	1	1	1
	ra	1	ra	Φ	ra		ra	ra	ra
ra	ri	ra	1	Ό		o	R	R	R
t)	ra	R	o		ri!	•P	0 .	0	0
	tJ	0	ri	0	ra	α	•P	P	-P
o	ra	•P	ri	τ)	a	ra	a	Cl	a
Ό	>	a	ra	r—1	ra	ri	•H	•H	•ri
ι^-'l	ra	ra	Ή	ítí	N	•P	ri	ri	ri
íO	iri	a	1	O	u		E-i	E-i	E-i
o

Características fisiológicas da estirpe H71O-49

ι

ra

•p

ra

r-1

ra	O°		0
g	r—i	ra	Π3
		•P	Ití
_oò	Ití	•ri ra	ω •ri
	0)	m	rd
ro		ra	0
	O	ra
ití	Q_	tn
Φ	S	•ri H)	•ri «

&

ε

o o Ο Ό ra ra n

•rl

o β Ό 0 ra +> rri ft 3 ra tn a ra

o ra o -p

o

ira

53

ra

ri

ra o

a	Ό
				ra
	ra			+j
	ri	ra		ra
	ra	R		R
	-P	•ri		cn
	ra	•P		ra
	ri	ra		tl
	ra	rri	0
	a	ra	t)	ra
	s o	tn	ri	P
	ra -p		ε	•rl
	-P R	ra	ra	ra
	ra	tl		rd
	ra ε		0
	t) -ri	0	tj	ε
	>	ira		ra
	0 rri	cn	ra
	rri 0	o	cn	cn
	cti !>	ra	•rl	ra
o	> R	m	rd	IO
•rl	ri ra	ra	»0	o»
ití	ra cn	3	ri	o
ω	-p ra	tn	tl	ra
6	fi tl	•r\|	•rl	ra
W	H	μΐ	ffi	P4

o

•P

R

ra

B

•rl

!>

rri

cn

ra

ε

o

	ω •r\| ω Φ M	Ití 0 4->	0 r> R ra cn ra	to ra 0 •P
o		ra	R		Q		R
tl		-P	ra				ra
•ri		R	ε		•		ε _Λ
N		ra	•rl		ra	QY>	•ri o
3		P	>		-P		> -
rai	0	ra	1—1		R	rd	rri tn
o		tl	o		ra	O	o
ri	•rl	ra	>	0\0	-P	o	> ra
a	N	ri	R	cn	*·	R
ra	ra	ra	o	•ri	o	ω o
0	*Ú	tl	tn	r-d	M		cnira
ira	ra	o	ra	fd	ra	ití	ra fi
ia	«	a	Q	rt		Q

ra

Ό

-ri rri

0	o	u
q	-P	ití
ítí	ra	53
rd	ri
Φ	•P
β	•ri	ití
	R
Φ		ití
TJ	ra	•rl
	T3	ϋ
o		q	ítí
l ro	O	«u	Ê
	ira	-μ	♦ri
ití	o	ω	N
β	3	•rd	0
Jd	tJ	cn	ω
0	ra	ra	•rl
Fd	Pí	Pí

-10-

Quadro 3

Utilização de fontes de carbono* pela estirpe H71O-49

Glicerol	+
D (-) -Arabinose	-
D (+) -Arabinose	+
D-Xilose	+
D-Ribose	+
L-Ramnose	+
D-Glucose	+
D-G-alactose	M
D-Frutose	+
D-Manose
li (-)-Sorbose	-
Sacarose	-
lactose	-
Oelobiose	+
Melibiose	-
Trehalose	+
Rafinose	-
D (+) -Melez ito se-	-
Amido solúvel	+
Celulose	M
Duloitol	-
Inositol	-
D-Manitol	+
D-Sorbitol	-
Salioina

* Observada após incubação a 28°0 durante 3 semanas. Meio basal: Meio inorgânico de Pridham-Gottlieb

11-

A parede celular purificada da estirpe H71O-49 contém ácido mesodiaminopimélico mas não contém glicina. 0 hidrolisado de células completas mostra a presença de madurose (3-O-metil-D-galactose), glucose, ribose e uma pequena quantida <3e de manose. A composição da parede celular e os componentes âe açúcar da célula completa da estirpe H71O-49 indicam que a estirpe pertence ao Tipo 11¾ de parede celular.

As caracteristicas anteriormente descritas da estirpe H71O-49 são semelhantes às do género "Actinomadura". Le acordo com a taxonomia numérica de "Actinomadura" e dos actino micetos com ele relacionados de Goodfellow e colab. em "J. Gen. Microbiol," 112:95-111 (1979)» a maior parte das espécies de "Actinomadura" provenientes do solo está classificada em "Clus ter" NB, 7 entre os 14 grupos descritos. A estirpe NB. H71O-49 é a mais aparentada com as espécies de "Gluster" 7. Nonomura e Ohara em "J. Fermente. Technol." 49, 904-912 (1971) fazem refe rência a cinco espécies sapréfitas do género "Actinomadura" e Nonomura /” "J.Ferment. Technol.", 52, 71-77 (1974)J e Preobraz henskaya e colab. /""Actinomycetes and Related Organisms" 12, 30-38 (1977)J descrevem a identificação e a classificação das espécies de "Actinomadura". Como resultado da comparação com as espécies de "Actinomadura" conhecidas descritas na literatu ra, a estirpe H71O-49 é considerada como pertencendo a umá nova espécie de "Actinomadura" semelhante a "A.roseola", "A. sal monea", "A.vinacea" ou "A. corallina" descritas por Preobrazhenskaya e colab* na referência citada antes e no pedido de pa tente de invenção japonesa Kokai 55/94391.

Deverá entender-se que, no que se refere à produção

-12-

de BBM-1644, a presente invenção, ainda que descrita em porme nor relativamente a uma estirpe H71O-49 espeoífioa de "Aotino madura” sp. (ATOO, 39144)» não está limitada a este microrganismo ou a microrganismos completamente descritos pelas caracs terísticas culturais aqui definidas. Pretende-se especificamente que a invençSo abranja a estirpe H71O-49 e todas as suas variantes e mutantes naturais e artificiais produtoras de BBM-1644.

Produção do antibiótioo

Pode preparar-se 0 antibiótico BBM-1644 da presente invençSo cultivando uma estirpe do género "Aotinomadura" produtora de BBM-1644, de preferência uma estirpe de "Actinomadu ra" sp. oom as características de identificação de ATOO 39144 ou de um seu mutante, em um meio nutriente aquoso convencional. 0 microrganismo desenvolve-se em um meio nutriente que contenha fontes nutritivas conhecidas para os actinomicetos, i. e. fontes de carbono e de azoto assimiláveis oom sais inorgânicos e outros factores de crescimento conhecidos facultativos.

É preferível utilizar condiçSes aeróbias submersas para produ zir grandes quantidades de antibiótioo, embora, para a produção de quantidades limitadas, possa também utilizar-se culturas de superfíoie e frascos de cultura. As técnicas gerais uti lizadas para cultivar outros actinomicetos são aplicáveis à presente invenção.

0 meio nutritivo deverá conter uma fonte de carbono assimilável apropriada como glicerol, 1 (+)-arabinose, D-xilose, D-ribose, D-glucose, D-frutose, amido solúvel, D-manitol ou celobiose.. Oomo fontes de azoto, pode utilizar-se cloreto

de amónio, sulfato de amónio, ureia, nitrato de amónio, nitrato de sódio, etc., sozinhos ou associados a fontes de azo to orgânico como peptona, extracto de carne, digesto de cereais, farinha de soja, farinha de sementes de algodão, etc. Pode também adicionar-se, eventualmente, sais inorgânicos nu tritivos para constituírem fontes de sódio, potássio, cáloio, amónio, fosfato, sulfato, cloreto, brometo, carbonato, zinco, magnésio, manganésio, cobalto, ferro, e similares.

A produção do antibiótico BBM-I644 pode efectuar-se a qualquer temperatura que conduza a um desenvolvimento satis fatório do microrganismo produtor, a saber 2Ο°-37°θ» sendo con veniente efectuá-la a uma temperatura de cerca de 27°-32°0. De uma maneira geral, consegue-se uma produção óptima em frascos agitadores após períodos de incubação de cerca de 6-7 dias. Quando tem de ser efectuada em um tanque de fermentação, é con veniente produzir um inoculo vegetativo em um caldo nutritivo inoculando 0 caldo de cultura com uma cultura em uma placa em forma de cunha ou uma cultura de solo ou uma cultura liofilizada do microrganismo. Depois de se obter, deste modo, um inó culo activo, transfere-se este, em condições de assepsia, para 0 meio de “cultura do tanque de fermentação. A produção de antibiótico pode ser verificada cuidadosamente mediante ensaio de difusão de disco de papel-agar utilizando "Bacillus Subtilis" M 45 Z*mutante Rec”; "Mutation Res.", 16, 165-174 (1972)_7 como microrganismo de ensaio.

Isolamento e purificação

Quando a fermentação está completa, BBM-1644 existe principalmente na porção líquida do caldo fermentado após

-14-

separação da porção sólida mediante filtração ou centrifugação. Deste modo, pode separar-se o caldo colhido, mediante centrifugação, em bolo de micélio e caldo sobrenadante. Concentra-se depois o filtrado e dialisa-se contra água da torneira utilizando uma membrana 3emi-permeável como um tubo de celofane para eliminar as impurezas permeáveis, A solução re tida no interior (após eliminação das substâncias insolúveis) que contém o BBM-1644 pode depois ser saturada com um reagen te de eliminação de sais como sulfato de amónio para precipi tar BBM-1644 sob a forma de um produto sólido bruto. Pode dis solver-se este produto sólido em água e eliminar os sais mediante diálise contra água da torneira.

Pode efectuar-se a purificação ulterior do BBM-1644 bruto mediante técnicas convencionais utilizadas com outros polipeptidos ácidos. Por exemplo, a solução aquosa que contem a BBM-1644 pode ser absorvida sobre um permutador de iOes co mo DEAE-Sephadex, DEAE-Gellulose, GM-Sephadex ou CM-oellulose e eluida oom uma solução de sal neutra. É preferível utilizar fases cromatográfioas sucessivas e uma concentração gradiente de solução salina como eluente. Goncentra-se depois até à secura, por ex.“mediante liofilização, as fracçBes aquosas que

(

contêm o BBM-1644 puro.

Propriedades físico-químicas de BBM-1644

BBM-I644 é isolado, após liofilização, sob a forma de um pó branco amorfo. Quando examinado mediante electroforese de papel de alta voltagem ( 4500 V em solução-tampão de 0,05 M de barbital, a pH 8,6), BBM-1644 sob a forma de ácido desloca-se 8,7 cm para 0 ânodo, após uma hora, BBM-1644 não

-15-

apresenta um P.F. definido.e deoomp3e-se gradualmente acima de 240°0, 3§ solúvel na água, mas praticamente insolúvel em dissolventes orgânicos comuns como metanol, etanol, acetona, acetato de etilo e hexano n. 0 antibiótico apresenta uma ro taçSo óptica de - 75,6° em solução aquosa a 0,25 $>.

Como se representa na Fig.2, o espectro UV de BBM-1644 mostra máximos de absorçSo a 275 nm ( E 8,2) e 310 nm

1 cm

4,6, inflexão) em solução aquosa. Apresenta um espectro

.lom

UV quase idêntico em água e em solução de ácido clorídrico

Ο,ΟΙΝ, mas apenas um máximo simples a 285 nm (E 8,9)

1 cm

em solução de hidróxido de sódio Ο,ΟΙΝ. 0 espectro IV de BBM-1644, medido em KBr, está representado na Fig. 1. 0 espectro indica a presença de grupos NH e OH ( 3300/^2980 cm^-·*¹) e de grupos amida (1650 e 1540 cm ^). 0 antibiótico dá reac çOes positivas com os reagentes de Folin-Lowry, xantoproteína, biureto e ninidrina e descora a solução de permanganato de potássio. Dá negativas as reaoçSes da antrona e de Sakaguchi. Quando cromatografado sobre Sephadex G-75 juntamente com ovalbumina (P.M. 43·ΟΟΟ), quimotripsinogánio (25.000) e ribonuclease A (13.700), BBM-1644 é eluido logo a seguir ao quimotripsinogánio e, por isso, o seu P.M. á avaliado como sendo cerca de 22.000. A análise elementar de BBM-1644 indica 46,60 % de carbono, 6,45 0 de hidrogénio, 13,34 % de azo to e 0,20 % de enxofre. A análise de aminoácidos revela a presença de 13 tipos de aminoácidos na molécula de BBM-1644, como se mostra no Quadro 4. Os aminoácidos básicos como a li sina, a histidina e a arginina não estão presentes em BBM-1644.

Quadro 4

Composição de aminoácidos do BBM-1644
Aminoaoido	Composição reli
	aminoácidos
Alanina	8,8
Ácido aspártico	6,0
Semi-Cistina	1,0
Ácido glutâmico	5,7
Glicina	8,7
Isoleucina	2,3
leucina	1,0
Fenilalanina	1,4
Prolina	4,1
Serina	1,6
Treonina	7,2
Tirosina	0,6
Valina	11,1

% Ao teor de leucina foi arbitrariamente atribuído o valor

1,0.

-17-

BBM-1644 é medianamente estável no intervalo de pH 2«^9, mas a estabilidade diminui nitidamente alem deste inter valo de pH. A solução aquosa de BBM-1644 é estável durante 2 horas a 5O°0 em pH neutro. Após exposição à luz ultravioleta, a aotlvidade antibiótica de BBM-1644 desaparece dentro de 20 minutos.

As propriedades físico-químicas de BBM-1644 descri tas antes indicam que este antibiótico e um membro do grupo de antibióticos anti-tumor proteicos que compreende a neocar zinostatina, a macromomicina e a auromomicina. N_o entanto, BBM-I644 pode distinguir-se dos antibióticos anti-tumor proteicos conhecidos pelo seu peso molecular, teor de aminoácidos e electroforese de papel. As mobilidades de BBM-1644, neo oarzinostatina e maoromomioina na electroforese de papel estão indicadas no Quadro 5.

Quadro 5

Electroforese de papel^

Mobilidade (mm a pa-rtir da mancha de

carga)

BBM-1644	+ 87
Neo oarz ino statina	+ 31
Ma oromomi o ina	- 20

* 4,500 V, 1 hora; Solução tampão de barbital de pH 8,6

0 grupo neocarzinostatínico de antibióticos apresenta normalmente dois máximos de absorção UV a cerca de 275 nm e a 350 nm, enquanto BBM-1644 apresenta o máximo de UV a cerca de 275 nm e a 310 nm. Eoi reoentemente referido em "Biochem. Res. Commun." 95, 1351-1356 (1980) que o máximo a 350 nm dos

antibiótioos neocarzinostatínicos pode ser devido aos oromóforos nSo-proteioos que sSo essenciais para a sua actividade biológica. Deverá notar-se que BBM-1644 tem um oromóforo diferente dodogniho.de - antibiótioos neocarzinostatínicos conhecidos.

Propriedades biológicas de BBM-1644

A actividade antibacteriana de BBM-1644 foi determinada pelo método de duas diluiçBes em série em agar. Utili za-se meio de agar nutritivo para bactérias gram-positivas e gram-negativas; meio de agar nutritivo com 4% de glicerol pa ra bactérias ácido-resistentes e meio de agar de Sabouraud para fungos. A actividade é expressa em oonoentraçSo inibido ra mínima (CIM) no meio de agar e os resultados estão indioa dos no Quadro 6 juntamente oom os da neoearzinostatina BBM-I644 apresenta uma forte actividade inibidora contra bactérias gram-positivas e bactérias ácido-resistentes mas nSo inibe 0 desenvolvimento de bactérias gram-negativas e de fun gos. O espectro antibacteriano de BBM-1644 é análogo ao da neoearzinostatina, enquanto a actividade intrínseca de BBM-1644 é mais forte que a desta última com alguns dos micror ganismos de ensaio.

Quadro 6

Actividade antimicrobiana In vitro

OIM em mcg/ml

Organismo de ensaio BBM-1644 Neoearzinostatina Staphyloooccus aureus

PDA 2O9P 0,4 1,6

Staphylooooous aureus Smith

0,8

0,2

-19Quadro 6 - continuação

Streptocoocus pyogenes A20201 Micrococous luteus PCI 1001 Micrococous flavus D12 Baoillua aubtilla PCI 219 Escheriohia ooli NIHJ Klebaiella pneumonlae D-ll Proteus vulgaris A9436 Pseudomonas aeruginosa A993O Myoobacterium smegmatis 607 D87 Myoobaoterium phlei D88 Oandida albioans IAM 4888

6,3

1,6

0,8

?100

>100

12,5

3,1

>100

3,1

1,6

3,1

>100

7100

50

12,5

>100

A capacidade do BBM-1644 para induzir profago em bactérias lisogénicas (ILB) foi determinada pelo método de Lein e colab. /""Nature”, 196, 783-784 (1962)_/ utilizando neocarzinostatina como composto de referência. Conta-se as placas sobre lâminas de agar que contêm o composto de ensaio (T) e o controlo (C). Uma relação T/c das contagens de plaoas superior a 3 e considerada como significativa e a actividade ILB é expressa como concentração indutora mínima do oomposto de ensaio. Como se mostra no Quadro 7, a activi dade ILB de BBM-1644 é análoga à observada com a neocarzinostatina, sendo a concentração indutora mínima igual a 1 mcg/ml.

Quadro 7

Indução de bactérias lisogénica por BBM-I644

____actividade de ILB (T/o)^

	100	10	1	0,1 mcg/ml
BBM-1644	10,4	10,3	6,0	1,2
Neocarzinosta tina	28,6	20,4	10,8	0,7

-20-

Quadro 7 continuação

$ actividade significativa: T/0 de >3,0

A actividade anti-tumor de BBM-1644 é determinada em murganhos (raça BDP-^) contra leucemia linfocítica P 388. Inocula-se cada murganho, por via intraperitoneal, com 3^x10 células do tumor. Administra-se doses progressivas do antibiótico, por via intraperitoneal, aos murganhos, 24 horas de pois da implantação do tumor. Efectua-se os tratamentos, uma vez por dia, nos dias 1, 4 e 7 (plano q 3d * 3) ou em 9 dias consecutivos (plano qd l->9). Ensaia-se oomparativamente a neocarzinostatina oomo agente anti-tumor de referência e os resultados estão resumidos no Quadro 8. BBM-1644 é extremamente activo contra a leucemia do murganho em uma dose compre endida entre 0,03 ® cerca de 1,0 mg/Kg/dia, em ambos os trata mentos. A actividade anti-tumor de BBM-1644 e aproximadamente a mesma (plano qd l->9) ou 3 vezes mais potente (plano q 3d* X3) do que a da neocarzinostatina em termos de dose eficaz mí nima.

Quadro 8

Actividade anti-tumor contra leucemia P388	(%) em MST*
	T/0
	Dose	em mg/Kg/dia,		q3d x 3
	1	0,3 0,1	0,03	0,01
BBM-1644	188	188 138	125	113
Neocarzinostatina	163	150 125	113
		T/C	(¢) em MST
	Dose	em mg/Kg/dia,	ip, gd 1-^9

·*·/··

Quadro 8 continuação

0,01

113

0,3 0,1 0,03

BBM-1644 125 175 138

Neooarzinostatina 163 138 125

tempo de sobrevivênoia medio; actividade significativa: T/C de 125 %

A actividade anti-tumor de BBM-1644 é também avalia da mediante um segundo ensaio efectuado contra leucemia P388 em murganhos e os resultados obtidos estão indicados no Quadro 9 a seguir. Os pormenores dos métodos utilizados neste en saio estão descritos, em "Câncer Chemother. Rep." J, 1-87 (Par te 3) (1972).

Quadro 9

Efeito de BEM-1644 sobre Leucemia P388

Material	Plano de tratamento	Dose, IP mg/kg/inj	MST Dias	Efeito de MST %T/0	AWC
gm d.6	Sobreviventes Dia 5 (30)
Neocarzinos
tatina	D.l,4&7,	1,6	8,0	89	-4,8	6/6
		• 0,8	10,5	117	-4,3	6/6
		0,4	15,5	172	-3,2	6/6
		0,2	15,0	167	-2,5	6/6
		0,1	13,5	150	-1,2	6/6
		0,05	12,0	133	-1,7	6/6
BBM-1644	D.l	2,56	9,0	100	-	4/6
		1,28	14,0	156	-4,1	6/6
		0,64	14,5	161	-4,9	6/6
		0,32	16,5	183	-4,8	6/6
		0,16	14,0	156	-4,1	6/6

-22

Quadro 9 continuação

			0,08	12,0	133	-2,8	6/6
			0,04	10,5	117	-2,7	6/6
			0,02	11,0	122	-2,5	6/6
	D.l,	4&7	1,28	23,5	261	-3,3	6/6
			0,64	19,0	211	-3,5	6/6
			0,32	18,5	206	-4,3	6/ 6
			0,16	14,5	161	-3,8	6/6
			0,08	12,0	133	-3,3	6/6
			0,04	12,0	133	-2,9	6/6
			0,02	10,0	111	-2,5	6/6
			0,01	10,0	111	-1,9	6/6
	QD H9	0,64	8,0	89	-5,2	6/6
			0,32	10,0	111	-4,2	6/6
			0,16	19,0	211	-4,3	6/6
			0,08	18,0	200	-4,2	6/6
			0,04	15,5	172	-3,5	6/6
			0,02	13,0	144	-3,3	6/6
			0,01	12,0	133	-2,2	6/6
		--	0,005	11,0	122	-1,1	6/6
Controlo	10⁷	Soro	fisiológi-
		co		8,0	-	-	10/10
	10⁶	Soro	'íisiológi-
		co		9,0	-	-0,3	20/20
	10⁵	Soro	fisiológi-
		co		11,0	-	-	10/10
	10⁴	Soro	fisiológi-
		co		14,0	-	-	10/10

-23-

Quadro 9 continuação

Inoculo de tumor : 10 células de ascites, ip (mais titulação)

Hospedeiro : ODP^ ? murganhos

Tox : <4/6 murganhos vivos no dia 5

Avaliação : MST = tempo de sobrevivência médio

Efeito : % T/C = (MST tratado/MST testemunha) x 100,

Critérios : % T/C = 125 actividade anti-tumor considerada significativa.

A toxicidade aguda de BBM-1644 é determinada em murganhos (raça dd y) mediante administração intraperitoneal simples, sendo a DL^q calculada da ordem de 5,8mg/Kg.

Como se mostrou antes, BBM-1644 possui uma potente aotividade antibaoteriana contra bactérias gram-positivas e ba£ terias ácido-resistentes e pode, por isso, ser utilizado no tra tamento terapêutico de mamíferos e de outros animais, nas doen ças infecciosas causadas por essas bactérias. Adicionalmente, pode ser utilizado em outras aplicaçSes convencionais de agentes antibacterianos como desinfecção de equipamento médico e dentário.

A indução de profago em bactérias lisogénicas e a mar cada aotividade anti-tumor demonstradas contra leucemia P 388 em murganhos indicam que BBM-1644 é também terapeuticamente utilizável na inibição do desenvolvimento de tumores de mamífe ros.

Por esse motivo, a presente invenção fornece um méto do de tratamento terapêutico de um hospedeiro animal afectado por uma infecçâo bacteriana ou por um tumor maligno que consis te em administrar, ao hospedeiro citado, uma dose antibacteria

-24-

na ou inibidora de tumor eficaz de BBM-1644 ou de uma composição farmacêutica que o contenha.

Em uma outra modalidade, a presente invenção proporciona composiçOes farmacêuticas que contêm uma quantidade anti bacteriana ou inibidora de tumor eficaz de BBM-1644 associada a um excipiente ou diluente inerte aceitável sob o ponto de vis "ta farmacêutico. Estas oomposiçBes podem apresentar-se em qual quer forma farmacêutica apropriada para administração parenteral.

As oomposiçBes de aoordo eom a invenção para adminis. traçSo parenteral compreendem soluçBes, suspensões ou emulsões aquosas ou não aquosas estéreis. Podem também ser preparadas sob a forma de oomposiçBes sólidas estéreis que podem ser dissolvidas em água estéril, soro fisiológico ou outros meios injectáveis estéreis imediatamente antes da sua utilização.

Deverá considerar-se que as quantidades actualmente preferidas do antibiótico BBM-1644 utilizado variam consoante a composição formulada em questão, o modo de aplicação e o local, o hospedeiro e a doença a ser tratada. Os entendidos na matéria deverão ter em conta muitos factores que modificam a acção da droga'7 por exemplo, a idade, o peso do corpo, o sexo, a dieta, o tempo de administração, a via de administração, a velocidade de excreção, o estado do hospedeiro, as associaçBes de drogas, as sensibilidades reaccionais e a gravidade da doen ça, A administração pode efectuar-se contínua ou periodicamente dentro da dose máxima tolerada. As taxas de aplicação óptimas para um dado conjunto de condiçBes podem ser determinadas pelos entendidos na matéria utilizando ensaios convencionais

de determinação de dosagem tendo em vista as direotrizes meneio nadas antes.

-25-

Os exemplos seguintes sHo apresentados apenas com fins ilustrativos e não pretendem limitar o âmbito da invenção. DEAE Oellulose é uma celulose permutadora de ião dietila minoetilo. SEPHADEX G-50 é um gel de filtração fabricado por Pharmacia Pine Chemicals, Inc. DEAE SEPHADEX A-50 é um gel per mutador de anião dietilaminoetilo fabricado por Pharmacia Pine Chemicals,Inc. SEPHADEX® é uma marca de comércio de Pharmacia Pine Chemicals, Inc.

Exemplo 1

Fermentação de BEM-1644

Utiliza-se uma cultura de agar em forma de cunha com um desenvolvimento bem estabelecido de "Actinomadura" sp. Η71Θ-49 para inocular o meio de sementeira (100 ml em um balão de Erlenmyer de 500 ml) que contêm 1 % de manitol, 2% de peptona e 1% de extracto de levedura, ajustando até pH 7»2 antes da este rilização. Inouba-se a cultura de sementeira a 32°0 durante 72 horas sobre um agitador rotativo (250 r.p.m.) e transfere-se 5 ml da cultura para o segundo meio de sementeira (100 ml) com a mesma composição do primeiro meio de sementeira. Cultiva-se aquele nas mesmas condiçOes utilizadas para a primeira cultura de sementeira. Utiliza-se cinco mililitros da cultura de inocu lo assim preparada para iniciar a fermentação em balBes de Erlenmyer de 500 ml que contêm 100 ml de meio de fermentação com a seguinte composição: 2,5$ de manitol, 0,5$ de glucose, 1$ de farinha de soja, 0,5$ de peptona, 1$ de extracto de carne, 0,3$ de carbonato de cálcio e 0,2$ de cloreto de sódio. Efectua-se a fermentação a 28°C sobre um agitador rotativo com uma rotação

-26-

de 250 r.p.m. A produção de antibiótico ê verificada cuidadosa mente pelo ensaio de difusão de disco de papel-agar utilizando "Bacillus subtilis" M45 (mutante Reo") como microrganismo de ensaio. A actividade antibiótica no caldo de cultura auíiienta gra dualmente com o progresso da fermentação e atinge cerca de 300 raog/ml após 6^7 dias.

Exemplo 2

Separa-se 0 caldo recolhido (18 litros), obtido a par tir da fermentação do exemplo 1, em bolo do micólio e caldo sobrenadante, utilizando um aparelho de centrifugação sem pontas (Kokusan N2.4A). Concentra-se 0 filtrado, a uma temperatura inferior a 40°c, até um décimo do volume original e dialisa-se 0 concentrado, utilizando, como membrana, um tubo de celofane (Union Carbide), contra água da torneira em ambiente frio. Con centra-se a solução retida no interior até cerca de 1,5 litro e centrifuga-se depois (8.000 G) para eliminar as substâncias insolúveis. Satura-se a camada sobrenadante límpida com sulfato de amónio e deixa-se ficar em repouso durante 5 horas a 5°0. Se para-se 0 precipitado formado mediante oentrifugação; dissolve-se em'300 ml dè água e dessaliniza-se mediante diálise oontra água da torneira. A solução dialisada (700 ml) contêm 22g de produto sólido bruto de BBM-1644 como revela a liofilização de uma parte da solução. 0 resto da solução é utilizado para puri ficação ulterior sem concentração com o fim de evitar a decomposição. Raz-se passar a solução antibiótica através de uma co luna de DEAE-celulose (Cl“400 ml), lava-se a coluna com 1 litro de água e desenvolve-se com uma solução-tampão de 1/15M de fosfato (pH7,0) contendo 0,3M de cloreto de sódio. Reúne-se as fracçOes activas (300 ml), dialisa-se durante 18 horas contra

-27-

água da torneira e cromatografa-se sobre uma ooluna de DEAE-ce lulose (400 ml) previamente equilibrada oom solução-tampão de 1/15 M de fosfato (pH 7,5). Desenvolve-se a coluna com a mesma solução-tampão contendo uma quantidade crescente de cloreto de sódio (0^0,214). Dessaliniza-se 0 líquido eluido activo median te diálise e carrega-se sobre uma coluna de DEAE-Sephadex A-50 (17 ml). Desenvolve-se a coluna com uma solução-tampão de l/l5 M de fosfato (pH 7,5) contendo uma concentração gradiente de cloreto de sódio (Ο^Ο,βΜ). Reúne-se as fraeções activas (determinadas mediante ensaio com "B.subtilis" M45) e dialisa-se contra água corrente durante 18 horas. Oromatografa-se a solução dessa linizada sobre uma coluna de DEAE-Sephadex A-50 (18 ml), utilizando, como eluente, um sistema de solução-tampão de 1/15M de fosfato (pH 7,0)-NaCl (0γ-ό,3Μ). Separa-se as fraeções apropria das, concentra-se ate 10 ml e aplica-se sobre uma coluna de Sephadex G-50 para dessalinização. Elui-se a ooluna com água de sionizada e liofiliza-se 0 líquido eluido activo para se obter 120 mg de um pó branco. A amostra de BBM-1644 assim obtida ó ho mogenea como revela a electroforese de gel de poliacrilamida.

-28-

Claims

Reivindicações

1.- Processo de preparação do antibiótico BBM-1644 que:

(a) ê eficaz na inibição do desenvolvimento de bactérias gram-positivas e ácido resistentes;

(b) ê efioaz na inibição do desenvolvimento de leucemia P 388 em murganhos;

(c) induz o profago em bactérias lisogénicas;

(d) ê solúvel na ãgua mas praticamente insolúvel em metanol, etanol, acetona, acetato de etilo e hexano n.;

(e) apresenta um espectro de absorção no infravermelho (KBr)

que indica substancialmente a presença de grupos NH e OH (3300 2980 cm 1 e de grupos amida (1650 e 1540 cm ;

(f) apresenta um espectro de absorção no ultravioleta que mostra

- ~ 1% 1% máximos de absorçao a 275 nm (E, 8,2) e 310 nm (E. 4,6

1 cm 1 cm

inflexão) em solução aquosa e um espectro UV quase idêntico em

ãqua e em solução de ácido clorídrico 0,01 N, mas apenas um mã1 %

ximo simples a 285 nm (E^ _cm 8,9) em solução de hidróxido de sódio 0,01 N;

(g) tem uma rotação óptica /"«7^ -75,6 em solução aquosa a 0,25 %;

(h) não tem nenhum P.F. definido mas de^ompõe-se gradualmente acima de cerca de 24O°C;

(i) desloca-se cerca de 8,7 cm para o ânodo durante a electroforese de papel a 4500 V durante 1 hora utilizando uma solução-tampão de 0,05 M de barbital de pH 8,6;

(j) tem a seguinte composição elementar;

0,46,60 %; H, 6,45 %; N, 13,34 %; S, 0,20 % e 0(por diferença) 33,41 %;

(l) e um péptido de P.M. elevado para o qual estã indicado um P.M. de cerca de 22.000;

(m) descora uma solução de permanganato de potássio, dá posi-29-

tivas as reacções de Folin-Lowry,da xantoproteína, do biureto e da ninidrina e negativas as reacções da antrona e de Sakaguchi; e,

(n) mediante hidrólise, apresenta a seguinte composição relativa de aminoãcidos, calculada em relação ao teor de leucina a que se atribui arbitrariamente o valor 1,0: alanina (8,8) , ãcido aspãrtico (6,0), semi-cistina (1,0), ãcido glutâmico (5,7), glicina (8,7), isoleucina (2,3), leucina (1,0), fenil-alanina (1,4), prolina (4,1), serina (1,6), treonina (7,2), tirosina (0,6) e valina (11,1), caracterizado pelo facto de se cultivar uma estirpe produtora de BBM-1644 de "Actinomadura sp." em um meio nutritivo aquoso que contêm fontes assimiláveis de carbono e de azoto sob condições aeróbias submersas até que seja produzida uma quantidade substancial de BBM-1644 pelo microrganismo citado no meio de cultura citado.
2. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de se isolar o BBM-1644 a partir do meio de cultura.
3. - Processo de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo facto de o microrganismo produtor de BBM-1644 ter as caracteristicas de identificação de "Actinomadura sp." H 710-49 (ATCC 39144).
4. - Processo de acordo com as reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo.facto de se utilizar uma cultura biologicamente pura do microrganismo "Actinomadura sp." ATCC 39144 capaz de produzir o antibiótico BBM-1644 em uma quantidade recuperãvel após cultura em um meio nutritivo aquoso que contém fontes assimiláveis

de azoto e de carbono.
5. - Processo de preparação de composições farmacêuticas, caracterizado pelo facto de se misturar uma quantidade antibacteriana eficaz de BBM-1644, como ingrediente activo, preparado pelo processo de acordo com as reivindicações 1 a 4, com um excipiente ou diluente apropriado, aceitável sob o ponto de vista farmacêutico.

-30-
6,- Processo de preparação de composições farmacêuticas, caracterizado pelo facto de se misturar uma quantidade inibidora de tumor eficaz de BBM-1644, como ingrediente activo, preparado pelo processo de acordo com as reivindicações 1 a 4, com um excipiente ou diluente apropriado, aceitável sob o ponto de vista farmacêutico.

Iisboa, 25 de Julho de 1983

Desenhos 2 - Folha N° 1

"7 I

FfG.f

(cm-/)

BRISTOL-MYERS COMPANY

Desenhos 2 - Folha NQ 2

220 240 260 2S0 300 320 340 360

Ί | | τ Γ”

§ fc § § §

kl

Τ'

3

~r

T

c>

BRISTOL-MYERS COMPANY