JPH05260984A

JPH05260984A - ３−ヒドロキシ酪酸および／またはその３量体の製造方法

Info

Publication number: JPH05260984A
Application number: JP4066311A
Authority: JP
Inventors: Nobuo Kato; 暢夫加藤
Original assignee: Mitsubishi Kasei Corp
Current assignee: Mitsubishi Kasei Corp
Priority date: 1992-03-24
Filing date: 1992-03-24
Publication date: 1993-10-12

Abstract

(57)【要約】【構成】バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属に属する微
生物の培養物またはその菌体処理物を使用して３−ヒド
ロキシ酪酸の単量体（３−ＨＢ）および／またはその３
量体（３−ＨＢ₃）を製造する。【効果】３−ＨＢおよび３−ＨＢ₃は、生分解性ポリ
マーとして有用なポリ−３−ヒドロキシブチレートまた
はそれとポリホドロキシバリレートとの共重合物の原料
となり、本発明の方法を用いることにより、効率良く製
造することができる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、微生物反応および／ま
たは酵素反応を利用した３−ヒドロキシ酪酸および／ま
たはその３量体の製造方法に関し、詳細には生分解性ポ
リマーの原料等として有用な３−ヒドロキシ酪酸および
／またはその３量体を、微生物反応および／または酵素
反応を利用して製造する方法に関するものである。

【０００２】

【従来の技術および発明が解決しようとする課題】近
年、地球環境問題等から生分解性ポリマーの需要が高ま
りつつある。かかる生分解性ポリマーとして、ポリ−３
−ヒドロキシブチレートあるいはそれとポリヒドロキシ
バリレートとの共重合物（以下、これらをまとめて「Ｐ
ＨＢ」と略すこともある。）が知られており、これは例
えばアルカリゲネス属に属する微生物の作用により生産
される（欧州特許３０４２９３号公開公報、欧州特許６
９４９７号公開公報、欧州特許２０４４４２号公開公報
等）。

【０００３】かかる微生物反応を使用する微生物学的方
法によれば、微生物の菌体内に目的とするＰＨＢを産生
させることができるという利点を有するものの、逆に菌
体内に産生するためにその蓄積量に限界があり、十分に
生産量を上げることができないという問題があった。そ
こで３−ヒドロキシ酪酸（以下、「３−ＨＢ」と略すこ
ともある。）、その３量体（以下、「３−ＨＢ₃」と略
すこともある。）等を原料とし、重合させてＰＨＢを製
造する検討が行われているが、かかる原料を安定、かつ
安価に供給する方法はまだ確立されていないのが現状で
あった。

【０００４】

【課題を解決するための手段】本発明者らは上記問題点
につき鑑み検討を重ねた結果、特定の微生物またはその
菌体の処理物の作用により生分解性ポリマーの原料とし
て有用な３−ヒドロキシ酪酸および／またはその３量体
を製造できることを初めて見出し、本発明を完成するに
至った。

【０００５】即ち本発明の要旨は、微生物反応および／
または酵素反応により３−ヒドロキシ酪酸および／また
はその３量体を製造する方法において、バチルス属に属
し３−ヒドロキシ酪酸および／またはその３量体を生産
する能力を有する微生物またはその菌体の処理物を使用
することを特徴とする３−ヒドロキシ酪酸および／また
はその３量体の製造方法に存する。

【０００６】以下、本発明につき詳細に説明する。本発
明では、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）に属する微生
物から選ばれる微生物菌体またはその菌体処理物を使用
する。かかる微生物としては、バチルス属に属し３−ヒ
ドロキシ酪酸の単量体および／または３量体を生産する
能力を有するものであれば特に制限はされない。具体的
には、バチルス・メガテリウムＢ−１２４（Ｂａｃｉ
ｌｌｕｓｍｅｇａｔｅｒｉｕｍＢ−１２４）（以
下、「本菌株」または「Ｂ−１２４号菌」と略すことが
ある）が挙げられる。Ｂ−１２４号菌は、本発明者らに
より鳥取県の天然土壌から分離された細菌であり、工業
技術院微生物工業技術研究所に微工研菌寄第１２８０３
号（ＦＥＲＭＰ−１２８０３）として寄託されてい
る。その菌学的性状は次の通りである。

【０００７】

【表１】１．形態学的性状 ○普通寒天培地上、３０℃ ５日間培養後のコロニーの特徴１）外形：円形２）表面の隆起：半球状３）表面の形状：平滑４）光沢：鈍光５）色調：黄味白色６）透明度：不透明７）周縁：全縁 ○普通寒天上、３０℃ ５日間培養後の形態的性質１）細胞形態：棹状２）運動性：あり３）胞子形成：細胞中央部または先端部に楕円形の
芽胞を形成する胞子形成による膨張はない４）グラム染色：陽性５）抗菌性：陰性

【０００８】

【表２】２．生理学的性状１）嫌気条件下での生育：陰性２）空気中での生育：陽性３）カタラーゼ：陽性４）オキシダーゼ：陽性５）Ｏ−Ｆテスト：Ｏ６）ゼラチンの加水分解：陽性７）リトマス・ミルク：アルカリ、ペプト
ン化８）硝酸塩の還元：陰性９）ＶＰテスト：陰性（ｐＨ５．
０）１０）インドールの生成：陰性１１）硫化水素の生成：陰性１２）デンプンの加水分解：陽性１３）クエン酸の利用：陽性（クリステ
ンセン培地上）１４）ウレアーゼ：陽性１５）カゼインの加水分解：陽性１６）７％ＮａＣｌ中での生育：生育可能１０％ＮａＣｌ中での生育：生育不可１７）色素の生成：茶色１８）生育温度域：１０〜４５℃ 生育ｐＨ：ｐＨ４〜１０１９）Ｅｇｇ−ｙｏｌｋ反応：陰性２０）チロシン分解性：陽性２１）フェニルアラニンの脱アミノ：陽性２２）アルギニンの加水分解：陰性２３）炭素源からの酸の生成

【０００９】

【表３】

【００１０】３．分類学的考察 ○属レベルの同定本菌株（Ｂ−１２４号菌）は、１）グラム陽性棹菌であ
る、２）運動性を有する、３）芽胞を形成する、４）グ
ルコースから好気的に酸を生成するなどの特徴を示す。
これらの特徴から、本菌株は、Ｂｅｒｇｅｙ’ｓＭａ
ｎｎｕａｌｏｆＳｙｓｔｅｍａｔｉｃＢａｃｔｅ
ｒｉｏｌｏｇｙ第２巻に記載されている、Ｅｎｄｏｓ
ｐｏｒｅ−ｆｏｒｍｉｎｇＧｒａｍ−Ｐｏｓｉｔｉｖ
ｅＲｏｄｓａｎｄＣｏｃｃｉ群のＢａｃｉｌｌｕ
ｓ属菌に帰属することが判明した。 ○種レベルの同定Ｂａｃｉｌｌｕｓ属菌には、現在約５０種近い菌が含ま
れている。これらの種は、芽胞の形態・形成部位、各種
の生理学的性質によって識別されている。

【００１１】本菌株Ｂ−１２４号菌は１）細胞の幅が
１．２μｍ、２）楕円形の胞子を形成、３）胞子形成に
よる細胞の膨張がないなどの形態学的特徴を示す、これ
らの特徴を有する種をＢｅｒｇｅｙ’ｓＭａｎｎｕａ
ｌｏｆＳｙｓｔｅｍａｔｉｃＢａｃｔｅｒｉｏｌ
ｏｇｙ第２巻に基づいて検索し、生理学的性状について
比較したところ、下表に示すように、本菌株はＢａｃｉ
ｌｌｕｓｍｅｇａｔｅｒｉｕｍの特徴とよく一致し
た。従って以上の結果から本菌株Ｂ−１２４号菌をＢａ
ｃｉｌｌｕｓｍｅｇａｔｅｒｉｕｍと同定した。

【００１２】

【表４】

【００１３】かかる微生物の培養に必要な栄養物として
は、特に限られるものではなく、通常微生物の培養に用
いられるものが利用される。たとえば、炭素源として
は、グルコース、シュクロース、フラクトース、グリセ
ロール、ソルビトール、糖蜜、澱粉加水分解物等の糖
質、酢酸、フマル酸等の有機酸、等が利用される。窒素
源としては、硝酸塩類、アンモニウム塩類、コーンステ
ィープリカー、酵母エキス、肉エキス、酵母粉末、大豆
加水分解液、綿実粉、ポリペプトン、ベントン等が挙げ
られる。無機塩としては、リン酸カルシウム、リン酸ナ
トリウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム等が利用
できる。また培地中に、鉄イオン、コバルトイオン、銅
イオン等の無機塩類等を添加することも望ましい。本発
明においては、かかる栄養物より目的とする３−ＨＢお
よび／または３−ＨＢ₃が産生される。

【００１４】培養温度は３〜４５℃、好ましくは２５〜
３７℃、ｐＨは４．０〜１０．０、好ましくは６．０〜
８．０で、通常１６〜９６時間程度培養する。その際培
養は好気的に行わせ、十分に、たとえばＯＤ₆₆₀で５〜
４０程度に菌を成育させる。本発明において、微生物と
して菌体自身（生菌体）を用いても良いし、あるいは菌
体の抽出物や菌体の磨砕物、超音波破砕物、更にはそれ
らを硫安分別、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾
過等の公知の方法によって分離精製したものを用いても
よい。即ち、本発明における「菌体の処理物」とは、こ
れらを意味する。

【００１５】さらに本発明においては、上記の培養条件
により前培養を行った後、新たな培養条件下で上記栄養
物を別途作用させることにより、３−ＨＢおよび／また
は３−ＨＢ₃を効率良く生産することもできる。例えば
菌体自身を用いる場合、上記のようにして十分に菌を生
育させた後、新たに上記栄養物を添加する。かかる栄養
物の濃度は０．１重量％〜飽和濃度、好ましくは１．０
〜５．０重量％の範囲で添加する。添加後、３〜４５
℃、好ましくは２５〜３７℃の温度で、ｐＨは４．０〜
１０．０、好ましくは６．０〜８．０で、１６〜９６時
間程度反応を行わせる。

【００１６】菌体の処理物を用いる場合は、タンパク質
重量で２〜１５ｍｇ程度の菌体抽出物または菌体磨砕物
を含む０．０１〜１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６〜９）等
の溶液に、上記栄養物を上記範囲で添加、酵素反応を行
う。また上記の培養で得られた微生物菌体またはその菌
体処理物を、ポリアクリルアミドゲル、光架橋性樹脂、
寒天、カラギーナン等のゲルで包括固定化した後、反応
させることも可能である。その場合は、上記の条件下で
攪拌型反応槽内で上記栄養物と反応させるか、固定化物
をカラムに充填して上記栄養物を含有する液を通気攪拌
させながら流通させる。

【００１７】かくして得られる３−ＨＢおよび／または
３−ＨＢ₃は、例えば鉄イオン、コバルトイオン銅イオ
ン等の無機塩類の添加条件を変化させることにより、目
的物の生産量、生産比等を制御することができる。かか
る３−ＨＢおよび／または３−ＨＢ₃は、反応物から公
知の方法、たとえば酢酸エチル、クロロホルム等の溶媒
で抽出し、必要に応じて高速液体クロマトグラフィ（Ｈ
ＰＬＣ）等で精製することができる。

【００１８】

【発明の効果】本発明方法によれば、生分解性ポリマー
として有用なＰＨＢの原料を、微生物および／または酵
素反応を用いて効率良く製造することができる。

【００１９】

【実施例】以下、本発明を実施例によりさらに詳細に説
明するが、その要旨を越えない限り以下に限定されるも
のではない。〔実施例１〕シュクロース４０ｇ、ＮＨ₄Ｃｌ４
ｇ、ＮａＣｌ３ｇ、Ｋ₂ＨＰＯ₄４ｇ、ＫＨ₂ＰＯ₄
２ｇ、ＭｇＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ１ｇ、コーンスティー
プリカー１ｇ、蒸留水１リットル、ｐＨ７．０の培
地が２０ｍｌ入った３００ｍｌエルレンマイヤーフラス
コへＢａｃｉｌｌｕｓｍｅｇａｔｅｒｉｕｍＢ−１２
４をスラントより１白金耳植菌し、３０℃、１００ｒｐ
ｍでロータリーシェーカーにて培養を行った。１リット
ルあたり４〜５ｇｄｒｙｃｅｌｌ（乾燥菌体）ぐら
いまで生育させたのち酢酸エチルにて生成物の抽出を行
った。

【００２０】生産量の分析はガスクロマトグラムにより
行った。酢酸エチル抽出を行ったサンプルをトリメチル
シリル化した後、以下の条件にて行った。

【表５】カラム：０．２６×２００ｃｍ充填剤：ｓｉｌｉｃｏｎＯＶ−１（８０／１０
０ｍｅｓｈ）Ｎ₂ガス：６０ｍｌ／分カラム温度：２００℃

【００２１】生成物質の構造解析は、まず質量分析法
（ＦＤ−ＭＳ）により分子量を決定し、続いて水素核磁
気共鳴スペクトル（５００ＭＨｚ、重メタノール溶媒）
を測定し、さらに、デカップル測定、二次元スペクトル
測定を行い解析した。以下に主生成物質の結果を示す。

【表６】分子式：Ｃ₁₂Ｈ₂₀Ｏ₇ 分子量：２７６ケミカルシフト及び結合定数：

【表７】

【００２２】１２０時間培養を行った際の生成物の経時
的変化を図−１に示す。培養後約２４時間程してから３
量体である３−ＨＢ₃の生産が活発となり、９６時間後
には７．６ｇ／ｌの生産量にまで達し、主生成物は３量
体である３−ＨＢ₃であることが確認された。なお副成
物としては３−ＨＢ（単量体）および重合体が観測され
たのみであった。

【００２３】〔実施例２〕実施例１において、培地中に
ＦｅＣｌ₃を０．５ｇ／ｌ添加した以外は同様にして、
本菌株を１２０時間培養した。結果を図−２に示す。実
施例１と同様に生成物の分析を行ったところ、主生成物
質は３−ＨＢであった。培養を開始してから４８時間位
経過すると３−ＨＢの生産が増大し、９６時間後には
４．８ｇ／ｌの生産量に達した。なお副成物としては３
−ＨＢ₃（３量体）が観測されたのみであった。

【図面の簡単な説明】

【図１】実施例１において本菌株を１２０時間培養した
際の生成物の経時変化を表わす図面である。図中、●は
３−ＨＢ₃（３量体）の、△は３−ＨＢ（単量体）の、
○は重合体の生産量をそれぞれ表わす。

【図２】実施例２において本菌株を１２０時間培養した
際の生成物の経時変化を表わす図面である。図中、●は
３−ＨＢ₃（３量体）の、△は３−ＨＢ（単量体）の生
産量をそれぞれ表わす。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所Ｃ１２Ｒ 1:11）

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】微生物反応および／または酵素反応によ
り３−ヒドロキシ酪酸および／またはその３量体を製造
する方法において、バチルス属に属し３−ヒドロキシ酪
酸および／またはその３量体を生産する能力を有する微
生物またはその菌体の処理物を使用することを特徴とす
る３−ヒドロキシ酪酸および／またはその３量体の製造
方法。