JPH0479892A

JPH0479892A - Ｆｒ９０１２２８物質の製造方法

Info

Publication number: JPH0479892A
Application number: JP19407090A
Authority: JP
Inventors: Takanao Otsuka; 隆尚大塚; Takashi Fujita; 隆藤田; Michio Yamashita; 道雄山下; Hiroshi Terano; 寺野　紘; Masakuni Okuhara; 正國奥原
Original assignee: Fujisawa Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Fujisawa Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1990-07-24
Filing date: 1990-07-24
Publication date: 1992-03-13
Anticipated expiration: 2014-08-23
Also published as: JP2936663B2

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】（産業上の利用分野）本発明は、ＦＲ９０１２２８物質を製造するための方法
に関するものであり、更に詳細には、シュードモナス属
細菌を使用する新規な製造方法に関するものである。

（従来の技術）本発明者らは、新規な生理活性物質の探索研究を鋭意行
った結果、ごく最近になって、抗菌活性及び抗腫瘍活性
を有するすぐれた生物学的活性物質であるＦＲ９０１２
２８物質をはじめて発見し、併せてクロモバクテリウム
属菌による製法の開発にも成功した（特開平２−８５２
９６号）。

本発明者らは、上記研究を更に進展せしめて、生物学的
に活性な新規環状ペプチド系物質であるＦＲ９０１２２
８物質を、シュードモナス属菌によって製造する技術を
ここに開発することに成功したものであるが、このよう
なことは従来全く知られておらず新規である。

（発明が解決しようとする問題点）本発明は、ＰＲ９０１２２Ｂ物質を製造するに当り、ク
ロモバクテリウム属菌を用いる方法ではなく、これとは
全く別異の新規な製法を開発する目的でなされたもので
ある。

（問題点を解決するための手段）本発明は、上記目的を達成するためになされたものであ
る。

そこで本発明者らは、各種微生物のスクリーニングを鋭
意且つ広範に行った結果、三重県から採取した土壌サン
プル中から分離したＮα２３１４株が培養物中にＦＲ９
０１２２８物質を蓄積することを発見し。

この新知見を基礎として更に研究の結果、本発明を完成
するに至った。

以下、本発明の詳細な説明する。

（１）微生物Ｎα２３１４株は、三重県から得られた土壌より分離さ
れた細菌である。

その分類学的研究は、主にＢｅｒｇｅｙ’ｓ　Ｍａｎｕ
ａｌ　ｏｆＳｙｓｔｅｍａｔｉｃ　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ
ｏｇｙ（Ｖｏｌｕｍｅ　１）に記載された方法に従った
。

（ｉ）形態的特徴重両を栄養ブロス及び栄養寒天培地上において３０℃、
２４時間生育せしめた後、光学顕微鏡及び電子顕微鏡下
で形態の観察を行なった。

本菌株は、ダラム陰性、運動性の桿菌である。

細胞は、０．８〜１．ＯＸ２．０−３．０μｍの大きさ
である。

その結果を表１に示した。

表ｌＮ１１２３１４株の形態的性質ダラム染色　　　　　　陰性コロニーの色調　　　　灰味黄色細胞の形態　　　　　　桿菌細胞の大きさ　　　　　０．８〜１．ＯＸ　２．０〜３
．０μ論胞子　　　　　　　　　陰性（ｉ）生理的特徴重両の生理的特徴を、表２に示した。

本閑の生育温度範囲は、１２℃から３４℃であった。

オキシダーゼ、カタラーゼは陽性で、０−Ｆ試験は、酸
化的であった。硝酸塩は、還元されなかった。ゼラチン
、カゼインの分解は、陽性であった。

デンプンの分解は、陰性であった。リジンデカルボキシ
ラーゼは、陽性であった。アルギニンジハイドロラーゼ
、オルニチンデカルボキシラーゼは陰性であった。グル
コース、マンニトール、フラクトース、シュークロース
から酸を産生した。グルコース、マンノース、マンニト
ール、Ｎ−アセチル−グルコサミン、グルコン酸、カプ
リン酸、アジピン酸、リンゴ酸、クエン酸、酢酸フェニ
ルを資化した。本菌株のＤＮＡのＧ＋Ｃ含量は、６７．
１ｍｏ１％であった。

表２Ｎ（１２３１４株の生理的性質生育温度範囲　　　　　　　１２℃〜３４℃空気中での
発育　　　　　　　陽　性カタラーゼオキシダーゼ０−Ｆ試験Ｈ２Ｓ産生（ＳＩＭ）クエン酸の資化性インドール産生硝酸塩の還元ゼラチン液化カゼイン加水分解表２（続き）デンプン加水分解０ＮＰＧ試験Ｎａ５ｅＴｔｉｅｅｎ８０加水分解リジンデカルボキシラーゼアルギニンジカルボキシラーゼオルニチンデカルボキシラーゼ糖より酸の産生Ｄ−グルコースＤ−マンニトールＤ−フラクトースＤ−キシロースラクトースマルトースシュークロースサリシン表２（続き）糖、有機酸の資化性Ｄ−グルコースＬ−アラビノースＤ−マンノースＤ−マンニトールＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンマルトースグルコン酸カプリン酸アジピン酸リンゴ酸クエン酸酢酸フェニルＤＮＡのＣ＋Ｃ含量陽性陰性陽性陽性陽性陰性陽性陽性陽性陽性陽性陽性６７．１ｍｏ１％（ｉ）微生物の同定及び寄託以上の特徴をＢｅｒｇｅｙ’ｓ　Ｍａｎｕａｌ　ｏｆ　
ＳｙｓｔｅｍａｔｉｃＢａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ（Ｖｏ
ｌｕｍｅ　１）より検索した結果、＆２３１４株は、シ
ュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）に属すると考
えられた。よって１重両株をシュードモナス　エスピー
Ｎｎ２３１４（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｓｐ、　Ｎα
２３１４）と同定した。

本菌株の培養物は、工業技術院微生物工業技術研究所（
〒３０５、茨城系つくば市東１−１−３）八ＦＥＲＮＰ
−１１４４４の番号で寄託されている。（寄託日＝　１
９９０年５月１０日）（２）　ＦＲ９０１２２８物質の生産本発明に係るＦＲ９０１２２８物質は、シュードモナス
属に属する該物質生産菌（例えばＰｓｅｕｄｏｍｏｎａ
ｓ　ｓｐ。

Ｎα２３１４）を資化しうる炭素及び窒素源を含む栄養
培地中に接種し、好気条件下で培養することにより（例
えば、振どう培養、通気撹拌培養等）、生産せしめるこ
とができる。

炭素源としては、グルコース、シュークロース、澱粉、
フラクトース、グリセリンその他の炭水化物を使用する
のが好ましい。

窒素源としては、ブイヨン、オートミール、イーストエ
キストラクト、ペプトン、グルテンミール、綿実粉、大
豆ミール、コーンステイープリカ、乾燥イースト、小麦
胚芽、落花生粉、チキン骨肉ミール等を使用するのが好
ましいが、アンモニウム塩（例えば、硝酸アンモニウム
、硫酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等）、尿素、
アミノ酸等の無機及び有機の窒素化合物も有利に使用す
ることができる。

これらの炭素源及び窒素源は、併用するのが有利である
が、純粋なものを必らずしも使用する必要はない。純粋
でないものには、生長因子や機敏要素が含まれているか
らである。

必要ある場合には、例えば次のような無機塩類を培地に
添加してもよい：炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、リン
酸ナトリウム、リン酸カリウム、塩化ナトリウム、塩化
カリウム、ヨウ化ナトリウム、ヨウ化カリウム、カルシ
ウム塩、マグネシウム塩、銅塩、コバルト塩等。

特に、培地が強く発泡するのであれば、必要あるときに
、液体パラフィン、動物油、植物油、鉱物油、シリコン
等を添加してもよい。

目的物質を大麓に工業生産するには、他の発酵生産物の
場合と同様に、通気撹拌培養するのが好ましい。夕景生
産の場合は、フラスコを用いる振どう培養が好適である
。

また、培養を大きなタンクで行う場合、ＦＲ９０１２２
８物質の生産工程において菌の生育遅延を防止するため
、はじめに比較的少量の培地に生産菌を接種培養した後
、次に培養物を大きな生産タンクｐこ移してそこで生産
培養するのが好ましい。

この場合、前培養に使用する培地及び生産培養に使用す
る培地の組成は、両者ともに同一であってもよいし必要
あれば両者を変えてもよい。

培養は通気撹拌条件で行うのが好ましく、例えばプロペ
ラやその他機械による撹拌、ファーメンタ−の回転また
は振どう、ポンプ処理、空気の吹込み等既知の方法が適
宜使用される。通気用の空気は滅菌しておくのが良い。

培養温度は、本ＦＲ９０１２２８物質生産菌が本物質を
生産する範囲内で適宜変更しうるが、通常は１０〜４０
℃、好ましくは２５〜３５℃で培養するのがよい。

培養時間は、培養条件や培養量によっても異なるが、通
常は約１５〜５０時間である。

発酵終了後、培養物から目的とするＦＲ９０１２２８物
質を回収する。すなわち、菌体は、直接水及び／又は有
機溶媒による抽出、あるいは、これを機械的に又は超音
波等既知の手段を用いて破壊した後、水及び／又は有機
溶媒で抽出した後、常法にしたがって回収、精製する。

培養液の場合は、直接、常法にしたがって回収、精製す
ればよい。

回収、精製方法としては１例えば、水、有機溶媒、これ
らの混合溶媒による溶媒抽出；クロマトグラフィー；単
一溶媒又は混合溶媒からの再結晶等常法が滴宜単独であ
るいは組合わせて使用できる。

ＦＲ９０１２２８物質の回収、精製は上記のように既知
の方法を適宜利用して行うが、例えば次のようにしても
よい。まず、培養物の濾液ないし抽出液を、熱水、酢酸
エチル、アセトン、またはこれらの混合溶媒で抽出し、
抽出液を蒸発又は蒸留して濃縮する。濃縮残渣をクロマ
トグラフィ又は再結晶処理して、粘製し、必要あれば更
に凍結乾燥してもよい。

（３）　ＦＲ９０１２２８物質の物理化学的性質上記し
た発酵法にしたがって得られるＦＲ９０１２２８物質は
、次の物理化学的性質を有する。

外観：無色プリズム晶融点：２５５〜２６０℃（分解）（メタノール中での結晶）比旋光度：（ａ　ｐ”　　：　＋３９°（ｃ＝１．０、　ＣＨＣｌ
３　）溶解性：可溶：クロロホルム、酢酸エチル難溶：メタノール、エタノール不ｒｓ：水、ヘキサン呈色反応：陽性：硫酸セリウム反応、硫酸反応、沃素蒸気反応薄層クロマトグラフィー：紫外吸収スペクトル：末端吸収（メタノール中）赤外吸収スペクトル：１４α０．１３９０．１３７０．１３５０．１３００．
１２５０゜１２２０．１１７０．１１００．１０４０．１０２０゜
１０００．９８０．９１０ｃｍ−１ＨＰＬＣ：カラム：　ＹＭＣ−ＧＥＬ　０ＤＳ（５μｍ）　（４ｍ
＋　Ｘ　２５０ｍｍ）検出方法：　２１０ｒｖ＋の紫外
部吸収による溶　媒：６５％メタノール流　速：　１．ＯｍＡ／１１ｉｎ保持時間：　０．９５（ＦＲ９０１２２８物質のＲＴは、同一条件下では、同
じく０．９５であった）Ｐｓｅｕｓｄｏｍｏｎａｓ　ｓｐ、　Ｎｎ２３１４を用
いて前述した方法により得られた物質は、上記したその
物理化学的性質を分析した結果、本発明者らに係る先行
文献（特開平２−８５２９６号）に記載されたＦＲ９０
１２２８物質と同一物質であることが判った。

（４）　ＦＲ９０１２２８物質の化学構造上記先行文献
によれば、ＦＲ９０１２２８物質の化学構造は次のとお
りである。

以下、本発明を実施例について更に詳しく説明する。

実施例１（１）発酵グルコース（１％）及びブイヨン（１％）を含む滅菌溶
液１６０ｍＱを収容した５００社の三角フラスコを１２
個用意し、これに成熟斜面培養物からＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｓｐ、　Ｎ（１２３１４（Ｆ
ＥＲＮ　Ｐ−１１４４４）を移しかえた。

得られた種培養物を接種し、ロータリーシェーカーを用
い、３０℃で１日培養した。

１０個のフラスコの内容物を用いて、２０Ｑ容ジャーフ
ァーメンタ−５基の接種を行い、生産培養を行った。

なお生産培地は、グルコース（２％）、グリセリン（１
％）、大豆ミール（１％）、ブイヨン（０，５％）、コ
ーンステイープリカー（１％）、（ＮＨ４）２Ｓｏ４（
０，１％）及びＭｇＳＯ４・７Ｈ２０（０，００６％）
から構成した。滅菌に先立ち、０．２％ＣａＣＯ３を添
加してｐＨを７に調節した。

そこで、３０℃、２００ｒｐｍで、３日間発酵を行った
。

その際ファーメンタ−の平均ρ！１は、２４．４８．７
２時間後にそれぞれ５．７８．６．５７．６．４７であ
った。

（２）分離精製活性化合物の検出は、次のいずれかのシステムを用いて
行った。

Ｌｉｃｈｒｏｓｐｈｅｒ　ＲＰ−１８カラムを備えた１
（ＰＬＣシステム＝５μｍ、　４Ｘ２５０ｍ＋。

溶　媒；メタノール：アセトニトリル：テトラハイドロ
フラン：水ニリン酸（２０：　２０　：　５　：　５５　：　０．１　；シ
：ｖ：ｖ：ｖ：Ｖ）検　　出；　ＵＶ　λ＝２１０ｍｎシリカゲル薄層クロマトグラフィーニジリカゲル；　６０Ｆ２Ｓ４（Ｅ、メルク社製）溶　媒
　　；ジクロロメタン、メタノールのｌ０＝１混合物、
又は酢酸エチル３日間培養した後の発酵ブロスにアセトン２００Ｑを加
え、得られた混合物を２４時間放置して平衡化せしめた
。濾過を容易ならしめるために、ケイソウ土と５ｉｌｉ
ｋａ　３００Ｓとの混合物を加えた後、濾過を行い、ケ
ーキは廃棄した。

減圧により溶媒を除去し、得られた水性溶液（５Ｑ）の
ｐＨを７に調整した後、ＩＯＱの酢酸エチルを用いて４
回抽出した。有機層を真空中で乾燥せしめて、油状残渣
２．４３４　ｇを得た。この油状残渣を１０ｍＱの５ｉ
ｌｉｃａ　ｇｅｌ　６０（７０〜２３０メツシユ、Ｅ、
メルク社ｆＲ）と混合し、この混合物をメタノール中で
スラリー化し、サンプルの被覆を行った。溶媒を蒸発せ
しめて被覆サンプルを得た。

このようにして得た被覆サンプルを、ｎ−ヘキサンを用
いて充填した５ｉｌｉｃａ　ｇｅｌ　６０カラム（４０
ｍＱ、２７■）上に適用した。段階的に展開することに
より、活性化合物を酢酸エチル中に溶出せしめた。

これを減圧濃縮して、油状残渣を得た。油状残渣には活
性化合物が１８．６８■含まれていた。

油状物質をシリカゲル２ｍＲ上で被覆し、これを、ジク
ロロメタンを用いて充填したＢＷｒＱカラム（Ｓｉｌｉ
ｃａ　ｇｅｌ　６０　；　７（１−２３０メツシュ；メ
ルク社製）上に適用した。カラムをジクロロメタン３０
＋ｏ１２で洗浄した後、ジクロロメタン：メタノール（
５０：１；Ｖ　：　Ｖ）でカラムの展開を行った。

活性フラクションを合し、減圧濃縮して、５７．１■の
油状残渣（１６，９ＩＩＩｇ）を得た。再結晶の結果、
純度９０．０％の結晶が８．４■得られ、純度９１．３
％の結晶が２．２■得られた。

（発明の効果）本発明は、抗菌活性及び抗腫瘍活性を有するすぐれた生
理活性物質である。ＦＲ９０１２２８物質について、こ
れを製造するための新しい方法をはじめて開発したもの
であって、その工業的価値が大いに期待されるものであ
る。

Claims

【特許請求の範囲】

（１）シュードモナス属に属するＦＲ９０１２２８物質
生産菌を培養してＦＲ９０１２２８物質を生成せしめ、
これを採取することを特徴とするＦＲ９０１２２８物質
の製造方法。
（２）シュードモナス属に属するＦＲ９０１２２８物質
生産菌がシュードモナスエスピーＮｏ．２３１４である
ことを特徴とする請求項１に記載の方法。
（３）シュードモナスエスピーＮｏ．２３１４（ＦＥＲ
ＭＰ−１１４４４）の生物学的に純粋な菌株。