JPH01317396A - 抗腫瘍性抗生物質ケダルシジン - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、ケダルシジンと名付けられた抗腫瘍抗生物質
に関し、５ｔｒａｐｔｏａｌｌｏｔａｉｅｈｓａ　　ａ
ｐ、　ｎｏｖ、菌株１．５８５−６によるその壬産に関
し、抗生物質を含む製薬組成物に関しそして該抗生物質
による腫瘍の生長を阻止する方法に関する。本発明は、
又ケダルシジン生産微住物Ｓｔｒａｐｔｏａｌｔｏｔｇ
ｉｃんＩＬａ　Ｈｐ、　％０１１．−株Ｌ５８５−６゜
Ａｉ’Ｃ（、’　５３６５０に関づる。

〔発明の概要〕

本発明は、 （α）外観：淡黄褐色の固体： ｆ６１　　分子ｊｌｋ：５ｌ）Ｓ−ポリアクリルアミド
ゲル電気泳動法により１２．４００ダルトン；ゲル濾過
／１１　Ｐ　Ｌ　Ｃ法により１７．０００ （ｃｌ　　紫外線スペクトル：第１図に実質的に示され
るものｌｄｌ　　等電点：　３．６５　；並に（ｍｌ　
　下記のアミノ酸配列を有するポリペプチドよりなるＸ
−ａｌａ−ａｌａ−ｖａｔ−ｓａｒ−ｖａＬ−ｘｍｒ−
ｐｒｏ−ａｌａ−を五ｒ−ｇＬｙ−１ａ１４−ａＬａ−
ａｓｐ−ｇＬｙ−ａｌａ−１ｈｒ−ｖａＬ−１んｒ−ｍ
ａｌ−ｍａｒ−ａｌａ−ｍａｒ−ｇＬｙ−ｐｈａ−ａｌ
ａ−ｔｈｒ−ｍａｒ−１ｈｒ−ｓａｒ−ａＬａ−１ｈｒ
−ａｌａ−Ｌｍｓ−ｇ１％−ｃｙｓ−ａｔａ−ｓｌｇ−
ｇａｓ−ａＬａ−ａａｐ−ｇＬｙ−ａｒｇ−ｇｌｙ−ａ
ｔａ−ｃｙｓ−ａａｎ−ｖａＬ−ｃＬｌａ−ｇＬｓ−ｐ
ｈａ−ｈｉａ−ａｘｐ−ｐｈｇ−ｍａｒ−Ｌｍｓ−ｍａ
ｒ−ｇＬｙ−Ｑｔ’Ｗ−ｆＪｌｕ−Ｑｔｖ−ｔんｒｌん
ｒ−ｍａｒ−ｖａＬ−ｖａＬ−ｖａｌ−ａｒｇ−ａｒｇ
−ｍａｒ−ｐｈａ−ｔｈｒ−ｇｌｙ−ｔｙｒ−ｖａｔ−
ｍａｔ−ｐｒ。

−ａａｐ−ｇＬｙ−ｐｒｏ−ｇｌｕ−ｖａＬ−ｇｌｙ−
ａｌａ−ｖａＬ−ａｓｐ−ｏｙｔｉ−ａｓｐ−ｔｈｒ−
ａｔａ−ｐｒｏ−ｇｌｙ−ｇｔｙ−ｃｙａ−ｇｌｎ−ｉ
ｌａ−ｖａｌ−ｖａｌ−ｇｌｙ−ｇｌｙ−ａｓ％−ｔｈ
ｒ−ｇＬｙ−ｇｌｘ−ｔｙｒ−ｇＬｙ−ａａｓ−ａＬａ
−ａｌａらｌａ−ｍａｒ−ｐｈａ−ｇｌｙ−ＯＨ；（た
だしＸはＥ−ａＬａ−ｓａｙ、Ｅ−ｍａｙ及びＨよりな
る群から選択される） 特徴を有する抗腫瘍抗生物質ケダルシジンを提供する。

前述の物理化学的特徴が、本発明の抗生物質を抗腫瘍活
性を有する他の周知のペプチド抗生物質例えばネオカル
ジノスタチン、マクロモマイシン、ラルゴマイシン、ア
クチノキサンチン及びＡＮ−７Ｄから区別する。

本発明は、さらに 液内＠寮好気性条件下同化ｏｆ能な炭素及び窒素源を含
む培地中で５ｔｒａｐｔｏａＬｌｏｔａｉｃｈｓａ　　
のケダルシジン生産株を培養し、そして培養したプロス
から該抗生物質を回収することよりなる抗生物質ケダル
シジンを製造する方法を提供する。

本発明の他の態様は、Ｓｔｒｇｐｔｏａｌｌｏｔａｉｃ
ｈｕａ　　ｓｐ。

％ｏｖ−＋菌株Ｌ５８５−６　、ＡＴＣ（、’５３６５
０のケダルシジン生産株を提供する。

本発明のさらに他の態様は、腫瘍阻止量の抗生物質ケダ
ルシジン及び製薬上許容しうる担体な含む製薬組成物を
提供する。

本発明の他の態様は、腫瘍を含む宿主に腫瘍阻止量の抗
生物質ケダルシジンを投与することよりなる哺乳動物の
宿主における腫瘍を阻止する方法を提供する。

〔図面の説明〕

第１図は、抗生物質ケダルシジンの紫外線スペクトルを
示す。

〔発明の詳細な説明〕

本明細曹で用いられるとき、下記の略称がアミノ酸を表
すのに用いられる。

αｓｚ：アスパラギン酸＋アスパラギンｔｈｒ：スレオ
ニン ａ−デ：セリン ｇｌｚ：グルタミン酸＋グルタミン α１ｐ：アスパラキン酸 ａａｎ：アスパラギン ｇｔ％：グルタミン酸 ｇｔル：グルタミン ｐｒｏニブロリン ｒｔｌｙニゲリシン ａｌａｌミニアラ ニン！：バリン 惟−ｔ：メチオニン ｉＬａ：インロイシン ｌａｗ、ロイシン ｔｙｒ：チロシン ｐｈａ：フェニルアラニン ｈｉｓ　：ヒスチジン ｌｙｅ：リジン αｒｇ：アルギニン ｃｙｓニジスティン ｔｒｐニトリブトファン 〔生産微生物〕 菌株Ｌ５８５−６はインド、マハラストラ州で採集され
た土珈のサンプルから単離された。菌株Ｌ５８５−６の
特徴は、下記に詳しく記述される。

形態学 菌株Ｌ５８５−６は、ダラム耐性の線状薗であって、基
質及び気菌糸を形成する。基質繭糸は、アガーに浸透し
そして分裂しない。置体した栄養菌糸とともに、直径５
〜２５μ偽の菌糸の球状の密な集りが観察される。気菌
糸は、十分に分岐しそして真直な、ねじれた又はらせん
状の長い菌糸となり、胞子が連続又は不連続の鎖で形成
する。分岐した短い胞子の鑓の苫なふさ状分岐は、ＩＳ
Ｐ冶地４５で主として形成する。胞子の両方のタイプは
、だ円から短い円筒状（０，４〜０．６　Ｘ　１．０〜
２．０μ悔）で非運動性でありそして平滑な表面を有す
る。

無色のバルーン様の物体（直径５〜２０μ倶）が、５〜
１０日間のインキュベーション後気菌糸上に単一で又は
塊状で観察される。３週間以上のインキュベーション後
、これらのバルーン様物体は、さらに伸長した気菌糸に
より覆われた黄色がかった褐色の菌核性の顆粒（直径４
０〜１００μ惰）を発育させる。

培養上の特徴 生長は一般的に中程度であるが、ツアペックの砂糖・硝
酸塩アガー、オートミール・アガー及びでん粉・鉱−ア
ガーでは非常に貧弱である。気菌糸は、チロシン・アガ
ー及びグリセロール・アスパラギン・アガーで形成する
が、ＩＳＰ培地屑２．３．４及び６並にベネットのアが
−では形成しない。気菌糸の色は、黄色がかった白色で
ある。

黒味がかったメラノイド顔料は、ＩＳＰ培地Ａ６６及び
７に形成する。他の明確な朗科は形成しない。菌株Ｌ５
８５−６の培養上の％徴は、第１表に示される。

砂糖・硝酸塩アガー　　　　　２）Ｇ：なし又はわずか
（ツアペック・ドックス・　　　Ａ：なしアガー）　　
　　　　　　　　Ｓ：無色Ｄ：なし トリプトン・イーストエキ　　Ｇ二中程度；混濁せず、
綿ス・プロス（ＩＳＰ４１）　　　　　毛状Ａ：なし Ｓ：無色 イーストエキス・麦芽工　　　Ｇ：中程度キス・アガー
　　　　　　　　Ａ：なしＣｌ５ＰＩ６２）　　　　　
　　　Ｓ：濃い黄色かがった茶色Ｉ）：濃い黄色ががっ
た茶色 オートミール・アガー　　　　Ｇ：わずかＡ：なし又は
わずか；存在 するとき白色 Ｓ：無色 Ｄ：なし 無機塩・でん粉アガー　　　　Ｇ：わずかＣｌ５Ｐ、１
６４）　　　　　　　　Ａ：なし又はゎすか；存在する
とき白色 ｓ：ｇｔ１色 ｌ）：なし グリセロール・アスパラ　　　Ｇ：中程度ギン・アガー
　　　　　　　　Ａ：中程度；黄色かがったＣｌ５ＰＡ
６５）　　　　　　　　　　白色（９２）Ｓ：無色 Ｄ：なし ペプトン・イーストエキス・　Ｇ：中程度鉄アガー（Ｉ
ＳＰ朧６）　　　Ａ：なしＳ：淡い灰色及び黄色がか った茶色（７９） １）：色がかった黒（６５） チロシン・アガー　　　　　　Ｇ：中程度＜ｌ５ＰＡ６
７）　　　　　　　　Ａ：豊富、黄色がかった白色（９
２） Ｓ；黒色 Ｄ：黒色 グルコース・アスパラギ　　　Ｇ：貧弱ン・アガー　　
　　　　　　Ａ：なし Ｓ：濃いオレンジ、＊色 ７Ｊ：なし ぺ不ソトのアガー　　　　　　Ｇ：中程度Ａ、なし又は
わずか：存在 するとき白色 Ｓ：濃い灰色及び黄色かが った茶色（８１） Ｄ：中程度の黄色がかった 茶色（７７） １）３週間２８℃でのインキュベーション後のＭ！２）
　　Ｇ−生長；Ａ−気菌色；Ｓ−基質菌糸；Ｄ−拡散性
の顔料。

３）色及びかっこ内の数字は、Ｉ　Ｓ　ｔ’　Ｃ−Ｎ　
ＨＳの命名に従う。

最適な生長は、３０〜３５’Ｃで観察される。生長に関
する温度範囲は、１８℃〜３９℃である。生長は１５℃
及び４１℃で生じない。生長は、５％より多いＮαＣ１
を補給された培地で生じない。ゼラチンは液化されるが
、でん紛は加水分解されない。テストされた２５柚の糖
の中、Ｄ−リボース及びＤ−グルコースのみが生長に利
用される。生理学上の特徴及び炭水化物の利用は、第■
及び■表に示される。

第■表　　菌株Ｌ５８５−６の生理学上の％徴以下の加
水分解　　　　　　　　　以下の利用１２Ｌ−ラムノー
ス　− ゼラチン　　　　　　　＋　　Ｄ−グルコース　＋でん
粉：可溶性でん粉　　　−Ｄ−ガラクトース−じゃがい
もでん粉　−Ｄ−フラクトース−ミルク凝固　　　　　
　＋　　Ｄ−マンノース　−ペプトン化　　　　＋　　
Ｌ−ソルボース　−以下の生産　　　　　　　　　砂糖
　　　　　　−硝［ｍ還元ｍ索　　　　−又はラクトー
ス普１ ＋（メリ　　セルビオース− チロシナーゼ　　　　　＋　　メリビオース　　　−以
下に対する耐性　　　　　　　テレ・・ロース　　　−
リゾチーム、０．０１％ＣＪＰ’／Ｖ）＋ラフィノース
　　　−ＮａＣノ、１％−４％（Ｗ／ｊ／）＋　　　Ｄ
−フラクトース　−５％　　　　　　−可溶性でん粉　
　　−ｐＨ５，０−１１，０＋　　セルロース　　　　
−４，５及び１２　　−　　デュルシトール　　−温度
：　　　　　　　　　　　イノシトール　　　一生長範
囲　１８℃〜３９℃　Ｄ−マンニトール　−生長なし　
１５℃及び４１℃　Ｄ−ンルビトール　−最適生長　３
０℃〜３５℃　　サリシン　　　　−グリセロール Ｄ−アラビノース− Ｌ−アラビノース− Ｄ−キシロース　− Ｄ−リボース　　十 螢１ツアペックの砂糖・硝酸塩プロスでは陰性、ペプト
ン・硝酸塩ブロスでは陽性。

骨２基本培地ニブリドハム・ゴツトリープの培地（＝Ｉ
ＳＰ　、紙９培地） 以下の加水分解：　　　　　　以下からの酸：アブ二ン
　　　　　−　　グリセロール　　−カゼイン　　　　
　十　　Ｄ−アラビノース−ニスキュリン　　　＋　　
Ｌ−アラビノース−馬尿酸　　　　　　＋　　Ｄ−キシ
ロース　−ヒポキサンチン　　−　　Ｌ−ラムノース　
−チロシン　　　　　＋　　Ｄ−グルコース　＋尿素　
　　　　　　−Ｄ−マンノース　−キサンチン　　　　
−　　ラクトース　　　−セルビオース　　＝ ５０℃、８時間の生存　−メリビオース　　−トレハロ
ース　　　− 以下の利用：　　　　　　　　ラフィノース　　　−安
息香酸塩　　　　−Ｄ−フラクトース　−（えん酸塩　
　　　−イノシトール　　　−粘液酸塩　　　　　−Ｄ
−マンニトール　−こはく識塩　　　　＋　　Ｄ−ンル
ビトール　−酒石酸塩　　　　　−エリスリトール　　
−アドニトール　　　− メチルα−グルコシド− 骨　テストはＧｏｒｄｏｎら、Ｊ、Ｇｉｎ、Ｍｉｃｒｏ
ｂ、１９７８゜１０９：６９〜７８により記載されてい
る。

細胞壁化学 菌株Ｌ５８５−６の細胞壁含ｔｈｌｉ′は、Ｂｉｃｋｅ
ｒら、Ａｐｐｔ。

ＭｉａｒｏｂｉｏＬ、１３　：２３６〜２４３（１９６
５）、ヤマグチ、Ｊ、Ｈａｔｔｍｒｉｏｌ、８９　’、
４４４〜４５３（１９６５）並にＬｇｃｋａｖａｌｉａ
ｒ及びＬｓｃに−ｖａｌｉｍｒ、　Ｂｉｏｌｏｇｙｏｆ
　　を五−Ａｃｔｉｎｏｍｙｃａｔｅｓ　　ａｎｄ　　
Ｒ−Ｌａｔａｄ　　Ｏｒｇａ−ｓｉｓｍｓ、１１　ニア
８〜９２（１９７６）により記載された方法に従って調
べられた。細胞壁のペプチドグリカンは、メン−ジアミ
ノピメリン酸を含む。全細胞・糖は、ガラクトース、グ
ルコース及びリボースを含む。従って細胞壁のタイプは
タイプ■６に属する。ホスホリピドは、ホスファチジル
エタノールアミン、ホスファチジルグリセロール及びホ
スファチジルイノシトールを含むタイプＰ−■である。

主なメナキノンはＭＫ−９（Ｈ４）及びＭＫ−９ＣＨ６
）である。グリコレートテストは陰性である。

分類学 長鎖の胞子を有するＡｃｔｔ％ｏｍｙｃａｔａｌ−虐の
属の中で、Ｐｓｇｕｄｏｎｏｅａｒｄｓａ、５ａｃｏｈ
ａｒｏｐｏｌｙａｐｏｒａ、Ａｅｔ−ｉ％ｏｐａＬｙａ
ｐｏｒｔｓ、　　Ｓｔｒａｐｔｏｍｙｃｍａ、Ａａｔｓ
ｎｏｔｎａｄｕｒａ。

Ｇｌｙａｏｍｙｃｍａ、　Ｎｏａａｒｄｉｏｐｓｉａ及
びＡｍｙａｏＬαｔａ　は、細胞壁のタイプ、細胞の糖
σリパターン、ホスホリピド及びメナキノンによりなる
細胞化学において菌株Ｌ５８５−６から鴫もかに区別さ
れる。Ｋｉｂｄｍｌｏｓｐｏｒａｎｇｉｕｒｎ（Ｓｈａ
ａｒｍｒら、Ｉｎｔ、Ｊ、Ｓｙｍｔ、Ｅａｅｔｇｒｉｏ
ｌ、３６：４７〜５４．１９８６）、Ｋｉｔａｚａｔｏ
ｓｐｏｒｉａ　　（タカ２、シら、Ｊ、Ｇａｓ、Ａｐｐ
ｌ、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、３０　：　３７７〜３８７．
１９８４）及びＡｍｙｃｏｌａｔｏｐｓ４ａ　（Ｌａｃ
ｈｇｖ−ａｌｉｓｙ　　ら、１ｓｔ、／、５ｙａｔ、Ｈ
ｔｓｃｔｍデ＜ｏｉ３６：２９〜３７．１９８６）は、
ホスホリピド及びメナキノンの組成において菌株Ｌ５８
５−６に関連があるが、Ｋｉｂｄａｌ−ｏ　ａｐｏｒａ
％ｇｉｓｍ及びＡｔｎｙｅｏｌａｔｏｐｓｉａは、細胞
壁の糖におけるアラビノースの存在で該菌株と興り、そ
してＫｉｔａｓａｔｏａｐｏｒｔａは、細胞壁中のＬＬ
−及びメソ−ジアミノピメリン酸の存在で異る。さらに
、ＫｉｌｄａＬｏｇｐｏ−ｒａｎｇｉｓ慣は真の菌糸エ
ンベロープ胞子の５様物体を有しそしてＫｉｔａｓａｔ
ｏａｐｏｒｔａは液内培養胞子を形成する。

これらの独特な構造は、菌株Ｌ　５８５−６では観察さ
れない。化学分類学上、５ｔｒａｐｔｏａｌｌｏｔａイ
ｃｈＩＪｓ（）ミタら、Ｉｔ％ｔ、　、７．５ｙｓｔ、
　ｌ１ａｅＬａｒｔｏ１．３７：２１１−２１３．１９
８７）、Ａｔ　ｔ　ｉｎｏａｙｎｎａｍａ　（ハセガワ
ら、Ｉｎｔ、Ｊ。

Ｓｙｍｔ、　Ｂａｃ　ｔａｒ４ｏ１．２８　：　３０４
〜３１０．１９７８）及び５ａｅｃｈａｒｏｔｈｒｉｚ
（Ｌａｂｔｄａら、Ｉｎｔ、　Ｊ、　５ｙｚｔ。

ＥｃＬｅｔａｒｉｏｌ、　３４　：４２６〜４３１．　
１９８４）は、菌［，５８５−６に最も関連がある。Ａ
ａｔｉｎｏ８ｖｎｎａｒｎａは、束状体の先端から気廟
子の鎖乞形成する。、５ａｅｃｈａｒｏｔｈｒｉｚは、
栄養菌糸及び気菌糸の両方で分裂した球状の要素の鎖を
形成し、そして分岐した短い胞子の鎖又は菌核の顆粒の
群れを形成しない。５ｎｃｃｈａｒｏｔｈｒｉｚ　ａｎ
ａｔｒａｌｉａｎａｔｇ及び、！？、　ａｍｒｏｃａｌ
ｏｎｉｇｇｎａａにおける球状の’７１の鎖の形態学（
Ｌａｂｇｄａ、　Ｉ鴬ｔ、　Ｊ、　５ｙａｔ、　Ｅａｅ
ｔｇｒｉｏｌ、　３６　：１０９〜１１０．１９８６）
は、Ｎｏｃａｒｄｉｏｐｓｔａのそれらに関連がある力
ζ　Ｓｔデーｐｔｏｔｎνｃｍｍのすべての種に無関係
である。従って、菌株Ｚ、５８５−６は、Ａｃｔｉ％ｏ
ａｙ％外−愼α及びＳαａｅｋａｒｏｔｈｒｔｓの何れ
とも関係がない。

Ｓｔｒａｐｔｏａｌｌｏｔｍｉｅｈｓａ　ｈｔｓｄｓａ
ｔａｓｓａは、分節胞子の長いらせん状の胞子の鎖、分
岐した短い胞子の鎖そして気菌糸の菌核の顆粒を有し、
さらに栄養菌糸における鞭毛を有する１〜４個の胞子を
包む小さな胞子の５様体並に菌糸の密な球状体を有する
。菌株Ｌ５８５−６Ｌ小さな胞子の５様頂のうのすべて
を形成する。５ｔｒＨｉｔｏα１ｌｏ−ｔａｃｃｈｓｓ
と同じ（、菌株Ｌ５８５−６は、菌核顆粒に生長するバ
ルーン様体を形成する。この構造は、Ｓｔｒａｐｔｏ−
ｍｙｅ＊＊の多（の種例えばＳ、　ｋａ＊ａｍ１１ｅａ
ｔｔｃｍａ（Ｓｈｉｒ−１ｉｓｇら、１ｓｔ、Ｊ、５ｐ
ａｔ、Ｅａｅｔｍｒｉｏｌ、　　２２　：　２６５〜３
９４．１９７２）及びＳ、　ｒｏａａｉａｃｌａｒｏｔ
ｉｃｓｓ（Ｃｈａｉｔ百ａ　　ｒｓｂｒａ）（Ｓｈｉｒ
ｌｉｎｇら、　１ｓｔ、Ｊ、５ｙａｔ。

Ｅａｃｔｇｒｉｏｌ、　２２　：　２６５〜３９４．１
９７２）において観察されている。

上述の比較する考察に基づいて、菌株Ｚ、５８５−６は
、属Ｓｔｒｇｐｔｏａｌｌｏｔａｉｃｈｓａに分類され
る。菌株Ｌ５８５−６は、ＩＳＰ培地培地ムコ及び４並
にベネットのアガーで気菌糸を形成する能力の欠除、メ
ラニンの形成、でん粉加水分解の欠除、４１℃における
生長の欠除並にテストされた２５種の糖の中でローリボ
ース及びローグルコースのみを利用する能力の点で、Ｓ
ｔｒｇｐｔｏａｌｌｏｔａｉｃｈｓｍｈｉ％ｄｓｘｔａ
％ｌとは異る。それ故菌株Ｌ５８５−６は、属５ｔｒａ
ｐｔｏａｌｌｏｔｅｉｅｈｘａの新しい種であると考え
られる。

属ｆ；ｔｒａｐｔｏａｌｌｏｔｓｉｃｈｓａの新しい種
と決定された菌株Ｌ５８５−６の生物学上純粋な培養物
は、Ａｍｅｒｉｃａ％Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ
１１ａｅｔｉｏｓ（Ｒｏｅｋ＊１Ｌｌａ＋ＭＤ）に寄託
され、そしてＡＴＣＣ５３６５０として微生物のその永
久的なコレクションに加えられている。

〔抗生物質の生産〕

本発明の抗腫瘍抗生物質は、菌株Ｌ５８５−６又はその
変種を水性の栄養培地中で液内培養の条件下で培養する
ことにより生産される。生産微生物は、同化ＯＴ能な炭
素源例えば同化可能な炭水化物を含む栄養培地中で生長
する。好適な炭素源の例は、セレロース及びグリセロー
ルを含む。

栄養培地は、又同化可能な窒素源例えばフィシュ・ミー
ル、イースト・エキス又はアンモニウム塩を含まねばな
らない。

無機塩例えば塩化ナトリウム、塩化カリウム、硫酸マグ
ネシウム、炭酸カルシウム、りん酸塩などが、必要なら
ば加えられる。微量元素例えば銅、マンガン、鉄、亜鉛
などは、所望ならば培地に加えられるか、又はそれらは
培地の他の成分の不純物として存在している。インキュ
ベーション温度は、生産菌株が生長することのできる任
意の温度例えば１８℃〜３９℃でちるが、２５℃〜３５
℃考も好ましくは２７℃〜３２℃で発酵を行うのが好ま
しい。中性のｐＨが好ましくは培地で用いられ、抗生物
質の生産は一般に約４〜８日の期間性われる。通常、最
適の生産は約５〜６日で達成されろ。比較的少量の抗生
物質の製造のために、振盪フラスコ及び表面培養が用い
られるが、多量での製造では液内培養の好気性培養（数
置タンク内の）が好ましい。タンク発酵が行われろとき
、微生物からの胞子をブロス培養に接種することにより
栄養ブロス中に増殖接種物を生成し、そして若い活性な
増殖接種物が得られたとき接、佃つ′Ｉ！ｌＪを発酵タ
ンクの培地に滅菌的に郡すごとが望ましい。攪拌はさら
に機械的な攪拌器によりもたらされる。発泡防止剤例え
ばラード油又はシリコーン油も又必要ならば加えられる
。

発酵培地中の抗生物質ケダルシジンの生産は、テスト微
生物としてＥａｅｉｌ１％ａ　ａｓｂｔｉｌｉａを用い
る抗菌性アッセイにより、又はネズミ（Ｊ？１６−ＦＩ
Ｏ）又はヒト（例えばＨＣＴ−１１６、ＫＢ）腫瘍細胞
系を用いる細胞毒性アッセイにより、発酵の途中で容易
（追跡できる。

本発明は、前述の％に好ましい菌株Ｌ５８５−６又は前
述の記述罠十分に適合する微生物の使用に限定されない
ことは理解されるべきである。従来の手段例えばＸ線照
射、紫外線照射、ナイトロジエンマスタードてよる処！
、ファージ露出などにより生成できる他のケダルシジン
生産菌株又は該微生物の変種を含むことを特に目的とし
ている。

〔抗生物質の単離及び精製〕

本発明の抗腫瘍蛋白は、従来の蛋白分離法例えば透析、
限外濾過、ゲル濾過、等電点沈澱、塩析、電気透析、イ
オン交換クロマトグラフィ及びアフイニテイクロマトグ
ラフイを用いて、発酵ブロスから単離できる。一連のこ
れらの技術の組合わせは、見掛は上の均一性にまで蛋白
を精製するのに一般に用いられる。単離及び精製の工程
は、微生物学的なアッセイ例えばＢ、　ａｓｂｔｉｌｉ
ｍ、生体外細胞毒性アッセイ（ネズミ又はヒトの癌細胞
系に対する）、生体内の抗腫瘍アッセイにより、又は物
理的方法例えばＵＶ又はＨＰＬＣ技術により、モニター
されそして導かれろ。スケーム■は、代表的な単離精製
の順序を示す。この特別な順序は、説明の目的のみのた
めであり、他の方法を用いる異る順序も又蛋白が高純度
で得られそしてその生物学的活性を保持する限り用いら
れうろことは当業者により理解されるだろう。

スチーム１．蛋白の単離及び精製 スケームＩを行うのに、全発酵ブロスの下塔性の塊＆Ａ
従来の方法例えば遠心分離又は濾過を用いて除去される
。

もしブロスが濾過されるならば、濾過助剤例えＩｄＪ）
ｉｃａｌｉｔａが有利に用いられる。Ｐｇを次に７〜８
のｐＨ範囲で溶離液として陽イオン性バッファーを用い
る隘イオン交換クロマトグラフィにかけ、次に塩化ナト
リウムを含む同一のバッファーを用いる。このｐＨ範囲
の好適な陽イオン性バッファーは例えばトリスＨＣ１で
ある。Ｎｅ５ＣＬ含有バツフアーにより溶離した画分を
集め、濃縮しそしてさらに同一の陽イオン性バッファー
を用いるゲル濾過クロマトグラフィにより精製する。画
分を集めそして活性成分の存在についてアッセイする。

溶離液をモニターする好都合な最初のシステムは、Ｂａ
ｅｉｌｌｓａ　ａｓｈｔｉｌｔａに対してアッセイする
ことである。阻止帯を示すこれらの両分は、集めもね、
濃縮しそしてさらに最初の６４ｇとして７〜８の範囲の
ｐＨを有する陽イオン性バッファーを用いる隘イオン交
換クロマトグラフィにより精製され、そしてイオン力を
増大する直線状の勾配により続ける。活性画分は、ナト
リウムドデシルサルフェート−ポリアクリルアミドゲル
電気透析（ＳＤ；５−ＰＡＧＥ）、等電点７．ｔ−カシ
ング及びＨＰＬＣ技術により、均一性についてチエツク
される。均一と判断される両分を集め凍結乾燥して活性
蛋白を得る。

〔抗生物質〕

ケダルシジンは、−本領ポリペプチド及び非蛋白発色団
よりなる有力な蛋白抗腫瘍抗生物質である。物理化学的
特徴及び生物学的テストにかけられた抗生物質のサンプ
ルは、配列の実験中５ＤＳ−ＰＡＧＥ、等電点フォーカ
シング及びＨＰＬＣにより均一と判断されたが、抗生物
質が一つの生な異型及び一つ又は二つの少い異型よりな
ることが分った。

異型は、下記に記載されるようにポリペプチドの最初の
Ｎ末端アミノ酸配列において異る。個々の異型の分離又
は単離は、抗腫瘍活性について要求されない。

本発明は、又ケダルシジンの異型を包含し、抗生物質の
ペプチド部分は、不明ＭＪ書に記載されたような抗生物
質の抗腫瘍活性を実質的に変更することなく、例えばペ
プチドの一次構造に沿って成るアミノ酸の欠損、付加又
は置換により、周知の技術によって変更されて、そのフ
ラグメント及び誘導体を生成することができる。

アミノ酸組成 周知の標準的な方法を用いて、精製された蛋白のアミノ
酸組成が決定されそして第１ｖ表に示される。

第　■　表　　ケダルシジンのアミノ酸組成ｔｈｒ　　
　３．１８　　　　９，３　　１１．６　　１０．６　
（１１）ｍａｒ　　　３．１６３　　　９．３　　１１
．５　　１０．６（１２）ｐｒｏ　　　１．６１５　　
　４．７　　　５．９　　　５．４　（４）ｑｌ、　　
　５．５２９　　１６．２　　２０．１　　　１８．５
　（１８）αｌα　　５．５６６　　１６．３　　２０
．３　　１８．６　（１８）ｖａｌ　　　３．７３１　
　１１　　　１３．６　　１２．５　（１３）チル−ｔ
　　　　　　　　Ｏ，２８７３０，８１，１１，０（１
）ｉＬａ　　　Ｕ、８５３１　　２．５　　　３．１　
　　２．９　（３）ｌａｘ　　　１．２９８　　　３．
８　　　４．７　　　４．３　（４）ｔｙｒ　　　Ｏ，
６２７４１，８２，３２，１（２）ｐｈｍ　　　１．５
６５　　　４．６　　　５．７　　　５．２　（５）ｈ
ｉｓ　　　Ｏ，６２３５１，８２，３２，１（１）ｌｙ
ｅ　　　Ｏ，３１９６０，９１，２１，１（Ｕ）ａｒｇ
　　　１．００１　　　２．９　　　３．７　　　３．
３　（３Ｊｃｙｓ　　　　Ｏ０００（４） ｔデル　　　　　　ＯＯ００（０） （５）ペプチドについて分子量１２．０００とすること
によるペプチド当りの残基の数。

（ｂ）合計１１４個の残基とすることによるペプチド当
りの残基の数。かっこ内の値は、アミノ酸配列分析によ
り求められたペプチド当りの残基の数を示す。

アミノ酸配列 アミン末端配列分析では、ケダルシジンは、２−メルカ
プトエタノールにより還元されそしてさらに５ｎｓ−Ｐ
ＡＧＥ（１５％アクリルアミド〕により精製されそして
電気溶離又は電気プロッティングによりゲルから回収さ
れた。

多くの酵素的開裂では、ケダルシジンはさらに精製する
ことなく用いられた。ケダルシジンは、５０℃で２時間
６μグアニジンＪｉＣ１，０，１％ＩＶａ、Ｅｌ）ＴＡ
　　を含む０．４Ｍトリス−ＥＣｌバッファー（、ｇ　
ｓ、ｓ）　１００μｌ中の２０ｍＭジチオスレイトール
により還元され、次に室温で１晩１００ｍＡ１４−ビニ
ルピリジンによりＳ−ピリジルエチル化された。反応を
５０℃で１時間１０μｌの２−メルカプトエタノールを
加えることにより停止した。試薬を２４時間５％（ｖ／
ｖ）酢酸に対する透（丁により除去し、そして修飾した
ケダルシジンを次にＳｐｇａｄｖａｃ遠心分離濃縮器（
Ｓａｖａｎｔ　　Ｉｎ５ｔｒｓｔｎａｎｔａ）中で乾燥
した０ＡＳＰ−Ｎ酵素又はＳ、　ａｓｒｍｕａ　Ｖ８プ
ロテアーゼによるＳ−ピリジルエチル化ケダルシジンの
酵素的開裂は、１　：１００ＣＡＳＰ−Ｎ）又は１：１
０（Ｖ８プロテアーゼ）の酵素／基質比を用いて、１晩
３７℃で０．７Ｍ尿素を含む０．１Ａｆ）リス酢酸バッ
ファー（、Ｂｓ、ｏ　）　４０μノ中で行われた。トリ
プシン消化は、１対２０のｔ１ｐ素／基質の比で１晩３
７℃で０．１Ａｆトリス酢酸バツフアー（ｊＢ８．０）
４０μｌ中で行われた。＃累の消化物は、トリフルオロ
酢酸（ＴＦＡ）により、１１２．０と酸性化され、そし
て逆相１１　Ｐ　Ｌ　Ｃ’により分離された。

、、ｌ１ＰＬＣによるペプチド精製は、モデル１３０／
ｆ分離システム（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙａｔｇｍ
ｓ＋　Ｉｎｃ、）により行われ、セしてｌ’−３００カ
ラム（２，ｌＸ１００鶴：Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏａｙ
ｔｔＬｇｍｓ、　Ｉ％ｅ、）で４０℃で行われた〇出発
バッファーとして水中０．１％ＴＦＡよりなりそして制
限バッファーとして０．０８５％７’　ＦＡを言む６０
％アセトニトリルよりなる線状アセトニトリル勾配を、
溶離に用いた。ペプチドは手で集めた。アミノ酸配列の
決定は、標準の技術を用いて自動アミノ酸シーケンサ−
（モデル４７５Ａ、　ＡｐｐＬｉａｄ　Ｈｉｏｓｙｓｔ
ａｍｍ、　７％６．）で行われた。

主な異型ポリペプチドは１１４個のアミノ酸残基よりな
る。アミノ酸の配列は、久の通りと決定されている。

Ｎ−末端 Ｈ−ａｌａ−ｓげ−ａｌａ−αＬａ−ｖａｌ−ｓｅｒ−
ｖａｌ−ｇａｒ−ｐｒｏ−ａｌａ−ｔｈｒ−ｇＬｙ−１
ａｓ−ａｌａ−ａｓｐ−ｇｌｙ−ａｌａ−ｔｈｒ−ｖａ
　ｌ　−１ｈｒ−ｖａｌ−ｍａｒ−ａｌａ−ｍａｒ−ｇ
ｌｙ−ｐｈａ−（ｌｌａ−１ｈｒ−ｓａｒ−ｔｈｒ−ｇ
ｇｒ−ａｌａ−１ｈｒ−ａｌａ−１ａｓ−ｇｉｎ−ｔｙ
ｓ−ａｌａ−ｉｔｅ−１ａｓ−ａｌｃＬ−ａａｐ−ｇｌ
ｙ−ａｒｇ−ｇｌｙ−ａｌａ−ｃｙａ−ａｓｎ−ｖａｌ
−ａｌａ−ｇｌｓ−ｐｈａ−んｉｓ−ａａｐ−ｐｈａ−
ｓｇｒ−Ｌｇｘ−ｓｇｒ−ｇｌｙ−ｇｔｙ−ｇｌｙ−ｇ
ｌｙ−ｔｈｒ−ｔｈｒ−ｓａｒ−ｖａｌ−ｖａｌ−ｖａ
ｌ−ａｒｇ−ａｒｇ−ｍａｒ−ｐｈａ−ｔｈｒ−ｇｌ　
ｙ−ｔｙｒ−ｖａｔ−ｒａｍ　ｔ−ｐｒｏ−ａｓｐ−ｇ
ｌｙ−ｐｒｏ−ｇＬｘ−ｖａｔ−ｇｌｙ−ａＬａ−ｖａ
ｌ−ａｓｐ−ｃｙｓ−ａｓｐ−ｔｈｒ−ａｌａ−ｐｒｏ
−ｇｌｙ−ｇｔｙ−ｃｙａ−ｇｌｎ−ｉｌａ−ｖａＬ−
ｖａｌ−ｇＬｙ−ｇｌｙ−ａａｎ−ｔｈｒ−ｇＬｙ−ｇ
ｌｘ−ｔｙｒ−ｇＬｙ−ａｓｎ−ａＬａ−ａＬａ−ｉｌ
ｇ−ｓａｒ−ｐん一−ｇｔ、−ｔｕｔ。

Ｃ“−末端 ２種の少い異型が同定され、一つは多い異型の初めのア
ラニア′？：欠き、そして他は多い典型の初めの２個の
アミノ酸即ちアシニンとセリ／を欠く。

分子量の決定 （ａ〕　ゲル濾過／ＨＰＬＣｆ５ ＴＳＫ−Ｇ２０００ＳＷカラム（７，５Ｘ３００闘）（
ＬＫＢ　　Ｐｒｏｄｓｋｔａｒ　ＡＥ、　　スウェーデ
ン）を用い、ゲル濾過を行い、０．５Ｎ／分の流速で０
．５ＭＮ、Ｃ１を言む３０毒ＭトリスＨｔ’ｌバッファ
ー（ｐ＃７．４）を用いる。−方、Ｖ／Ｇｔａｒｓ　Ａ
ｓ５ｏｃｉａｔｅｓ　Ｐｒｏｔａｉｓ　Ａｎａｌｙｓｉ
ｓＣ’ｏＬｕｍｒｎ　Ｉ　−１２５が、１紅／分の流速
で溶離液として０．２Ｍトリスアセテートとともに用い
られる。分子量は、標準の分子量マーカーから得られる
参考曲線から１７，０００ダルトンであると測定される
（ｌＪｉｏ　Ｒａｄ　Ｌａｂｏｒａｔｏ−ｒｔａａ　）
。

（Ｍｌ　　ナトリウムドデシルサルフェート・ポリアク
リルアミドゲル電気泳動法 蛋白のサンプル及び分子量マーカー（Ｄｉｖｅｒｓｉｆ
ｉｅｄＨｉｏｔａｃｈ、　　メインより購入）を、等容
量のＳｍｐｒａｓｏＬ（砂糖及び追跡均染＃＋を含む直
に用いられる蛋白溶解液）と混合し、次Ｋｍ気泳動直前
に９０℃で３分間加熱する。

電気泳動は、追跡用染料がゲルの底に達する壕で５ａｐ
ｒ−Ｉｌｌｂ％ｆｆＣトリス−グリシン−５ＤＳ、、Ｂ
８．３）中で３００Ｖで行う。ゲルを次に少（とも１０
時時間位浴液（含水メタノール９０８−中の１．２５９
のＣ”ｏｍａａｓｉａＢＢＲ−２５０，９２ゴの氷酢酸
）に浸漬し、次いでゲルのバックグラウンドが透明にな
るまで脱色浴ｉ（水８７５ａｇ中の７５−の酢酸及び５
０−のメタノール）に浸漬スる。

５ａｐｒａａｏＬ及び５ａｐｒａｂｕｆｆは、Ｉｎｔａ
ｇｒａｔａｄＳ、αｒａｔｉｏｎ　５ｙｓｔａ惰、マサ
チューセッツから購入した。

分子量は、この方法により１２，４００ダルトンである
と測定される。

フォーカシングに用いられるゲルは、以下のものを混合
することにより製造される。

２９１％アクリルアミド（水中）　　　　　　１〇−０
，９％Ｎ、Ｎ’−メチレン−ビス−１０ｄアクリルアミ
ド（水中） グリセリン　　　　　　　　　　　　　　　７１ｎｔ１
８０２　Ａｔｎｐｈｏ　ｌ　ｉｎａ　ｐＨ２，５〜４　
　　　　３　ａｔ水を加えて　　　　　　　　　　　　
　　　　６０ｄ得られた浴液を１０分間脱気しそして水
中１％過硫酸アンモニウム１．５ｄ及びＮ　、　＃　、
　Ｎ’、　Ｎ’−テトラメチルエチレンジアミン１０μ
ｌをそれに加える。混合物をｆＥ梨用の型に注ぎそして
放置して重合させる。用いる電極溶液は陰極で１Ｍ燐酸
であり陽極で２％１８０９Ａｍｐｈｏｌｉｎａ（ｐＨ６
〜８）である。フォーカシングの実験は、２時間２５ワ
ツトの一定電力で行われる。％は容量中の重量の％であ
る。等電点は、３．６５と測定されそして陽極からの泳
動距離は６．２５ｃｍである。

〔生物学上の活性〕

蛋白の抗腫瘍活性は、移植可能なネズミＰ３８８白血病
について評価された。ＣＤＦマウスに、この移植可能な
ネズミ白血病を有するＤＢＡ／２ドナーマウスから得た
１０６Ｐ３８８白血病細胞を腹腔内（ｉｐ）又は静脈内
（ｊｔＩ）に移植した。ｉｐ移植されたＰ３８８白血病
に対して、マウスは、肚編移植後の１日からＴＡ３まる
５日間連続して毎日１回ケダルシジンの投与又は塩水（
コントロール・マウス）の何れかによりｉｐ処理された
。イシ移植されたＰ３８８白血病に対して、マウスは移
植後１．３及び５日にケダルシジンを（雪で受けた。こ
れらの動物は、毎日観察されそしてそれらの死亡を記録
した。平均の体重の変化（白血病移植の日から最後の処
理の日まで）を、薬剤の毒性を反映する手段としてすべ
ての群について求めた。腫瘍移植後５日目の各群におい
て生存したマウスの発生を、薬剤の毒性を評価する追加
の手段として記録した。もし処理群当り１匹より多いマ
ウスが５日までに死亡したならば、治療結果は有意とは
考えなかった。処理群は４匹又は６匹の何れかのマウス
よりなり；コントロール群は１０匹のマウスを含んだ。

もしあるならば３０日（実験の最後の日）′１で生存す
るマウスの数も又記録された。実験の終りでは、各群に
関する平均の生存時間（＃、５Ｔ）が求められそして％
Ｔ／Ｃ（１００倍された処理群のＭＳＴ及びコントロー
ル群のＭＳＴＯ比である）を計／ｘ、するのに用いら扛
た。１２５より大きい％Ｔ／Ｃ値は、有意な抗腫瘍活性
を示す。生体内のデータを第Ｖ及びＶｌａ＋に示す。

Ｄ１６Ｆ４１１Ｄｉ１．１−４０　　７．０　　７４　
　１．９　　４７４藷１１−８０　１０．０　　１０５
　−１．２　　４／４ａｌｌ−１６０１２，５１３２１
，０４／４１）ｊｊ、１−３２０　１８．５　　１９５
　　１．９　　４／４コントロール　　９．５　　　−
　　　０．２　１０／１０１）１８／”４１３　０．２
７　　　　７．０　　７０　−１．９　　４／、６０．
０９　　　　１５．０　　１５０　−０．８　　６／６
０．０３　　　　１？、０　　１７０　−１．７　　６
／６０．０１　　　　１５．０　　１５０　−０．３　
　６／６Ｉ）１８Ｇ４１４ｂ）０．０ソ　　　９．５　
　９５−１．３　６／６０．０３　　　　１５．５　　
１５５　−１．２　　６／６０．０１　　　　１４．５
　　１４５　−０．５　　６／６ｕ、ｕ０３３　　１４
．０　１４０　−ｏ、２　　６／６コントロール　　　
　　　　　　　１０．０　　　−　　　０　　　１０／
１０、）腫瘍移植後１日から始まる５日間連続して１日
１回ｉｐ投与された薬剤。

ｂ）ロツＢ）１８Ｆ４１３により表された同一サンプル
の凍結乾榛且再溶解された製品。

Ｄ１８Ｆ４１３　０．３２　　　　　　６．０　　　７
５　　−３．１　　６／６０．１６　　　　　　７．５
　　　９４　　−３．２　　６／６０．０８　　　　　
１１．０　　１３８　　−１．４　　６／６０．０４　
　　　　１２．５　　１５６　　−０．６　　６／６０
．０２　　　　　１０．０　　１２５　　　０．１　　
６／６０．０１　　　　　　　８．０　　１００　　　
１．２　　６／６Ｄ１６Ｆ４１１１）ｉｌ、　１−２５
　　　７．０　　８８　−２．９　　６／６Ｄｉ１．１
−５０　　１０．５　１３１　　−１．６　　６／６１
）＄！３．１−１００　１３．０　　１６３　　−１．
２　　６／６Ｄｄ１．１−２００　　９．５　　１１９
　　　０．２　　６／６Ｄｉｇ、　１−４００　　９．
０　　１１３　　　０．５　　６／６Ｄｉ１．１−８０
０　　８．０　１００　　　０．８　　６／６コントロ
ール　　８．０　　−　　　−　　１０／１０α）腫瘍
移植後１．３及び５日にｉｖ投与された薬斎しケダルシ
ジンは、又１０％腫賜ブライ０，５−を腹腔内に移植し
たネズミＢ１６黒色肺に対して評価された。１０匹のマ
ウスを各投与量のレベルについて用いた。薬剤は、腫瘍
移植後１日から始まる９日間連続して１日１回腹腔内に
投与された。１０日１及び実験の終り即ち９０日１に生
存しているマウスの数を記録した。テストの結果を第■
表に示す。１２５より大きい％Ｔ／Ｃ’値は、有慧な抗
腫瘍活性を示す。

第■表　　ｉｐ移植されたＢＩ３黒色腫に対するケダ投
与ｆ　　ＭＳＴ　　　％　平均の体　５　（６０）’８
目の０．２５６　　１６．０　　９７　−２．７　　　
　９７１００．１２８　　２４．５　１４８　−１．３
　　　１０／１０領０６４　　　２６．５　　１６１　
　　０．３　　　　１０／１００．０３２　　３１．５
　１９１　　１．０　　　１０／１００．０１６　　　
３２．５　　１９７　　　０．６　　　　１０／１００
．００８　　　３４．０　　２０６　　　０．６　　　
　　９７１００．００４　　２７．０　１６４　　０．
３　　　１０／１０ｆｌ１０．００２　　２１．５　１
３０　　　０　　　１０／１０コントロール　１６．５
　　　−　　　　１．３φ　かつこ内の数＝腫瘍移植後
６０日月に生存しているマウスの数 第Ｖ、　Ｍｌ及び４表に示されているテストの結果は、
抗生物質ケダルシジンがネズミ白血病Ｐ３８８及びＢ２
Ｏ黒色肺に対して再現可能な生体内抗腫瘍活性を示す有
力な物質であることを証明している。銭祭された油性は
、ｉｐ移植されたＢ４Ｃ黒色肺並に（ｐ及びｉνの両方
の移植されたＰ２Ｓ５に対して生存日を増大することに
より明らかにされ、後者はその転移する性質のため有効
に治療することがさらに困難な形の疾患を示す。ケダル
シジンは、又皮下に移植されたＢ２Ｏ黒色肺、Ｍ５０７
６ネズミ肺腫瘍及び頭内に移植されたＰ３８８白血病に
対して評価されたが、これらの動物のモデルにおいて有
意な活性を示さなかった。

本発明は、その範囲内に、不活性な製薬上許容しうる担
体又は希釈剤とともに有効な腫瘍阻止量の本発明の抗生
物質を含む製薬組成物を含む。このような組成物は、又
他の活性抗腫瘍剤を含みそして所望の投与経路に適切な
任意の製薬上の形に作られる。このような組成物の例は
、経口投与用の固体組成物例えば錠剤、カプセル、ビル
、粉末及び顆粒、駐日投与用の液体組成物例えば溶液、
懸ＰＡ液、シロップ又はエリキシル並に非経口投与用の
製剤例えば滅菌溶液、懸濁液又はエマルションを含む。

それらは、又使用直前に滅菌水、生理学的湯水又は成る
他の滅菌した注射可ａｂな媒体に溶解できる滅菌固体組
成物の形で製造できる。

抗腫瘍剤として使用するために、成る哺乳動物の宿主に
対する最適の投与量及び用法は、当業者により容易に確
められる。もち論、用いられる実際の投与量は、処理さ
れる特定の組成物、投与経路及び特定の部位、治療され
る宿主及び疾患に応じて変化することは理解されよう。

薬剤の作用を修飾する多くのファクターは、考慮に入れ
られ、年令、体重、性別、食事、投与の時間、投与の経
路、排出の速度、患名の状態、薬剤の組合せ、反応の感
受性及び疾患の程度を含む。

〔実施例〕

本発明は下記の実施例により祝明され、それらは本発明
の範囲を制限するものとは考えてはならない。

実施例１゜ Ｓｔｒｇｐｔｏａｌｌｏｔａｉｃｈｕａ菌株Ｌ５８５−
６の栄養培養物の製造 ５ｔｒａｐｔｏａＬｌｏｔａｉｃｈｓａ　　ａｐ、菌株
Ｌ５８５−６（ＡＴＣＣ５３６５０）を、試験管内のデ
キストロース　　　　　　　　　４．Ｏｆイースト・エ
キス　　　　　　　４．０１麦芽エキス　　　　　　　
　　　ｉｏ、ｏｒＣａＣＯｓｌ、５　ｆ アガー　　　　　　　　　　　　１５９蒸留水を加えて
　　　　　　　　１１ よりなるイースト−麦芽エキスアガーのスラントに維持
且移した。それぞれの移植にはアガー・スラントを２週
間２８℃でインキュベートした。栄養培養物を、セレロ
ース（Ｃｏｔｓ　Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）　　　　３０　ｆ
Ｐｈａｒｍａｍａｄｉａ（Ｔｒａｄｅｒｓ　　Ｏｉｌ　
　　　　１０　ｔＭｉｌｌ　　Ｃｏ、） ＮｓｔｒｉｓＨ（Ａｒｃｈｅｒ　　Ｄａｎｉｅｌｓ　　
　　　　　１　０　ｆＭｉｄｌａｎｄ　Ｃｏ、） Ｃαｃｏ、　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
３　ｙ蒸留水を加えて　　　　　　　　　　　　　１１
よりなる滅菌培地１００−を含む５０〇−容エルレンマ
イヤー・フラスコに、スラント培養物からの表面培養物
を移すことにより製造した。この栄養培養物を２５０回
転回転圧セットされた回転振盪機で７２時間２８℃でイ
ンキュベートした。

実施例２゜ 振盪フラスコにおける発酵 実施例１の栄養培養物５−を、 グリセロール　　　　　　　　　　　　３０ｒ１’ｈａ
ｒｍａｍａｄｉａ　　　　　　　　　　　　ｌ　Ｏｆ！
Ｄｉｓｔｉｌｌａｒの可溶物（Ｎｘｔｒｉｔｉｏｓ　　
　１５　？Ｐｒｏｄｕｃｔ　　Ｃｏ） フイシュ・ミールＣＭａｓｈａｄａ％）　　　　　１０
？Ｃ’　ｃ　Ｃ（７ｓ　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　６　ｆ蒸留水を加えて　　　　　　　　　　
　　　１１！よりなる生産培地１００ｄをそれぞれ含む
５００１Ｒｔ容エルレンマイヤー・フラスコに接種した
。生産培養を２５０回転回転圧セットした回転振盪機で
２８℃でインキュベートした。蛋白抗生物質の生産なり
、ａｕｂｔｉｌｉａを用いる微生物アッセイ並にネズミ
黒色腫細胞系＃１６−Ｆ１０及びヒト血筋細胞系を用い
る生俸外の細胞毎注アッセイによりモニターした。最適
の生産は一般に１４４〜１６８時間で達した。

実施例３゜ タンク中の発酵 実施例１の栄養培養物２５−を、同一の栄養培地５００
−を含む２Ｅ容Ｖｉｔｒｏ瓶に接撫した。第二次の段階
の種培養物を、２５０回転／分にセットした攪拌速度で
回転振盪機で７２時間２８℃でさらにインキュベートし
た。第二次の段階の糧培養５００−を、実施例２に示さ
れた組成を有する生産培地１０Ｊを含むＮｅｗ　ｌｉｒ
ｓｎｓｗｉｅｋ　Ｍｉｃｒ−ｏｇｇ％発酵槽（公称容１
ｔ１６１）に接種した。発酵を、２５０回転／分にセッ
トした攪拌、毎分１答ｔの通気盆及び２８℃で行った。

抗生物置ケダルンジンの生産は、適切な生体外バイオア
ッセイによりモニターされた。

実施例４゜ ケダルシジンの単離及び精製 涼料発醇プロス１０１をＤｉｃａｌｉｔａ　６　ｌと混
合しそして得られた薄いスラリーをＤｉｃａＬｓｔａパ
ッドで濾過した。

不溶物を捨てそして戸液を３０−７分の速度でＺｅｔａ
Ｐｒａｐ　２５０　　ＱＡＥイオン交換カートリッジ（
ＬＫＢ−Ｐデｏｄ％ｋｔａｒＡＢ、　　スウェーデン）
に圧入した。カートリッジは予め２１の５０ｓＡｆ）リ
ス−１１Ｃｌバツフ゛アー（ｐＨ７，４）により平衡に
されていた。溶離液を集めた。

カートリッジを１１の５０ｍＭトリス−１１Ｃｌバツフ
アー（ｐＨ７，４）により洗い次にＮａＣｌ０．５モル
を含む５０溝ＭトリスーＥＣｌバッファー（、Ｈ７，４
）５００−により溶離した。溶離液を集めそしてＡｍ１
６６％ＹＭ５膜を付けたＡｍ１ｃｏｔｓ標準限外濾過セ
ルを用いて５００ゴから１００−に濃縮した。濃縮した
溶液を、等容量の５０ｍＪ（ト４７スーｌ１Ｃｌバッフ
ァー中の１４００ｇのＵｔｔｒｏｇａＬ　ＡｃＡ３４　
（ＬＫＢ−Ｐｒｏｄｕｋｔａｒ　ＡＢ　、スウェーデン
）を充填したゲル濾過カラム（５Ｘ１００ｃ！！Ｌ）に
浸透させた。

Ｕｌｔｒｏ（Ｈｌベツドは既に５１の５０ａＡｆトリス
−ＥＣｌバッファー（アｎ　７．ａ）により平衡されて
いた。装入したカラムを、６０ｒｎｔ／分で２１！０５
０ｍＭトリスー１１Ｃｌバッファー（ｐＨ７，４）によ
り溶離した。４５０ｒＲ１の最初の部分の次に、１０ｍ
Ａの両分を集めそしてそれぞれの画分をＢ、　５ｓｂｔ
ｉＬｉｓ　　Ｉｃついてアッセイした。阻止帯を示す両
分（画分８３−１３３）を集め、次に限外濾過により１
００−に濃縮した。濃縮した溶液を、等容量の５０？＋
％Ｍト’）スーＭＣＩバッファー中のＤＥ　ＡＥ　　Ｔ
ｒｉｍｃＬｅｒｙｔ　　（ＬＫＢ−Ｐｒｏｄｔ＆ｋｔａ
ｒ　ＡＢ＋　　スウェーデン）７０−のスラリーを充填
したイオン交換カラム（２，５ｘ　１５ｃＷＬ）に浸透
した。

ＴｒｉｍαｃｒｙＬ　　ベットを既に１０倍のカラム容
量の５０ｔｎＭ）リス−１１ｃｌ　バッファーにより平
衡にしておいた。

装入したカラムを最初に１０倍のカラム容量の５０ｍＭ
−トリス−１１Ｃ１バッファーにより溶離し、次に６０
ｄ／時ノ流速で１００％５０ｍＭトリス−ＨＣｌバッフ
ァーから０．５ＭＮａＣ１を含む５０　ｍＭ　）リスー
Ｂｃ／ｌバッファー０１００％までの３００−の線状勾
配（スロープ−０，１Ｍ７時）により溶離した。合計４
７個の５１ｎｔＩＩ！ｌ１分を果めそしてＢ、　５ｕｂ
ｔｉＨａについてアッセイした。活性画分２５〜３７を
集めそしてＷａｔｅｒｓ　Ｐｒｏｔｅｉ％Ａｎａｌｙｓ
ｉカラムｌ−１２５、溶離液として１ｒｎｔ／分の皿速
で０．２．ｉリスアセテート（ｐＨ７，０）並に２６０
％慣のＩＪＶ検出器を用いて分析用ゲル濾過／Ｅ　Ｐ　
Ｌ　Ｃにかけた。これらの条件下、クロマトグラムは８
．３分間の保持時間で単一のピークを示す。集められた
画分な、又前述の条件を用いる：４電点フォーカシング
及び５ＤＳ−ＰＡＧＥにより均一であると判断した。活
性成分の磯度は、１０ｒｎｔの部分の凍結乾燥及びバッ
ファーＭｍについて補正することにより、４．２５ｍＪ
ｉ／ｒｎｔであると測定された。

【図面の簡単な説明】

第１図は、抗生物質ケダルシジンの紫外線スペクトルな
示す。 特許出願人　　プリストルーマイヤーズ　カンパニー化
　　理　　人　　弁理士　　　斉　藤　武　産量　　　
　弁理士　　川　瀬　良　治 手続補正書 平成１年６月５日 特許庁長官　吉　１）文　毅　殿 １．９件の表示 平成１年特許願第９０９０８号 ２発明の名称 抗腫瘍性抗生物質ケダルシジン ３＠正をする者 事件との関係　　　特許出願人 名称　　ブリストルーマイヤーズ　カンパニー４代理人 別紙のとおり、但し明細書の内容の補正はない。 手続補正書 平成１年６月２２日 特許庁長官　吉　１）文　教　殿 １事件の表示 平成１年特許願第９０９０８号 ２発明の名称 抗腫瘍性抗生物質ケダルシジン ３補正をする者 事件との関係　　　特許出願人 名称　ブリストルーマイヤーズ　カンパニー４、代理人 ／１＼

Claims (8)

【特許請求の範囲】
1. （１）（ａ）外観：淡黄褐色の固体； （ｂ）分子量：ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳
   動法により１２，４００ダルトン；ゲル濾過／ＨＰＬＣ
   法により１７，０００ （ｃ）紫外線スペクトル：第１図に実質的に示されるも
   の （ｄ）等電点：３．６５；並に （ｅ）下記のアミノ酸配列を有するポリペプチドよりな
   る【遺伝子配列があります】 （ただしＸはＨ−ａｌａ−ｓｅｒ，Ｈ−ｓｅｒ及びＨよ
   りなる群から選択される） 抗生物質ケダルシジン（ｋｅｄａｒｃｉｄｉｎ）。
2. （２）液内培養好気性条件下同化可能な炭素及び窒素源
   を含む培地中でＳｔｒｅｐｔｏａｌｌｏｔｅｉｃｈｕｓ
   のケダルシジン生産株を培養し、そして培養したブロス
   から該抗生物質を回収することよりなる抗生物質ケダル
   シジンを製造する方法。
3. （３）該生産株が菌株Ｌ５８５−６、ＡＴＣＣ５３６５
   ０である請求項２記載の方法。
4. （４）微生物Ｓｔｒｅｐｔｏａｌｌｏｔｅｉｃｈｕｓ　
   ｓｐ．ｎｏｖ，菌株Ｌ５８５−６、ＡＴＣＣ５３６５０
   の生物学的に純粋な培養。
5. （５）腫瘍阻止量のケダルシジン及び製薬上許容しうる
   担体を含む製薬組成物。
6. （６）ケダルシジンに対して感受性を有する腫瘍を有す
   る宿主に、有効な腫瘍阻止投与量のケダルシジンを投与
   することよりなる哺乳動物の宿主における該腫瘍の生長
   を阻止する方法。
7. （７）（ａ）液内培養好気性条件下同化可能な炭素及び
   窒素源を含む培地中でＳｔｒｅｐｔｏａｌｌｏｔｅｉｃ
   ｈｕｓのケダルシジン生産株を培養する工程；そして （ｂ）培養したブロスから該抗生物質を回収する工程よ
   りなる方法により製造された抗生物質ケダルシジン。
8. （８）該生産株が菌株Ｌ５８５−６，ＡＴＣＣ５３６５
   ０である請求項７記載の方法により製造された抗生物質
   ケダルシジン。