FI93969C - Menetelmä kedarsidiini-antibiootin valmistamiseksi - Google Patents

Description

93969

Menetelmä kedarsidiini-antibiootin valmistamiseksi Tämä keksintö koskee menetelmää kasvainten kasvua estävän antiobiootin, joka tässä on nimetty kedarsidiinik-5 si, valmistamiseksi Streptoalloteichus sp. nov. kannan L585 - 6 avulla. Keksintö koskee myös kedarsidiinia tuottavaa mikro-organismia Streptoalloteichus sp. nov. kanta L585 - 6, ATCC 53 650.

Tämä keksintö antaa käyttöön menetelmän kasvua es-10 tävän kedarsidiini-antibiootin valmistamiseksi jolla on seuraavat ominaisuudet: a) ulkonäkö: ruskeankeltainen kiinteä aine; b) molekyylipaino: 12 400 daltonia SDS-polyakryyli-amidigeelielektroforeesimenetelmällä määritettynä; 17 000 15 daltonia geelisuodatus/HPLC-menetelmällä määritettynä; c) UV-spektri: oleellisesti sama kuin kuviossa 1; d) isoelektrinen piste: 3,65; sekä e) sisältää ei-proteiinisen kromoforin ja polypep-tidiketjun, jolla on seuraavanlainen aminohappojärjestys: 20 X-ala-ala-val-ser-val-ser-pro-ala-thr-gly-leu-ala-asp- gly-ala-thr-val-thr-val-ser-ala-ser-gly-phe-ala-thr-ser-thr-ser-ala-thr-ala-leu-gln-cys-ala-ile-leu-ala-asp-gly-arg-gly-ala-cys-asn-val-ala-glu-phe-his-asp-phe-ser-leu-ser-gly-sly-glu-gly-thr-thr-ser-val-val-val-arg-arg-ser-' 25 phe-thr-gly-tyr-val-met-pro-asp-gly-pro-glu-val-gly-ala- val-asp-cys-asp-thr-ala-pro-gly-gly-cys-gln-ile-val-val-gly-gly-asn-thr-gly-glu-tyr-gly-asn-ala-ala-ile-ser-phe-gly-OH; jossa X voi olla H-ala-ser, H-ser tai H.

Yllä esitetyt fysikokemialliset ominaisuudet erot-30 tavat tämän keksinnön mukaisesti valmistetun antibiootin

• I

*· muista tunnetuista peptidiantibiooteista, jotka estävät kasvainten kasvua, kuten neokartsinostaniinista, makromo-mysiinistä, largomysiinistä, aktinoksantiinista ja AN-7D:-Stä .

2 93969

Keksinnön mukaiselle menetelmälle on tunnusomaista, että viljellään kedarsidiinia tuottavaa Streptoalloteic-hus-kantaa L585-6, ATCC 53 650, tai sen jälkeläistä väliaineessa, joka sisältää assimiloitavia hiili- ja typpiläh-5 teitä, submersseissa aerobisissa olosuhteissa ja otetaan talteen mainittu proteiini käymisliemestä.

Edelleen keksintö antaa käyttöön kedarsidiinia tuottiavan kannan Streptoalloteichus sp. nov. kanta L585 -6, ATCC 53 650.

10 Kuvio 1 esittää kedarsidiini-antibiootin UV-spekt- riä.

Tässä hakemuksessa aminohapoista käytetään seuraa-via lyhennyksiä: asx: asparagiinihappo + asparagiini 15 thr: treoniini ser: seriini glx: glutamiinihappo + glutamiini asp: asparagiinihappo asn: asparagiini 20 glu: glutamiinihappo gin: glutamiini pro: proliini gly: glysiini ala: alaniini 1 25 vai: väliini met: metioniini ile: isoleusiini leu: leusilni tyr: tyrosiini 30 phe: fenyyliaianiini ♦. his: histidiini lys: lysiini arg: arginiini cys: kysteiini 35 trp: tryptofaani 3 93969

Tuotta i aorqanisml

Kanta L585 - 6 eristettiin maaperänäytteestä, joka oli kerätty Maharastran osavaltiosta Intiasta. Kannan L585 - 6 ominaisuudet kuvataan alla yksityiskohtaisesti.

5 Morfologia

Kanta L585 - 6 on gram-positiivinen, rihmainen organismi, joka muodostaa substraatti- ja ilmarihmastoa. Substraattirihmasto tunkeutuu agariin eikä fragmentoidu. Havaitaan pallomaisia, tiheitä hyyfiaggregaatteja, joiden 10 halkaisija on 5 - 25 pm, sekä yhteen kasvaneita, suvutto-mia hyyfejä. Ilmarihmasto on hyvin haaroittunutta ja muodostaa suoria, kiertyviä tai spiraalinmuotoisia pitkiä hyyfejä, joissa itiöt muodostuvat jatkuvina tai keskeytyvinä ketjuina. Tiheitä haaroittuneiden, lyhyiden itiöket-15 jujen muodostamia mättäitä muodostuu ensisijaisesti ISP-väliaineessa nro 5. Molemmat itiötyypit ovat muodoltaan ovaalinmuotoisesta lyhyen sylinterin muotoiseen (0,4 - 0,6 x 1,0 - 2,0 pm), liikkumattomia ja sileäpintaisia.

Värittömiä ilmapallomaisia kappaleita (halkaisijal-20 taan 5 - 20 pm) havaitaan yksinään tai ryhminä ilmarih-maston päällä 5-10 päivän inkuboinnin jälkeen. Kolmen viikon tai pidemmän inkuboinnin jälkeen näistä ilmapallo-maisista kappaleista kehittyy keltaisenruskeita kovettuneita jyväsiä (halkaisijaltaan 40 - 100 pm), jotka peit-* 25 tävät edelleen pidentyneet ilmahyyfit.

Viljelyominaisuudet

Kasvu on yleensä kohtalaista, mutta erittäin heikkoa Czapekin sakkaroosi-nitraatti-agarilla, kaurajauhoaga-rilla ja tärkkelysmineraalisuola-agarilla. Ilmarihmastoa .... 30 muodostuu tyrosiini-agarilla ja glyseroli-asparagiiniaga- v rilla, mutta ei ISP-väliaineilla nro:t 2, 3, 4 ja 6 eikä

Bennettin agarilla. Ilmarihmaston väri on keltaisenvalkoi-nen. Mustahkoja melanoidipigmenttejä muodostuu ISP-väliaineilla nro:t 6 ja 7. Muita selviä pigmenttejä ei muodostu. 35 Kannan L585 - 6 viljelyominaisuudet on esitetty taulukossa I.

4 93969

Taulukko I

Kannan L585 - 6 viljelyominaisuudet väliaine Ominaisuudet^ 2)

Sakkaroosi-mtraatti-agar 'G; ei lainkaan tai niukka _ (Czapek-Dox-agar) A: ei lainkaan

O

S: väritön D: ei lainkaan

Trvptoni-hiivauute- G; kohtalainen, ei samea, käymisliemi (ISP nro 1) höytyinen A: ei lainkaan S; väritön D: syvän keltaisenrus-kea (75)3)

Hiivauute-mallasuute-agar G: kohtalainen 15 (ISP nro 2) A: ei lainkaan S: tumman keltaisenrus-kea (78) D: syvän keltaisenrus-kea (75)

Kaurajauho-agar C: niukka 20 (ISP nro 3) A: ei lainkaan tai niuk ka, jos esiintyy: valkoinen S: väritön D: ei lainkaan 25

Epäorgaaniset suolat - G: niukka tärkkelys -agar A: ei lainkaan tai niuk- (ISP nro 4) ka; jos esiintyy: valkoinen S: väritön ... D: ei lainkaan « l * i ·

Glyseroli-asparagiini-agar G: kohtalainen (ISP nro 5) A: kohtalinen, keltai- senvalkoinen (92) S: väritön D: ei lainkaan

II

5 93969 Väliaine Ominaisuudet

Peptoni-hiivauute-rauta-agar G: kohtalainen (ISP nro 6) A: ei lainkaan S: vaalean harmahtava -5 keltaisenruskea (79) D: ruskeanmusta (65)

Tyrosiini-agar G: kohtalainen (ISP nro 7) A: runsas; keltaisenval- koinen (92) 10 S: musta D: musta

Glukoosi-asparagiini-agar G: heikko A: ei lainkaan S: tumman oranssinkeltai-15 nen (72) D: ei lainkaan

Bennettin agar G: kohtalainen A: ei lainkaan tai niukka; jos esiintyy; valkoinen 20 S: tummanharraaa-keltaisen- ruskea (81) D: kohtalainen, keltaisenruskea (77) 11 havaitaan 3 viikon inkuboinnin 28 *C:ssa Jälkeen 25 3G * kasvu; A - ilmarihmasto; S - substraattirih- masto; D - helposti leviävä pigmentti 3>väri Ja numero suluissa ovat lSCC-NBS:n mukaisia. Fysiologiset ominaisuudet

Optimikasvu havaitaan 30 - 35 *C:ssa. Kasvulämpöti-30 la-alue on 18 - 39 °C. Kasvua ei tapahdu 15 eC:ssa eikä ♦ c f v * 41 °C:ssa; kasvua ei esiinny väliaineissa, Joihin on li sätty yli 5 % NaCl:a. Nesteyttää gelatiinin, mutta ei hydrolysoi tärkkelystä. 25 testatusta sokerista vain D-riboo-sia Ja D-glukoosia käytetään kasvuun. Fysiologiset ominai-35 suudet Ja hiilihydraattien käyttö on esitetty taulukoissa II Ja III.

6 93969

Taulukko II

Kannan L585 - 6 fysiologiset ominaisuudet Hydrolysoi: Käyttää: 2 L-raunioosi

Gelatiini + D-glukoosi + 5 Tärkkelys: D-galaktoosi liukoinen tärkkelys perunatärkkelys - D-fruktoosi

Maidon hyydytys + D-mannoosi peptonisointi + L-sorboosi

Tuottaa: Sakkaroosi nitraatti- - tai Laktoosi reduktaasi + (w)+^ Sellobioosi tyrosinaasi + Melibioosi 15 Sietää: Trehaloosi lysotsyymi, 0,01 % (w/v) + Raffinoosi

NaCl, 1 - 4 % (w/v) + D-meletsitoosi 2q 5 % - Liukoinen tärk kelys pH, 5,0 - 11,0 + Selluloosa 4,5 ja 12 - Dulsitoli Lämpötila:

Inositoli • ** 25 o

Kasvualue 18 - 39 C D-mannitoli

Ei kasvua 15°C D-sorbitoli 41°C Salisiini

Optimaalinen Glyseroli kasvu 30 - 35°C D-arabinoosi - 30 L-arabinoosi • e· c D-ksy loosi • e e D-riboosi

Negatiivinen Czapekin sakkaroosi-nitraatti-käymisliemes-sä ja positiivinen peptoni-nitraatti-käymisliemessä.

35 *^Perusväliaine: Pridham-Gottliebin väliaine (ISP nro 9 väliaine).

7 93969

Taulukko III

Lisaa kannan L585 - 6 fysiologisia ominaisuuksia1 Hydrolysoi: Tuottaa happoa:

Adeniini - Glyseroli 5 Kaseiini + D-arabinoosi

Eskuliini + L-arablnoosi

Hippurihappo + D-ksyloosi

Hypoksantiini - L-ramnoosi

Tyrosiini + D-glukoosi + 10 Urea - D-mannoosi

Ksantiini - Laktoosi

Sellobioosi Säilyy hengissä Melibioosi 15 50eC:ssa,8 h - Trehaloosi Käyttää: Raffinoosi

Bentsoaatti - D-meletsitoosi

Sitraatti - Inositoli

Mukaatti - D-marmitoli 20 Käyttää:

Sukkinaatti + D-sorbitoli

Tartraatti - Erytritoli

Adonitoli Metyyli-a-glu- '1 25 kosidi

Kokeet kuvanneet Gordon et ai., J. Gen. Microb. 109 (1978) 69 - 78.

Soluseinän kemiallinen rakenne # , 30 Kannan L585 - 6 soluseinän sisältö tutkittiin

>·« I

Becker et al.:n, Appi. Microbiol. 13 (1965) 236 - 243, Yamaguchin, J. Bacteriol. 89 (1965) 444 - 453, ja Lechevalierin ja Lechevalierin, Biology of the Actino-ray-cetes and Related Organisms 11 (1976) 78 - 92, kuvaamien 35 menetelmien mukaisesti. Soluseinän peptidoglykaani sisäl- • c • l 8 93969 tää meso-diaminopimeliinihappoa. Kokonaisen solun sokereja ovat galaktoosi, glukoosi ja riboosi. Täten soluseinätyyp-pi kuuluu tyyppiin III. Fosfolipidit ovat tyyppiä P - II ja sisältävät fosfatidyylietanoliamiinia, fosfatidyyligly-5 serolia ja fosfatidyyli-inositoli. Tärkeimmät menakinonit ovat MK - 9(H4) ja MK - 9(H6) Glykolaattitesti on negatiivinen .

Taksonomia

Actinomycetales-suvun jäsenistä, joilla on pitkät 10 itiöketjut, Pseudonocardia, Saccharopolyspora, Actinopoly- spora, Streptomyces, Actinomadura, Glycomyces, Nocardiop-sis ja Amycolata eroavat selvästi kannasta 1*585 - 6 solu-kemialtaan, joka käsittää soluseinätyypin, solujen sokerit, fosfolipidit ja menakinonit, Kibdelosporangium [Shea-15 rer et ai., Int. J. Syst. Bacteriol. 36 (1986) 47 - 54], Kitasatosporia [Takahashi et ai., J. Gen. Appi. Microbiol. 30 (1984) 377 - 387] ja Amycolatopsis [Lechevalier et ai., Int. J. Syst. Bacteriol. 36 (1986) 29 - 37] muistuttavat kantaa L585 - 6 fosfolipidi- ja menakinonikoostumuksel-20 taan, mutta Kibdelosporangium ja Amycolatopsis eroavat kannasta soluseinäsokereiden arabinoosin suhteen ja Kitasatosporia sekä soluseinän LL- että meso-diaminopimeliini-hapon suhteen. Lisäksi Kibdelosporangiumissa on hyyfejä koteloiva itiösäkkimäinen kappale, jossa on oikea kalvo, 25 ja Kitasatosporia muodostaa nesteessä olevia itiöitä. Näitä ainutlaatuisia rakenteita ei havaita kannalla L585 - 6. Kemotaksonomisesti Streptoalloteichus [Toimita et ai., Int. J. Syst. Bacteriol. 37 (1987) 211 - 213], Actinosyn-nema [Hasegawa et ai., Int. J. Syst. Bacteriol. 28 (1978) 30 304 310] ja Saccharothrix [Labeda et ai., Int. J. Syst.

• · · . Bacteriol. 34 (1984) 426 - 431] muistuttavat eniten kantaa L585 - 6. Actinosynnema muodostaa ilmaitiöketjuja varren kärjestä. Saccharothrix muodostaa fragmentoitujen, kokki-maisten elementtien ketjuja sekä suvuttomassa että ilma-35 rihmastossa, eikä muodosta haaroittuneiden, lyhyiden itiö- li 9 93969 ketjujen tai kovettuneiden jyvästen ryhmiä. Kokkimaisten elementtien ketjujen morfologia Saccharothrix australien-sis- ja S. aerocolonigenes-lajeissa [Labeda et ai., int. J. Syst. Bacteriol. 36 (1986) 109 - 110] muistuttavat No-5 cardiopsis-lajin elementtejä, mutta eivät muistuta mitään Streptomyces-lajia. Niinpä kanta L585 - 6 ei sijoitu Acti-nosynnema- eikä Saccharothrix-lajeihin.

Streptoalloteichus hindustanus-lajissa on pitkiä, kierteisiä artrospoori-itiöketjuja, haaroittuneita lyhyitä 10 itiöketjuja ja kovettuneita jyväsiä ilmarihmastossa ja tiheitä, pallomaisia hyytikappaleita samoin kuin itiosäkki-mäisiä kappaleita, joissa on 1 - 4 itiötä, sekä uintisii-moja suvuttomassa rihmastossa. Kanta L585 - 6 muodostaa pelkästään itiösäkkimäisiä vesikkelejä. Kuten Streptoallo-15 teichus kanta L585 - 6 muodostaa ilmapallomaisen kappaleen, joka kehittyy kovettuneeksi jyväseksi. Tämä rakenne on havaittu useilla Streptomyces-lajeilla, kuten S. kana-mvceticuksella [Shirling et ai., Int. J. Syst. Bacteriol. 22 (1972) 265 - 394] ja S. roseiscleroticuksella (Chainia 20 rubra) [Shirling et ai., Int. J. Syst. Bacteriol. 22 (1972) 265 394].

Yllä mainittujen vertailevien havaintojen perusteella kanta L585 - 6 luokitellaan Streptoalloteichus-su-kuun. Kanta T585 - 6 poikkeaa Streptoalloteichus hindusta-25 nus -lajista siinä, että siltä puuttuu kyky muodostaa il-marihmastoa ISP-väliaineissa nro:t 2, 3 ja 4 sekä Bennet-tin agarissa, että se muodostaa melaniinia, ettei se hydrolysoi tärkkelystä, ettei se kasva 41 eC:ssa ja että se pystyy käyttämään vain D-riboosia Ja D-glukoosia 25 tes- . . „ 30 tatusta sokerista. Niinpä kanta L585 - 6 katsotaan • · c .·. . Streptoalloteichus-suvun uudeksi lajiksi.

Biologisesti puhdas kannan L585 - 6 viljelmä, joka kanta määritettiin Streptoalloteichus-suvun uudeksi lajiksi, on talletettu American Type Culture Collection -talle-35 tuslaitokseen (Rockville, MD) ja on lisätty sen pysyvään mikro-organismikokoelmaan ATCC-numeroila 53 650.

10 93969

Antibiootin tuotanto Tämän keksinnön mukaisesti valmistettu kasvainten kasvua estävä antibiootti tuotetaan viljelemällä kantaa L585 - 6 tai sen jälkeläistä submersseissa olosuhteissa 5 vesipitoisessa ravintovällaineessa. Tuottajaorganismia kasvatetaan ravintoväliaineessa, joka sisältää assimiloitavan hiililähteen, esimerkiksi assimiloitavan hiilihydraatin. Esimerkkejä sopivista hiililähteistä ovat sereloo-si ja glyseroli. Ravintoväliaineen tulisi sisältää myös 10 assimiloitavaa typpilähdetta, kuten kalajauhoa, hiiva- uutetta tai ammoniumsuoloja. Epäorgaanisia suoloja, kuten natriumkloridia, kaliumkloridia, magnesiumsulfaattia, kal-siumkarbonaattia, fosfaatteja jne. lisätään tarvittaessa. Hivenaineita, kuten kuparia, mangaania, rautaa, sinkkiä 15 jne. lisätään väliaineeseen haluttaessa tai niitä voi -esiintyä epäpuhtauksina väliaineiden muissa aineosissa. Inkubointilämpötila voi olla mikä tahansa lämpötila, jossa tuottajakanta pystyy kasvamaan, esim. 18 - 39 °C, mutta on edullista suorittaa fermentointi 25 - 35 °C:ssa, edulli-20 simmin 27 - 32 eC:ssa. Väliaineessa käytetään edullisesti neutraalia pH:ta, ja antibiootin tuotantoa jatketaan yleensä 4-8 päivän ajan. Tavallisesti optimituotanto saavutetaan noin 5-6 päivässä. Suhteellisen pienten an-tibioottimäärien valmistamiseksi voidaan käyttää ravistus-25 pulloa ja pintaviljelmää, mutta suuria määriä valmistettaessa on edullista käyttää aerobista viljelmää liuoksessa steriileissä tankeissa. Kun halutaan suorittaa tankkifer-mentointi, on toivottavaa tuottaa kasvuymppi ravintokäy-misliemessä siirrostamalla käymisliemiviljelmä organismin ... 30 itiöillä ja, kun on saatu tuore, aktiivinen ymppi, siirtää • « .

• V<· ymppi aseptisesti fermentointitankin väliaineeseen. Lisä- sekoitusta voidaan saada mekaanisella sekoittajalla. Vaah-toamista estäviä aineita, kuten laardiöljyä tai silikoni-öljyä, voidaan myös tarvittaessa lisätä.

• » 11 93969

Antibiootti kedarsidiinin tuotantoa fermentointivä-liaineessa voidaan helposti seurata fermentoinnin aikana antimikrobiaalisilla määritvsmenetelmillä käyttäen Bacillus subtilista koeorganismina tai solun sytotoksisuus 5 - määritysmenetelmällä käyttäen hiiren (B16 - F10) tai ih misen (esim. HCT - 116, KB) kasvainsolulinjoja.

Antibiootin eristys 1a puhdistus Tämän keksinnön mukaisesti valmistettu kasvainten kasvua estävä proteiini voidaan eristää fermentointikäy-10 misliemestä tavanomaisia proteiinin erotusmenetelmiä, kuten dialyysiä, ultrasuodatusta, geelisuodatusta, iso-elek-tristä saostusta, ulossuolausta, elektroforeesia, ionin-vaihtokromatografiaa ja affiniteettikromatografiaa, käyttäen. Näiden menetelmien peräkkäistä yhdistelmää käytetään 15 yleisesti proteiinin puhdistamiseksi näennäiseen homogeenisuuteen. Eristys- ja puhdistusmenetelmää voidaan monitoroida ja ohjata mikrobiologisia määritysmenetelmiä, kuten B. subtilis -menetelmää, in vitro sytotoksisuus -määritysmenetelmiä hiiren tai ihmisen syöpäsolulinjoja käyttäen 20 tai fysikaalisia menetelmiä, kuten UV:ta tai HPLC:tä, käyttäen. Kaavio I, kuvaa tyypillistä eristys- puhdistus-sekvenssiä. Tämä tietty sekvenssi on tarkoitettu vain esimerkki luonteiseksi ja alan asiantuntijat ymmärtävät, että myös erilaisia sekvenssejä ja muita menetelmiä voidaan 25 käyttää, kunhan proteiini saadaan erittäin puhtaana ja sen biologiset aktiivisuudet säilyttäen.

• t t • « l « l ' • 4> fc • t • 12 93969

Kaavio I

Proteiinin eristys ia puhdistus fermencointlkäynisliemi 'n--L- sienirihmasco anioninvaihto I puskuri 1 puskuri + 2Q eluaatti eluaatti I 1 mol/1 NaCl eluaatti geelisuo- datus eluaatti 15 preparatli- vinen anioninvaihto puhdistettu proteiini-liuos kylnäkui- 20 vaus puhdistettu proteiini

Kaavion I toteuttamiseksi koko fermentointikäymis-liemen 1 iukenematon massa poistetaan tavanomaista menetel-25 mää, kuten sentrifugointia tai suodatusta, käyttäen. Jos käymisliemi halutaan suodattaa, suodatusapuliuosta, Dica-lite-liuosta, voidaan edullisesti käyttää. Sitten suodok-sesta ajetaan anioninvaihtokromatografia käyttäen eluoin-tiliuoksena kationista puskuria, jonka pH on alueella 7 -30 8, ja sitten samaa puskuria, joka sisältää natriumklori- e · e c .“Λ dia. Sopiva kationinen puskuri tällä pH-alueella on esi merkiksi Tris-HCl. NaClta sisältävällä puskurilla eluoitu-nut fraktio otetaan talteen, konsentroidaan ja puhdistetaan edelleen geelisuodatusta ja samaa kationista puskuria 35 käyttäen. Fraktiot kerätään ja määritetään aktiivisen kom- i *>

II

13 93969 ponentin suhteen. Käyttökelpoinen aloitussysteemi eluaatin monitoroimiseksi on Bacillus subtilis-määritysmenetelmä. Ne fraktiot, joilla saadaan inhibitiovyöhykkeet, yhdistetään, konsentroidaan ja puhdistetaan edelleen käyttäen 5 anioninvaihtokromatografiaa ja ensimmäisenä eluointiliuok- sena kationistapuskuria,jonka pH on alueella 7 - 8, ja jatkaen lineaarisella gradientilla, jossa ionivahvuus kasvaa. Aktiiviset fraktiot tarkistetaan homogeenisyyden suh-teennatriumdodekyylisulfaattipolyakryyliamidigeeli-elekt-10 roforeesilla (SDS-PAGE), isoelektrisellä fokusoinnilla ja HPLC-menetelmällä. Homogeenisiksi todetut fraktiot yhdistetään ja kylmäkuivataan, jolloin saadaan aktiivinen proteiini .

Antibiootti 15 Kedarsidiini on tehokas kasvainten kasvua estävä proteiiniantibiootti, joka muodostuu yksiketjuisesta poly-peptidistä ja ei-proteiinikromoforista. Vaikka antibioot-tinäytteet fysikokemialliseen karakterisointiin ja biologisiin testeihin oli todettu homogeenisiksi SDS-PAGE:11a, 20 isoelektrisellä fokusoinnilla ja HPLC:lla, sekvenointiko-keiden aikana havaittiin, että antibiootti muodostui yhdestä päävariantista ja yhdestä tai kahdesta vähäisemmästä variantista. Variantit poikkeavat polypeptidin alkuperäisen N-terminaalisen aminohappojärjestyksen suhteen, kuten 25 myöhemmin tullaan kuvaamaan. Yksittäisten varianttien erottaminen eikä eristys ole tarpeen kasvainten kasvua estävän vaikutuksen kannalta.

Aminohappokoostumus Käyttäen normaaleja, alalla hyvin tunnettuja mene- ... 30 telmiä määritettiin puhdistetun proteiinin aminohappokoos- • « · .1- - tumus, ja se on lueteltu taulukossa VI.

l • ·.

14 93969

Taulukko VI

Kedarsidilnin aminohappokoostumus _nmol mooli_(a) (b) s SS 2'7« »,1 10,1 0,3 <‘> thr 3,18 93 11,6 10,6 (11) ser 3,163 93 11,5 10.6 (12) |}“ 1*»M S,7 7,0 6,5 {*} pt° MH v 5.9 5,4 (4) 8}y 3'32? 16'2 20,1 18,5 (18) 10 ala 5,566 16 3 20,3 18,6 (18)

Val Vili, 11 13,6 12,5 (13) *** °'2873 0,8 1,1 10 (1) ϊ1β Vili1 2 5 3,1 2/9 (3> leU l·2™ 3,B 47 4/3 (4> T M 2 3 2fl (2) phe 1,565 4 6 5|7 5.2 (5) __ iis X'S?oi! M 2,3 2jl (1) 15 1ys ?»3i?6 0J9 1(2 i!i (o) arg 1,001 2/9 3^7 3^3 (3) cys 0 o 0 0 (4) trP 0 0 0 0 (0) a) Tähteiden lukumäärä peptidiä kohti olettaen peptidin 20 molekyylipainoksi 12 000.

b) Tähteiden lukumäärä peptidiä kohti olettaen tähteiden kokonaismääräksi 114. Soluissa olevat arvot osoittavat tähteiden lukumäärää peptidiä kohti aminohappojärjestys-analyysillä määritettynä.

25 Aminohappo1är1estvs

Aminoterminaalisen järjestyksen analysoimiseksi ke-darsidiini pelkistettiin 2-merkaptoetanolilla ja puhdistettiin edelleen SDS-PAGE:lla (15-%:inen akryyliamidi) ja otettiin talteen geeleistä eluolmalla tai siirtämällä säh-... 30 kövirran avulla.

tcf o ; Useimmissa entsymaattisissa pilkkomisissa kedarsi- dlinl käytettiin puhdistamatta sitä enempää. Kedarsidiini pelkistettiin 20 mmol/1 ditlotreltolilla 100 pl:ssa 0,4 mol/1 Tris-HCl-puskuria, pH 8,5, joka sisälsi 6 mol/1 gua-35 nidiini-HCl:a ja 0,1 % Na2-EDTA:ta, kahden tunnin ajan 50 -

II

15 93969 °C:ssa ja S-pyridyylietyloitiin sen jälkeen 100 nunol/1 4-vinyylipyridiinillä yli yön huoneen lämpötilassa. Reaktio pysäytettiin lisäämällä 10 μΐ 2-merkaptoetanolia, 1 h, 50 ®C. Reagenssit poistettiin dialysoimalla 5-%:ista (v/v) 5 etikkahappoa vastaan 24 tuntia, ja modifioitu kedarsidiini kuivattiin tämän jälkeen Speedvac -sentrifugaalisessa kon-sentraattorissa (Savant Instruments).

S-pyridyylietyloidun kedarsidiinin entsymaattinen pilkkominen ASP-N-entsyymillä tai S.aureuksen V8-proteaa-10 silla suoritettiin 40 pl:ssa 0,1 mol/1 Tris-etikkahappo-puskuria, pH 8,0, joka sisälsi 0,7 mol/1 ureaa, 37 °C:ssa yli yön käyttäen entsyymi/substraattisuhdetta 1:100 (ASP-N) tai 1:10 (V8-proteaasi). Trypsiinihajoitus suoritettiin 40 yl:ssa 0,1 mol/1 Tris-etikkahappopuskuria, pH 8,0, 37e-15 C:ssa yli yön entsyymi/substraattisuhteessa 1:20. Entsy-maattiset hajoitusliuokset tehtiin happamiksi trifluori-etikkahapolla (TFA) pH-arvoon 2,0 ja erotettiin käänteis-faasi-HPLC:11a.

Peptidin puhdistus rpHLPLC:llä suoritettiin käyt-20 täen malli 130 A -erotussysteemiä (Applied Biosystems, Inc.) 40 °C:ssa RP-300-pylväällä (2,1 x 100 mm; Applied Biosystems, Inc.). Lineaarisia asetonitriiligradientteja, jotka sisälsivät 0,1 % TFA:a vedessä lähtöpuskurina ja 60 % asetonitriiliä, joka sisälsi 0,085 % TFA:a, rajoituspus- ψ 25 kurina, käytettiin eluointiin. Peptidit kerättiin talteen käsin. Aminohappojärjestyksen määritykset suoritettiin käyttäen automaattista aminohapposekvenaattoria (malli 475 A, Applied Biosystems, Inc.) normaaleilla menetelmillä.

Polypeptidin päävariantti muodostuu 114 aminohappo- ... 30 tähteestä. Aminohappojärjestykseksi määritettiin seuraava: • ·«

• 1 • I

• C

16 93969 N-Pää H-ala-ser-ala-ala-val-ser-val-ser-pro-ala-thr-gly-leu-ala-asp-gly-ala-thr-val-thr-val-ser-ala-ser-gly-phe-ala-thr-ser-thr-ser-ala-thr-ala-leu-gln-cys-ala-ile-leu-ala-asp-5 gly-arg-gly-ala-cys-asn-val-ala-glu-phe-his-asp-phe-ser-

leu-ser-gly-gly-glu-gly-thr-thr-ser-val-val-val-arg-arg-ser-phe-thr-gly-tyr-val-met-pro-asp-gly-pro-glu-val-gly-ala-val-asp-cys-asp-thr-ala-pro-gly-gly-cys-gln-ile-val-val-gly-gly-asn-thr-gly-glu-tyr-gly-asn-ala-ala-ile-ser-10 phe-gly-OH

c-paa

Kaksi vähäisempää varianttia on identifioitu; toisesta puuttuu päävariantin ensimmäinen alaniini ja toisesta kaksi ensimmäistä aminohappoa, toisin sanoen päävarian-15 tin alaniini ja seriini.

Molekvvlipainon määritys a) geelisuodatus/HPLC-menetelmä

Geelisuodatus tehdään käyttäen TSK-G2000 SW- pylvästä (7,5 x 300 mm) (LKB Produkter AB, Ruotsi) ja 50 20 mmol/1 Tris-HCl-puskuria, joka sisältää 0,5 mol/1 NaCl:a (pH 7,4) virtausnopeudella 0,5 ml/min. Vaihtoehtoisesti voidaan käyttää Waters Associates Protein Analysis - pylvästä I - 125 käyttäen 0,2 mol/1 Tris-asetaattipuskuria eluointiliuoksena virtausnopeudella 1 ml/min. Molekyyli-25 painoksi arvioidaan 17 000 daltonia vaklokuvaajalta, joka saadaan molekyylipainomerkkiaineiden (Bio Rad Laboratories) avulla, b) natriumdodekyylisulfaatti - polyakryyli-amidigeelielektroforeesimenetelmä.

Proteiininäyte ja molekyylipainomerkkiaineet ... 30 (Diversified Biotech, Maine) sekoitetaan yhtä suureen mä- • t . arään Seprasol-liuosta (käyttövalmis proteiinin liuotus- neste, joka sisältää sakkaroosia ja merkkivärin) ja kuumennetaan 3 minuutin ajan 90 °C:ssa juuri ennen elektroforeesia. Elektroforeesi ajetaan 300 V:n jännitteellä Sepra-35 buff-liuoksessa (Tris-glysiini-SDS, pH 8,3), kunnes merk- • l ♦ i

II

17 93969 kiväri saavuttaa geelin pohjan. Sitten geeli upotetaan värjäyslluokseen (1,25 g Comassle BB R-250, 92 ml jääetik-kahappoa 908 ml:ssa vesipitoista metanolla) vähintään 10 tunniksi, minkä jälkeen se upotetaan värinpoistolluokseen 5 (75 ml etikkahappoa ja 50 ml metanolla 875 ml:ssa vettä), kunnes geelin tausta tulee läpinäkyväksi. Seprasol ja Seprabuff ostettiin Integrated Separation System -firmasta, Massachusetts. Molekyylipainoksi arvioitiin 12 400 daltonia tällä menetelmällä.

10 Isoelektrinen fokusointi

Fokusointiin käytetty geeli valmistetaan sekoittamalla seos 29,l-%:inen akryyliamidi vedessä 10 ml 0,9-%:inen N,N'-metyleeni-bis-akryyliamidi 15 vedessä 10 ml glyseriini 7 ml 1802 Ampholine pH 2,5 - 4 3 ml vesi täytet. 60 ml:ksi

Saadusta liuoksesta poistetaan kaasut 10 minuutin 20 ajan, ja 1,5 ml l-%:ista ammoniumpersulfaattia vedessä ja 10 μΐ N,N,N',N’-tetrametyylietyleenidiamiinia lisätään liuokseen. Seos kaadetaan valumuottiin ja sen annetaan po-lymeroitua. Käytetyt elektrodiliuokset ovat 1 mol/1 fos-fosforihappo-anodilla ja 2-%:inen 1809 Ampholine, pH 6 -25 8, katodilla. Fokusointi suoritetaan 25 wattin vakiotehol la kahden tunnin ajan. Prosentti viittaa painotilavuudessa -prosenttiin. Isoelektriseksi pisteeksi määritetään 3,65 ja kulkuetäisyys katodilta on 6,25 cm.

Biologinen aktiivisuus 30 Proteiinin kasvainten kasvua estävä vaikutus määri- ** tettiin siirrettävää hiiren P388-leukemiaa vastaan. CDF- hiiriin siirrettiin vatsaonteloon (ip) tai suoneen (iv) 106 P388-leukemiasolua, jotka oli saatu DBA/2-luovuttajahii-ristä, jotka sairastivat tätä siirrettävää hiiren leuke-35 miaa. Ip-siirrettyä P388-leukemiaa vastaan hiiret käsiteltiin ip joko fysiologisella suolaliuoksella (konrollihii- » t V- 18 93969 ret) tai kedarsidiiniannoksilla kerran päivässä viiden peräkkäisen päivän ajan alkaen kasvaimen siirtoa seuraavana päivänä. Iv-siirrettyä P388-leukemiaa vastaan hiiret saivat kedarsidiinia iv päivinä 1, 3 ja 5 siirron jälkeen.

5 Näitä eläimiä tarkkailtiin päivittäin ja niiden kuolemat pantiin muistiin. Keskimääräiset ruumiinpainon muutokset (päivästä, jolloin leukemia siirrettiin, viimeiseen käsit-telypäivään) määritettiin kaikilla ryhmillä lääkkeen myrkyllisyyden arvioimiseksi. Elossa olevien hiirien lukumää-10 rä jokaisessa ryhmässä päivänä 5 kasvaimen siirrosta pantiin myös muistiin lääkkeen myrkyllisyyden arvioimiseksi. Mitään terapeuttista tulosta ei pidetty merkityksellisenä, jos useampi kuin yksi hiiri hoitoryhmää kohden oli kuollut päivänä 5. Hoitoryhmissä oli joko 4 tai 6 hiirtä; kontrol-15 liryhmissä oli 10 hiirtä. Päivänä 30 (kokeiden viimeinen päivä) elossa olevien hiirien lukumäärä, jos hiiriä oli yhtään elossa, pantiin myös muistiin. Kokeen lopussa määritettiin keskimääräinen eloonjäämisaika (MST) jokaiselle ryhmälle ja sitä käytettiin laskettaessa % T/C -arvo, joka 20 on hoitoryhmän MST;n ja kontrolliryhmän MST;n suhde kerrottuna sadalla. % T/C -arvo 125 tai yli osoittaa merkittävää kasvainten kasvua estävää vaikutusta. Nämä in vivo-tulokset on esitetty taulukoissa IV ja V.

~ c t« • t • i • e * ♦ I »- V «.

Il 19 93969

Taulukko IV

Kasvainten kasvua estävä vaikutus ip-siirrettyä P388-leukemiaa vastaan_._

Annoksen*^ Keskimää- % T/C Keskimää- Päivänä 5 5 laimennos räinen räinen pai- elossa oleta! mg/kg/ eloonjää- nonmuutos vien hii-

Erä inj. misaika (d) (g) rien luku- _määrä D16F411 Laim. 1- 40 7,0 74 -1,9 4/4 10 ' '

Laim. 1- 80 10,0 105 -1,2 4/4

Laim. 1- 160 12,5 132 -1,0 4/4

Laim. 1- 320 18,5 195 -1,9 4/4

Kontrolli 9,5 --- 0,2 10/10 15 D18F413 o,27 7,0 70 -1,9 4/6 0,09 15,0 150 -0,8 6/6 0,03 17,0 170 -1,7 6/6 0,01 15,0 150 -0,3 6/6 20 D18G414b) 0,09 9,5 95 -1,3 6/6 0,03 15,5 155 -1,2 6/6 0,01 14,5 145 -0,5 6/6 0,0033 14,0 140 -0,2 6/6

Kontrolli 10.0 --- 0 10/10 ·- 25 ' •’Lääke annettiin ip kerran päivässä viitenä peräkkäisenä päivänä alkaen kasvaimen siirtoa seuraavana päivänä. b,Saman näytteen kylmäkuivattu ja liuotettu valmiste oli 30 erä D18F413.

« · · <. «. · · c · · • · « % · • · 20 93969

Taulukko V

Kasvainten kasvua estävä vaikutus iv-siirrettyä P388-leukemiaa vastaan 5 Erä Annoksena) Keskimää- % T/C Keskimää- Päivänä 5 laimennos räinen räinen elossa tai mg/kg/ eloonjää- painon- oievien inj. misaika (d) muutos (g) hiirien •_lukumäärä 10 D18F413 0,32 6,0 75 -3,1 6/6 0,16 7,5 94 -3,2 6/6 0,08 11;0 138 -1,4 6/6 0,04 12,5 156 -0,6 6/6 15 0,02 10,0 125 0,1 6/6 0,01 8,0 100 1,2 6/6 D16F411 Laim. 1-25 7,0 88 -2,9 6/6

Laim. 1-50 10,5 131 -1,6 6/6

Laim. 1-100 13,0 163 -1,2 6/6 20 '

Laim. 1-200 9,5 119 -0,2 6/6

Laim. 1-400 9,0 113 0,5 6/6

Laim. 1-800 8,0 100 0,8 6/6

Kontrolli --- --- 10/10 **.. 25 (‘Lääke annettiin iv päivänä 1, 3 ja 5 kasvaimen siirron jälkeen.

' , 30 Kedarsidiini määritettiin myös hiiren Bl6-melanoo- ma, joka oli siirretty vatsaonteloon käyttäen 0,5 ml 10-%:ista kasvainymppiä, vastaan. Kymmentä hiirtä käytettiin jokaisella annospitoisuudella. Lääke annettiin vatsaonteloon kerran päivässä yhdeksänä peräkkäisenä päivänä alkaen 35 kasvaimen siirtoa seuraavana päivänä. Päivänä 10 ja kokeen * · ( • ^ • · 21 93969 lopussa, tämä on päivänä 60, elossa olevien hiirien lukumäärä pantiin muistiin. Koetulokset on esitetty taulukossa VI. % T/C -arvo 125 tai suurempi osoittaa merkitsevää kasvainten kasvua estävää vaikutusta.

5

Taulukko VI

Kedarsidiinin kasvainten kasvua estävä vaikutus ip-siirrettyä B16-melanoomaa vastaan_

Annos HST (d) % T/C Keskimääräinen Päivänä 5* (rag/kg/ painonmuutos (g) elossa ole- annos) vien hii rien luku- __määrä 0,256 16,0 97 -2,7 9/10 15 0,128 24,5 *1»3 10/10 0,064 26,5 161 0,3 10/10 0,032 31,5 191 1,0 10/10 0,016 32,5 197 0,6 10/10 0,008 34,0 206 0,6 9/10 2o 0,004 27,0 164 0,3 10/10(1) 0,002 21,5 13° 0 10/10

Kontrolli 16,5 " 1/3 ♦Suluissa oleva luku - päivänä 60 kasvaimen siirrosta ** 25 elossa olevien hiirien lukumäärä.

Taulukoissa IV, V ja VI annetut tulokset osoittavat, että kedarsidiini-antibiootti on tehokas aine, jolla on toistettava kasvainten kasvua estävä vaikutus hiiren P388-leukemiaa ja B16-melanoomaa vastaan. Havaittu vaiku-... 30 tus näkyi pidentyneenä elinaikana ip-siirrettyä B16-me-lanoomaa vastaan ja sekä ip- että iv-siirrettyä P388-leu-kemiaa vastaan, joista viimeksi mainittu sairaus on vaikeammin hoidettava, koska se on luonteeltaan haj apesäkkei-nen. Kedarsidiini on määritetty myös ihon alle siirrettyä 35 B16-melanoomaa, hiiren M5076-keuhkokasvainta ja kallonsi- • * * • * 22 93969 säisesti siirrettyä P388-leukemiaa vastaan, mutta sen vaikutus näissä eläinmalleissa oli merkityksetön. Tämän keksinnön mukaisesti valmistettua antibioottia voidaan käyttää yhdessä inertin, farmaseuttisesti hyväksyttävän kanta-5 jän tai laimentimen kanssa farmaseuttisessa koostumuksessa. Nämä koostumukset voivat sisältää myös muita aktiivisia kasvainten kasvua estäviä aineita, ja ne voidaan valmistaa mihin tahansa farmaseuttiseen muotoon, joka sopii haluttuun antoreittiin. Esimerkkejä näistä koostumuksista 10 ovat suun kautta antoon sopivat kiinteät koostumukset, kuten tabletit, kapselit, pillerit, jauheet ja rakeet, suun kautta antoon sopivat nestemäiset koostumukset, kuten liuokset, suspensiot, siirapit tai eliksiirit, ja ruoansulatuskanavan ulkopuoliseen antoon sopivat valmisteet, kuten 15 steriilit liuokset, suspensiot tai emulsiot. Niitä voidaan valmistaa myös steriilien kiinteiden koostumusten muodossa, jotka koostumukset voidaan liuottaa steriiliin veteen, fysiologiseen suolaliuokseen tai johonkin muuhun steriiliin, injektoitavaan väliaineeseen juuri ennen käyttöä.

20 Kasvainten kasvua estävänä aineena käytössä tietyl le imettäväisisännälle annettavat optimiannokset ja annos-ohjeet voivat alan asiantuntijat helposti määrittää. Tulee tietysti ymmärtää, että varsinainen annos vaihtelee riippuen formuloidusta tietystä koostumuksesta, antoreitistä 25 sekä kasvaimen tarkasta sijainnista, isännästä ja hoidettavasta taudista. Monet lääkkeen vaikutusta muuttavat tekijät, kuten ikä, paino, sukupuoli, ruokavalio, antoaika, antoreitti, eritysnopeus, potilaan tila, lääkeyhdistelmät, reaktioherkkyydet ja taudin vaikeus, tulee ottaa huomioon.

-.30 Tätä keksintöä valaistaan seuraavilla esimerkeillä, i · joita ei ole tarkoitettu keksinnön suoja-alaa rajoittaviksi.

• i

II

23 93969

Esimerkki 1

Streptoalloteichus kannan L585 - 6 veaatatiivlsen vllleiman valmistus.

Streptoalloteichus kanta L585 - 6 (ATCC 53 650) 5 säilytettiin ja siirrettiin koeputkissa hiiva-mallasuute-agar-vinopinnoille, jotka sisälsivät seuraavat ainekset: dekstroosi 4,0 g hiivauute 4,0 g mallasuute 10,0 g 10 CaC03 1,5 g agar 15,0 g tislattu vesi täytet. 1 l:ksi

Jokaisessa siirrossa agar-vinopintaa inkuboitiin 28 °C:ssa kahden viikon ajan. Vegetatiivinen viljelmä val-15 mistettiin siirtämällä vinopintaviljelmän pintakasvu 500 ml:n erienmeyer-pulloon, joka sisälsi 100 ml steriiliä väliainetta, joka sisälsi seuraavat ainekset:

Sereloosi (Corn Products) 30 g

Pharmamedia (Traders Oil Mill Co.) 10 g 20 Nutrisov (Archer Daniels Midland Co.) 10 g

CaC03 3 g tislattu vesi täytet. 1 l:ksi Tätä vegetatiivista viljelmää inkuboitiin 28 °C:ssa 72 tuntia pyöröravistelijassa, jonka kierrosnopeus oli 250 25 kierrosta minuutissa.

Esimerkki 2

Fermentointi ravistuspulloissa

Viisi ml esimerkin 1 mukaista vegetatiivista viljelmää siirrostettiin 500 ml:n erlenmeyer-pulloihin, jois-t . 30 ta kukin sisälsi 100 ml tuotantoväliainetta, joka sisälsi '* seuraavat ainekset: glyseroli 30 g

Pharmamedia 10 g

Distiller's solubles 35 (Nutrition Product Co.) 15 g * · *· ♦ c · ' « *.

24 93969 kalajauhe (Menhaden) 10 g

CaC03 6 g tislattu vesi täytet. 1 l:ksi

Tuotantoviljelmää inkuboitiin 28 eC:ssa pyöröravis-5 telijassa, jonka kierrosnopeus oli 250 kierrosta minuutissa. Proteiiniantibiootin tuotantoa monitoroitiin mikrobiologisella määritysmenetelmällä käyttäen B. subtilista sekä in vitro sytotoksisuusmääritysmenetelmillä käyttäen hiiren melanoomasolulinjaa B16 - F10 ja ihmisen kasvainsolulinjo-10 ja. Optimituotanto saavutettiin yleensä 144 - 168 tunnissa.

Esimerkki 3

Fermentointi tankeissa 25 ml esimerkin 1 mukaista vegetatiivista viljel-15 tmää siirrostettiin 2 l:n Vitro-pulloon, joka sisälsi 500 ml samaa vegetatiivista väliainetta. Toisen vaiheen ymppi-viljelmää inkuboitiin 28 °C:ssa vielä 72 tuntia pyöröra-vistelijassa, jonka ravistelunopeus oli 250 kierrosta minuutissa. 500 ml toisen vaiheen ymppiviljelmää siirrostet-20 tiin New Brunswick Microgen -fermentoriin (16 l:n nimel-listilavuus), joka sisälsi 10 litraa tuotantoväliainetta, jonka koostumus on annettu esimerkissä 2. Fermentointi suoritettiin 28 °C:ssa ilmastaen yhdellä tilavuudella minuutissa, ja ravistusnopeus oli 250 kierrosta minuutissa.

f ' <-· 25 Kedarsidiini-antibiootin tuotantoa monitoroitiin sopivilla biologisilla in vitro -määritysmenetelmillä.

Esimerkki 4

Kedarsidiinin eristys ja puhdistus 10 1 puhdistamatonta fermentointikäymislientä se-,30 koitettiin 6 l:aan Dicalite-liuosta, ja saatu ohut liete suodatettiin Dicalite-tyynyn läpi. Liukenemattomat aineet heitettiin pois, ja suodos pumpattiin Zeta Prep 250 QAE -ioninvaihtopatruunan (LKB-Produkter AB, Ruotsi) läpi nopeudella 30 ml/min. Patruuna oli etukäteen tasapainotettu 35 2 1:11a 50 mmol/1 Tris-HCl-puskuria, pH 7,4. Eluaatti < » c <. «

II

25 93969 otettiin talteen. Patruuna pestiin 1 1:11a 50 mmol/1 Tris-HCl-puskuria, pH 7,4, ja eluoitiin sitten 500 ml:11a 50 mmol/1 Tris-HCl-puskuria, pH 7,4, joka sisälsi 10,5 moolia NaCl:a. Eluaatti otettiin talteen ja konsentroitiin 500 5 ml:sta 100 ml:ksi käyttäen normaalia Amicon-ultrasuodatus-säiliötä ja Amicon YM5-kalvoa. Konsentroitu liuos imeytettiin geelisuodatuspylvääseen (5 x 100 cm), joka oli pakattu 1 400 ml:11a Ultrogel AcA54 -geeliä (LKB-Produkter AB, Ruotsi) yhtä suuressa tilavuudessa 50 mmol/1 Tris-HCl-pus-10 kuria. Ultrogel-patsas oli tasapainotettu 5 1:11a 50

mmol/1 Tris-HCl-puskuria, pH 7,4. Näytteen sisältävää pylvästä eluoitiin 2 1:11a 50 mmol/1 Tris-HCl-puskuria, pH

7,4, virtausnopeudella 60 ml/min. Kun aluksi oli eluoitu 450 ml, kerättiin 10 ml:n fraktiot, ja jokainen fraktio 15 analysoitiin B. subtilista vastaan. Fraktiot, joilla saatiin inhibitiovyöhykkeet (fraktiot 83 - 133), yhdistettiin ja konsentroitiin sitten 100 ml:ksi ultrasuodattamalla. Konsentroitu liuos imeytettiin ioninvaihtopylvääseen (2,5 x 15 cm), joka oli pakattu lietteellä, joka sisälsi 70 ml 20 DEAE-Trisacryl -geeliä (LKB-Produkter AB, Ruotsi) yhtä suuressa tilavuudessa 50 mmol/1 Tris-HCl-puskuria. Tris-acryl-täyte oli tasapainotettu 10 pylvään tilavuudella 50 mmol/1 Tris-HCl-puskuria. Näytteen sisältävä pylväs eluoitiin aluksi 10 pylvään tilavuudella 50 mmol/1 Tris-HCl-25 puskuria ja sitten 300 ml:n lineaarisella gradientilla (kulmakerroin 0,1 mol/l/tunti), joka muodostui 100 %:sta 50 mmol/1 Tris-HCl-puskuria 100 %:iin 50 ramol/1 Tris-HCl-puskuria, joka sisälsi 0,5 mol/1 NaCl:a, virtausnopeudella 60 ml/h. Kaikkiaan 47 5 ml:n fraktiota kerättiin ja määri- #30 tettiin B. subtilista vastaan. Aktiiviset fraktiot yhdis-• < * tettiin, ja niistä ajettiin analyyttinen geelisuodatus/-HPLC käyttäen Waters Protein Analysis -pylvästä I - 125, 0,2 mol/1 Tris-asetaattia, pH 7,0, eluointiliuoksena, virtausnopeus 1 ml/min ja UV-detektoria 260 nm:ssä. Näissä 35 olosuhteissa kromatogrammissa on yksi ainoa piikki, jonka · i · l 26 93969 retentioaika on 8,3 minuuttia. Yhdistettyjen fraktioiden todettiin olevan homogeenisia myös isoelektrisellä fokusoinnilla ja SDS-PAGE:lla käyttäen aikaisemmin kuvattuja olosuhteita. Aktiivisen komponentin pitoisuudeksi arvioi-5 tiin 4,25 mg/ml kylmäkuivaamalla 10 ml:n erä ja korjaamalla puskurin paino.

e c · • ' < O · 1 *· « • · < • <

II

Claims (2)

1. 93969