JPS6135832B2

JPS6135832B2 -

Info

Publication number: JPS6135832B2
Application number: JP8023879A
Authority: JP
Inventors: Jiro Ito; Shinji Myaji; Norio Ezaki; Tomizo Niwa; Jujiro Yamada
Original assignee: Meiji Seika Kaisha Ltd
Current assignee: Meiji Seika Kaisha Ltd
Priority date: 1979-06-27
Filing date: 1979-06-27
Publication date: 1986-08-15
Also published as: JPS565495A

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は抗生物質、およびその製造法に関する
ものであり、さらに詳しく述べるとエルビニア属
に属する細菌を培地に培養し、得られた培養物か
ら分離、採取した新抗生物質BN―240―Ｂ物質、
およびその製造法に関するものである。本発明者らはエルビニア属に属する菌株の培養
物中に主としてグラム陰性細菌に抗菌活性を示す
物質が生産されていることを見出し、その有効物
質を培養物中から純粋に単離し、その性状を調べ
た結果、既知の物質と異なる新抗生物質であるこ
とを確かめ、この有効物質をBN―240―Ｂ物質と
命名し本発明を完成した。本発明の方法で使用されるエルビニア属の菌株
の一例としては、本発明者らによつて広島県の土
壌から新たに分離されたエルビニアsp・BN―240
株がありこの菌株は工業技術院微生物工業技術研
究所に保管委託申請書受理番号4994号において保
管されている。エルビニアsp・BN―240株の菌学的性質は以下
に記すとおりである。 (a) 形態的性質肉汁寒天上で培養した細胞は、0.5〜0.8×1.0
〜3.0ミクロンの桿菌であり側毛により運動す
る。胞子やさやは作らず多形性も示さない。グラム染色性および抗酸性は陰性である。 (b) 培養的性質 (1) 肉汁寒天培養：菌体は黄茶色でクリーム様
に生育する。集落は顕著なシワ様増殖、粘稠
性、遊走性を示さず、拡散性色素の生成も認
められない。 (2) 肉汁培養：培地全体が混濁する。 (3) 肉汁ゼラチン穿刺培養：液化される。 (4) ミルク培養：ペプトン化や凝固など顕著な
変化は認められない。 (c) 生理的性質 (1) 硝酸塩の還元：陰性 (2) 脱窒反応：陰性 (3) MRテスト：陽性 (4) VPテスト：陽性 (5) インドールの生成：陽性 (6) 硫化水素の生成：陰性 (7) デンプンの加水分解：陰性 (8) 無機窒素源の利用：アンモニウム塩を唯一の
Ｎ源として利用する。 (9) クエン酸の利用：陽性 (10) 色素の生成：菌体は黄色いが水溶性色素は生
成しない。 (11) ウレアーゼ：陰性 (12) オキシダーゼ：陰性 (13) カタラーゼ：陽性 (14) リジンデカルボキシラーゼ：陰性 (15) オルニチンデカルボキシラーゼ：陰性 (16) アルギニン加水分解：陰性 (17) フエニルアラニン脱アミノ酵素：陰性 (18) KCN耐性：陰性 (19) 生育温度：10〜37℃で生育するが、42℃
で生育しない。 (20) 通性嫌気性 (21) OFテスト：Ｆ型、ガスの発生は認めら
れない。 (22) 糖の利用性：アラビノース（＋），グリ
セリン（＋），イノシツト（＋），ラクトース
（＋），マルトース（＋），マンニツト（＋），
ラムノース（＋），サリシン（＋），シユーク
ロス（＋），キシロース（＋），トレハロース
（＋），アドニツト（−），ズルシツト（−）以上の菌学的性質を示す細菌はグラム陰性桿菌で運動を持つといる形態的性
質を有し、通性嫌気性であり、カタラーゼ陽
性、オキシダー陰性であることからBN―240株
はFamily Enterobacteriaceae（腸内細菌科）
に所属すると判定した。グルコースからガスを発生しない、硝酸還元
能陰性、黄色い菌体、ゼラチン液化陽性、
KCN耐性なし、リジンデカルボキシラーゼ陰
性、オルニチンデカルボキシラーゼ陰性などの
性質より、腸内細菌科の中ではErwinia属に所
属すると考えられる。 Bergey’ｓ Manual8版によれば、糖の利用
性パターンはErwinia herbicola var ananasの
記載に近い。 BN―240―Ｂ物質生産菌を培養し、BN―240―
Ｂ物質を生産蓄積させるには、通常の微生物の発
酵に用いられる各種の培地が使用できる。すなわ
ち炭素源としてグルコース、グリセリン、デキス
トリン、デンプン、水あめなどが用いられ、窒素
源として市販のペプトン、肉エキス、粉末ブイヨ
ン、コーンステイープリカー、大豆粕、魚粉、硫
安、塩安などが用いられる。また食塩や炭酸カル
シウム等の無機塩を併用することもあり、必要に
より消泡剤を添加することもある。培養方法としては振盪培養法、深部通気撹拌培
養法等の液体培地を使用する方法が適当である。
培養温度は20℃〜35℃の範囲で選択され、培養時
間は２〜４日が適当である。 BN―240―Ｂ物質の検定に当つては次の方法が
用いられる。検定用培地としては、マイシンアツ
セイアガー（共栄製薬製）２％を用いる。検定菌としてはエシエリヒアコリーNIHJを用
いる。BN―240―Ｂ物質（純品）はこれを用いた
検定で250mcg／ml〜2000mcg／ml濃度の対数と
阻止円径との関係は直線関係を示し、それぞれ
16.0mm〜20.0mmの阻止円をペーパーデイスク法で
与える。BN―240―Ｂ物質は後記する理化学的性
状を有するので、その性状に従つて抽出、精製す
ることが可能であり、以下に示す方法が効率的で
ある。即ち、有効成分を含む培養物から固形分を去
し、液をダイヤイオンHP―20（三菱化成社
製）カラムにかけ、有効成分を樹脂に吸着させた
のち、50％メタノール溶液あるいは50％アセトン
溶液で溶出し、濃縮乾固してBN―240―Ｂ物質の
粗製物を得る。さらに精製するには、イオン交換
樹脂、イオン交換セフアデツクス、セフアデツク
スＧ―10等を用いたクロマトグラフイーにより
BN―240―Ｂ物質の精製品を得る。かくして得ら
れたBN―240―Ｂ物質の精製品は各種の溶剤系の
ペーパークロマトグラフイー、薄層クロマトグラ
フイーで単一のスポツトを示し、BN―240―Ｂ物
質が純品であることを示している。本BN―240―Ｂ物質の理化学的性状は以下に示
す通りである。１元素分析値：Ｃ；44.22％，Ｈ；6.38％，
Ｎ；17.41％，Ｏ；31.99％（差）２分子量セフアデツクスＧ―25（フアルマシア社製）
によるゲル過の結果２，000〜２，200と推定
される。３融点 210℃付近より褐変しはじめ250℃付近で発泡
分解する。４比旋光度〔α〕^２０ _Ｄ−37.3゜（Ｃ＝１，H₂O）５紫外部吸収スペクトル水に溶解して測定したスペクトルは第１図に
示した通りである。６赤外部吸収スペクトル臭化カリウム錠として測定したスペクトルは
第２図に示した通りである。７溶剤に対する溶解性メタノール、水、ジメチルスルホキサイドに
は溶けるが、アセトン、クロロホルム、酢酸エ
チルにはほとんど溶けない。８呈色反応ニンヒドリン反応：陽性ビユーレツト反応：陽性坂口反応：陰性フエーリング反応：陰性塩化第二鉄反応：陰性９物質の形状、色白色の粉末 10 シリカゲル薄層クロマトグラフイーにおける
Rf値ｎ―ブタノール―メタノール―水（４：１：
２）…０ｎ―ブタノール―エタノール―クロロホルム
アンモニヤ（４：５：２：８）…0.66 ｎ―ブタノール―酢酸―水（２：１：１）…
0.10 11 アミノ酸組成６規定塩酸で110℃、16時間分解し、アミノ
酸分析計で分析した結果、アスパラギン酸、ス
レオニン、リジン、グリシン、ロイシン、イソ
ロイシン、中性未知アミノ酸２種類および塩基
性未知アミノ酸１種類検出され、その含有比は
２：１：３：７：１：２：１：１：１であつ
た。 12 塩基性、酸性、中性の区別高圧紙電気泳動を以下の条件で行つた。PH
6.4，3500V，30分泳動し、陰極に3.1cm移動し
た。このときアラニンは1.5cm、アルギニン
12.3cm陰極に移動した。以上の結果、本物質は塩基性物質であること
を示している。本BN―240―Ｂ物質の各種微生物に対する活性
は第１表に示した通りで、抗菌剤として有用であ
る。またマウスを用いた急性毒性試験の結果50mg／
Kgを静脈内投与してもマウスは全例生存してい
た。以上の諸性状から明らかなように、本BN―240
―Ｂ物質はペプタイド系抗生物質であり、既知抗
生物質に一致するものがなく、BN―240―Ｂ物質
は新規な抗生物質であると認められる。また化学
合成化合物中にも本BN―240―Ｂ物質に該当する
ものはない。

【表】

【表】次に本発明の実施例を記載するが、これらは単
なる例示であつて、なんら本発明を制限するもの
ではない。（実施例１） 500ml容坂口フラスコ20本に大豆粕１％、グル
コース２％、ペプトン0.5％、塩化ナトリウム0.5
％、塩化アンモニウム0.2％、炭酸カルシウム0.3
％を含有する液体培地を100mlずつ分注して綿栓
を施し、120℃、10分加圧滅菌し、FERM―Ｐ
4994株の斜面培養より一白金耳ずつ植菌した。28
℃、２日間振盪培養してBN―240―Ｂ物質を含有
する培養液1.8lを得た。この培養液から固形分を別し、液をダイヤ
イオンHP―20（三菱化成社製のカラムに通し、
有効成分を吸着させた。これを水洗したのち50％アセント水で溶出し
た。溶出された活性区分を集め、減圧濃縮し、約
３ｇの褐色粗粉末を得た。この粗粉末を水に溶解
し、CM―セフアデツクスＣ―25（フアルマシア
社製）のカラムに通し有効成分を吸着させた。これを水洗したのち、0.2モル塩化ナトリカム
溶液で溶出した。この溶出液を再びダイヤイオン
HP―20（三菱化成社製）のカラムに通し有効成
分を吸着させた。該カラムを水洗したのち50％ア
セトン水で溶出し、活性区分を集め減圧濃縮し約
720mgの粗粉末を得た。この粗粉末を少量の水に
溶解し、セフアデツクスＧ―10（フアルマシア社
製）のカラムにのせ、水で展開し、活性区分を集
め凍結乾燥し約110mgの白色粉末を得た。（実施例２）大豆粕１％、グルコース２％、ペプトン0.5
％、塩化ナトリウム0.5％、塩化アンモニウム0.2
％、炭酸カルシウム0.3％、消泡用シリコン0.03
％を含む培養基20を30容培養槽に仕込んで
120℃、10分殺菌し、冷却後、あらかじめ同培地
にて２本の坂口フラスコ２日間前培養した
FERM―Ｐ 4994株の種菌を培養槽に植菌し
た。 28℃にで通気撹拌培養（通気量20／分，撹拌
数200r.p.m）し、培養２日でBN―240―Ｂ物質を
含有する培養液16を得た。この培養液から固形分を別し、液をダイヤ
イオンHP―20（三菱化成社製）のカラムに通
し、有効成分を吸着させた。これを水洗したのち50％アセトン水で溶出し、
溶出された活性区分を集め減圧濃縮し約28ｇの褐
色粗粉末を得た。この粗粉末を水に溶解し、CM―セフアデツク
スＣ―25（フアルマシア社製）のカラムに通し、
有効成分を吸着させた。これを水洗したのち0.2
モル塩化ナトリウム溶液で溶出した。この溶出液
を再びダイヤイオンHP―20（三菱化成社製）の
カラムに通し、有効成分を吸着させた。該カラム
を水洗したのち50％アセトン水で溶出し、活性区
分を集め減圧濃審縮し約6.8ｇの粗粉末を得た。この粗粉末を少量の水に溶解し、数回に分けて
セフアデツクスＧ―10（フアルマシア社製）のカ
ラムにのせ、水で展開し、活性区分を集め凍結乾
燥し約１ｇの白色粉末を得た。

【図面の簡単な説明】

第１図はBN―240―Ｂ物質の紫外部吸収スペク
トルであり、本物質を550mcg／mlの濃度に溶解
し水イ，0.1規定塩酸ロ，0.1規定カ性ソーダーハ
で測定したものである。第２図はBN―240―Ｂ物
質の赤外部吸収スペクトルであり、臭化カリウム
に混合し錠剤にして測定したものである。

Claims

【特許請求の範囲】１下記の特性を有する新抗生物質BN―240―Ｂ
物質炭素44.22％、水素6.38％、窒素17.41％、酸素
31.99％（差）であり、水での紫外部吸収が第１
図に、臭化カリウム錠での赤外部吸収が第２図に
示す如きスペクトルを有し、ニンヒドリン、ビウ
レツト反応で陽性、フエーリング、塩化第２鉄反
応で陰性を示し、酸化水分解によりアスパラギン
酸、スレオニン、リジン、グリシン、イソロイシ
ン、ロイシン、未知アミノ酸３ケが検出される２エルビニア属に属するBN―240―Ｂ物質生産
菌を培養し、培養物からBN―240―Ｂ物質を採取
することを特徴とする新抗生物質BN―240―Ｂ物
質の製造法。