JPH01174397A

JPH01174397A - ポリグルタミン酸の製造法

Info

Publication number: JPH01174397A
Application number: JP33551287A
Authority: JP
Inventors: Hideaki Takebe; 英日武部; Toshio Matsunobu; 松信　俊男; Kazumichi Uotani; 和道魚谷; Atsuyuki Sato; 篤行佐藤; Shunzo Fukatsu; 深津　俊三; Makoto Taniguchi; 誠谷口
Original assignee: Meiji Seika Kaisha Ltd
Current assignee: Meiji Seika Kaisha Ltd
Priority date: 1987-12-29
Filing date: 1987-12-29
Publication date: 1989-07-10

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】（産業上の利用分野）本発明は工業的に有用な機能性高分子の一つであるポリ
グルタミン酸を、細菌を用いアミノ酸の添加培養法によ
り多量に安価に製造する方法に関する。

（従来の技術）ポリグルタミン酸の製造法としては特許出願公告昭４３
−２４４７２号公報、層化、４３巻、５９５頁（１９６
９）及び層化、４５巻、１１８頁（１９７１）が知られ
ている。

（発明が解決しようとする問題点）微生物によるポリグルタミン酸の製造法としては、ホバ
ーニック［Ｍ、Ｂｏｖａｒｎｉｃｋ；Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃ
ｈｅｍ、。

１４５．４１５（１９４２）］らの研究以来多くの報告
がなされているが、ポリグルタミン酸の培養液中への蓄
積量が微量であるため、工業的に安価なポリグルタミン
酸の製造が困難である。従って、ポリグルタミン酸の新
規製造法の開発が望まれている。

（問題点を解決するための手段）本発明者らは、ポリグルタミン酸生成能を有する微生物
を培養するに際しアミノ酸を添加して培養することによ
り、高収率でポリグルタミン酸を生産出来ることを見い
だした。

以下に１本発明の詳細な説明する。

本発明は、ポリグルタミン酸を生産する能力を有する微
生物を栄養培地に培養し、該培養物からポリグルタミン
酸を採取する方法において、培養液中にアミノ酸を２〜
１２％添加して培養するポリグルタミン酸の製造法を提
供する。

本発明に使用する微生物は、ポリグルタミン酸を菌体外
に蓄積する菌株であればいずれも使用可能であるが、特
にバチルス属菌種が望ましい。

具体的な例としては、バチルス・ズブチルス、バチルス
・アントラシス、バチルス・メガテリウム。

バチルス・ナントゥなどが用いられる。特に好適にはバ
チルス・ズブチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　５ｕｂｔｉｌ
ｉｓ）Ｆ−２−０１株カアケラレル。Ｆ−’２−０１株
は大阪型の土壌（大阪重大キャンパス）より分離され。

菌学的性状は次の通りである。

■、形態的性質肉汁寒天上で生育した本菌株の栄養細胞は０．７〜０．
９Ｘ２．Ｏ〜３．０ミクロンの桿菌である。３０’Ｃ。

２〜３日の培養で内生胞子の形成が認められ、胞子の大
きさは０．７〜０．９Ｘ１．２〜１．５ミクｐンの長円
形である。胞子は、胞子のうのパラセントラルーサブタ
ーミナルに位置し、胞子による胞子のうの膨らみは、は
とんど認められない。細胞の運動性はほとんど認められ
ず、ダラム染色性は陽性である。抗酸性は陰性、多形性
を示さず通常単独あるいは数個が連鎖するが、長く連鎖
することはない。

■、培養的性質本菌株は１通常の細菌用培地に２５〜４５℃、１〜３日
の培養でよく増殖する。

（１）肉汁寒天平板培養：生育は良好で、集落は薄茶色
、小さなシワ状を呈して生育し、暗褐色の水溶性色素を
生産する。

（２）肉汁寒天斜面培１１　：　（１）に同じ。

（３）　肉汁液体培１！：　菌膜を形成して液面に増殖
し、液体部は透明である。

（４）　肉汁ゼラチン穿刺培ｔ：　ゼラチンを液化しな
がら増殖する。

（５）　リドマス・ミルク培＊：　液化されるが。

凝固あるいはｐＨの顕著な変動は認められない。

■、生理的性質（１）　硝酸塩の還元二陽性。

（２）　脱窒反応：陰性。

（３）　　ＭＲテスト　：陰性。

（４）　　ＶＰテスト　：陽性。

（５）　インドールの生成：陰性。

（６）　硫化水素の生成：陰性。

（７）　デンプンの加水分解二陽性。

（８）　クエン酸の利用二陽性。

（９）　無機塩の利用：　アンモニューム塩を唯一の窒
素源として利用できる。

（１０）　　色素の生成：暗褐色の水溶性色素を生産す
る。

（１１）　　ウレアーゼ：陰性。

（１２）　　オキシダーゼ：陽性。

（１３）　　カタラーゼ：陽性。

（１４）　　生育の範囲：　１５−５０℃の温度範囲で
生育するが、６０’Ｃでは生育しない。生育の適温は、
３〇−４０℃である。ｐＨは中性付近が生育に適してお
り。

耐塩性は、７％ＮａＣｌ含有の寒天培地でも生育する。

（１５）　　酸素に対する態度：好気性細菌であり。

嫌気条件では生育しない。

（１６）　　ｏ−ｐテスト　：○型。

（１７）　　糖の利用性：ｌ）　次の糖から酸の生成が認められるが、ガスは発生
しない。

Ｌ−アラビノース、Ｄ−キシロース、Ｄ−グルコース、
Ｄ−マンノース、Ｄ−７ラクトース、Ｄ−ガラクトース
、麦芽糖、シＢ糖、Ｄ−マンニット、トレハロース。

１１）　　次の糖から酸もガスも生成しない。

乳糖＋　ｍｙｏ−イノシトール、Ｄ−ソルビット。

グリセリン。

以上の通り、好気性桿菌で胞子を作り、カタラーゼ陽性
であることがら９本面株は、バチルス属に所属すると考
えられる。更に形態的性質、生理的性質を総合するとバ
チルス属の中でバチルス・ズブチルス属に所属すると考
えるのが最も妥当である。以上の結果より９本発明者ら
はＦ−２−０１株をバチルス・ズブチルスＦ−２−０１
（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　５ｕｂｔｉｌｉｓ）と命名し、既
知株と区別した。本菌株は、工業技術院微生物工業技術
研究所に微工研菌寄第９０８２号（ＦＥＲＮ　Ｐ−９０
８２）として寄託されている。

Ｆ−２−０１株は他の細菌にみられるように。

その性状が変化しやすく１例えば紫外線、エックス線、
薬品などを用いる人口的変異手段で変異しうるちのであ
り、このような変異株であってもＦ−２−０１株と同様
の生産能を有するバチルス属の菌株はすべて本発明の方
法に使用できる。

添加アミノ酸としては、グルタミン酸、アスパラギン酸
、アラニン、ロイシン、フェニルアラニン、ヒスチジン
など及びそれらの塩が使用出来。

好ましくはグルタミン酸であり、添加濃度は２〜１２％
、好ましくは４〜１０％である。

本発明に使用する培地としては、炭素源、窒素源、無機
物その他の栄養物を適当に含有する培地ならば９合成培
地、天然培地いずれでも使用で詐る。

炭素源としては、グルコース、シュクロース、グリセリ
ン、キシロース、７ラクトース、マルトース、廃糖蜜、
澱粉加水分解物などが使用でｂる。

窒素源としては、ペプトン、ポリペプトン、酵母エキス
、コーンスチープリカー、カゼイン加水分解物などの有
機栄養源の添加が望ましく、尿素などを併用することも
できる。無機塩としては、リン酸カリ、硫酸マグネシウ
ム、マンガン、鉄すどが使用できる。

培養は、振盪培養９通気撹拌培養などの好気的条件下で
行う。培養温度は２５〜４５℃、好ましくは３０〜４０
℃が適当である。培養時のｐｎは５〜９．好ましくは６
〜８が適当である。ｐＨの調節は水酸化ナトリウム、水
酸化カリウムなどによって行う。

培養期間は通常２〜３日間でポリグルタミン酸は主とし
て菌体外に蓄積する。

培養物からのポリグルタミン酸の単離は、従来からおこ
なわれている分離採取方法によって行う。

すなわち、遠心分離またはろ過動剤、微細孔を有するフ
ィルターろ過により菌体を除去し、３〜４倍容のエタノ
ールなどを添加してポリグルタミン酸を沈澱させる。沈
澱物を水に溶解させ不溶物を除去し、低分子物を透析、
限外ろ過などにより除き、有機溶媒による再沈澱を繰り
返してポリグルアミノ酸を単離することがで終る。

本発明で得られるポリグルタミン酸の物理化学的性質は
次の通りである。

１）　白色の粉末であってニンヒドリン反応陰性。

６Ｎ−ＨＣＩで加水分解後、ニンヒドリン反応陽性。

２）　　６Ｎ−ＨＣＩで加水分解後、アミノ酸分解を行
うと、アミノ酸はグルタミン酸のみが検出される。

３）　ペプシンにより消化されず、γ−グルタミルトラ
ンスペプチダーゼにより消化される事がら。

γ位のカルボキシル基とα位のアミ７基がアミド結合し
たポリーγ−グルタミン酸である。

４）　分子量はＧＰＣカラムを使用した高速液体クロマ
トグラフにより、５０〜１００万である。

５）　赤外線吸収スペクトラム（第１図）。

６）　水に可溶。エタノール、アセトンに不溶。

（実施例）以下に本発明の実施例を示すが４本発明はこれらに限定
されるものではない。

８一実施例１゜酵母エキス０．５％、ペプトン１．５％、尿素０．３％
。

Ｋ２ＨＰ０．０．２％からなる生産培地（ｐＨ７，０）
に各種アミノ酸５％を加えた培地をそれぞれ調整し。

この３０ｍＮを２５０＋ｎＮ容三角フラスコに分注し、
１２０℃。

１５分間蒸気殺菌した。これに別に殺菌したグルコース
を８％宛加えた。これにバチルス・ズブチルスＦ−２−
０１株（ＦＥＢＭ　Ｐ−９０８２）を２％のビイール・
インヒュジョン・ブロス（Ｖｅａｌ　Ｉｎｆｕｓｉｏｎ
Ｂｒｏｔｈ）で予め前培養しておいたものを５％接種し
。

２２０ｒｐＩ１１＋　３７℃で２〜３日間振盪培養した
。

結果は第１表に示したとおりであり、無添加の対照培養
のポリグルタミン酸生成量は０．１３ｇ／Ｌ　。

ヒスチジン添加培養の場合は５．８５ｇ／Ｌ、またグル
タミン酸の添加培養の場合は４７．５＋＋／　Ｌであっ
た。

第１表ア　ミ　ノ酸　　　　　ポリグルタミン酸生成量グルタ
ミン酸　　　　　　　　　　４７．５　ｇ／Ｌアスパラ
ギン酸　　　　　　　　０．６８アラニン　　　　　　
　　　　　　３．５１０イシン　　　　　　　　　　　
　２．２５フエルアラニン　　　　　　　　　１．５０
ヒスチジン　　　　　　　　　　　５．８５無添加（対
照＞　　　　　　　　　　　０．１３実施例２゜酵母エキス０．５％、ペプトン１．５％、尿素０．３％
。

Ｋ２ＨＰ０．０．２％からなる生産培地（ｐｌ＋７．０
）にグルタミン酸を１〜２０％を加えた培地それぞれ調
整し、３Ｌ溶ジヤー７７メンターに１．６Ｌ分注し。

１２０°Ｃ１１５分間蒸気殺菌した。これに別に殺菌し
たグルツース液４００ｍｎ（８％）宛を加えた。実施例
１と同様に前培養しておいたものを５％接種し、培養温
度３７℃９通気量２Ｌ／ｍｉｎ、攪拌回転数８０Ｏｒｐ
ｍで２〜３日間培養を行った。結果は第２表に示したと
おりであり、無添加の対照培養のポリグルタミン酸生成
量は７．２ｇ／Ｌ、　５％のグルタミン酸添加培養では
３９ｇ／Ｌ、　　；］：な７％のグルタミン酸添加培養
では４７．８ｇ／　Ｌであった。

第２表グルタミン酸　　　　ポリグルタミン酸生成量無添加（
対照）　　　　　　　　　　７．２　　ｇ／Ｌ１％　　
　　　　　　　　　　９．２３　　　　　　　　　　　　　２１．５５　　　　　　
　　　　　　　３９、０７　　　　　　　　　　　　　
４７．８１０　　　　　　　　　　　　４６、１１５　
　　　　　　　　　　　、　４５．５実施例３゜酵母エキス０．５％、ペプトン１．５％、尿素０．３％
。

Ｋ２ＨＰ０．０．２％からなる生産培地（ｐｌ（７，０
）にグルタミン酸を１０％を加えた培地それぞれ調整し
。

１ｌ− ６００Ｌ容槽に３００Ｌ分注し、１２０℃、１５分間蒸
気殺菌した。これに別に殺菌したグルコースを８％宛加
えた。実施例１と同様に前培養しておいたものを５％接
種し、培養温度３７℃１通気量３００Ｌ／ｍｉｎ。

攪拌回転数１００〜３００ｒｐｍの各条件下で２〜３日
間培養を行った。

結果は第３表に示したとおりであり、攪拌回転数１１０
０ｒｐでは９．６ｇ／　Ｌ　＋　２５０ｒｐｍでは４８
．５ＦＩ／Ｌ。

３００ｒｐｍでは６０．８ｇ／Ｌのポリグルタミン酸生
成量であった。

第３表第１．２．３表より明らかなようにポリグルタミン酸の
生成量は、アミノ酸、とくにグルタミン酸の添加により
著しく高い値を示す。

（発明の効果）一１２＝本発明方法によれば、ポリグルタミン酸を極めて多量に
安価に製造することがで終る。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明の方法によって得られたポリグルタミン
酸の赤外線吸収スペクトルである。特許出願人　　　明治製菓株式会社

Claims

【特許請求の範囲】

（１）ポリグルタミン酸を生産する細菌にアミノ酸を添
加して培養することを特徴とするポリグルタミン酸の製
造方法。
（２）アミノ酸がグルタミン酸、アスパラギン酸、アラ
ニン、ロイシン、フエニルアラニン、ヒスチジン及びそ
れらの塩である特許請求の範囲第１項記載の製造方法。