KR970010137B1

KR970010137B1 - 항종양 항생제 케다르시딘(kedarcidin)

Info

Publication number: KR970010137B1
Application number: KR1019890004782A
Authority: KR
Inventors: 제이. 호프스태드 산드라; 에이. 매트슨 제임스; 에스. 램 킨; 포렌자 살바토르; 에이. 부쉬 제임스; 도미따 고지
Original assignee: 브리스톨-마이어즈 컴페니; 아이삭 자아코브스키
Priority date: 1988-04-12
Filing date: 1989-04-11
Publication date: 1997-06-21
Also published as: IE62912B1; US5001112A; FI93969B; EP0337430A3; PT90252A; FI891710A0; AU3272889A; FI93969C; DK173589A; YU73989A; AU623641B2; PT90252B; PL278782A1; DK174751B1; NO174474C; KR900016469A; JPH01317396A; DE68913063D1; DE68913063T2; JP2850132B2

Abstract

내용없음.

Description

항종양 항생제 케다르시딘(KEDARCIDIN)

첨부된 도면은 항생제 케다르시딘의 UV 스펙트럼.

본 발명은 케다르시딘이라 표시된 항종양 항생재, Streptoalloteichus sp. nov. 균주 L585-6에 의한 그것의 제조방법, 상기 항생제를 함유하는 약제조성물 및 그 항생제에 의한 종양성장을 억제하는 방법에 관한 것이다.

또한 본 발명은 케다르시딘 생성 미생물인 Streptoalloteichus sp. nov. 균주 L585-6(ATCC 53650)에 관한 것이다.

본 발명은 다음과 같이 특징지워진 항종양 항생제 카다르시딘을 제공한다.

(a) 모양 : 담황색 고체

(b) 분자량 : SDS-폴라아크릴아미드겔 전기영동법에 의하여 12,400 dalton, 겔 필터레이션/HPLC 방법에 의하여 17,000 dalton

(c) UV 스팩트럼 : 첨부된 도면에 도시한 것과 실질적으로 같음

(d) 등전점 : 3.65, 그리고

(e) 다음의 아미노산 배열을 가진 폴리펩티드로 이루어짐 :

이며 상기 배열에서 X는 H-ala-ser, H-ser 및 H로 구성된 기로부터 선택된다.

상기에 부여된 물리화학적 특성으로서 본 발명의 항생제는 네오카르지노스타틴(neocarzinostatin), 매크로마이신(macromycin), 라르고마이신(largomycin), 아크티노크산틴(actinoxantin) 및 AN-7D와 같은 항종양 활성을 가진 다른 펩티드 항생제와 구별된다.

또한 본 발명은 침수 호기 조건하에 탄소 및 질소 동화원을 함유한 배지 속에서 Streptoalloteichus의 케다르시딘 생성균주를 배양시키고, 발효액으로부터 상기 단백질을 회수하는 것으로 이루어진 항생제 케다르시딘을 제조하는 방법을 제공한다.

본 발명의 또 다른 일면은 케다르시딘 생성균주인 Streptoalloteichus sp. nov. 균주 L585-6, ATCC 53650를 제공한다.

또한 본 발명의 또 다른 일면은 종양-억제량의 항생제 케다르시딘 및 약리학적 허용 가능한 담체로 구성된 약체 조성물을 제공한다.

본 발명의 또 다른 일면은 종양이 있는 숙주세포에 항생제 케다르시딘의 종양-억제량을 투여하는 것으로 이루어진 종양성장을 억제시키는 방법을 제공한다.

본 발명에서 사용된 다음의 약호는 아미노산 대표하는 것으로 사용된다.

asx : 아스파르트산+아스파라긴 val : 발린

thr : 트레오닌 met : 메티오닌

ser : 세린 Ile : 이소로이신

glx : 글루탐산+글루타민 leu : 로이신

asp : 아스파르트산 tyr : 티로신

asn : 아스파라긴 phe : 페닐알라닌

glu : 글루탐산 his : 히스티딘

gln : 글루타민 lys : 리신

pro : 프롤린 arg : 아르기닌

gly : 글리신 cys : 시스테인

ala : 알라닌 trp : 트립토판

생산균주

균주 L585-6를 인도의 마하라스트라(Maharastra)주에서 수집한 흙시료로부터 분리하였다. 균주 L585-6의 특성을 상세히 기술하면 다음과 같다.

[형태학]

균주 L585-6는 기저 및 공중 균사체를 형성하는 그램 양성 사상체 미생물이다. 기저 균사는 한천을 통과하며 분절화되지 않는다. 직경 5-25㎛인, 균사의 구형 밀집응집체가 융합된 영양 균사와 함께 관찰된다. 이와 같은 공중 균사체는 잘 분지되어 있으며 직선 돌기를 가진 또는 나선형의 긴 균사를 발생시키며, 그 포자는 연속 또는 비연속 사슬로 형성된다. 분지된 단포자 사슬의 밀집더미는 ISP 배지 제5호에서 무성히 형성된다. 포자의 두가지 형태는 비 운동성으로서 난형에서 짧은 관형(0.4-0.6×1.0-2.0㎛)이며 매끈한 표면을 가지고 있다.

5일 배양 후 무색의 풍선유사체(balloon-like bodies)(직경 5-20㎛)가 공중 균사체 위에 단독으로 또는 대량으로 관찰된다. 3주 또는 그 이상의 배양 후, 이와 같은 풍선유사체는 더 확정된 공중균사로 덮힌 황갈색 경화입자(직경 40-100㎛)로 발색된다.

[배양적 특성]

일반적으로 성장이 정상적이지만 짜펙(Czapek)의 질산-당한천, 오우트 밀한천 및 전문-무기염한천 배지 위에서는 매우 양호하지 못하다. 공중균사체가 티로신한천 및 글리세롤-아스파라긴 한천 위에서는 형성되지만, ISP 배지 제2호, 제3호, 제4호 및 제6호 그리고 베네트(Bennett) 한천 위에서는 형성되지 않는다. 공중균사체의 색상은 백황색이다. 흑생의 흑생종 안료가 ISP 배지 제6호 및 제7호에 형성된다. 뚜렷한 다른 안료는 형성되지 않는다. 균주 L585-6의 배양 특성을 표 1에 제시하였다.

1) 3주간 28℃ 항온 배양 후 관찰

2) G=성장; A=공중균사체; S=기저균사체; D=분산안료

3) 괄호의 색상 및 숫자는 ISCC-NBS시를 따름.

[생리학적 특성]

최적 성장이 30-35℃에서 관찰된다.

성장 온도 범위는 18℃-39℃이다.

15℃ 및 41℃에서는 어떠한 성장도 발생되지 않으며, NaCl이 5% 이상 보충된 배지에서도 어떠한 성장도 발생하지 않는다. 젤라틴은 액화되지만 전분은 가수분해 되지 않는다. 25개 당분을 시험한 가운데 D-리보스 및 D-글루코스만이 성장에 유용하다. 생리학적 특성 및 탄수화물 사용을 표 2 및 3에 제시한다.

1. 짜펙 질산당액체비지에서 음성, 질산 펩톤액체배지에서 양성임.

2. 기초배지 프리담-고틀리브(Pridham-Gottlieb) 배지(=ISP 제9호 배지)

* Gordon외, J. Gen, Microb., 1978,109 : 69-78에 기술된 시험임.

[세포벽 화학]

균주 L585-6의 세포벽 조성을 Becker외의 Appl. Microliol. 13 : 236-243(1965), Yamaguchi의 J. Bacteriol. 89 : 444-453(1965) 및 Lechevalier의 Biology of the Actinomycetes and Related Organisms 11 : 78-92(1976)에 기술된 방법에 따라 시험하였다. 상기 세포벽 펩티도글리칸은 meso-디아미노피멜린산을 함유한다. 전체 세포당은 갈락토스, 글루코스 및 리보스를 함유한다. 그러므로, 세포벽 형태는 III 형태에 속한다. 인지질은 포스파티딜에탄올아민, 포스파티딜글리세롤 및 포스파티딜이소시톨을 함유한 P-II 형태이다. 주요 메나키논(menaquinone)은 MK-9(H₄) 및 MK-9(H₆)이다. 글리콜산염 시험은 음성이다.

[분류학]

포자의 긴 사슬을 가진 Antinomycetales속 가운데서, Pseudono-cardia, Saccharopolyspora, Actinopolyspora, Streptomyces, Actinomadura, Glycomyces, Nocardiopsis 및 Amycolata는 세포벽 형태, 세포당 모양, 인지질 및 메나퀴논으로 구성된 세포화학에서 균주 L585-6와 분명히 구별된다. Kibdelosporangium(Shearer외., Int. J. Syst. Bacteriol. 36 : 47-54, 1986), Kitasatosporia(Takahashi외, J. Gen. Appl. Microbiol. 30 : 377-387, 1984) 및 Amycolatopsis(Lechevalier외, Int. J. Syst. Bacteriol. 36 : 29-37, 1986)은 인지질 및 메나퀴논의 조성에 있어서 균주 L585-6에 관련되어 있지만, Kibdelosporangium 및 Amycolatopsis는 세포벽 당에 아라비노스가 존재한다는 점에 있어서 상기 균주와 다르고 Kitasatosporia는 세포벽에 LL-및 meso-디아미노피멜린산 둘다가 존재한다는 점에 있어서 다르다. 추가로, Kibdelosporangium은 진성막을 가진 균사-외포 포자낭-유사체를 생산하고 Kitasatosporia은 침수포자를 형성한다. 이와 같은 독특한 구조가 균주 L585-6에서는 관찰되지 않는다. 화학 분류학적으로, Streptoalloteichus(Tomita외, Int. J. Syst. Bacteriol. 37 : 211-213, 1987), Actinsoynnema(Hasegawa외, Int. J. Syst. Bacteriol. 28 : 304-310, 1978) 및 Saccharothrix(Labeda외, Int. J. Syst. Bacteriol. 34 : 426-431. 1984)가 균주 L585-6(케다르시딘)에 가장 잘 관련되어 있다. Actinosynnema는 속상체(synnema)의 종단으로부터 공중 포자사슬을 형성한다. Saccharothrix는 영양군사체 및 공중균사체 둘 다에 분절된 구상 성분의 사슬을 형성하며 분지된 짧은 포자사슬 더미 또는 경화입자를 형상하지 않는다. Saccharothrix australiensis 및 S.aerocol onigenes(Labeda. Int. J. Syst. Bacteriol. 36 : 109-110, 1986)의 구상 성분 사슬형태는 Nocardiopsis의 형태에 관련되지만 Streptomyces의 어떠한 종류의 종에도 관련되지 않는다. 그러므로, 균주 L585-6(케다르시딘)은 Actinsoynnema나 또는 Saccharothrix에도 속하지 않는다.

Streptoalloteichus hindustanus는 영향 균사체 속에 1-4개의 포자를 편모로 감싸는 소 포자낭 유사체와 더불어 공중균사체 및 균사의 밀집 구성체 내에 분절 포자의 긴 나선형 포자사슬, 분지된 짧은 포자사슬 및 경화 입자를 갖는다. 균주 L585-6는 모든 소포자낭 유사소포를 형성한다. Streptoalloteichus처럼, 균주 L585-6는 경화 입자로 발생되는 풍선유사체를 형성한다. 이와 같은 구조는 S.kanamyceticus(Shisling외, Int. J. Syst. Bacteriol. 22 : 265-394, 1972) 및 S.roseiscleroticus(Chainia rubra)(Shirling외, Int. J. Syst. Bacterial. 22 : 265-394, 1972) 등의 여러 종의 Streptomyces 속에서 발견되었다.

상기 언급된 비교적인 고려를 근거로 해서, 균주 L585-6는 Streptoalloteichus 속으로 분류된다. 균주 L585-6은 ISP 배지 제2호, 제3호 및 제4호 그리고 베네트한천 속으로 공중균사체 형성능력이 결핍, 멜라닌의 형성, 전분 가수분해의 결핍, 41℃에서 성장 결핍 및 시험된 25개 당분 가운데 D-리보드 및 D-글루코스만을 사용하는 능력면에서 Streptoalloteichus hindustanus와 다르다. 따라서 균주 L585-6는 Streptoalloteichus 속의 새로운 종으로 생각된다.

Streptoalloteichus 속의 새로운 종으로 결정된 균주 L585-6의 생물학적 순수 배양체는 The American Type Culture Collection(매릴랜드주, 록빌시 소재)에 기탁되어 미생물 영구 기탁번호 ATCC 제53650호를 부여받았다.

[항생제 생산]

본 발명의 항종양 항생제를 액체 영양 배지속의 침수 조건하에 균주 L585-6 또는 그 변이체를 배양시켜 제조한다. 생산 미생물은 탄소동화원(예, 동화성 탄수화물)을 함유한 영양 배지 속으로 성장된다. 적당한 탄소원에 세레로스와 글리세롤이 포함된다. 영양 배지는 또한 어분, 효모 추출물 또는 암모늄염과 같은 질소동화원을 함유한다. 필요하다면 염화나트륨, 염화칼륨, 황산마그네슘, 탄산칼슘, 인산염 등과 같은 무기염이 첨가된다. 필요하다면 구리, 망간, 철, 아연 등과 같은 미량원소가 배지에 첨가되거나, 배지의 다른 구성물의 불순물로써 존재할 수 있다. 배양 온도는 생성 균주가 성장할 수 있는 어떠한 온도 예, 18℃-39℃일 수 있으나, 25℃-35℃에서 발효시키는 것이 바람직하고 27℃-32℃가 가장 바람직하다. 배지가 중성 pH로 사용되는 것이 바람직하고 항생제의 생산은 일반적으로 약 4-8일의 기간동안 수행된다. 통상적으로, 최적 생산은 약 5-6일 내에 성취된다. 항생제의 상대적 소량 제조에는 진탕 플라스크 및 표면배양이 사용될 수 있지만, 대량 제조에는 무균 탱크에서의 침수호기성 배양이 바람직하다. 탱크 발효가 수행될 때, 미생물의 포자를 영양배지에 접종시켜 영양 접종원을 얻는 것이 바람직하고, 활성의 영양상태 접종물이 얻어질 때 접종물을 무균적으로 발효 탱크 배지에 접종한다. 또한 기계적 임펠러(impeller)에 의하여 교반이 제공될 수 있다. 돼지 기름 또는 실리콘 오일과 같은 소포제가 또한 필요하다면 첨가될 수 있다.

발효배지 내 항생제 케다르시딘의 제조는 발효의 경과동안 시험 미생물로써 Bacillus subtilis를 사용한 항미생물 시험 또는 쥐(B16-f10) 또는 사람(예, HCT-116, KB)의 종양 세포주를 사용한 세포독성시험에 의하여 쉽게 알 수 있다.

본 발명은 상기에 기재된, 구체적으로 바람직한 균주 L585-6의 사용 또는 상기 기술에 완전히 일치하는 미생물에 국한되지 않는다. 구체적으로 본 발명은 다른 케다르시딘 생성 균주 또는 X-선 방사, 자외선방사, 질소원자 머스타드처리, 파지노출 및 그 유사한 것과 같은 종래 수단에 의하여 제조될 수 있는 상기 미생물의 변이체를 포함한다.

[항생체의 분리 및 정제]

본 발명의 항종양 단백질은 투석, 울트라필트레이션, 겔필트레이션, 등전침전, 염출, 전기영동, 이온교환 크로마토그래피 및 친화성 크로마토그래피와 같은 단백질 분리를 위한 종래의 계통적 분류법으로부터 분리될 수 있다. 일반적으로 이와 같은 일련의 기술의 조합은 상기 단백질을 확실히 균질하게 정제하는데 이용된다.

분리 및 정제방법은 B. subtilis와 같은 미생물 시험, 쥐 또는 사람의 암세포주에 대한 시험관 내 세포독성 시험, 체내 항종양시험에 의하여, 또는 UV 또는 HPLC 기술과 같은 물리적 방법에 의하여 검사되고 인도될 수 있다. 도표 1은 전형적인 분리 정제순서를 도시하고 있다. 이와 같은 구체적 순서는 예시 목적만으로 제공되면 상기 단백질이 고순도로 얻어지고 생물학적 활성을 보유하는 한 선행기술 숙련자에 의하여 다른 방법을 이용한 다른 순서도 또한 사용될 수 있다는 것이 확인될 것이다.

[도표 1]

단백질의 분리 및 정제

도표 1에 대하여 상세히 설명하면, 전체 발효액의 불용성 물질이 원심분리 또는 여과와 같은 종래 방법을 이용하여 제거된다. 미 배지가 여과될 때 디칼리트(Dicalite)와 같은 여과보조제 사용이 바람직할 것이다. 그 후 용출액으로써 pH 7-8의 양이온 완충액을 사용하여 여과물을 음이온 교환 크로마트그래피시키고 염화나트륨을 함유한 동일한 완충액으로 더 용출시킨다. 이와 같은 pH 범위의 적합한 양이온 완충액을 예를 들어 Tris HCl이다. NaCl-함유 완충액으로써 용출된 분획을 모아 농축시키고 동일한 양이온 완충액을 사용한 겔여과 크로마트그래피에 의하여 더 정제시킨다. 분획을 수집하여 활성 성분의 존재에 대하여 시험한다. 용출액을 검사하기 위한 적합한 최초 계는 Bacillus subtilis에 대하여 시험하는 것이다. 억제 영역을 나타내는 분획을 섞어 농축시키고 pH 7-8의 양이온 완충액을 최초의 용출액으로 사용하는 음이온 교환 크로마토그래피에 의하여 더 정제시키고 이온세기의 선형기울기를 증가시키면서 계속한다. 활성 분획을 도데실 황산나트륨-폴리아크릴아미드 겔 전기영동(SDS-PAGE), 동전집중 및 HPLC에 의하여 균질성에 대하여 검사한다. 균질하다고 판단된 분획을 섞어 냉동건조하여 활성단백질을 얻는다.

[항생제]

케다르시딘은 단일 사슬 폴리펩티드 및 비단백질 발색단으로 된 강력한 단백질 항종양 항생제이다. 물리 화학적 특성 및 생물학적 시험을 위하여 제시된 항생제의 시료가 SDS-PAGE, 동전집중 및 HPLC에 의하여 균일하다고 판단되었었지만, 연속적인 실험을 거치는 동안 항생제가 한가지 주요 변종 및 1-2개의 약간 다른 변종으로 구성되었다는 것이 발견되었다. 상기 변종들은 다음에 기술될 폴리펩티드의 최초 N-말단기 아미노산 배열이 다르다. 항종양 활성을 위하여 각 변종의 분리 또는 정제는 필요치 않다.

본 발명은 또한 항생제의 펩티드 부분이 그 단편 및 유도체를 생산하도록 공지이 선행기술, 즉 본 발명에 기술된 항생제의 항종양 활성을 실질적으로 변경함이 없이 상기 펩티드의 일차 구조를 따라 어떤 아미노산의 삭제, 부가 또는 치환에 의하여 변경될 수 있는 케다르시딘의 변종을 포함한다.

[아미노산 조성]

선행기술에 잘 알려진 표준 방법을 이용하여, 정제된 단백질의 아미노산 조성이 검사되었고 표 4에 제시한다.

(a) 펩티드의 분자량 12,000이라는 가정하에 펩티드당 잔기수

(b) 총잔기가 114개라는 가정하에 펩티드당 잔기수. 괄호안의 수치는 아미노산 배열 분석에 의하여 측정된 펩티당 잔기수를 나타낸다.

[아미노산 배열]

아미노 말단기 배열 분석을 위하여, 케다르시딘이 2-머갚토에탄올로써 환원되고 SDS-PAGE(15% 아크릴아미드)에 의하여 더 정제되며 전기용출 또는 전기 블라팅(electro blotting)에 의하여 겔로부터 회수되었다.

대부분의 효소적인 분해를 위하여, 케다르시딘을 더 이상의 정제없이 사용되었다.

게다르시딘을 6M의 구아니딘 HCI, 0.1% Na₂EDTA를 함유한 pH 8.5의 0.4M Tris-HCI 완충액 100μl 속의 20mM의 디티오트레이톨로써 50℃에서 2시간 동안 환원시켰고 이어 상온에서 밤새 100mM의 4-비닐피리딘으로써 S-피리딜에틸화시켰다. 상기 반응은 50℃에서 1시간동안 2-머갚토에탄올 10μl를 첨가하여 정지시켰다. 24시간동안 5%(v/v)의 초산에 대한 투석에 의하여 시약을 제거하고, 이어 변형된 케다르시딘을 스피드백(Speedvac) 원심분리 농축기(Savant Instru-ments) 속에서 건조시켰다.

ASP-N 효소 또는 S.aureus V8 프로테아제에 의한 S-피리딜에틸화된 케다르시딘의 효소 분해를 0.7M 요소를 함유한 pH 8.0의 0.1M Tris-초산 완충액 40μl 속에서 효소/기질 비 1 : 100(ASP-N) 또는 1 : 10(V8 프로테아제)으로써 밤새도록 37℃에서 수행하였다. pH 8.0의 0.1M Tris-초산 완충액 40μl 속에서 효소/기질 비 1 : 20으로서 37℃에서 트립신 절단이 밤새 수행되었다. 효소 절단체가 트리플루오로초산(TFA)으로서 pH 2.0으로 산성화되고 역상 HPLC에 의하여 분리되었다.

역상 HPLC에 의한 펩티드 정체가 RP-300 컬럼(2.1×100mm : Applied Biosystems, Inc.)을 사용하는 모델 130A 분리기(Applied Biosystems, Inc.)를 사용하여 40℃에서 수행되었고, 용출을 위하여 출발 완충액으로써 아세토니트릴이 선형기울기로 증가하는 0.1% TFA 수용액이 사용되었고, 제한 완충액으로써 0.085% TFA를 함유한 60% 아세토니트릴이 사용되었다. 펩티드를 수동으로 수집하였다. 아미노산 배열측정은 표준 기술을 이용한 자동 아미노산 배열기(모델 475A, Applied Biosystems, Inc.)를 이용하여 수행되었다.

주요 변종 폴리펩티드는 114개의 아미노산 잔기로 구성된다. 아미노산 배열이 다음과 같이 측정된다.

N-말단기

C-말단기

[분자량 측정]

(a) 겔여과/HPLC 방법에 의한 측정

TSK-G2000SW 컬럼(7.5×300mm)(LKB Produkter AB, sweden)을 이용하여 유체 속도 0.5ml/min에서 0.5M NaCl를 함유한 50mM Tris HCl 완충액(pH 7.4)을 사용하여 겔여과시킨다. 다른 방도로서, 유체속도 1ml/min에서 용출액으로 0.2M Tris 아세테이트를 사용한 Waters Associates 단백질 분석 컬럼 I-125가 이용될 수 있다. 분자량은 기준 분자량 표시자(Bio Red Laboratories)로부터 얻어진 참조 곡선으로부터 17,000dal임이 평가된다.

(b) 도데실 황산나트륨-폴리아크릴아미드 겔 전기영동방법.

단백질 및 분자량 표지사(Diversified Biotech, Maine으로부터 구입)의 시료를 동일부피의 세프라졸(Seprasol)(당 및 추적 염료를 함유한 조제 단백질 가용화 용액)과 혼합하여 전기영동 바로전에 90℃에서 3분간 가열시킨다. 추적염료가 겔 아래면에 도달될 때까지 세프라버프(Seprabuff)(Tris-글리신-SDS, pH 8.3)에서 300V로 전기영동시킨다. 그 후 적어도 10시간 동안 착색용액(메탄올 수용액 908ml 내의 1.25g의 Comassie BB R-250, 92ml의 빙초산) 속에 겔을 담그고, 그리고 나서 겔의 배경이 투명하게 될 때까지 탈색용액(75ml의 초산 및 물 875ml, 메탄올 50ml)에 담근다. 세프라졸 및 세프라버프를 Integrated Separation System사(마사츄세츠(Massachusetts) 소재)로부터 구입하였다. 이와 같은 방법에 의하여 분자량은 12,400dal으로 평가된다.

[등전집중]

집중을 위해 사용된 겔은 다음 성분을 혼합하여 제조된다.

29.1% 아크릴아미드 수용액 10ml

0.9% N,N'-메틸렌-bis-아크릴아미드 수용액 10ml

글리세린 7ml

pH 2.5-4의 1802 암폴린(Ampholine) 3ml

물 60ml

으로 맞춘다.

이와 같이 얻어진 용액을 10분간 가스제거시키고 1.5ml의 1%과 황산암모니아수 및 N,N,N',N'-테트라메틸에틸렌 디아민 10μl를 첨가한다. 상기 혼합물을 주입틀에 부어넣고 중합시킨다. 사용된 전해질은 양극에 1M 인산이고 음극에 pH 6-8의 2% 1809 암폴린이다. 집중 실험을 25w 정전력에서 2시간 수행한다. 퍼센트는 부피 내 중량 퍼센트이다. 등전점은 3.65로 측정되며 음극으로부터 이동 거리는 6.25cm이다.

[생물학적 활성]

단백질의 항종양 활성을 쥐의 이식가능한 P388 백혈병에 대하여 평가하였다. 쥐의 상기 이식 가능한 백혈병을 가지고 있는 DBA/2 수여자(donor) 생쥐로부터 얻어진 P388백혈병 세포 10⁶을 CDF₁, 생쥐에게 복강내 또는 정맥 내에 이식시켰다. 복강내-이식된 P388 백혈병에 대하여, 종양 접종한 다음날부터 복강 내에 연속 오일간 매일 한번씩 대조구 생쥐는 식염으로 다른 생쥐는 케다르시딘으로 투여 처리하였다. 정맥 내-이식 내 P388 백혈병에 대하여, 그 생쥐는 이식후 1, 3, 5일에 정맥 내로 케다르시딘 IV가 투여되었다. 이와 같은 동물들을 매일 관찰하였고 그들의 사망이 기록되었다. 약제 독성을 반영하는 수단으로써 모든 그룹에 대하여 평균 체중변화(백혈병 이식일로부터 마지막 처리시까지)가 측정되었다. 약제 독성을 시험하는 추가 수단으로서 종양이식 후 5일 째에 각 그룹의 생쥐 생존율을 기록되었다. 5일 경과시 처리 그룹당 한마리 이상의 생쥐가 죽었다면 어떠한 치료결과도 의미가 없다. 처리 그룹은 4 또는 6 마리의 생쥐로 구성되고 대조구 그룹에는 10 마리의 생쥐가 포함되었다. 어찌되었든 30일(실험의 최종일자)까지 생존한 생쥐의 숫자가 또한 기록되었다. 실험이 끝날 때 각 그룹에 대한 중간 생존시간(MST)이 측정되었고 처리된 그룹의 MST와 대조구 그룹의 MST의 비율에 100을 곱한 값인 % T/C를 계산하도록 사용되었다. 125 또는 그 이상의 % T/C 수치는 중요한 항종양 활성을 나타낸다. 체내 시험 데이타를 표 4 및 5에 나타낸다.

a) 종양 접종 다음날로부터 시작한 연속 5일 동안 매일 한번 복강 내 투여된 약물.

b) 롯트 D18F413으로 대표된 동일 시료를 냉동건소하여 재구성한 제조.

a) 종양 이식 후 1일, 3일 및 5일에 정맥 내 투여된 약물.

케다르시딘은 10% 종양 수질 0.5ml로서 복강 내 이식된 쥐의 B16 흑색종에 대하여서도 평가되었다. 각투여량 수준에 대하여 열마리의 생쥐가 사용되었다. 종양 이식 다음날부터 시작하여 연속 9일 동안 매일 한번 상기 약물이 투여되었다. 10일 및 실험의 끝, 즉 60일에 생존 생쥐수가 기록되었다. 시험결과를 표 6에 나타낸다. 125 또는 그 이상의 %T/C 수치는 중요한 항종양 활성을 나타낸다.

* 괄호내 숫자=종양 이식 후 60일 경과시 생존생쥐수

표 4, 5, 및 6에 제시된 시험결과는 항생제 케다르시딘이 쥐의 백혈병 P388 및 B16 흑색종에 대한 재현성 있는 체내 항종양 활성을 나타내는 강력한 물질이라는 것을 보여준다. 관찰된 활성은 복강 내 이식된 B16 흑색종 및 정맥 내 이식 및 복강 내 이식된 P388에 대한 수명의 증가에 의하여 명백해졌으며 후자는 그 분산성으로 인하여 효과적으로 치료하기에 곤란한 질병 형태를 취했다. 케다르시딘은 또한 피하 이식된 B16 흑색종, M5076 쥐 폐종양 및 두개 내 이식된 P388 백혈병에 대하여 평가되었지만, 이와 같은 동물 모델에 있어서 중요한 활성을 보여주지 않았다.

본 발명은 약리학적으로 허용가능한 담체 또는 희석제와 조합하여 본 발명의 항생제의 종양 억제 유효량을 함유한 악제 조성물을 본 발명의 청구범위에 포함시킨다. 이와 같은 조성물은 또한 다른 활성 항종양제를 함유할 수 있고 필요한 투여경로에 적합한 약제 형태로 만들어질 수 있다. 이와 같은 조성물의 실예는 정, 캡슐, 환, 분말 및 입자와 같은 경구투여용 고체 조성물, 용액, 분산매, 시럽 또는 엘릭시르(elixir)와 같은 경구투여용 액체조성물 및 살균용액, 분산매, 또는 에멀젼과 같은 비경구적 투여용 제제를 포함한다. 그들은 또한 사용전 즉시 살균수, 생리적 식염수 또는 여러가지의 다른 살균된 주사용 매질에 용해될 수 있는 살균 고체상 조성물의 형태로 제조될 수 있다.

항종양제로서 사용에 대하여, 부여된 포유류 숙주에 대한 최적투여량 및 섭생이 선행기술 숙련자에 의하여 쉽게 확인될 수 있다. 물론 실제 사용되는 일회 투여량이 구체적으로 처방된 조성, 투여경로 및 구체적인 부위, 처리될 숙주 및 질병에 따라 변할 것이라는 것이 확인될 것이다. 약물 작용을 변형시키는 많은 인자들은 나이, 체중, 성, 식사, 투여시간, 투여경로, 배설율, 환자의 상태, 약물 조합, 반응 민감성 및 질병의 심각성을 포함하여 설명될 것이다.

본 발명은 본 발명의 청구범위를 국한하는 것으로 의도되지 않는 다음 실시예에 의하여 예시된다.

[실시예 1]

(Streptoalloteichus 균주 L585-6의 영양 배양체 제조)

Streptoalloteichus sp. 균주 L585-6(ATCC 53650)가 보존되었으며 다음 조성으로 이루어진 효모-맥아추출물 한천의 사면 배양 시험관 내로 옮겨졌다.

덱스트로스 4.0g

효모추출물 4.0g

맥아추출물 10.0g

CaCO₃1.5g

한천 15g

증류수 1L

로 맞춘다.

옮긴 후 한천 사면 배양기는 28℃에서 이주일간 배양되었다. 영양 배양체가 표면 성장체를 사면배양기에서 다음 조성의 살균배지 100ml가 넣어진 500ml Erlenmeyer 플라스크로 전이시켜 영양 배양체를 제조하였다.

세레로스(Corn Products) 30g

파르마메디아(Pharmamedia)(Traders Oil Mill Co.) 10g

뉴트리소이(Nutrisoy)(Archer Daniels Midland Co.) 10g

CaCo 3g

증류스 1L

로 맞춘다.

이와 같은 영양 배양체를 250rev/min에 맞춘 회전식 진동기를 이용하여 28℃에서 72시간 배양시켰다.

[실시예 2]

진동플라스크 내 발효

실시예 1의 영양 배양체 5ml를 각각 다음 조성을 가진 제조배지 100ml를 함유한 500ml Erlenmeyer 플라스크로 접종시켰다.

글리세롤 30g

파르마메디아 10g

주정박 증류 영양소(Distiller's solubles)(Nutrition Product Co. 15g

어분(Menhaden) 10g

CaCO 6g

증류수 1L

까지 충분한 량.

제조 배양체를 250rev/min에 맞춘 회전식 진탕기를 이용하여 28℃에서 배양시켰다. 단백질 항생제의 제조를 B. subtilis를 사용한 미생물 시험 및 쥐의 흑생종 세포주 B16-F10 및 사람의 종양세포주를 사용한 시함관 내 세포 독성시험으로써 검사하였다. 일반적으로 최적 생산은 144-168 시간에 도달되었다.

[실시예 3]

탱크내 발효

실시예 1의 영양 배양체 25ml를 동일한 영양 배지 500ml가 담긴 2L 시험관병에 접종시켰다. 두번째 단계의 파종 배양체를 250rev/min에 맞춘 회전식 진탕기를 이용하여 72시간 28℃에서 더 배양시켰다. 두번째 단계의 접종 배양체 500ml를 실시예 2에 주어진 조성을 갖는 생산배지 10L가 담긴 New Brunswick Microgen 발효(공칭부피 16L)에 접종시켰다. 발효 반응을 28℃, 1분당 1일 부피의 통기 및 250rev/min에 맞춘 교반 하에 수행하였다. 항생제 케다르시딘의 제조는 적합한 시험관 내 생물시험으로써 검사되었다.

[실시예 4]

(케다르시딘의 분리 및 정제)

발효액 원료 10L를 디칼리트 6L와 혼합시키고 이와 같이 얻어진 얇은 슬러리를 디칼리트패드를 이용하여 여과시켰다. 불용물을 제거시키고 여과물을 30ml/min의 비율로 Zeta Prep 250 QAE 이온-교환 캐트리지(LKB-Produkter AB, Sweden)를 이용하여 펌프시켰다. 상기 캐트리지는 미리 pH 7.4인 50mM Tris HCl 완충액 2L로 평형시켰다. 용출액을 수집하였다.

캐트리지를 pH 7.4인 50mM Trip-HCl 완충액 1L로 세척시키고 그 후 NaCl 0.5mol을 함유한 pH 7.4인 50mM Tris=HCl 완충액 500ml로써 용출시켰다. 용출액을 수집하고 Amicon YM5 막이 장치된 Amicon 기준 울트라필트레이션 장치(standard ultrafiltration cell)를 사용하여 500ml에서 100ml로 농축시켰다. 농축액을 140ml 의 50mM Tris-HCl 완충액과 울트로겔(Ultrogel) AcA54(LKB-Produkter AB, Sweden) 1400ml로써 채워진, pH 7.4인 50mM Tris-HCl 완충액 5L와 평형된 겔 여과 컬럼(5×100cm)으로 걸러냈다. 충전된 컬럼을 pH 7.4인 50mM Tris-HCl 완충액 2L로 60ml/min으로 용출시켰다. 최초 부분 표분 450ml 다음으로 10ml식 분획을 모으고 각 분획을 B. subtilis에 대하여 시험하였다. 억제 영역(분획 83-133)을 나타내는 분획들을 섞고 그 후 초여과에 의하여 100ml로 농축시켰다. 농축액을 70ml의 50mM Tris-HCl 완축액과 DEAE 트리스아크릴(LKB-Produkter AB, Sweden) 70ml을 현탁시킨 슬러리로 채워진 이욘교환 컬럼(2.5×15cm)으로 걸러냈다.

트리스아크릴층을 미리 컬럼부피 10배의 50mM Tris-HCl 완충액으로 평형시켰다. 충전된 컬럼을 최초로 50mM Tris-HCl 완충액 10컬럼 부피로 용출시키고, 유체속도 60ml/hr에서 100% 50mM Tris-HCl 완충액에서 0.5M NaCl을 함유한 50mM Tris-HCl 완충액 100%로 직선 구매(gradient)가 되도록 300ml을 용출시켰다. 선형기울기(경사=0.1M/hr)에 의하여 이어졌다. 총 47개의 5ml 분획을 수집하여 B. usbtilis에 대하여 시험하였다. 활성 분획(25-37)을 섞고 용출액으로써 유체속도 1ml/min의 pH 7.0인 0.2M Tris 아세테이트를 사용하여 Waters 단백질 분석 컬럼 I-125 및 260nm의 UV 검출기를 이용하여 분석겔여과/HPLC를 수행하였다. 이와 같은 조건 하에, 크로마토그램은 보유시간 8.3분에서 단일 피크를 보여준다. 혼합된 분획들은 또한 이미 기술된 조건을 사용한 등전 집중 및 SDS-PAGE에 의하여 균일함이 판명되었다. 활성 성분의 농도는 10ml 부분표본(aliquot)의 냉동건도 및 완충액중량에 대한 보정에 의하여 4.25mg/ml로 평가되었다.

Claims

다음과 같은 특징지워진 항생제 케다르시딘 : (a) 모양 : 담황색고체, (b) 분자량 : SDS-폴리아크릴아미드겔 전기 영동 방법에 의해 12,400dalton, 겔여과/HPLC 방법에 의해 17,000delton, (c) UV스펙트럼 : 첨부된 도면에 도시된 것과 실질적으로 같으며, (d) 등전점 : 3.65이고, (e) 다음의 아미노산 배열을 가진 폴리 펩티드로 구성됨.

이며 상기 배열에서 X는 H-ala-ser, H-ser 및 H로 구성되는 구룹으로부터 선택됨.
첨수 호기 조건 하에 탄소 및 질소 동화원을 함유하는 배지에서 Streptoalloteichus에 속하는 균주 L585-6, ATCC 53650를 배양시키고, 배양액으로부터 상기 항생제를 회수하는 것으로 이루어지는 항생제 케다르시딘의 제조방법.
미생물 Streptoalloteichus sp. nov., 균주 L585-6, ATCC 53650.
케다르시딘의 종양 억제량 및 약제학적으로 허용가능한 담체로 이루어지는
다음 단계로 이루어진 방법에 의하여 제조되는 항생제 케다르시딘; a. 침수 호기 조건 하에 탄소 및 질소동화원을 함유하는 배지에서 Streptoalloteichus에 속하는 L585-6, ATCC 53650를 배양하는 단계와 b. 배양액으로부터 상기 항생제를 회수하는 단계.