NO174474B - Fremgangsmaate til fremstilling av et antibiotisk kedarcidin, samt en biologisk ren kultur av streptoalloteichus L585-6, ATCC 53650 - Google Patents
Fremgangsmaate til fremstilling av et antibiotisk kedarcidin, samt en biologisk ren kultur av streptoalloteichus L585-6, ATCC 53650 Download PDFInfo
- Publication number
- NO174474B NO174474B NO891462A NO891462A NO174474B NO 174474 B NO174474 B NO 174474B NO 891462 A NO891462 A NO 891462A NO 891462 A NO891462 A NO 891462A NO 174474 B NO174474 B NO 174474B
- Authority
- NO
- Norway
- Prior art keywords
- gly
- ala
- val
- ser
- thr
- Prior art date
Links
- RSXFZXJOBQZOOM-WXIIGEIKSA-N kedarcidin Chemical compound O([C@@H]\1COC(=O)C[C@H](C2=CC=C(C(=N2)Cl)O[C@@H]2[C@H](O[C@@H]3O[C@@H](C)[C@H](O)[C@](C)(O)C3)[C@]34O[C@H]3C#C/C=C/1C#CC4=C2)NC(=O)C=1C(O)=CC2=CC(OC(C)C)=C(C(=C2C=1)OC)OC)[C@H]1C[C@H](O)[C@H](N(C)C)[C@H](C)O1 RSXFZXJOBQZOOM-WXIIGEIKSA-N 0.000 title claims abstract description 21
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 title claims abstract description 18
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 26
- 241000203615 Streptoalloteichus Species 0.000 title claims description 11
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title description 3
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 title description 2
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims abstract description 9
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims abstract description 7
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims abstract description 6
- 239000002609 medium Substances 0.000 claims description 19
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 12
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 claims description 9
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 claims description 9
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 claims description 8
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 238000000926 separation method Methods 0.000 claims description 6
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 claims description 5
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 238000001641 gel filtration chromatography Methods 0.000 claims description 3
- 244000005700 microbiome Species 0.000 claims description 3
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 238000002211 ultraviolet spectrum Methods 0.000 claims description 3
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 2
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 claims description 2
- 239000007787 solid Substances 0.000 claims description 2
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 claims 1
- POTCZYQVVNXUIG-BQBZGAKWSA-N Asp-Gly-Pro Chemical compound OC(=O)C[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N1CCC[C@H]1C(O)=O POTCZYQVVNXUIG-BQBZGAKWSA-N 0.000 claims 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 abstract description 13
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 abstract description 13
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 abstract description 3
- 239000003972 antineoplastic antibiotic Substances 0.000 abstract description 3
- 241000178647 Streptoalloteichus sp. Species 0.000 abstract description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 24
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 15
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 14
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 13
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 11
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 11
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 10
- 235000002639 sodium chloride Nutrition 0.000 description 10
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 8
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 8
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 description 8
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 8
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 7
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 7
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 7
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 7
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 description 6
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 6
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 6
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 6
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 6
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 5
- PYMYPHUHKUWMLA-LMVFSUKVSA-N aldehydo-D-ribose Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-LMVFSUKVSA-N 0.000 description 5
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 description 5
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 5
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 5
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 5
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 5
- 241000894007 species Species 0.000 description 5
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 5
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 4
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 4
- 150000001768 cations Chemical class 0.000 description 4
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 4
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 4
- 230000002784 sclerotic effect Effects 0.000 description 4
- 241000123663 Actinosynnema Species 0.000 description 3
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 3
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 3
- 208000001382 Experimental Melanoma Diseases 0.000 description 3
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 3
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000203790 Kibdelosporangium Species 0.000 description 3
- 241000204057 Kitasatospora Species 0.000 description 3
- 241000204098 Saccharothrix Species 0.000 description 3
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 3
- 241000187747 Streptomyces Species 0.000 description 3
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N Trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N arabinose Natural products OCC(O)C(O)C(O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N beta-D-Pyranose-Lyxose Natural products OC1COC(O)C(O)C1O SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 3
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 238000002513 implantation Methods 0.000 description 3
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 3
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 3
- 238000001155 isoelectric focusing Methods 0.000 description 3
- 150000003904 phospholipids Chemical class 0.000 description 3
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 3
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 3
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 3
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 3
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 3
- 235000019143 vitamin K2 Nutrition 0.000 description 3
- 239000011728 vitamin K2 Substances 0.000 description 3
- HYPYXGZDOYTYDR-HAJWAVTHSA-N 2-methyl-3-[(2e,6e,10e,14e)-3,7,11,15,19-pentamethylicosa-2,6,10,14,18-pentaenyl]naphthalene-1,4-dione Chemical compound C1=CC=C2C(=O)C(C/C=C(C)/CC/C=C(C)/CC/C=C(C)/CC/C=C(C)/CCC=C(C)C)=C(C)C(=O)C2=C1 HYPYXGZDOYTYDR-HAJWAVTHSA-N 0.000 description 2
- 241000187643 Amycolatopsis Species 0.000 description 2
- 244000063299 Bacillus subtilis Species 0.000 description 2
- VTYYLEPIZMXCLO-UHFFFAOYSA-L Calcium carbonate Chemical compound [Ca+2].[O-]C([O-])=O VTYYLEPIZMXCLO-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 208000030453 Drug-Related Side Effects and Adverse reaction Diseases 0.000 description 2
- 108010051815 Glutamyl endopeptidase Proteins 0.000 description 2
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 2
- XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N Iron Chemical compound [Fe] XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 2
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 2
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 2
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 2
- CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L Magnesium sulfate Chemical compound [Mg+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- XUMBMVFBXHLACL-UHFFFAOYSA-N Melanin Chemical compound O=C1C(=O)C(C2=CNC3=C(C(C(=O)C4=C32)=O)C)=C2C4=CNC2=C1C XUMBMVFBXHLACL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- KWYHDKDOAIKMQN-UHFFFAOYSA-N N,N,N',N'-tetramethylethylenediamine Chemical compound CN(C)CCN(C)C KWYHDKDOAIKMQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000203622 Nocardiopsis Species 0.000 description 2
- WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M Potassium chloride Chemical compound [Cl-].[K+] WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 241000187603 Pseudonocardia Species 0.000 description 2
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000203644 Streptoalloteichus hindustanus Species 0.000 description 2
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 2
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 2
- 206010070863 Toxicity to various agents Diseases 0.000 description 2
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Chemical compound CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 125000003295 alanine group Chemical group N[C@@H](C)C(=O)* 0.000 description 2
- ROOXNKNUYICQNP-UHFFFAOYSA-N ammonium persulfate Chemical compound [NH4+].[NH4+].[O-]S(=O)(=O)OOS([O-])(=O)=O ROOXNKNUYICQNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 238000005571 anion exchange chromatography Methods 0.000 description 2
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 2
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 2
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 2
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 2
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 2
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 2
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 2
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 2
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 2
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 2
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 2
- 238000005342 ion exchange Methods 0.000 description 2
- 201000001441 melanoma Diseases 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- 239000000049 pigment Substances 0.000 description 2
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 2
- 239000013587 production medium Substances 0.000 description 2
- 239000000700 radioactive tracer Substances 0.000 description 2
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 2
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 2
- 239000002002 slurry Substances 0.000 description 2
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 2
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 2
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 2
- PIEPQKCYPFFYMG-UHFFFAOYSA-N tris acetate Chemical compound CC(O)=O.OCC(N)(CO)CO PIEPQKCYPFFYMG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229940041603 vitamin k 3 Drugs 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000003643 water by type Substances 0.000 description 2
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- GMKMEZVLHJARHF-UHFFFAOYSA-N (2R,6R)-form-2.6-Diaminoheptanedioic acid Natural products OC(=O)C(N)CCCC(N)C(O)=O GMKMEZVLHJARHF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UQZSVIGPZAULMV-DKWTVANSSA-N (2s)-2,4-diamino-4-oxobutanoic acid;propane-1,2,3-triol Chemical compound OCC(O)CO.OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O UQZSVIGPZAULMV-DKWTVANSSA-N 0.000 description 1
- XIFDBACLRPLVEQ-BXRBKJIMSA-N (2s)-2-aminobutanedioic acid;(2s)-2,4-diamino-4-oxobutanoic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O.OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O XIFDBACLRPLVEQ-BXRBKJIMSA-N 0.000 description 1
- KFDVPJUYSDEJTH-UHFFFAOYSA-N 4-ethenylpyridine Chemical compound C=CC1=CC=NC=C1 KFDVPJUYSDEJTH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N Acrylamide Chemical compound NC(=O)C=C HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000187362 Actinomadura Species 0.000 description 1
- 241000203809 Actinomycetales Species 0.000 description 1
- 241000187619 Actinopolyspora Species 0.000 description 1
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N Copper Chemical compound [Cu] RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101000972324 Cynodon dactylon Leaf protein Proteins 0.000 description 1
- HMFHBZSHGGEWLO-SOOFDHNKSA-N D-ribofuranose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H]1O HMFHBZSHGGEWLO-SOOFDHNKSA-N 0.000 description 1
- 238000011765 DBA/2 mouse Methods 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000019733 Fish meal Nutrition 0.000 description 1
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 1
- JZNWSCPGTDBMEW-UHFFFAOYSA-N Glycerophosphorylethanolamin Natural products NCCOP(O)(=O)OCC(O)CO JZNWSCPGTDBMEW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- AEMRFAOFKBGASW-UHFFFAOYSA-M Glycolate Chemical compound OCC([O-])=O AEMRFAOFKBGASW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 241000592889 Glycomyces Species 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 241000108463 Hygrophila <snail> Species 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- 241000970318 Lechevalieria aerocolonigenes Species 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 1
- 241000544912 Melanoides Species 0.000 description 1
- UEZVMMHDMIWARA-UHFFFAOYSA-N Metaphosphoric acid Chemical compound OP(=O)=O UEZVMMHDMIWARA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- MSFSPUZXLOGKHJ-UHFFFAOYSA-N Muraminsaeure Natural products OC(=O)C(C)OC1C(N)C(O)OC(CO)C1O MSFSPUZXLOGKHJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000001429 N-terminal alpha-amino-acid group Chemical group 0.000 description 1
- 229910002651 NO3 Inorganic materials 0.000 description 1
- 101710204212 Neocarzinostatin Proteins 0.000 description 1
- NHNBFGGVMKEFGY-UHFFFAOYSA-N Nitrate Chemical compound [O-][N+]([O-])=O NHNBFGGVMKEFGY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 108010013639 Peptidoglycan Proteins 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000204094 Saccharothrix australiensis Species 0.000 description 1
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 1
- 241000187132 Streptomyces kanamyceticus Species 0.000 description 1
- 241000187309 Streptomyces roseiscleroticus Species 0.000 description 1
- 241001646644 Streptomyces ruber Species 0.000 description 1
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 1
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 1
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N Zinc Chemical compound [Zn] HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ATBOMIWRCZXYSZ-XZBBILGWSA-N [1-[2,3-dihydroxypropoxy(hydroxy)phosphoryl]oxy-3-hexadecanoyloxypropan-2-yl] (9e,12e)-octadeca-9,12-dienoate Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OCC(COP(O)(=O)OCC(O)CO)OC(=O)CCCCCCC\C=C\C\C=C\CCCCC ATBOMIWRCZXYSZ-XZBBILGWSA-N 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 1
- 238000005273 aeration Methods 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 1
- HMFHBZSHGGEWLO-UHFFFAOYSA-N alpha-D-Furanose-Ribose Natural products OCC1OC(O)C(O)C1O HMFHBZSHGGEWLO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-PHYPRBDBSA-N alpha-D-galactose Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-PHYPRBDBSA-N 0.000 description 1
- AWUCVROLDVIAJX-UHFFFAOYSA-N alpha-glycerophosphate Natural products OCC(O)COP(O)(O)=O AWUCVROLDVIAJX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000003277 amino acid sequence analysis Methods 0.000 description 1
- 229910001870 ammonium persulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000003863 ammonium salts Chemical class 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 230000000845 anti-microbial effect Effects 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 239000002518 antifoaming agent Substances 0.000 description 1
- 239000004599 antimicrobial Substances 0.000 description 1
- PYMYPHUHKUWMLA-WDCZJNDASA-N arabinose Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-WDCZJNDASA-N 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 1
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 1
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 239000007613 bennett's agar Substances 0.000 description 1
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 1
- 244000309464 bull Species 0.000 description 1
- 229910000019 calcium carbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000010216 calcium carbonate Nutrition 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 1
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 1
- 230000025938 carbohydrate utilization Effects 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 239000000356 contaminant Substances 0.000 description 1
- 229910052802 copper Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010949 copper Substances 0.000 description 1
- 238000012937 correction Methods 0.000 description 1
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 1
- 230000034994 death Effects 0.000 description 1
- 231100000517 death Toxicity 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 1
- 230000007515 enzymatic degradation Effects 0.000 description 1
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 239000004467 fishmeal Substances 0.000 description 1
- 210000003495 flagella Anatomy 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 1
- 229930182830 galactose Natural products 0.000 description 1
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 1
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 1
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 1
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 229960004198 guanidine Drugs 0.000 description 1
- PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N guanidinium chloride Chemical compound [Cl-].NC(N)=[NH2+] PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000005917 in vivo anti-tumor Effects 0.000 description 1
- 229910052500 inorganic mineral Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002198 insoluble material Substances 0.000 description 1
- 238000009413 insulation Methods 0.000 description 1
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 229910052742 iron Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000002093 isoelectric focusing polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 208000020816 lung neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 208000037841 lung tumor Diseases 0.000 description 1
- 108700030388 macromomycin Proteins 0.000 description 1
- HXKWEZFTHHFQMB-UHFFFAOYSA-N macromomycin b Chemical compound O1C(=C)C(=O)NC2=C1C=C(OC)C=C2C(=O)OC HXKWEZFTHHFQMB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052943 magnesium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019341 magnesium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- WPBNNNQJVZRUHP-UHFFFAOYSA-L manganese(2+);methyl n-[[2-(methoxycarbonylcarbamothioylamino)phenyl]carbamothioyl]carbamate;n-[2-(sulfidocarbothioylamino)ethyl]carbamodithioate Chemical compound [Mn+2].[S-]C(=S)NCCNC([S-])=S.COC(=O)NC(=S)NC1=CC=CC=C1NC(=S)NC(=O)OC WPBNNNQJVZRUHP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 125000000695 menaquinone group Chemical group 0.000 description 1
- GMKMEZVLHJARHF-SYDPRGILSA-N meso-2,6-diaminopimelic acid Chemical compound [O-]C(=O)[C@@H]([NH3+])CCC[C@@H]([NH3+])C([O-])=O GMKMEZVLHJARHF-SYDPRGILSA-N 0.000 description 1
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 1
- 239000000693 micelle Substances 0.000 description 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 1
- 238000013048 microbiological method Methods 0.000 description 1
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 1
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 1
- 235000010755 mineral Nutrition 0.000 description 1
- 239000011707 mineral Substances 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- QZGIWPZCWHMVQL-UIYAJPBUSA-N neocarzinostatin chromophore Chemical compound O1[C@H](C)[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](NC)[C@H]1O[C@@H]1C/2=C/C#C[C@H]3O[C@@]3([C@@H]3OC(=O)OC3)C#CC\2=C[C@H]1OC(=O)C1=C(O)C=CC2=C(C)C=C(OC)C=C12 QZGIWPZCWHMVQL-UIYAJPBUSA-N 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 239000006877 oatmeal agar Substances 0.000 description 1
- NAHBVNMACPIHAH-HLICZWCASA-N p-ii Chemical compound C([C@H]1C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@H](C(N[C@H]2CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](CC=3C=CC=CC=3)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)NC2=O)C(=O)N[C@@H](CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@@H](C(=O)N1)NC(=O)[C@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@@H](N)CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(N)=O)=O)C(C)C)C1=CC=CC=C1 NAHBVNMACPIHAH-HLICZWCASA-N 0.000 description 1
- 238000005325 percolation Methods 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000021317 phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 150000008104 phosphatidylethanolamines Chemical class 0.000 description 1
- 150000003905 phosphatidylinositols Chemical class 0.000 description 1
- 150000003013 phosphoric acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 238000000053 physical method Methods 0.000 description 1
- 238000013379 physicochemical characterization Methods 0.000 description 1
- 239000003910 polypeptide antibiotic agent Substances 0.000 description 1
- 239000001103 potassium chloride Substances 0.000 description 1
- 235000011164 potassium chloride Nutrition 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- 239000000376 reactant Substances 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 238000005185 salting out Methods 0.000 description 1
- 238000011218 seed culture Methods 0.000 description 1
- 229920002545 silicone oil Polymers 0.000 description 1
- 239000002689 soil Substances 0.000 description 1
- 239000012192 staining solution Substances 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- FQIYBGJSPWHUQN-UHFFFAOYSA-N sulfanyloxymethane Chemical compound COS FQIYBGJSPWHUQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- WROMPOXWARCANT-UHFFFAOYSA-N tfa trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F.OC(=O)C(F)(F)F WROMPOXWARCANT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 239000011573 trace mineral Substances 0.000 description 1
- 235000013619 trace mineral Nutrition 0.000 description 1
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 1
- 241001446247 uncultured actinomycete Species 0.000 description 1
- 239000004474 valine Substances 0.000 description 1
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 1
- 239000011701 zinc Substances 0.000 description 1
- 229910052725 zinc Inorganic materials 0.000 description 1
- 229950009268 zinostatin Drugs 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
- C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
- C07K14/36—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Actinomyces; from Streptomyces (G)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Virology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Pyrane Compounds (AREA)
- Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
- Medicinal Preparation (AREA)
Description
Den foreliggende oppfinnelse vedrører fremgangsmåte til
fremstilling av antibiotisk kedarcidin med følgende kjennetegn:
(a) utseende: brungult faststoff,
(b) molekylvekt: 12.400 dalton ved
SDS-polyakrylamidgel-elektroforesemetoden, 17.000 ved gelfiltrering/høytrykksvæskekromatografimetoden,
(c) UV-spektrum: stort sett som vist i fig. 1,
(d) isoelektrisk punkt: 3,65, og
(e) omfattende et polypeptid med følgende aminosyresekvens:
Oppfinnelsen vedrører også en biologisk ren kultur av
mikroorganismen Streptoal1oteichus L585-6, ATTC 53650.
Ovennevnte fysikalsk-kjemiske kjennetegn atskiller kedarcidin fra andre kjente peptidantibiotika med antitumor-aktivitet, såsom neocarzinostatin, macromomycin, largomycin, antinoxantin og AN-7D.
Fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen til fremstilling av det antibiotiske kedarcidin kjennetegnes ved at en kedarcidin-produserende Streptoalloteichusstamme med egenskaper som sp. nov., stamme L585-6, ATCC 53650, eller mutanter derav med i alt vesentlig samme biokjemiske og morfologiske egenskaper som opphavsstammen dyrkes i et medium som inneholder assimilerbare karbon- og nitrogenkiIder under submerse, aerobe betingelser, og at antibiotikumet utvinnes fra dyrkningsmediet ved hjelp av konvensjonelle separeringsmetoder.
Til anvendelse ved fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen er det også frembrakt en kedarcidin-produserende stamme av Streptoalloteichus kjennetegnet ved at den er sp. nov. stamme L585-6, ATCC 53650.
Fig. 1 viser et UV-spektrum for det antibiotiske kedarcidin. Følgende forkortelser anvendes her for aminosyrer:
asx: asparaginsyre-asparagin
thr: treonin
ser: serin
glx: glutaminsyre+glutamin
asp: asparaginsyre
asn: asparagin
glu: glutaminsyre
gin: glutamin
pro: prolin
gly: glycin
ala: alanin
val: valin
met: metionin
ile: isoleucin
leu: leucin
tyr: tyrosin
phe: fenylalanin
his: histidin
lys: lysin
arg: arginin
cys: cystein
trp: tryptofan
Stamme L585-6 ble isolert fra en jordprøve innsamlet i staten Maharastra i India. Kjennetegn for stamme L585-6 er beskrevet nedenfor i detalj.
Morfologi
Stamme 585-6 er en grampositiv, trådformet organisme, som danner substrat og luftmycelier. Myceliumsubstratet trenger gjennom agaren og fragmenteres ikke. Det iakttas kuleformede, tette aggregater av hyfer med en diameter på 5-25 ^im, sammen med sammenvokste vegetative hyfer. Luftmyceliet er temmelig forgrenet og utvikler utforgrenete dreiende eller spiralformete lange hyfer, hvori sporer dannes i kontinuerlig eller diskontinuerlig kjede. Tette klynger av forgrenede korte sporekjeder dannes overveiende i ISP-medium nr. 5. Begge typer sporer er ovale til kort-sylindriske (0,4-0,6 um x 1,0-2,0 |im) , er ubevegelige og har glatt overflate.
Fargeløse, ballongliknende legemer (5-20 um i diameter) ble iakttatt enkeltvis eller i samling på luftmyceliet etter inkubering i 5-10 dager. Etter inkubering i 3 uker eller mer utvikles disse ballongliknende legemer til gulaktig-brune, sklerotiske korn (40-100 |im i diameter), som dekkes med ytterligere, for-lengede lufthyfer.
Veksten er vanligvis moderat, men er meget dårlig på Czapek's sakkarose-nitratagar, havremel-agar og mineralsalter-stivelse-agar. Luftmyceliet dannes på tyrosin-agar og glycerol-asparagin-agar, men ikke på ISP-medier nr. 2, 3, 4 og 6 og Bennett's agar. Luftmyceliets farge er gulaktig-hvit. Svarte melanoide pigmenter dannes i ISP-medier nr. 6 og 7. Andre tydelige pigmenter dannes ikke. Dyrkningsmessige karakteristika for stamme L585-6 er vist i tabell I.
Fysiologiske karakteristika
Optimal vekst iakktas ved 30-35°C. Temperaturområdet for vekst er 18-39°C. Det forekommer ingen vekst ved 15 og 41°C, og ingen vekst forekommer på medier supplert med mer enn 5% NaCl. Gelatin blir flytende, men stivelse hydrolyseres ikke. Blant 25 forsøkte sukkerarter anvendes kun D-ribose og D-glukose til vekst. De fysiologiske karakteristika og karbohydratutnyttelsen er vist i tabell II og III.
Ce1leveggkj emi
Cellevegginnholdet hos stamme L585-6 ble undersøkt ved fremgangsmåtene som er beskrevet av Becker et al., i Appl. Microbiol., Vol 13, p. 236-243, (1965), av Yamaguchi i J. Bacteriol., Vol 89, p. 444-453, (1965) og av Lechevalier og Lechevalier i Biology of the Actinomycetes and Related Organisms, Vol 11, p. 78-92, (1976). Cellevegg-peptidoglykan inneholder meso-deaminopimelinsyre. Helcelle-sukkerarter omfatter galaktose, glukose og ribose. Typen cellevegg hører således til type III^,. Fosfolipider er type P-II som inneholder fosfatidyletanolamin, fosfatidylglycerol og fosfatidylinositol. Hovedmenakinonene er MK-9(H4) og MK-9(Hg). Glykolattesten er negativ.
Taxonomi
Blant slektene Actinomeycetales med lange kjeder av sporer avviker Pseudonocardia, Saccaropolyspora, Actinopolyspora, Streptomyces, Actinomadura, Glycomyces, Nocardiopsis og Amycolata klart fra stamme L585-6 når det gjelder cellekjemien som omfatter celleveggtypen, cellesukkermønsteret, fosfolipid og menakinon. Kibdelosporangium (beskrevet av Shearer et al., Int. J. Syst, Bacteriol., Vol 36, p. 47-54, 1986), Kitasatosporia (beskrevet av Takahashi et al., J. Gen. Appl. Microbiol., Vol 30, p. 377-387, 1984) og Amycolatopsis (beskrevet av Lechevalier et al., Int. J. Syst. Bacteriol., Vol 36, p. 29-37, 1986) er beslektet med stamme L585-6 når det gjelder sammensetning av fosfolipid og menakinon, men Kibdelosporangium og Amycolatopsis avviker fra stammen når det gjelder nærværet av arabinose i celleveggsukker, og Kitasatosporia når det gjelder nærværet av både LL- og meso-diaminopimelinsyre i celleveggen. Dessuten har Kibdelosporangium et hyfeomsluttende sporangiumliknende legeme med riktig membran, og Kitasatosporia danner submerse sporer. Disse enestående strukturer iakttas ikke i stamme L585-6. Kjemotaxonomisk er Streptoalloteichus (beskrevet av Tomita et al., Int. J. Syst. Bacteriol., Vol 37, p. 211-213, 1987), Actinosynnema (beskrevet av Hasegawa et al., Int. J. Syst. Bacteriol., Vol 28, p. 304-310, 1978) og Saccharothrix (beskrevet av Labeda et al., Int. J. Syst. Bacteriol., Vol 34, p. 426-431, 1984) mest beslektet med stamme L585-6. Actinosynnema danner en luftsporekjede fra spissen av en synnema. Saccharothrix danner kjeder av fragmenterte kokkoide elementer både i vegetative mycelier og luftmycelier og danner ikke klynger av forgrenete, korte sporekjeder eller sklerotiske korn. Morfologien til kjedene av kokkoide elementer i Saccharothrix australiensis og S. aerocolonigenes (beskrevet av Labeda, Int. J. Syst. Bacteriol., Vol 36, p. 109-110, 1986) er beslektet med kjedene hos Nocardiopsis, men er ikke beslektet med noe art av Streptomyces. Stamme L585-6 tilhører derfor hverken Actinosynnema eller Saccharothrix.
Streptoalloteichus hindustanus bærer lange spiralformete sporekjeder av artrosporer, forgrenete korte sporekjeder og sklerotiske korn i luftmyceliet og tette kuleformete grupper av hyfer samt mindre sporangiumliknende legemer, som omslutter 1-4 sporer av flageller i det vegetative mycelium. Stamme L585-6 danner alle de små sporangiumliknende blærer. Liksom Streptoalloteichus danner stamme L858-6 ballongliknende legemer som utvikles til sklerotiske korn. Denne struktur er blitt iakttatt hos mange arter av Streptomyces, såsom S. kanamyceticus (Shirling et al., Int. J. Syst. Bacteriol., Vol 22, p. 265-394, 1972) og S. roseiscleroticus (Chainia rubra) (Shirling et al., Int. J. Syst. Bacterial., Vol 22, p. 265-394, 1972).
Basert på ovennevnte sammenlikningsbetraktninger klassifi-seres stamme L585-6 som tilhørende slekten Streptoalloteichus. Stamme L585-6 avviker fra Streptoalloteichus hindustanus ved manglende evne til å danne luftmycelium i ISP-mediuer nr. 2, 3 og 4 og i Bennet's agar, ved å danne melanin, ved manglende stivelseshydrolyse, ved manglende vekst ved 41°C og ved evnen til å kunne utnytte D-ribose og D-glukose blant de 25 testede sukkerarter. Stamme L585-6 betraktes således som en ny art av slekten Streptoalloteichus.
En biologisk ren kultur av stamme L585-6, bestemt som en ny art av slekten Streptoalloteichus, er blitt deponert ved American Type Culture Collection (Rockville, MD) og er føyet til deponer-ingsmyndighetenes permanente samling av mikroorganismer under aksessjonsnummer ATCC 53650.
Antibiotisk produksjon
Antitumor-antibiotikumet som fremstilles ifølge den foreliggende oppfinnelse fremstilles som nevnt ovenfor ved å dyrke stamme L585-6 eller en mutant derav under submerse betingelser i et vandig næringsmedium. Produksjonsorganismen dyrkes i et næringsmedium som inneholder en assimilerbar karbonkilde, f.eks. et assimilerbart karbohydrat. Eksempler på egnete karbonkilder omfatter cerelose og glycerol. Næringsmediet inneholder også en assimilerbar nitrogenkilde, såsom fiskemel, gjærekstrakt eller ammoniumsalter. Uorganiske salter, såsom natriumklorid, kaliumklorid, magnesiumsulfat, kalsiumkarbonat, fosfater etc. tilsettes om nødvendig. Sporelementer, såsom kobber, mangan, jern, sink etc, tilsettes til mediet dersom det er ønskelig, eller kan være til stede som forurensninger i andre av mediets bestanddeler. Inkubasjonstemperaturen kan være en vilkårlig temperatur hvor den produserende stamme kan vokse, f.eks. 18-39°C, men det foretrekkes å utføre fermenteringen ved 25-35°C, mest foretrukket ved 27-32°C. Mediet har fortrinnsvis nøytral pH-verdi, og fremstillingen av antibiotikumet utføres vanligvis i løpet av 4-8 dager. Optimal produksjon oppnås vanligvis i løpet av 5-6 dager. Til fremstilling av forholdsvis små mengder antibiotikum kan det utføres dyrking i rystekolbe eller som overflatekulturer, mens submers aerob dyrking i sterile tanker foretrekkes til fremstilling i større skala. Ved utførelse av tankfermentering er det ønskelig å produsere et vegetativt podestoff i et næringsmedium ved å pode næringsmediumkulturen med sporer fra organismen, og når et ungt, aktivt, vegetativt podestoff har blitt oppnådd, overføre podestoffet aseptisk til fermenteringstankmediet. Ytterligere omrøring kan foregå med et mekanisk røreverk. Antiskummemidler, såsom "lard"-olje eller silikonolje, kan om nødvendig også tilsettes.
Fremstilling av det antibiotiske kedarcidin i fermenteringsmediet kan lettvint følges under fermenteringsforløpet ved anti-mikrobielle metoder under anvendelse av Bacillus subtilis som testorganisme eller ved cellecytotoksisitetsmetoder under anvendelse av tumorcellelinjer fra mus (B16-F10) eller mennesker (f.eks. HCT-116, KB).
Isolering og rensing av antibiotikum
Antitumor-proteinet fremstilt ifølge den foreliggende oppfinnelse kan isoleres fra fermenteringsmediet under anvendelse av konvensjonelle proteinsepareringsmetoder, såsom dialyse, ultrafiltrering, gelfiltrering, isoelektrisk utfelling, utsalting, elektroforese, ionebytterkromatografi og affinitetskromatografi. En kombinasjon av disse metoder i rekkefølge anvendes vanligvis til rensing av proteinet til tilsynelatende homogenitet. Isolerings- og rensemetoden kan overvåkes og styres ved mikrobiologiske metoder, såsom ved anvendelse av B. subtilis, in vitro cytotoksisitetsmetoder overfor kreftcellelinjer fra mus eller mennesker, in vivo antitumormetoder, eller ved fysikalske metoder, såsom UV-teknikk eller høytrykksvæskekromatografiteknikk. I skjema I er det vist en typisk isolerings-rensesekvens. Denne spesielle sekvens er bare illustrerende, og det vil være åpenbart for fagfolk at forskjellige sekvenser under anvendelse av andre metoder kan benyttes så lenge proteinet oppnås med høy renhet og bibeholder de biologiske aktiviteter.
For å utdype skjema I nærmere fjernes den uløselige masse fra fermenteringsmediet på konvensjonell måte, såsom ved sentri-fugering eller filtrering. Dersom næringsmediet skal filtreres kan det med fordel anvendes et filterhjelpemiddel, såsom "Dicalite". Deretter underkastes filtratet anionbytterkromatografi under eluering med en kationbuffer ved pH 7-8 etterfulgt av samme buffer inneholdende natriumklorid. En passendes kationbuffer med ovennevnte pH-verdi er f.eks. Tris-HCl. Fraksjonen som er eluert med den NaCl-holdige buffer oppsamles, konsentreres og renses ytterligere ved gelfiltreringskromatografi under anvendelse av ovennevnte kationbuffer. Fraksjoner oppsamles og under-søkes på nærvær av den aktive bestanddel. Et hensiktsmessig system for innledende overvåking av eluatet er å utføre et forsøk under anvendelse av Bacillus subtilis. De fraksjoner som oppviser inhiberingssoner kombineres, konsentreres og renses ytterligere ved anionbytterkromatografi under innledningsvis eluering med en kationbuffer med pH 7-8, og det fortsettes med en gradient av lineært stigende ionestyrke. Aktive fraksjoner undersøkes på homogenitet ved natriumdodecylsulfat-polyakrylamid-gelelektro-forese (SDS-PAGE), isoelektrisk fokusering og høytrykksvæske-kromatograf imetoder . Fraksjoner som bedømmes som homogene, kombineres og lyofiliseres for oppnåelse av det aktive protein.
Antibiotikumet kedarcidin er et kraftig antitumor-antibiotisk protein sammensatt av et enkeltkjedet polypeptid og en ikke-proteinholdig kromofor. Selv om prøver av antibiotikumet underkastet fysikalsk-kjemisk karakterisering og biologiske utprøvinger ble bedømt som homogene ved SDS-PAGE, isolelektrisk fokusering og høytrykksvæskekromatografi, viste det seg ved sekvens-oppdelingsforsøk, at antibiotikumet besto av en hoved-variant, og én eller to bivarianter. Variantene avviker fra hverandre med hensyn til polypeptidets innledningsvis N-ende-aminosyresekvens, slik som beskrevet nedenfor. Separering eller isolering av de individuelle varianter er ikke nødvendig for å oppnå antitumor-aktivitet.
Aminosyresammensetning
Under anvendelse av kjente standardmetoder ble det rensete proteins aminosyresammensetning bestemt. Sammensetningen er angitt i tabell IV.
Verdier i parentes angir antall rester per peptid bestemt ved aminosyresekvensanalyse.
Aminosyresekvens
For aminoterminalsekvensanalyse ble kedarcidin redusert med 2-merkaptometanol og renset ytterligere ved SDS-PAGE (15% akryl-amid) og utvunnet fra gelene ved elektroeluering eller elektro-blotting.
Til de fleste enzymatiske spaltinger ble kedarcidin anvendt uten ytterligere rensing. Kedarcidin ble redusert med 20mM ditiotreitol i 100 uliter 0,4 M Tris-HCl-buffer, pH 8,5, inneholdende 6 M guanidin-HCl, 0,1% Na2 EDTA, i 2 timer ved 50°C og deretter S-pyridyletylert med 100 mM 4-vinylpyridin natten over ved romtemperatur. Reaksjonen ble stoppet ved tilsetning av 10 uliter 2-merkaptoetanol i 1 time ved 50°C. Reaktantene ble fjernet ved dialyse mot 5 volum% eddiksyre i 24 timer, og det modifiserte kedarcidin ble deretter tørket i en "Speedvac" sentrifugalkonsentrator.
Enzymatisk spalting av S-pyridyletylert kedarcidin med ASP-N-enzym eller S-aureus V8 protease ble utført i 40 uliter 0,1 M Tris-eddiksyrebuffer, pH 8,0, inneholdende 0,7 M urea ved 37°C natten over under anvendelse av et enzym:substrat-forhold på 1:100 (ASP-N) eller 1:10 (V8 protease). Trypsinnedbrytning ble utført i 40 uliter 0,1 M Tris-eddiksyrebuffer, pH 8,0, ved 37°C natten over ved et enzym:substrat-forhold på 1-20. De enzymatiske nedbrytningsblandinger ble surgjort med trifluoreddiksyre (TFA) til pH 2,0 og separert ved høytrykksvæskekromatografi med omvendt fase.
Peptidrensing ved høytrykksvæskekromatografi med omvendt
fase ble utført med et "Model 130A"-separasjonssystem og foregikk ved 40°C med en "RP-300"-søyle (2,1 x 100 mm, Applied Biosystems, Inc.). Lineære acetonitrilgradienter bestående av 0,1% TFA i vann som utgangsbuffer og 60% acetonitril inneholdende 0,085% TFA som grensebuffer ble anvendt for eluering. Peptider ble oppsamlet manuelt. Aminosyresekvensbestemmelser ble utført i et automatisk aminosyresekvensbestemmelsesapparat ("Model 475 A", Applied Biosystems, Inc.) ved hjelp av standardmetoder.
Hovedvarianten av polypeptidet består av 114 aminosyrerester. Aminosyresekvensen ble bestemt til å være følgende:
N- terminus
C- terminus
To bivarianter ble identifisert, hvor den ene manglet den første alaninrest i hovedvarianten, mens den andre manglet de to første aminosyrerester, dvs. alamin og serin i hovedvarianten.
Bestemmelse av molekylvekt
(a) Ved gelfiltrering ( høytrykksvæskekromatografi- metode)
Ved anvendelse av en "TSK G2000 SW"-kolonne (7,5 x 300 mm)
(LKB Produkter AB, Sverige) ble gelfiltrering utført under anvendelse av 50 mM Tris-HCl-buffer inneholdende 0,5 M NaCl (pH 7,4) ved en strømningshastighet på 0,5 ml/minutt. Alternativt kan en "1-125"-proteinanalysekolonne fra "Waters Associates" anvendes med 0,2 M Tris-acetat som elueringsmiddel ved en strømnings-hastighet på 1 ml/minutt. Molekylvekten ble vurdert til 17.000 dalton ut fra referansekurven som ble oppnådd ved standard molekylvektmarkører (Bio Rad Laboratories).
(b) Natriumdodecylsulfat- polyakrylamidgel- elektroforesemetode
En prøve av proteinet og molekylvektmarkørene (fra Diversified Biotech, Maine) ble blandet med et tilsvarende volum "Seprasol" (bruksferdig proteinløsende væske inneholdende sakkarose og et sporfargestoff) og oppvarmet i 3 minutter ved 90°C umiddelbart forut for elektroforese. Elektroforese ble utført ved 300 V i "Seprabuff" (Tris-glycin-SDS, pH 8,3) inntil sporfargestoffet nådde bunnen av gelen. Gelen ble deretter nedsenket i en fargende løsning (1,25 g "Comassie BB R-250", 92 ml eddiksyre i 908 ml vandig metanol) i minst 10 timer, og deretter nedsenket i en avfargende løsning (75 ml eddiksyre og 50 ml metanol i 875 ml vann) inntil gelens bakgrunn ble transparent. "Seprasol" og "Seprabuff" kommer fra Integrated Separation Systems, Massachusetts. Molekylvekten ble bestemt til 12.400 dalton ved denne metode.
Isoelektrisk fokusering
Gelen som ble anvendt til fokusering ble fremstilt ved å blande
Den resulterende løsning ble avgasset i 10 minutter, og 1,5 ml 1% ammoniumpersulfat i vann og 10 uliter N,N,N<1>,N<1->tetramety1-etylendiamin ble tilsatt. Blandingen ble helt i støpeform og polymerisert. De anvendte elektrodeløsninger var 1 M fosforsyre ved anoden og 2% "1809 Ampholine", pH 6,8, ved katoden. Fokuser-ingsforsøket ble utført ved en konstant belastning på 25 watt i 2 timer. Prosentangivelsen refererer til vekt pr. volum. Det iso-elektriske punkt ble bestemt til 3,65, og migreringsavstanden fra katoden var 6,2 5 cm.
Biologisk aktivitet
Antitumor-aktiviteten til proteinet ble vurdert overfor transplanterbar P388 museleukemi. Til CDF.-mus ble det implantert intraperitonealt (i.p.) eller intravenøst (i.v.) 10 P388 leuke-miceller oppnådd fra DBA/2 donormus med denne transplanterbare museleukemi. Musene ble behandlet intraperitonealt enten med saltvann (kontrollmus) eller med doser av kedarcidin én gang daglig i 5 på hverandre følgende dager begynnende første dag etter tumorinokulering mot interperitonealt implantert P388 leukemi. Mot intravenøst implantert P388 leukemi mottok musene kedarcidin intravenøst på dag 1, 3 og 5 etter inokulering. Disse dyr ble iakttatt daglig og dødsfall notert. Forandringer i gjennomsnittlig legemsvekt (fra dagen for leukemiimplantering til dagen for siste behandling) ble bestemt for alle grupper for derved å avspeile legemiddeltoksisitet. Forekomsten av mus som var i live i hver gruppe på dag 5 etter tumorimplantering ble registrert for derved ytterligere å kunne vurdere legemiddel-toksisiteten. Intet terapeutisk resultat ansås for betydnings-fullt dersom mer enn én mus per behandlingsgruppe var død på dag 5. Behandlingsgrupper besto av enten 4 eller 6 mus, og kontroll-grupper besto av 10 mus. Antallet mus som overlevde til dag 30 (siste dag i forsøket) ble likeledes notert. Ved avslutning av forsøket ble den gjennomsnittlige overlevelsestid (MST) for hver gruppe bestemt og anvendt til beregning av %T/C, som er forholdet mellom MST for en behandlet gruppe og MST for kontrollgruppen multiplisert med 100. En %T/C-verdi på 125 eller mer indikerer vesentlig antitumor-aktivitet. In vivo-data er angitt i tabellene V og VI..
Kedarcidin ble også vurdert overfor B16 musemelanoma implantert intraperitonealt med 0,5 ml 10% tumorcellesuspensjon. Til hvert dosenivå ble det anvendt 10 mus. Legemidlet ble administret intraperitonealt én gang daglig i 9 på hverandre følgende dager, begynnende én dag etter tumorimplantering. Antallet overlevende mus på dag 10 og ved avslutningen av forsøket, dvs. dag 60, ble registrert. Testresultatene er angitt i tabell VII. %T/C-verdier på 125 eller mer angir vesentlig tumor-aktivitet.
Testresultatene som er angitt i tabellene V, VI og VII viser at antibiotisk kedarcidin er et kraftig middel, som oppviser reproduserbar antitumor-aktivitet in vivo overfor museleukemi B388 og B16 melanoma. Den iakttatte aktivitet ble manifestert ved økning i levetid ved intraperitoneal implantert B16 melanoma og i både intraperitonealt og intravenøst implantert B388, idet sistnevnte utgjør en form for sykdommen som er mer vanskelig å behandle effektivt på grunn av dens tendens til å disseminere. Kedarcidin er også blitt vurdert overfor subkutant implantert B16 melanoma, M5076 lungetumor hos mus, og intrakranialt implantert P388 leukemi, men viste ikke vesentlig aktivitet i disse dyremodeller.
Oppfinnelsen vil i det etterfølgende bli belyst ved hjelp av eksempler.
Eksempel 1
Fremstilling av vegetativ kultur av Streptoalloteichus stamme L585- 6
Streptoalloteichus sp. stamme L585-6 (ATCC 53650) ble bibeholdt og overført til reagensglass på skråsubstrater av gjær-maltekstraktagar bestående av
Ved hver overføring ble skråsubstratagaren inkubert ved 28°C i to uker. Vegetative kulturer ble fremstilt ved å overføre over-flateveksten fra skråsubstratkulturen til en 500 ml Erlenmeyer-kolbe som inneholdt 100 ml av et sterilt medium bestående av
Denne vegetative kultur ble inkubert ved 28°C i 72 timer på et roterende rysteapparat ved 250 omdr./minutt.
Eksempel 2
Fermentering i rystekolber
5 ml av den vegetative kultur fra eksempel 1 ble inokulert i 500 ml Erlenmeyerkolber, som hver inneholdt 100 ml av et produksjonsmedium bestående av
Produksjonskulturen ble inkubert ved 28°C på et roterende rysteapparat ved 250 omdr./minutt. Produksjonen av det antibiotiske protein ble overvåket ved mikrobielle metoder under anvendelse av B. subtilis og cytotoksiske in vivo metoder under anvendelse av musemelanoma cellelinje B16-F10 og humane tumorcellelinjer. Optimal produksjon ble vanligvis oppnådd etter 144-168 timer.
Eksempel 3
Tankfermentering
25 ml av den vegetative kultur fra eksempel 1 ble inokulert i en 2 liter "Vitro"-flaske som inneholdt 500 ml av det samme vegetative medium. Podekulturen på annet trinn ble inkubert ytterligere ved 28°C i 72 timer på et roterende rysteapparat ved en rystehastighet på 250 omdr./minutt. 50 ml av podekulturen på annet trinn ble inokulert i en "New Brunswick Microgen"-fermentor (16 liter nominelt volum) som innholdt 10 liter produksjonsmedium med den i eksempel 2 angitte sammensetning. Fermenteringen ble utført ved 28°C, gjennomlufting med 1 volum/minutt, og løsningen ble innstilt på 250 omdr./minutt. Produksjonen av antibiotisk kedarcidin ble overvåket med egnete in vitro biometoder.
Eksempel 4
Isolering og rensi, ng av kedarcidin
10 ml rått fermenteringsmedium ble blandet med 6 liter "Dicalite", og den resulterende tynne oppslemming ble filtrert på en "Dicalite"-pute. De uoppløselige materialer ble kastet og filtratet pumpet gjennom en "Zeta Prep" 250-QAE ionebytterpatron ved en hastighet på 30 ml/minutt. Patronen var blitt likevekts-innstilt på forhånd med 2 liter 50 mM Tris-HCl-buffer, pH 7,4. Eluatet ble oppsamlet. Patronen ble vasket med 1 liter 50 mil Tris-HCl-buffer, pH 7,4, og deretter eluert med 500 ml 50 mM Tris-HCl-buffer, pH 7,4, inneholdende 0,5 mol NaCl. Eluatet ble oppsamlet og konsetrert fra 500 ml til 100 ml under anvendelse av en "Amicon" standard ultrafiltreringscelle utstyrt med en "Amicon-YM5" membran. Den konsentrerte løsning ble filtrert
gjennom en gelfiltreringskolonne (5 x 100 cm) pakket med 1400 ml "Ultrogel"-AcA54 i et tilsvarende volum av 50 mM Tris-HCl-buffer. "Ultrogel"-laget var blitt brakt i likevektstilstand med 5 liter 50 mM Tris-HCl-buffer, pH 7,4. Den fyllte kolonne ble eluert med 2 liter 50 mM Tris-HCl-buffer, pH 7,4, ved en hastighet på 60 ml/minutt. Etter en første porsjon på 450 ml ble det oppsamlet fraksjoner på 10 ml, og hver fraksjon ble utprøvet under anvendelse av B. subtilis. De fraksjoner som ga inhiberingssoner (fraksjoner av 83-133) ble kombinert og konsentrert til 100 ml ved ultrafiltrering. Den konsentrerte løsning ble under perko-lering overført til ionebytterkolonnen (2,5 x 15 cm) pakket med en oppslemming av 70 ml "DEAE-Trisakry1" (LKB-Produkter AB, Sverige) i et tilsvarende volum 50 mM Tris-HCl-buffer. "Tris-akryl"-laget var blitt brakt i likevektstilstand med 10 kolonnevolumer 50 mM Tris-HCl-buffer. Den fyllte kolonne ble først eluert med 10 kolonnevolumer 50 mM Tris-HCl-buffer, etterfulgt av en 300 ml lineær gradient (helning = 0,1 M/time) av 100% 50 mM Tris-HCl-buffer til 100% 50 mM Tris-HCl-buffer inneholdende 0,5 M NaCl ved en strømningshastighet på 60 ml/time. Totalt 47 fraksjoner å 5 ml ble oppsamlet og utprøvet overfor B. subtilis. Aktive fraksjoner 25-37 ble kombinert og underkastet analytisk gelfiltrering/høytrykksvæskekromatografi under eluering med "Waters Protein analysis"-kolonne 1-125, 0,2 M Tris-acetat, pH 7,0, ved en strømningshastighet på 1 ml/minutt, og UV-detektor ved 260 nm. Under disse betingelser viste kromatogrammet en enkelt topp ved en oppholdstid på 8,3 minutter. De kombinerte fraksjoner ble også bedømt som homogene ved isoelektrisk fokusering og SDS-PAGE under de overfor beskrevne betingelser. Konsentrasjonen av den aktive komponent ble vurdert til 4,25 mg/ml ved lyofilisering av en 10 ml prøve og korreksjon for buffervekt.
Claims (3)
1. Fremgangsmåte til fremstilling av antibiotisk kedarcidin med følgende kjennetegn: (a) utseende: brungult faststoff, (b) molekylvekt: 12.400 dalton ved
SDS-polyakrylamidgel-elektroforesemetoden, 17.000 ved gelfiltrering/høytrykksvæskekromatografimetoden, (c) UV-spektrum: stort sett som vist i fig. 1, (d) isoelektrisk punkt: 3,65, og (e) omfattende et polypeptid med følgende aminosyresekvens: X-ala-ala-val-ser-val-ser-pro-ala-thr-gly-leu-ala-asp-gly-ala-thr-val-thr-val-ser-ala-ser-gly-phe-ala-thr-ser-thr-ser-ala-thr-ala-leu-gln-cys-ala-ile-leu-ala-asp-gly-arg-gly-ala-cys-asn-val-ala-glu-phe-his-asp-phe-ser-leu-ser-gly-gly-glu-gly-thr-thr-ser-val-val-val-arg-arg-ser-phe-thr-gly-tyr-val-met-pro-asp-gly-pro-glu-val-gly-ala-val-asp-cys-asp-thr-ala-pro-gly-gly-cys-gln-ile-val-val-gly-gly-asn-thr-gly-glu-tyr-gly-asn-ala-ala-ile- ser-phe-gly-OH, hvor X er valgt blant H-ala-ser, H-ser og H, karakterisert ved at en kedarcidin-produserende Streptoalloteichusstamme med egenskaper som sp. nov., stamme L585-6, ATCC 53650, eller mutanter derav med de vesentlige
biokjemiske og morfologiske egenskaper som opphavsstammen dyrkes i et medium som inneholder assimilerbare karbon- og nitrogenkilder under submerse, aerobe betingelser, og at antibiotikumet utvinnes fra dyrkningsmediet ved hjelp av konvensjonelle separeringsmetoder.
2. Fremgangsmåte i samsvar med krav 1, karakterisert ved at den produserende stamme er stamme L585-6, ATCC 53650.
3. Biologisk ren kultur av mikroorganismen Streptoalloteichus, karakterisert ved at den er sp. nov., stamme L585-6, ATCC 53650.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US18051988A | 1988-04-12 | 1988-04-12 | |
| US07/323,001 US5001112A (en) | 1988-04-12 | 1989-03-17 | Antitumor antibiotic kedarcidin |
Publications (4)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| NO891462D0 NO891462D0 (no) | 1989-04-10 |
| NO891462L NO891462L (no) | 1989-10-13 |
| NO174474B true NO174474B (no) | 1994-01-31 |
| NO174474C NO174474C (no) | 1998-06-09 |
Family
ID=26876396
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| NO891462A NO174474C (no) | 1988-04-12 | 1989-04-10 | FremgangsmÕte til fremstilling av et antibiotisk kedarcidin, samt en biologisk ren kultur av streptoalloteichus L585-6, ATCC 53650 |
Country Status (24)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5001112A (no) |
| EP (1) | EP0337430B1 (no) |
| JP (1) | JP2850132B2 (no) |
| KR (1) | KR970010137B1 (no) |
| CN (1) | CN1034589C (no) |
| AT (1) | ATE101653T1 (no) |
| AU (1) | AU623641B2 (no) |
| CA (1) | CA1338262C (no) |
| CY (1) | CY1849A (no) |
| DE (1) | DE68913063T2 (no) |
| DK (1) | DK174751B1 (no) |
| ES (1) | ES2061760T3 (no) |
| FI (1) | FI93969C (no) |
| HK (1) | HK83195A (no) |
| HU (1) | HU201119B (no) |
| IE (1) | IE62912B1 (no) |
| IL (1) | IL89896A0 (no) |
| MY (1) | MY105842A (no) |
| NO (1) | NO174474C (no) |
| NZ (1) | NZ228672A (no) |
| PL (1) | PL161004B1 (no) |
| PT (1) | PT90252B (no) |
| SG (1) | SG30654G (no) |
| YU (1) | YU73989A (no) |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5143906A (en) * | 1991-09-26 | 1992-09-01 | Bristol-Myers Squibb Company | Kedarcidin antitumor chromophore and pharmaceutical composition containing same |
| WO2003062458A2 (en) * | 2002-01-24 | 2003-07-31 | Ecopia Biosciences Inc. | Method, system and knowledge repository for identifying a secondary metabolite from a microorganism |
| AU2009309416B2 (en) * | 2008-10-27 | 2015-05-28 | Glaxosmithkline Biologicals S.A. | Purification method |
Family Cites Families (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS519837B2 (no) * | 1974-03-29 | 1976-03-30 | ||
| JPS53107408A (en) * | 1977-02-28 | 1978-09-19 | Yamanouchi Pharmaceut Co Ltd | Micellar preparation for rectal infusion |
| JPS6017206B2 (ja) * | 1977-03-24 | 1985-05-01 | 浩 前田 | ネオカルチノスタチン誘導体の製造法 |
| JPS56113791A (en) * | 1980-02-15 | 1981-09-07 | Kaken Pharmaceut Co Ltd | Novel antibiotic and its preparation |
| JPS57206693A (en) * | 1981-06-10 | 1982-12-18 | Ajinomoto Co Inc | Protein an-7d |
| JPS59184135A (ja) * | 1983-04-04 | 1984-10-19 | Teijin Ltd | グリセリンピログルタミン酸エステル類を含有する医薬品組成物 |
-
1989
- 1989-03-17 US US07/323,001 patent/US5001112A/en not_active Expired - Lifetime
- 1989-04-10 NZ NZ228672A patent/NZ228672A/xx unknown
- 1989-04-10 IL IL8989896A patent/IL89896A0/xx unknown
- 1989-04-10 NO NO891462A patent/NO174474C/no not_active IP Right Cessation
- 1989-04-11 CN CN89103572A patent/CN1034589C/zh not_active Expired - Lifetime
- 1989-04-11 KR KR1019890004782A patent/KR970010137B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1989-04-11 FI FI891710A patent/FI93969C/fi not_active IP Right Cessation
- 1989-04-11 MY MYPI89000459A patent/MY105842A/en unknown
- 1989-04-11 PT PT90252A patent/PT90252B/pt not_active IP Right Cessation
- 1989-04-11 DK DK198901735A patent/DK174751B1/da not_active IP Right Cessation
- 1989-04-11 IE IE115789A patent/IE62912B1/en not_active IP Right Cessation
- 1989-04-11 PL PL1989278782A patent/PL161004B1/pl unknown
- 1989-04-12 ES ES89106518T patent/ES2061760T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1989-04-12 YU YU00739/89A patent/YU73989A/xx unknown
- 1989-04-12 AU AU32728/89A patent/AU623641B2/en not_active Expired
- 1989-04-12 SG SG1995907457A patent/SG30654G/en unknown
- 1989-04-12 EP EP89106518A patent/EP0337430B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1989-04-12 AT AT89106518T patent/ATE101653T1/de not_active IP Right Cessation
- 1989-04-12 JP JP1090908A patent/JP2850132B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1989-04-12 DE DE68913063T patent/DE68913063T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1989-04-12 HU HU891756A patent/HU201119B/hu unknown
- 1989-04-12 CA CA000596547A patent/CA1338262C/en not_active Expired - Fee Related
-
1995
- 1995-05-25 HK HK83195A patent/HK83195A/xx not_active IP Right Cessation
-
1996
- 1996-03-08 CY CY184996A patent/CY1849A/xx unknown
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US5795767A (en) | Epimerase | |
| NO174474B (no) | Fremgangsmaate til fremstilling av et antibiotisk kedarcidin, samt en biologisk ren kultur av streptoalloteichus L585-6, ATCC 53650 | |
| US5098887A (en) | Angiotensin converting enzyme inhibitor | |
| US4014860A (en) | Plasminostreptin (enzyme inhibitor) and method for producing it from streptomyces | |
| WO2002055715A1 (fr) | Adn codant pour une d-myo-inositol 1-épimérase | |
| EP0353342A1 (en) | Low molecular weight xylanase glycoprotein | |
| KR20020022758A (ko) | 환상 리포펩티드 아실라제를 암호화하는 유전자 및 그 발현 | |
| WO1988005993A2 (en) | Aminopeptidase for removing n-terminal methionine from proteins and proteins prepared therefrom | |
| AU5758699A (en) | Polypeptide having antihuman immunodeficiency virus activity, gene encoding the polypeptide and process for producing the polypeptide | |
| EP0213320B1 (en) | Physiologically active formamides | |
| US4960877A (en) | DNA having genetic information of L-α-glycerophosphate oxidase and application thereof | |
| CZ279196B6 (cs) | Protinádorové antibiotikum kedarcidin | |
| JP2625129B2 (ja) | 酵素活性阻害剤及びその製造法 | |
| CS251077B2 (en) | Method of new polypeptide antibiotic production with antitumor effect | |
| DD280553A5 (de) | Verfahren zur herstellung des antibiotikums kedarcidin | |
| KR20190047602A (ko) | 신규 d-입체특이적 아미노산 아미다아제와 그 돌연변이체, 및 이를 이용한 d-아미노산 생산 방법 | |
| KR20200002183A (ko) | 신규 d-트레오닌 생산 효소 및 이를 이용한 d-트레오닌의 생산 방법 | |
| WO2004029252A2 (en) | A gene encoding vitamin b6 phosphate phosphatase and use thereof | |
| Yang et al. | Development Centerfor Biotechnology, 81 Chang Hsing Street, Taipei, Taiwan. ROC | |
| JPH0811758B2 (ja) | ポリペプチド同族体マリノスタチン | |
| JPS61115100A (ja) | Ｄｃ−７９およびその製造法 | |
| JPS633789A (ja) | 新規なエステラ−ゼ及びその製造法 | |
| JPS60168389A (ja) | 新規なａ−８９８物質，その製造法およびそれを有効成分とする抗腫瘍剤 | |
| JPS6339898A (ja) | 新規なペプチドｍｒ−３３−ａ物質及びその製造法 | |
| JPS58107173A (ja) | 新規微生物 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MK1K | Patent expired |