JPS58107173A - 新規微生物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は新規微生物に関する。更に詳しくは本発明はシ
ー−トモナス属に属し、制癌作用物質ＹＭ−３２２９Ｇ
を産生することを特徴とする新規微生物に関する。

本発明者らは、薬理作用物質生産菌の検策中に、札幌市
丸山公園内の土壌から常法によって分離した細菌が、そ
の菌学的性質から判断してシー−トモナス属に属する新
菌種であることをつきとめ、その知見に基づ℃・て本発
明を達成した。

本発明に係る新規微生物は、優れた制癌作用を有する新
規な中性多糖類ＹＭ−３２２９Ｇを産生ずるので、産業
上極めて有用である。

本菌株の菌学的性質は以下のとおりである。

■　形態学的性質 肉汁寒天培地上で培養した細胞は、０６〜０．８　Ｘ　
１．５〜３０μｍの大きさをもつ桿菌であり。

極子を有し運動性がある。胞子を形成せず。

ダラム染色性は陰性である。細胞の多形性及び抗酸性は
ない。

■　各種培地における生育状態 （１）肉汁寒天培地（２８ｃ、２〜６日）菌体は淡黄色
を呈し、増殖はよい。

（２）　　肉汁プロス　（２１，２〜６日）表面に薄膜
を形成する。培地は全体に濁る。

（３）　　　リドマスミルク　（２８ｃ、２〜６日）中
性〜アルカリ性のまま液化される。

（４）　　肉汁ゼラチン穿刺培養 液化される。

■　生理学的性質 （１）　デンプンの加水分解　　　陰性（２）　　ゼラ
チンの液化　　　　　陽性（３）　　カゼインの加水分
解　　　陰性（４）　　カタラーゼ反応　　　　　陰性
（５）　　インドールの生成　　　　陰性（６）硫化水
素の生成　　　　　陰性 （７）　　ウレアーゼ反応　　　　　陰性ｒＢ）　　硝
酸塩の還元　　　　　　陽性（９）　　クエン酸の利用
（シモンズ培地）陽性α０）卵黄反応　　　　　　　　
陰性 ａｔ＋　　オキシダーゼ　　　　　　陽性Ｑ２　　ＶＰ
テスト　　　　　　　陰性（１３）　　ＭＲテスト　　
　　　　　陽性０４　　栄養要求性　　　　　　　なし
０つ　嫌気性条件下での生育　生育せず（１６）無機窒
素源の利用　　７７−Ｅ−ｊ’−１−ｍ岬１刷硝酸塩（
利用しない） θη　色素の生成　　　　　　　なし ＯＱ　　　ポリ−β−ハイドロキシブチレートの体内蓄
積　陰性θ０　脱窒反応　　　　　　　　陰性 （２０）Ｏ−Ｆテスト　　　　　　Ｏ型Ｄ−クルコース
、スターチ、グリセリンを各々唯一の炭素源として生育
するが。

Ｌ−アラビノース、Ｄ−キシロース、Ｄ−フラクトース
、シュークロース、イノシトール、Ｌ−ラムノース、ラ
フィノース、Ｄ−マンニトール、Ｄ−ガラクトース、マ
ルトース、トレハロース、ラクトース、Ｄ−ソルビトー
ル、サクシン、エスクリンのいずれも生育に利用できな
い。

以上の菌学的性質についてパージエイズ　マニーアル　
オブ　デターミネイティブ　バクテリオロジイ（Ｂｅｒ
ｇｅｙ’ｓ　Ｍａｎｎｕａｌ　　ｏｆ　Ｄｅｔｅｒｍｉ
ｎａｔｉｖｅＢａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ　）第８版（１
９７４年）Ｋより検策すると。

本菌株はダラム陰性の桿菌で、胞子を形成せず。

種型性鞭毛な有し、絶対好気性であるところからシー−
トモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　）属に属すると同
定される。さらに、ポリ−β−ハイドロキシブチレート
の菌体内蓄積が認められず、ポリ−β−ハイドロキシブ
チレートを炭素源として利用できなし・ことから２本菌
株はシー−トモナス属のセクション（５ｅｃｔｉｏｎ　
）　Ｉに属すると考えられる。セクションＩＫ包括され
る菌種のうち、蛍光性色素を生成せず、脱窒反応が陰性
であるものとしては、シー−トモナス　アルカリゲネス
（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ　
）が挙げられる。

しかしながら２本菌株はシー−トモナス　アルカリゲネ
スの菌学的性質と比較して、以下−の性質においてシー
−トモナス　アルカリゲネスと異なっている。

１）本菌株はデンプンを含む培地で粘液性の物質を生産
する。

２）本菌株は１５〜３７Ｃを生育温度範囲とし。

４１Ｕでは生育しないのに対し、シー−トモナス　アル
カリゲネスは４］１においても生育する。

以上の結果より９本菌株はシー−トモナス属に属するい
ずれの標準種の菌とも峻別でき５本５− 発明者らは本菌株をシー−トモナス属に属する新菌種の
ものであると判定し２本菌株をシー−トモナス　エスピ
ー　ＹＭ−３２２９Ｇ　（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｓｐ
、　ＹＭ−３２２９Ｇ　）と命名ルだ。

本菌株は通商産業省工業技術院微生物工業技術研究所に
微工研菌寄第６１６７号として寄託されている。

本発明に係る微生物は、上記菌学的性質における特徴の
他、優れた制癌作用を有する中性多糖類ＹＭ　−３２２
９Ｇを生産する点でも特徴づけられる。

微生物の諸性質は常に一定したものでなく自然的１人工
的に変化することは周知のとおりである。従って２本発
明に係る微生物は上記シュードモナス　エスピー　ＹＭ
−３２２９Ｇ株のみに限定されるものではなく、該ＹＭ
　３２２９　Ｇ株と同一の菌種シー−トモナス　エスピ
ーに属する全ての菌株、あるいはシュードモナス属に属
し制癌作用物質ＹＭ　−３２２９Ｇを産生ずる全ての菌
株を包含するものである。かかる菌株の具体例としては
１例えば上記ＹＭ−３２２９Ｇ株に、Ｘ線、γ線、紫外
線等の照射、化学変異剤処理、ファージ接触、形質転換
、形質導入、接合による遺伝子組換え、細胞融合による
遺伝子組換え、プラスミドによる遺伝子導入などの変異
処理を施すことにより、制癌作用物質ＹＭ　−３２２９
Ｇの生産能を高めた人工的変異株ある℃・はＹＭ　−３
２２９Ｇ株の培養中などにおいて自然発生した突然変異
株が挙げられる。

本発明の新菌種に属する微生物は天然の土壌より分離し
て取得したものであるが、前記微生物工業技術研究所に
寄託した菌株の凍結乾燥品を復元することによって容易
に取得することができる。

本発明に係る微生物の培養は、その微生物が利用する栄
養源を含有する培地を用し・て行なわれる。培地は合成
、半合成、又は天然の、固体又は液体培地の℃・ずれを
用いてもよいが９通常天然の栄養源を含む液体培地が好
適である。培地に添加する栄養源としては、炭素源とし
てＤ−クルコース、スターチ、あるいはグリセリンが、
窒素源としては肉エキス、ペプトン、グルテンミール、
カゼイン加水分解物７綿実粕、大豆粉、落下生粉、魚粉
、コーンスチーブリカー。

乾燥酵母、酵母エキス、各種アミノ酸（例えばグルタミ
ン酸、アラニノ、リジン等）、アンモニウム塩（例えば
硝酸アンモニウム、硫酸アンモニウム等）、尿素などの
有機、無機の窒素源が用いられる。

また、培地には必然に応じナトリウム、カリウム、マグ
ネシウム、カルシウム、亜鉛、鉄などの金属の硫酸塩、
硝酸塩、硝酸塩、塩化物。

炭酸塩、リン酸塩などを添加することができる。

培養は好気的条件下に行なうのがよく、静置。

振盪１通気攪拌培養のいずれも可能であるが。

振盪あるいは通気攪拌培養が有利である。培養温度はお
よそ１８〜３５ｔＺ’の範囲内が好ましく。

殊に約２７〜２８′Ｃが有利である。また、培地のｐＨ
は約５５〜８５．殊に約６〜８の中性付近に保持するの
が好適である。培養期間は培地の組成、温度等の培養条
件によって異なるが１通常約２日〜１０日程度がよい。

培養物に蓄積された制癌作用物質ＹＭ　−３２２９Ｇを
単離・精製するには１通常用いられる単離精製手段を適
用すればよい。制癌作用物質ＹＭ−３２２９Ｇは主に培
養液中に蓄積されるので、遠心分離又はｆ過等により菌
体を除去した後、除菌液より単離精製される。

単離、精製は適当な溶剤に対する溶解性及び溶解度の差
、溶液からの析出性及び析出速度の差１種々の吸着剤に
対する吸着親和性の差、２種の液相間如おける分配の差
などを利用する方法を適用して行なうのが好ましい。こ
れらの方法は必要に応じて単独に用いられ、あろ℃・は
任意の順序に組合せ、また反覆して適用できる。

かくして得られた制癌作用物質ＹＭ　−３２２９Ｇの理
化学的性質は以下のとおりである。

形状　　白色粉末 赤外線吸収スペクトル 第１図に赤外線吸収スペクトルデータを示す。

ν　　　鑞　；　３４２０，２９００，１７２０，１６
１０，１４１０゜１２４０．１０６０．５７０ 呈色反応 オルジノ塩化第二鉄塩酸反応　　陽性 アノスロノ反応　　　　　　　　陽性 フォリンローリ−反応　　　　陰性 エルソンモルガノ反応陰’６ 溶剤に対する溶解性 水に溶けるが、メタノール、エタノール。

ブタノール、アセトン、クロロホルム、ベンゼン、酢酸
エチル、酢酸ブチルなどの有機溶媒（では全く溶げな（
・。

イオン交換樹脂に対する吸着性 強塩基性及び強酸性のイオン交換樹脂 ［Ｄｏｗｅｘ　ｌｘｌ　（ＯＨ型）　＋　Ｄｏｗｅｘ　
５０Ｗ　　（Ｈ型）〕　のし・ずれにも吸着されない。

薄層クロマトグラフィー（シリカゲル６０．　Ｆ２５４
）ｔｅｒｔ−ブタノール−水（７：３）、ｎ−ブタノー
ル−酢酸−水（４：１：２）、ｎ−ブタノール−メタノ
ール−水（４：１：２）、　ｎ−プロパノ−ルー水酸化
アンモニウム−水（４０：６０：５）のいずれの溶媒系
においても、硫酸発色、トルイジンブルーによる染色で
原点であった。

セルローズアセテート膜による電気泳動１Ｍ酢酸−ピリ
ジン（ｐＨ３，５）　；　０．ＳｒｎＭ偽（総電流量７
ｍＡ）２０分の泳動で移動は認められなかった。

物性中性多糖類 以上のデータから、詳細な構造は不明ながら本有効物質
ＹＭ　−３２２９Ｇは中性多糖類であると同定される。

周知のとおり、薬理作用を有する多糖類の検策にお℃・
ては、粗製物〔例えば本発明にお℃・ては除菌液、ある
℃・はその除菌液より直ちに有機溶媒又は含水有機溶媒
を加えて沈澱させ、その沈澱物を乾燥して得られる白色
粉末（粗製ＹＭ−３２２９Ｇという）〕でも強力な薬理
作用を示す反面、精製を繰り返しても薬理作用との相関
において精製度の定まらな℃・場合が多い。従って、以
下に定量的データを示すものの。

その定量的データにより同定されたもののみが。

薬理作用を有する物質であるとは限らな℃・。本発明の
制癌作用物質ＹＭ　−３２２９Ｇは以下の定量的データ
によって同定された物のみに限定されるものではなく、
上記の理化学的性質と薬理作用との相関において、同一
の性質を示す全ての中性多糖類を包含するものである。

融点　明瞭な融点２分解点を示さないが。

１４５Ｃからやや褐変し、１８０〜１９０Ｃで褐変する
。

元素分析値 Ｃ＝３８．５５　　　Ｈ＝５．９５　　　Ｎ＝０．６３
本発明徴生物より生産されるＹＭ　−３２２９Ｇは優れ
た制癌作用を示す。その薬理効果を以下に示す。

〔試験方法〕

１群１０匹のＩＣＲ／ＣＲＴ　５週の雌性マウスにザル
コーマ’　（Ｓａｒｃｏｍａ　）　１８０３　Ｘ　１０
’個の細胞をマウス皮下に接種して腫瘍を作る。このマ
ウスＫ　ＹＭ　−３２２９Ｇ　（１ｍｇ／ｋｇ、　５ｍ
ｇ／ｋｇ、　１０ｍｇ／ｋｇ）を腹腔内より１日１回１
０日間連投し、７日、１５日、２１日、２８日目におけ
る腫瘍の大きさを測定し、対照との比較においてＹＭ　
−３２２９Ｇの腫瘍に対する抑制率を求めた。

〔結　果〕

試験結果を第１表に示す。

第１表 以下に実施例を掲記し１本発明を更に詳細に説明する。

なお、制癌作用物質の力価の測定は以下の方法によった
。

〔５′−ヌクレオチダーゼ活性阻止物質の検定法〕基質
溶液；　５．５ｍＭの塩化マグネシウムを含む５５ｍＭ
のトリス塩酸緩衝液（ｐ）１８．５）　）に１．１ｍＭ
のアデノシンモノホスフェートナトリウム塩と１０ｍＭ
の酒石酸 ナトリウム、カリウム塩を溶解したも のを用いる。

酵素液；ラット肝臓形質膜５′−ヌクレオチダーゼ 測　　定；基質溶液０．９　ｍＺと酵素液６０１Ｊ−ｅ
３及びＹＭ　−３２２９Ｇの培養液（又はＹＭ−３２２
９Ｇ）水溶液）４０ｕを加え温 浴中３０Ｃで３０分間反応させる。

反応終了後１　ｍｌの１０％トリクロ ロ酢酸を加えて夾雑するタンパク 質を沈澱させ、遠心分離する。上 澄１　ｍｌをとり１％トリトン５０１Ｌｅ蒸留水３．５
　ｍｌ及び２．５％（、、Ａ）モリブデン酸アンモニウ
ムを含む５規 定の硫酸水溶液０．５　ｍｌを加え、２０分後６６０　
ｎｍの吸光度を用いて測定する。

実施例 〔シー−トモナス　エスピー　ＹＭ−３２２９Ｇの分離
〕札幌市丸山公園内で採取された土壌サンプルを一夜風
乾し、適当な濃度になるまで滅菌生食液で希釈した後１
分離用培地にサンプルを混釈しシャーレに流す。なお分
離用培地の組成は酵母エキス０．１％、肉エキス０１％
、Ｎ−ＺアミンタイプＡ　Ｏ，２％、グルコース１．０
％、タウリン０５％、寒天１．５％でありｐＨは７，０
である。２８Ｃで５日間培養した後、ベネット寒天斜面
培地に釣菌し、さらに同温度で７日間培養したものを原
菌株（ＹＭ　−３２２９Ｇ株）とした。

〔制癌作用物質ＹＭ−３２２’ｌＧの採取〕（１）　　
グルコース２．５％、大豆粉１．５％、綿実粕０．５％
、肉エキス１％、炭酸カルシウム０．３％、塩化ナトリ
ウム０．２％を含むｐＨ７，０の液体培地３Ｌを用意し
、培地を５００　ｍｌの三角フラスコにそれぞれ１００
ｍ１ずつ分注し、１２０Ｃで２０分間滅菌する。

滅菌終了後、了じめ調製したシー−トモナスエスピー　
ＹＭ　−３２２９Ｇ株の前培養菌液をそれぞれのフラス
コに２ｍＺずつ接種し、２７Ｃで４日間振盪培養する。

培養終了後、それぞれのフラスコ中の培養液を集め、　
５０００回転、　　１０分間遠心分離し、遠心上清を集
めると２５８乙の培養液が得られる。

この培養液には、前記検定法によって測定したところ５
′−ヌクレオチダーゼ活性を５０％阻止する濃度を１単
位とすると、５′−ヌクレオチダーゼ活性阻止物質が全
体量として４９０，０００単位含有する。

培養液をＴ））１７．８に調整し、４３Ｃで１．２２　
Ｚまで濃縮すると５′−ヌクレオチダーゼ活性阻止物質
が全体量として３３０，０００単位となった。濃縮液に
５０％トリクロロ酢酸を最終濃度５％となるように加え
攪拌した後、放置すると沈澱が生ずる。沈澱を１２００
０回転１５分間遠心分離して除去する。遠心上清を集め
（総量１．０１　ｔ　）　、　　これにエタノールを最
終濃度８０％となるように加える。生成する沈澱を５０
００回転１０分間遠心分離して回収し、さらに８０％エ
タノール水溶液で洗浄した後乾燥すると黄色の粗粉末２
２７．３ｇが得られる。

粗粉末１１４．７　ｇ　（２２０，０００単位）をとり
、　　１１６５＋ｎＺの蒸留水に溶解し、　Ｄｏｗｅｘ
　Ｉ　Ｘ２　（■型）（ダウ　ケミカルズ社製）の強塩
基性の樹脂を用い蒸留水で展開し、１フラクション１０
ｍ１ずつ分画すると。

フラクション／１６１６〜１０８のものに活性が認めら
れた。活性画分を集め、凍結乾燥すると３．３１７ｇの
淡黄色の粗粉末が得られる。この粗粉末１ｍｇの力価は
３８単位であり、全体量として１２６，０５０単位であ
った。収率は５７％。

（２）　　この粗粉末６０ｍｇを２０　ｍｌの蒸留水に
分散させ、　４０，０００回転３０分間遠心分離して沈
澱物を除去し、遠心上清を高速液体クロマトグラフィー
（ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ　ＨＷ５０　ｓφＸ５０Ｃｍ、東
洋ソーダー社製）に付し、蒸留水で展開して精製し、減
圧濃縮する。

濃縮物を更に同じ操作に付して精製を繰り返して行ない
、溶出時間２０分から３２分までをフラクション２　＋
　３２分から４０分までをフラクション３，４０分から
５６分までをフラクション４として分取し。

それぞれ濃縮した後凍結乾燥まると白色の粉末が得られ
る〔フラクション２がらは１１．７　ｍｇ　（３ｏ単位
／＋ｎｇ）、フラクション３からは１０　ｍｇ　（３３
単位／ｍｇ）。

フラクション４がらは６ｒｌ１ｇ（２５単位／ｍｇ）〕
。

得られた白色粉末１００　ｍｇを、さらに高速液体り０
’？トゲラフ　イー　（ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ　５０００
ｐｗ、東洋ソーダー社製）に付し、０１Ｍリン酸緩衝液
（ｐＨ７，０）で分画する。得られる活性画分を集め濃
縮した後。

セロファンテー−ブで３日間蒸留水で脱塩透析し。

凍結乾燥して白色粉末の有効物質ＹＭ　−３２２９Ｇが
１５ｍｇ（５７単位／ｍｇ）得られた。

【図面の簡単な説明】

第１図はＹＭ　−３２２９Ｇの赤外線吸収スペクトルを
示す。 代理人　佐々木　晃　−

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. シー−トモナス属に属し、制癌作用物質ＹＭ−３２２９
   Ｇを産生することを特徴とする新規微生物