JP2004208644A - 新規メタノール資化性菌およびそれを用いたｌ−セリン製造方法 - Google Patents
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Abstract
【課題】効率的なＬ−セリン製造方法の提供、および当該方法に用いることができる新規メタノール資化性菌の提供。
【解決手段】メチロバクテリウム属に属し、セリン経路を有する細菌またはその破砕物を用いて、グリシンとメタノールとのモル比が１：０．８〜１：５．５であるグリシンとメタノールからＬ−セリンを製造する。土壌より分離したメチロバクテリウム属に属し、セリン経路を有する新規メタノール資化性菌であるメチロバクテリウム エスピー ＲＦＳ−１０１２９株を提供する。
【選択図】 なし
【解決手段】メチロバクテリウム属に属し、セリン経路を有する細菌またはその破砕物を用いて、グリシンとメタノールとのモル比が１：０．８〜１：５．５であるグリシンとメタノールからＬ−セリンを製造する。土壌より分離したメチロバクテリウム属に属し、セリン経路を有する新規メタノール資化性菌であるメチロバクテリウム エスピー ＲＦＳ−１０１２９株を提供する。
【選択図】 なし
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、新規メタノール資化性菌およびそれを用いたＬ−セリン製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
Ｌ−セリンは、皮膚保湿因子として存在する非必須アミノ酸（分子量１０５．０９）である。Ｌ−セリンは反応性に富む光学活性体で、輸液用途や光学活性体・医薬の合成原料・化粧品等に用いられている。
【０００３】
Ｌ−セリンの製造方法として、Ｌ−セリンを多量に含むタンパク質（例えば絹）を加水分解し抽出する方法が知られている。しかし、効率が悪く、またＬ−セリンが反応性に富む為、加水分解中にラセミ化する問題がある。
【０００４】
また、コリネ型細菌を使用した糖からの直接発酵法によるＬ−セリンの製造法が開示されているが効率的ではない（特許文献１参照）。さらに、メタノール資化性の微生物をメタノールとグリシンの存在下に培養し培養液中に蓄積したＬ−セリンを回収する発酵法が開示されているが、いずれも効率的な方法ではない（特許文献２、３参照）。また発酵法では、後の精製が煩雑となる問題がある。
【０００５】
そこで、酵素法による変換反応による効率のよいＬ−セリン製造法が種々研究され、例えばｉ）ホルムアルデヒドとグリシン（および補酵素葉酸）からのＬ−セリンの製造法、ｉｉ）シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属に属する細菌を使用したグリシンと５，１０−メチレンテトラヒドロ葉酸（またはグリシンとホルムアルデヒドとテトラヒドロ葉酸）からのＬ−セリンの製造法（特許文献４参照）が開発されている。
しかし、ｉ）の方法は、近年のシックハウス症候群の原因物質であるホルムアルデヒドを使用する点で問題があり、また、ホルムアルデヒドは微生物に対して有害であるので、ホルムアルデヒドを低濃度で制御する必要があり工業的な大量生産には適さない。ｉｉ）の方法は、ホルムアルデヒドを用いる点で上記と同様の問題があり、また葉酸を添加しない場合にはＬ−セリンの生産量が著しく減少するという問題がある。
【０００６】
さらに、酵素法による変換反応として、ｉｉｉ）Ｌ−セリン分解活性を抑制した条件下で、ヒポミクロビウム エスピー ＮＣＩＢ１００９９（Ｈｙｐｈｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ ｓｐ． ＮＣＩＢ１００９９）株の休止細胞を用いたメタノールとグリシンからのＬ−セリン合成、（非特許文献１参照）、ｉｖ）メチロバクテリウム エスピー ＭＮ４３（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ． ＭＮ４３）株の休止細胞を用いたメタノールとグリシンからのＬ−セリン製造（非特許文献２参照）が開示されている。
しかし、ｉｉｉ）、ｉｖ）には、本発明のグリシンとメタノールのモル比による効果は開示されていない。
【０００７】
これらの従来技術の問題点を勘案すると、１）ラセミ化することを防ぐため加水分解等の化学合成手法を用いず、微生物およびその酵素により光学活性な状態でＬ−セリンを得ることができること、２）発酵法ではなく、酵素手法によるグリシンからセリンへの変換反応を用いて効率化、後の精製の簡易化を図ることができること、３）ホルムアルデヒドを実質的に添加せずに、メタノール等を炭素源として培養した微生物による、メタノールとグリシンからＬ−セリンに変換する反応を用いることができること（すなわちホルムアルデヒドは微生物に必要な分だけ作らせることができること）、および４）効率化を図ることができる新規メタノール資化性・セリン経路を有する微生物の発見がＬ−セリンの製造のためには望まれる。
【０００８】
【特許文献１】
特開平１１−２６６８８１号公報
【特許文献２】
特公昭５８−１６８７８号公報
【特許文献３】
特公昭５７−３７３２０号公報
【特許文献４】
特開昭６２−９６０９２号公報
【非特許文献１】
Ｔ．ＹＯＳＨＩＤＡら、「ジャーナル オブ ファーメンテイションアンド バイオエンジニアリング（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ）」、第７９巻、第２号、１９９５年、ｐ１８１−１８３
【非特許文献２】
Ｔ．ＨＡＧＩＳＨＩＴＡら、「バイオサイエンス バイオテクノロジー アンド バイオケミストリー（Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ａｎｄ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）」、第６０巻、第１０号、１９９６年、ｐ１６０４−１６０７
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、効率的なＬ−セリン製造方法の提供および、それに用いることができる新規メタノール資化性菌の提供を目的とする。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記目的を達成するために鋭意研究を重ねた結果、上記１）〜３）の要件を満たす微生物である、メチロバクテリウム属に属し、セリン経路を有する細菌またはその破砕物を用いて、かつ原料とするグリシンとメタノールのモル比を特定の範囲内とすることで効率的なＬ−セリンの製造が可能となることを見出した。また、本発明者らは、土壌より上記１）〜３）の要件を満たすメチロバクテリウム属に属し、セリン経路を有する新規微生物（新規メタノール資化性菌）を発見し、この微生物を用いることで効率的なＬ−セリンの製造が可能となることを見出し、さらに研究を重ねて本発明を完成させるに至った。
【００１１】
すなわち、本発明は以下の通りである。
（１）メチロバクテリウム属に属し、セリン経路を有する細菌またはその破砕物を用いて、グリシンとメタノールとのモル比が１：０．８〜１：５．５であるグリシンとメタノールからＬ−セリンを製造するＬ−セリン製造方法、
（２）細菌の破砕物を用いる、上記（１）記載の方法、
（３）細菌がメチロバクテリウム エスピー ＲＦＳ−１０１２９株である、上記（１）または（２）記載の方法、
（４）細菌がメタノールを炭素源として培養した細菌である、上記（１）〜（３）のいずれかに記載の方法、
（５）メチロバクテリウム エスピー ＲＦＳ−１０１２９株。
【００１２】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳述する。
本発明では、メタノールとグリシンから以下に説明する微生物を用いてＬ−セリンを製造する。まず、メタノールとグリシンからＬ−セリンを生じる反応を図１に表した概念図で説明する。メタノールはメタノールデヒドロゲナーゼによる脱水素反応（図１中、▲１▼で表す反応系）によりホルムアルデヒドとなり、当該ホルムアルデヒドとグリシンとが補酵素テトラヒドロ葉酸を介したセリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼによる反応（図１中、▲２▼で表す反応系）によりＬ−セリンとなる。このように上記一連の酵素反応によりメタノールとグリシンからＬ−セリンが生じる。図１中▲１▼または▲２▼で示す一方の系のみを持つものは他にも多数存在するが、このような経路を有するのはメタノール資化性菌の中でもセリン経路を有する限られた微生物のみである。
【００１３】
本発明に用いられる微生物は、メチロバクテリウム（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属に属する細菌であって、かつセリン経路を有する細菌であれば特に限定されないが、例えば、後述のメチロバクテリウム エスピー ＲＦＳ−１０１２９（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ． ＲＦＳ−１０１２９）株、上記メチロバクテリウム エスピー ＭＮ４３（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ． ＭＮ４３）株等が挙げられる。このうち、メチロバクテリウム エスピー ＲＦＳ−１０１２９株が好ましい。
このような微生物は、例えば以下のスクリーニング方法によって、自然界から分離・取得、あるいは既存の保存菌株から選定・取得することができる。
【００１４】
スクリーニング方法
自然界から採取した土壌サンプルを、単一炭素源としてメタノールを含む液体培地（例えば培地Ａ（ｐＨ７）：メタノール０．８％（ｗ／ｖ）、Ｋ２ＨＰＯ４ １ｇ／ｌ、（ＮＨ４）２ＰＯ４ ２ｇ／ｌ、ＮａＣｌ １ｇ／ｌ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．０５ｇ／ｌ、ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．０５ｇ／ｌ、ＭｎＳＯ４・４−６Ｈ２Ｏ ０．０２ｇ／ｌ、ビタミン混合液（塩酸チアミン５ｍｇ／ｌ、リボフラビン１０ｍｇ／ｌ、パントテン酸カルシウム６ｍｇ／ｌ、塩酸ピリドキシン８ｍｇ／ｌ、ビオチン０．２ｍｇ／ｌ、ｐ−アミノ安息香酸３ｍｇ／ｌ、ニコチン酸４ｍｇ／ｌ）０．０５％（ｖ／ｖ））に加え、２５〜３０℃で２〜４日間集積培養を数度行い生育の確認をする（１次スクリーニング：メタノール資化性）。
生育のあった菌株については同培地組成の寒天培地で２５〜３０℃、２〜６日間培養し、単菌分離を行い、同培地スラントに保存する。
１次スクリーニングにおける生育株を、単一炭素源としてメタノールを含む液体培地（例えば上記培地Ａ）で２５〜３０℃で２〜６日間振とう培養を行い、次いで、同じ組成の培地で２５〜３０℃で２〜４日間、振とう培養を行った後、集菌する。得られた菌体と、メタノールおよびグリシンを含む反応液（例えば反応液１ｍｌ中最終濃度メタノール４．７％（ｗ／ｖ）、グリシン５．１％（ｗ／ｖ）、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８）５０ｍＭ、菌懸濁液１０％ＰＣＶ（ｖ／ｖ）を含む）を２５〜３０℃で１〜７日間振とうし反応させる。反応後の溶液についてＬ−セリン濃度を例えばＨＰＬＣ等で測定してＬ−セリン生産性を確認する（２次スクリーニング：Ｌ−セリン生産性）。生産性のあったサンプルを選択・単菌化し保存する。このようにして、メタノール資化性でセリン経路を有する微生物を選択することができ、特にこれらの中からＬ−セリン高生産性のメチロバクテリウム エスピー ＲＦＳ−１０１２９株を選択することができる。
なお、略号ＰＣＶ（Ｐａｃｋｅｄ Ｃｅｌｌ Ｖｏｌｕｍｅ）は、培養液中に含まれる菌体量を容積％で表したものである。
【００１５】
このようにして、本発明者らにより福井県内の土壌より新たに分離されたメチロバクテリウム エスピー ＲＦＳ−１０１２９株の菌学的諸性質を以下に示す。なお、各記号は、＋：陽性、−：陰性、Ｗ：反応弱を示す。
【００１６】
１．形態学的性質
培養条件：Ｎｕｔｒｉｅｎｔ Ａｇａｒ（Ｏｘｏｉｄ， Ｅｎｇｌａｎｄ， ＵＫ）培地、３０℃において、細胞の形態：桿菌（０．８×１．５〜２．０μｍ）、細胞の多形性の有無：−、運動性（鞭毛の着生状態）：＋（極毛）、胞子の有無：−である。
【００１７】
２．培養的性質
培養条件：培地メタノール０．８％（ｗ／ｖ）を含む合成培地Ａ（下記表１および表２）、培養時間４８ｈｒにおいて、コロニー形態：円形、全縁滑らか、低凸状、光沢あり、オレンジ色である。培養条件：Ｎｕｔｒｉｅｎｔ Ａｇａｒ（Ｏｘｏｉｄ， Ｅｎｇｌａｎｄ， ＵＫ）培地、３０℃において、色：オレンジ色→赤色（増殖期→定常期でのコロニーの色の変化）、光択：＋、色素産生：＋である。培養条件：Ｎｕｔｒｉｅｎｔ ｂｒｏｔｈ（Ｏｘｏｉｄ， Ｅｎｇｌａｎｄ， ＵＫ）培地、３０℃において、表面発育の有無：＋、培地の混濁の有無：＋である。培養条件：ゼラチン穿刺培養、３０℃において、生育状態：＋、ゼラチン液化：−である。培養条件：リトマス・ミルク、３０℃において、凝固：−、液化：−である。
【００１８】
３．生理学的性質
生理学的性質は、グラム染色性：−、硝酸塩の還元：−、脱窒反応：−、ＭＲテスト：−、ＶＰテスト：−、インドール産生：−、硫化水素の生成：−、デンプンの加水分解：−、クエン酸の利用（Ｋｏｓｅｒ）：−、クエン酸の利用（Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ）：−、無機窒素源の利用（硝酸塩）：＋、無機窒素源の利用（アンモニウム塩）：＋、ウレア−ゼ活性：＋、オキシダーゼ：＋、カタラーゼ：＋、生育の範囲（ｐＨ）：（ｐＨ５＋、ｐＨ６＋、ｐＨ８＋）、生育の範囲（温度（℃））：（２０＋、２５＋、３０＋、３７＋、４２−、４５−）、生育条件（好気性、嫌気性）：好気、Ｏ−Ｆテスト（グルコース酸化／発酵）：−／−、糖類からの酸産生／ガス産生：（Ｌ−アラビノース−／−、Ｄ−グルコース−／−、Ｄ−フラクトース−／−、マルトース−／−、ラクトース−／−、Ｄ−ソルビトール−／−、イノシトール−／−、Ｄ−キシロース−／−、Ｄ−マンノース−／−、Ｄ−ガラクトース−／−、サークロース−／−、トレハロース−／−、Ｄ−マンニトール−／−、グリセリン＋／−）、β−ガラクトシダーゼ活性：−、アルギニンジヒドロラーゼ活性：−、リジンデカルボキシラーゼ活性：−、トリプトファンデアミナーゼ活性：−、ゼラチナーゼ活性：−、ブドウ糖酸性化：−、エスクリン加水分解：−、ゼラチン加水分解：−、ブドウ糖資化性：−、Ｌ−アラビノース資化性：−、Ｄ−マンノース資化性：−、Ｄ−マンニトール資化性：−、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン資化性：−、マルトース資化性：−、グルコン酸カリウム資化性：−、ｎ−カプリン酸資化性：−、アジピン酸資化性：−、ｄｌ−リンゴ酸資化性：＋、クエン酸ナトリウム資化性：−、酢酸フェニル資化性：−、チトクロームオキシダーゼ：＋である。
【００１９】
各試験の実施方法は、（ｉ）［ＢＡＲＲＯＷ， （Ｇ．Ｉ．） ａｎｄ ＦＥＬＴＨＡＭ，（Ｒ．Ｋ．Ａ．）： Ｃｏｗａｎ ａｎｄ Ｓｔｅｅｌ’ｓ Ｍａｎｕａｌ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｂａｃｔｅｒｉａ． ３ｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ． １９９３， Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ．］、（ｉｉ）［ＨＯＬＴ，（Ｊ．Ｇ．）， ＫＲＩＥＧ，（Ｎ．Ｒ．），ＳＮＥＡＴＨ， （Ｐ．Ｈ．Ａ．）， ＳＴＡＬＥＹ， （Ｊ．Ｔ．） ａｎｄ ＷＩＬＬＩＡＭＳ， （Ｓ．Ｔ．）： Ｂｅｒｇｅｙ’ｓ ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｖｅ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ． ９ Ｅｄｉｔｉｏｎ． １９９４． Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ， Ｗｉｌｌｉａｍｓ ａｎｄ Ｗｉｌｋｉｎｓ］、（ｉｉｉ）［ＫＲＩＥＧ，（Ｎ．Ｒ．） ａｎｄ ＨＯＬＴ，（Ｊ．Ｇ．）： Ｂｅｒｇｅｙ’ｓ ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ． Ｖｏｌ． １． Ｗｉｌｌｉａｍｓ ａｎｄ Ｗｉｌｋｉｎｓ， Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ． １９８４］、（ｉｖ）［坂崎利一・吉崎悦郎・三木寛二：新 細菌培地学講座・下（第二版）． １９８８， 近大出版， 東京］、（ｖ）細菌同定キットＡＰＩ２０ＮＥ（ｂｉｏＭｅｒｉｅｕｘ， Ｆｒａｎｃｅ）の各文献の記載に従った。
【００２０】
上記硝酸塩の還元、インドール産生、ブドウ糖酸性化、アルギニンジヒドロラーゼ活性、ウレア−ゼ活性、エスクリン加水分解、ゼラチン加水分解、β−ガラクトシダーゼ活性、ブドウ糖資化性、Ｌ−アラビノース資化性、Ｄ−マンノース資化性、Ｄ−マンニトール資化性、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン資化性、マルトース資化性、グルコン酸カリウム資化性、ｎ−カプリン酸資化性、アジピン酸資化性、ｄｌ−リンゴ酸資化性、クエン酸ナトリウム資化性、酢酸フェニル資化性、チトクロームオキシダーゼについては、上記（ｖ）細菌同定キットＡＰＩ２０ＮＥ（ｂｉｏＭｅｒｉｅｕｘ， Ｆｒａｎｃｅ）を使用し、その測定方法に従った。
上記脱窒反応、ＶＰテスト、硫化水素の生成、リジンデカルボキシラーゼ活性、トリプトファンデアミナーゼ活性、ゼラチナーゼ活性については、上記文献（ｖ）に従い、上記ゼラチン液化、グラム染色性については上記文献（ｉ）に従い、上記リトマス・ミルク培養、ＭＲテスト、デンプンの加水分解、クエン酸の利用（Ｋｏｓｅｒ、Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ）、無機窒素源の利用（硝酸塩、アンモニウム塩）、オキシダーゼ、カタラーゼ、Ｏ−Ｆテスト、糖類からの酸産生／ガス産生については、上記文献（ｉｖ）に従った。
【００２１】
以上の細菌学的諸性質、特にオレンジ色のコロニー色彩を示し、グラム染色陰性、運動性、カタラーゼ反応陽性、オキシダーゼ反応陽性を示す好気性桿菌であること、およびメタノール資化能を有することから判断し、メチロバクテリウムエスピー（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．）に属する細菌であることが確認された（参考文献：上記文献（ｉｉ））。
しかしながら、ＲＦＳ−１０１２９株はこれまでに報告されている同属細菌（上記メチロバクテリウム エスピー ＭＮ４３株）とブドウ糖の資化性およびクエン酸ナトリウム資化性が違うことから、新菌株と設定することが妥当であるとの結論に達した。
そこで本発明者らは、メチロバクテリウム エスピー ＲＦＳ−１０１２９株と命名し、保存サンプルを平成１４年１２月１１日付で独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託した（受託番号：ＦＥＲＭ Ｐ−１９１４９）。
【００２２】
以下に、メチロバクテリウム属に属し、セリン経路を有する細菌（以下単に本発明のメタノール資化性菌ともいう。）、特にメチロバクテリウム エスピー ＲＦＳ−１０１２９株を用いた本発明のＬ−セリン製造方法（培養法、反応法）の一実施態様を説明する。
【００２３】
培養法
本発明のメタノール資化性菌の培養は、炭素源、窒素源等を含む通常の栄養培地で行うことができる。
炭素源としては、例えばメタノール、メチルアミン、モノクロロメタン等のＣ１化合物等が挙げられる。特にメタノールから変換されるホルムアルデヒドは、セリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼの活性発現・維持、活性化が期待される等の理由から、メタノールが好ましい。炭素源（特にメタノール）の培地中の濃度は、通常０．１〜３．０％（ｗ／ｖ）、好ましくは０．５〜１．５％（ｗ／ｖ）である。
【００２４】
窒素源としては、無機窒素、有機窒素のいずれを用いることもできるが、無機窒素が好ましい。無機窒素としては、例えば燐安、硫安、硝安等が挙げられる。有機窒素としては、例えばコーン・スティープ・リカー、酵母エキス等が挙げられる。窒素源の培地中の濃度は、通常０．０１〜１．０％（ｗ／ｖ）、好ましくは０．１〜０．５％（ｗ／ｖ）である。
【００２５】
培地にはその他微量成分として、マグネシウム、鉄、マンガン、硫黄等の金属塩、リボフラビン等のビタミン類、ピロロキノリンキノン、葉酸等の補酵素類、グリシン等のアミノ酸類等も適宜使用することができる。これらの微量成分の培地中の濃度は、微生物の生育を害しない濃度であれば特に制限はない。
【００２６】
培地には、培養途中に上記炭素源、窒素源、微量成分等を途中添加することもできる。特に限定されないが、グリシンの添加はこれらの中でもＬ−セリン生産性向上に非常に有効である。
【００２７】
培養条件は、振とう培養・通気培養等の好気培養であればよく、培養温度、培地のｐＨ、培養時間等は、Ｌ−セリンが大量に生産されるように適宜選択することができる。培養温度は通常２５〜４０℃、好ましくは２５〜３０℃であり、培地のｐＨは通常ｐＨ５〜９、好ましくはｐＨ６〜８であり、培養時間は通常１〜７日間、好ましくは２〜４日間である。
【００２８】
反応法
上記のように培養した菌体、グリシンおよびメタノールを含む反応液中で反応させてＬ−セリンを製造する。
本発明のＬ−セリン製造方法は、反応液中のグリシンとメタノールの組成モル比が１：０．８〜１：５．５であり、好ましくは１：１〜１：５であり、特に好ましくは１：２〜１：５であることを特徴とする。組成モル比がグリシン１に対してメタノールが０．８未満のときは、セリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼの活性が低くなってしまい、セリン生成量が低くなり、グリシン１に対してメタノールが５．５を越えるときは、メタノールによるセリン生成反応阻害が著しくなる。
【００２９】
菌体は、培養液をそのまま、または濃縮して用いることができる。また、非破砕の菌体または菌体の破砕物のいずれも用いることもできるが、基質であるメタノールやグリジン等が、より酵素と接触しやすくなること、反応性が高くなる等の理由から、菌体の破砕物を用いることが好ましい。菌体の破砕処理方法は酵素を失活させることがなければどのような方法でも良いが、例えば、超音波破砕、浸透ショック破砕、ホモジナイザー破砕、ミル破砕、高圧破砕、凍結破砕等が挙げられる。破砕時の温度は、通常２０℃以下であり、好ましくは１０℃以下である。
非破砕菌体調製及び破砕処理菌体調製時の溶媒は特に限定されず、例えば水、生理食塩水、緩衝液等が使用可能であり、緩衝液が好ましい。
【００３０】
反応液中、メタノール濃度は、通常０．２〜１５％（ｗ／ｖ）、好ましくは２〜７％（ｗ／ｖ）であり、グリシン濃度は、通常０．１〜１５％（ｗ／ｖ）、好ましくは２〜６％（ｗ／ｖ）である。
反応液中、非破砕菌体または菌体の破砕物の濃度は、通常１〜３０％（ｖ／ｖ）、好ましくは２〜１５％（ｖ／ｖ）である。
反応液には、さらに緩衝液等を添加することもでき、用いられる緩衝液の濃度は通常５〜５００ｍＭ、好ましくは２０〜２００ｍＭである。また、反応液には、セリン産生活性を抑制させるものでなければ、その他の添加物を添加することもでき、例えば、無機金属塩、ビタミン類、補酵素類等を添加することができる。
本発明では、補酵素葉酸を添加せずに、グリシンとメタノールからＬ−セリンを製造することもできる。
【００３１】
反応は、静置、攪拌、振とうのいずれでもよいが、攪拌または振とうして行うことが好ましい。反応温度は、通常２５〜４０℃、好ましくは２５〜３５℃である。反応ｐＨは、通常ｐＨ５〜１０、好ましくはｐＨ７〜１０である。反応時間は、通常１〜７日間、好ましくは２〜５日間である。
【００３２】
上記の方法で生成したＬ−セリンは、イオン交換樹脂法、その他の公知の方法を組み合わせることにより採取できる。
【００３３】
【実施例】
以下、本発明を詳細に説明するために実施例を記載するが、本発明はこれらの実施例によって何ら限定されるものではない。
【００３４】
実施例１ 土壌からの新規Ｌ−セリン生産微生物のスクリーニング
（１）１次スクリーニング（メタノール資化性）
福井県内３６箇所より採取した土壌サンプルを、滅菌水にて懸濁し、上清を微生物サンプルとした。当該微生物サンプルを単一炭素源としてメタノールを含む合成培地Ａ（表１および表２）液体培地に一白金耳加え、３０℃で３日間培養を数度行って生育の確認をし、生育株を得た。
生育株は同培地組成の寒天培地で３０℃３日間培養し、単菌分離を行った。
（２）２次スクリーニング（Ｌ−セリン生産性）
１次スクリーニングで得られた生育株を単一炭素源としてメタノールを含む合成培地Ａ（表１および表２）液体培地５ ｍｌで３０℃３日間振とう培養を行った。次いで、同じ組成の培地１００ ｍｌにて３０℃３日間、数度集積培養を行った。生育した菌を集菌・生理食塩水で洗菌し、再懸濁した。得られた懸濁液を超音波破砕処理し、菌体の破砕物を得た。当該菌体の破砕物を含む菌懸濁液とグリシン・メタノールを含むＬ−セリン生産反応液Ｂ（表３） １ ｍｌを３０℃３日間、振とうし反応させた。得られた溶液について、ＨＰＬＣにてＬ−セリンの濃度を測定し、Ｌ−セリン生産性を確認した。
生産性のあったサンプルを選択・単菌化し保存した。これらの中からＬ−セリン高生産性の微生物１株ＲＦＳ−１０１２９を選択した。この分離菌株について前記の如く更に菌学的諸性質を調べた結果、新規菌株であることが判明しメチロバクテリウム エスピー ＲＦＳ−１０１２９株と命名した。
【００３５】
【表１】
【００３６】
【表２】
【００３７】
【表３】
【００３８】
実施例２（培養法）
０．８％（ｗ／ｖ）メタノールを含む合成培地Ａ（表１および表２）２０ ｍｌを入れた１００ｍｌ三角フラスコに同培地組成の保存寒天培地からメチロバクテリウム エスピー ＲＦＳ−１０１２９株を一白金耳植菌し、３０℃で３日間、１５０ ｒｐｍで振とう培養（種培養）を行った。次いで、種培養と同じ培地１００ ｍｌを入れた５００ ｍｌ三角フラスコに種培養から１％植菌し、３０℃で２日間、１５０ ｒｐｍで振とう培養（本培養）を行った。
【００３９】
実施例３（培養液をそのまま使用した反応法）
実施例２の本培養終了後、得られた培養液に対し最終０．３％（ｗ／ｖ）となるようにグリシンを注加した。メタノールは添加しないが培養液中に最終０．５５％（ｗ／ｖ）となる量残っている。当該溶液を３０℃で２日間、１５０ ｒｐｍで振とうし反応させ、Ｌ−セリンを製造した。菌体分離後の上清をＨＰＬＣで測定した。結果を表４に示す。
【００４０】
実施例４（濃縮非破砕菌体使用時の反応法）
実施例２の本培養終了後、得られた培養液を、８０００ ｒｐｍで１０分間遠心分離し、沈殿を回収した（集菌）。得られた沈殿を２０ ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８）で最終２０％ＰＣＶになるように再懸濁した。当該懸濁液０．５ ｍｌに、グリシンを最終５％（ｗ／ｖ）、メタノールを最終４．７％（ｗ／ｖ）となるように添加し、最終１ ｍｌとして、３０℃で３日間、１５０ｒｐｍで振とうして反応させ、Ｌ−セリンを製造した。菌体分離後の上清をＨＰＬＣで測定した。結果を表４に示す。
【００４１】
実施例５（濃縮破砕処理菌体使用時の反応法）
実施例２の本培養終了後、得られた培養液を、８０００ ｒｐｍで１０分間遠心分離し、沈殿を回収した（集菌）。得られた沈殿を２０ ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８）で最終２０％ＰＣＶになるように再懸濁した。当該懸濁液を、０．５秒×１０回照射（使用機器「ＰＯＷＥＲ ＳＯＮＩＣ Ｍｏｄｅｌ ５０」（ヤマト科学（株）））を２サイクル行って超音波破砕し、菌体の破砕物を得た。当該菌体の破砕物を含む懸濁液０．５ ｍｌに、グリシンを最終５％（ｗ／ｖ）、メタノールを最終２．１％（ｗ／ｖ）となるように添加し、最終１ ｍｌとして、３０℃で３日間、１５０ ｒｐｍで振とうして反応させ、Ｌ−セリンを製造した。菌体分離後の上清をＨＰＬＣで測定した。結果を表４に示す。
【００４２】
実施例６〜１２（濃縮破砕処理菌体使用時の反応法）
グリシンおよびメタノールを表４に示す各最終濃度となるように添加した以外は実施例５と同様にしてＬ−セリンを製造した。菌体分離後の上清をＨＰＬＣで測定した。結果を表４に示す。
【００４３】
実施例１３（濃縮破砕処理菌体使用時の反応法）
グリシンおよびメタノールを表４に示す各最終濃度となるように添加し、テトラヒドロ葉酸（ＴＨＦ）が１ ｍＭとなるように反応液に添加した以外は実施例５と同様にしてＬ−セリンを製造した。菌体分離後の上清をＨＰＬＣで測定した。結果を表４に示す。
【００４４】
実施例１４（濃縮破砕処理菌体使用時の反応法）
グリシンおよびメタノールを表４に示す各最終濃度となるように添加し、ピリドキサール５’−リン酸（Ｐ−５’−Ｐ）が０．５ ｍＭとなるように反応液に添加した以外は実施例５と同様にしてＬ−セリンを製造した。菌体分離後の上清をＨＰＬＣで測定した。結果を表４に示す。
【００４５】
比較例１（培養液をそのまま使用した反応法）
グリシンおよびメタノールを表４に示す最終濃度となるように添加した以外は実施例３と同様にしてＬ−セリンを製造した。菌体分離後の上清をＨＰＬＣで測定した。結果を表４に示す。
【００４６】
比較例２〜３（濃縮破砕処理菌体使用時の反応法）
グリシンおよびメタノールを表４に示す各最終濃度となるように添加した以外は実施例５と同様にしてＬ−セリンを製造した。菌体分離後の上清をＨＰＬＣで測定した。結果を表４に示す。
【００４７】
【表４】
【００４８】
【発明の効果】
本発明によれば、効率的なＬ−セリン製造方法が提供でき、また、当該方法に用いることができる新規メタノール資化性菌を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】メタノールとグリシンからＬ−セリンを生じる反応を表した概念図である。
【発明の属する技術分野】
本発明は、新規メタノール資化性菌およびそれを用いたＬ−セリン製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
Ｌ−セリンは、皮膚保湿因子として存在する非必須アミノ酸（分子量１０５．０９）である。Ｌ−セリンは反応性に富む光学活性体で、輸液用途や光学活性体・医薬の合成原料・化粧品等に用いられている。
【０００３】
Ｌ−セリンの製造方法として、Ｌ−セリンを多量に含むタンパク質（例えば絹）を加水分解し抽出する方法が知られている。しかし、効率が悪く、またＬ−セリンが反応性に富む為、加水分解中にラセミ化する問題がある。
【０００４】
また、コリネ型細菌を使用した糖からの直接発酵法によるＬ−セリンの製造法が開示されているが効率的ではない（特許文献１参照）。さらに、メタノール資化性の微生物をメタノールとグリシンの存在下に培養し培養液中に蓄積したＬ−セリンを回収する発酵法が開示されているが、いずれも効率的な方法ではない（特許文献２、３参照）。また発酵法では、後の精製が煩雑となる問題がある。
【０００５】
そこで、酵素法による変換反応による効率のよいＬ−セリン製造法が種々研究され、例えばｉ）ホルムアルデヒドとグリシン（および補酵素葉酸）からのＬ−セリンの製造法、ｉｉ）シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属に属する細菌を使用したグリシンと５，１０−メチレンテトラヒドロ葉酸（またはグリシンとホルムアルデヒドとテトラヒドロ葉酸）からのＬ−セリンの製造法（特許文献４参照）が開発されている。
しかし、ｉ）の方法は、近年のシックハウス症候群の原因物質であるホルムアルデヒドを使用する点で問題があり、また、ホルムアルデヒドは微生物に対して有害であるので、ホルムアルデヒドを低濃度で制御する必要があり工業的な大量生産には適さない。ｉｉ）の方法は、ホルムアルデヒドを用いる点で上記と同様の問題があり、また葉酸を添加しない場合にはＬ−セリンの生産量が著しく減少するという問題がある。
【０００６】
さらに、酵素法による変換反応として、ｉｉｉ）Ｌ−セリン分解活性を抑制した条件下で、ヒポミクロビウム エスピー ＮＣＩＢ１００９９（Ｈｙｐｈｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ ｓｐ． ＮＣＩＢ１００９９）株の休止細胞を用いたメタノールとグリシンからのＬ−セリン合成、（非特許文献１参照）、ｉｖ）メチロバクテリウム エスピー ＭＮ４３（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ． ＭＮ４３）株の休止細胞を用いたメタノールとグリシンからのＬ−セリン製造（非特許文献２参照）が開示されている。
しかし、ｉｉｉ）、ｉｖ）には、本発明のグリシンとメタノールのモル比による効果は開示されていない。
【０００７】
これらの従来技術の問題点を勘案すると、１）ラセミ化することを防ぐため加水分解等の化学合成手法を用いず、微生物およびその酵素により光学活性な状態でＬ−セリンを得ることができること、２）発酵法ではなく、酵素手法によるグリシンからセリンへの変換反応を用いて効率化、後の精製の簡易化を図ることができること、３）ホルムアルデヒドを実質的に添加せずに、メタノール等を炭素源として培養した微生物による、メタノールとグリシンからＬ−セリンに変換する反応を用いることができること（すなわちホルムアルデヒドは微生物に必要な分だけ作らせることができること）、および４）効率化を図ることができる新規メタノール資化性・セリン経路を有する微生物の発見がＬ−セリンの製造のためには望まれる。
【０００８】
【特許文献１】
特開平１１−２６６８８１号公報
【特許文献２】
特公昭５８−１６８７８号公報
【特許文献３】
特公昭５７−３７３２０号公報
【特許文献４】
特開昭６２−９６０９２号公報
【非特許文献１】
Ｔ．ＹＯＳＨＩＤＡら、「ジャーナル オブ ファーメンテイションアンド バイオエンジニアリング（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ）」、第７９巻、第２号、１９９５年、ｐ１８１−１８３
【非特許文献２】
Ｔ．ＨＡＧＩＳＨＩＴＡら、「バイオサイエンス バイオテクノロジー アンド バイオケミストリー（Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ａｎｄ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）」、第６０巻、第１０号、１９９６年、ｐ１６０４−１６０７
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、効率的なＬ−セリン製造方法の提供および、それに用いることができる新規メタノール資化性菌の提供を目的とする。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記目的を達成するために鋭意研究を重ねた結果、上記１）〜３）の要件を満たす微生物である、メチロバクテリウム属に属し、セリン経路を有する細菌またはその破砕物を用いて、かつ原料とするグリシンとメタノールのモル比を特定の範囲内とすることで効率的なＬ−セリンの製造が可能となることを見出した。また、本発明者らは、土壌より上記１）〜３）の要件を満たすメチロバクテリウム属に属し、セリン経路を有する新規微生物（新規メタノール資化性菌）を発見し、この微生物を用いることで効率的なＬ−セリンの製造が可能となることを見出し、さらに研究を重ねて本発明を完成させるに至った。
【００１１】
すなわち、本発明は以下の通りである。
（１）メチロバクテリウム属に属し、セリン経路を有する細菌またはその破砕物を用いて、グリシンとメタノールとのモル比が１：０．８〜１：５．５であるグリシンとメタノールからＬ−セリンを製造するＬ−セリン製造方法、
（２）細菌の破砕物を用いる、上記（１）記載の方法、
（３）細菌がメチロバクテリウム エスピー ＲＦＳ−１０１２９株である、上記（１）または（２）記載の方法、
（４）細菌がメタノールを炭素源として培養した細菌である、上記（１）〜（３）のいずれかに記載の方法、
（５）メチロバクテリウム エスピー ＲＦＳ−１０１２９株。
【００１２】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳述する。
本発明では、メタノールとグリシンから以下に説明する微生物を用いてＬ−セリンを製造する。まず、メタノールとグリシンからＬ−セリンを生じる反応を図１に表した概念図で説明する。メタノールはメタノールデヒドロゲナーゼによる脱水素反応（図１中、▲１▼で表す反応系）によりホルムアルデヒドとなり、当該ホルムアルデヒドとグリシンとが補酵素テトラヒドロ葉酸を介したセリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼによる反応（図１中、▲２▼で表す反応系）によりＬ−セリンとなる。このように上記一連の酵素反応によりメタノールとグリシンからＬ−セリンが生じる。図１中▲１▼または▲２▼で示す一方の系のみを持つものは他にも多数存在するが、このような経路を有するのはメタノール資化性菌の中でもセリン経路を有する限られた微生物のみである。
【００１３】
本発明に用いられる微生物は、メチロバクテリウム（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属に属する細菌であって、かつセリン経路を有する細菌であれば特に限定されないが、例えば、後述のメチロバクテリウム エスピー ＲＦＳ−１０１２９（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ． ＲＦＳ−１０１２９）株、上記メチロバクテリウム エスピー ＭＮ４３（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ． ＭＮ４３）株等が挙げられる。このうち、メチロバクテリウム エスピー ＲＦＳ−１０１２９株が好ましい。
このような微生物は、例えば以下のスクリーニング方法によって、自然界から分離・取得、あるいは既存の保存菌株から選定・取得することができる。
【００１４】
スクリーニング方法
自然界から採取した土壌サンプルを、単一炭素源としてメタノールを含む液体培地（例えば培地Ａ（ｐＨ７）：メタノール０．８％（ｗ／ｖ）、Ｋ２ＨＰＯ４ １ｇ／ｌ、（ＮＨ４）２ＰＯ４ ２ｇ／ｌ、ＮａＣｌ １ｇ／ｌ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．０５ｇ／ｌ、ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．０５ｇ／ｌ、ＭｎＳＯ４・４−６Ｈ２Ｏ ０．０２ｇ／ｌ、ビタミン混合液（塩酸チアミン５ｍｇ／ｌ、リボフラビン１０ｍｇ／ｌ、パントテン酸カルシウム６ｍｇ／ｌ、塩酸ピリドキシン８ｍｇ／ｌ、ビオチン０．２ｍｇ／ｌ、ｐ−アミノ安息香酸３ｍｇ／ｌ、ニコチン酸４ｍｇ／ｌ）０．０５％（ｖ／ｖ））に加え、２５〜３０℃で２〜４日間集積培養を数度行い生育の確認をする（１次スクリーニング：メタノール資化性）。
生育のあった菌株については同培地組成の寒天培地で２５〜３０℃、２〜６日間培養し、単菌分離を行い、同培地スラントに保存する。
１次スクリーニングにおける生育株を、単一炭素源としてメタノールを含む液体培地（例えば上記培地Ａ）で２５〜３０℃で２〜６日間振とう培養を行い、次いで、同じ組成の培地で２５〜３０℃で２〜４日間、振とう培養を行った後、集菌する。得られた菌体と、メタノールおよびグリシンを含む反応液（例えば反応液１ｍｌ中最終濃度メタノール４．７％（ｗ／ｖ）、グリシン５．１％（ｗ／ｖ）、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８）５０ｍＭ、菌懸濁液１０％ＰＣＶ（ｖ／ｖ）を含む）を２５〜３０℃で１〜７日間振とうし反応させる。反応後の溶液についてＬ−セリン濃度を例えばＨＰＬＣ等で測定してＬ−セリン生産性を確認する（２次スクリーニング：Ｌ−セリン生産性）。生産性のあったサンプルを選択・単菌化し保存する。このようにして、メタノール資化性でセリン経路を有する微生物を選択することができ、特にこれらの中からＬ−セリン高生産性のメチロバクテリウム エスピー ＲＦＳ−１０１２９株を選択することができる。
なお、略号ＰＣＶ（Ｐａｃｋｅｄ Ｃｅｌｌ Ｖｏｌｕｍｅ）は、培養液中に含まれる菌体量を容積％で表したものである。
【００１５】
このようにして、本発明者らにより福井県内の土壌より新たに分離されたメチロバクテリウム エスピー ＲＦＳ−１０１２９株の菌学的諸性質を以下に示す。なお、各記号は、＋：陽性、−：陰性、Ｗ：反応弱を示す。
【００１６】
１．形態学的性質
培養条件：Ｎｕｔｒｉｅｎｔ Ａｇａｒ（Ｏｘｏｉｄ， Ｅｎｇｌａｎｄ， ＵＫ）培地、３０℃において、細胞の形態：桿菌（０．８×１．５〜２．０μｍ）、細胞の多形性の有無：−、運動性（鞭毛の着生状態）：＋（極毛）、胞子の有無：−である。
【００１７】
２．培養的性質
培養条件：培地メタノール０．８％（ｗ／ｖ）を含む合成培地Ａ（下記表１および表２）、培養時間４８ｈｒにおいて、コロニー形態：円形、全縁滑らか、低凸状、光沢あり、オレンジ色である。培養条件：Ｎｕｔｒｉｅｎｔ Ａｇａｒ（Ｏｘｏｉｄ， Ｅｎｇｌａｎｄ， ＵＫ）培地、３０℃において、色：オレンジ色→赤色（増殖期→定常期でのコロニーの色の変化）、光択：＋、色素産生：＋である。培養条件：Ｎｕｔｒｉｅｎｔ ｂｒｏｔｈ（Ｏｘｏｉｄ， Ｅｎｇｌａｎｄ， ＵＫ）培地、３０℃において、表面発育の有無：＋、培地の混濁の有無：＋である。培養条件：ゼラチン穿刺培養、３０℃において、生育状態：＋、ゼラチン液化：−である。培養条件：リトマス・ミルク、３０℃において、凝固：−、液化：−である。
【００１８】
３．生理学的性質
生理学的性質は、グラム染色性：−、硝酸塩の還元：−、脱窒反応：−、ＭＲテスト：−、ＶＰテスト：−、インドール産生：−、硫化水素の生成：−、デンプンの加水分解：−、クエン酸の利用（Ｋｏｓｅｒ）：−、クエン酸の利用（Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ）：−、無機窒素源の利用（硝酸塩）：＋、無機窒素源の利用（アンモニウム塩）：＋、ウレア−ゼ活性：＋、オキシダーゼ：＋、カタラーゼ：＋、生育の範囲（ｐＨ）：（ｐＨ５＋、ｐＨ６＋、ｐＨ８＋）、生育の範囲（温度（℃））：（２０＋、２５＋、３０＋、３７＋、４２−、４５−）、生育条件（好気性、嫌気性）：好気、Ｏ−Ｆテスト（グルコース酸化／発酵）：−／−、糖類からの酸産生／ガス産生：（Ｌ−アラビノース−／−、Ｄ−グルコース−／−、Ｄ−フラクトース−／−、マルトース−／−、ラクトース−／−、Ｄ−ソルビトール−／−、イノシトール−／−、Ｄ−キシロース−／−、Ｄ−マンノース−／−、Ｄ−ガラクトース−／−、サークロース−／−、トレハロース−／−、Ｄ−マンニトール−／−、グリセリン＋／−）、β−ガラクトシダーゼ活性：−、アルギニンジヒドロラーゼ活性：−、リジンデカルボキシラーゼ活性：−、トリプトファンデアミナーゼ活性：−、ゼラチナーゼ活性：−、ブドウ糖酸性化：−、エスクリン加水分解：−、ゼラチン加水分解：−、ブドウ糖資化性：−、Ｌ−アラビノース資化性：−、Ｄ−マンノース資化性：−、Ｄ−マンニトール資化性：−、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン資化性：−、マルトース資化性：−、グルコン酸カリウム資化性：−、ｎ−カプリン酸資化性：−、アジピン酸資化性：−、ｄｌ−リンゴ酸資化性：＋、クエン酸ナトリウム資化性：−、酢酸フェニル資化性：−、チトクロームオキシダーゼ：＋である。
【００１９】
各試験の実施方法は、（ｉ）［ＢＡＲＲＯＷ， （Ｇ．Ｉ．） ａｎｄ ＦＥＬＴＨＡＭ，（Ｒ．Ｋ．Ａ．）： Ｃｏｗａｎ ａｎｄ Ｓｔｅｅｌ’ｓ Ｍａｎｕａｌ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｂａｃｔｅｒｉａ． ３ｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ． １９９３， Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ．］、（ｉｉ）［ＨＯＬＴ，（Ｊ．Ｇ．）， ＫＲＩＥＧ，（Ｎ．Ｒ．），ＳＮＥＡＴＨ， （Ｐ．Ｈ．Ａ．）， ＳＴＡＬＥＹ， （Ｊ．Ｔ．） ａｎｄ ＷＩＬＬＩＡＭＳ， （Ｓ．Ｔ．）： Ｂｅｒｇｅｙ’ｓ ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｖｅ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ． ９ Ｅｄｉｔｉｏｎ． １９９４． Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ， Ｗｉｌｌｉａｍｓ ａｎｄ Ｗｉｌｋｉｎｓ］、（ｉｉｉ）［ＫＲＩＥＧ，（Ｎ．Ｒ．） ａｎｄ ＨＯＬＴ，（Ｊ．Ｇ．）： Ｂｅｒｇｅｙ’ｓ ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ． Ｖｏｌ． １． Ｗｉｌｌｉａｍｓ ａｎｄ Ｗｉｌｋｉｎｓ， Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ． １９８４］、（ｉｖ）［坂崎利一・吉崎悦郎・三木寛二：新 細菌培地学講座・下（第二版）． １９８８， 近大出版， 東京］、（ｖ）細菌同定キットＡＰＩ２０ＮＥ（ｂｉｏＭｅｒｉｅｕｘ， Ｆｒａｎｃｅ）の各文献の記載に従った。
【００２０】
上記硝酸塩の還元、インドール産生、ブドウ糖酸性化、アルギニンジヒドロラーゼ活性、ウレア−ゼ活性、エスクリン加水分解、ゼラチン加水分解、β−ガラクトシダーゼ活性、ブドウ糖資化性、Ｌ−アラビノース資化性、Ｄ−マンノース資化性、Ｄ−マンニトール資化性、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン資化性、マルトース資化性、グルコン酸カリウム資化性、ｎ−カプリン酸資化性、アジピン酸資化性、ｄｌ−リンゴ酸資化性、クエン酸ナトリウム資化性、酢酸フェニル資化性、チトクロームオキシダーゼについては、上記（ｖ）細菌同定キットＡＰＩ２０ＮＥ（ｂｉｏＭｅｒｉｅｕｘ， Ｆｒａｎｃｅ）を使用し、その測定方法に従った。
上記脱窒反応、ＶＰテスト、硫化水素の生成、リジンデカルボキシラーゼ活性、トリプトファンデアミナーゼ活性、ゼラチナーゼ活性については、上記文献（ｖ）に従い、上記ゼラチン液化、グラム染色性については上記文献（ｉ）に従い、上記リトマス・ミルク培養、ＭＲテスト、デンプンの加水分解、クエン酸の利用（Ｋｏｓｅｒ、Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ）、無機窒素源の利用（硝酸塩、アンモニウム塩）、オキシダーゼ、カタラーゼ、Ｏ−Ｆテスト、糖類からの酸産生／ガス産生については、上記文献（ｉｖ）に従った。
【００２１】
以上の細菌学的諸性質、特にオレンジ色のコロニー色彩を示し、グラム染色陰性、運動性、カタラーゼ反応陽性、オキシダーゼ反応陽性を示す好気性桿菌であること、およびメタノール資化能を有することから判断し、メチロバクテリウムエスピー（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．）に属する細菌であることが確認された（参考文献：上記文献（ｉｉ））。
しかしながら、ＲＦＳ−１０１２９株はこれまでに報告されている同属細菌（上記メチロバクテリウム エスピー ＭＮ４３株）とブドウ糖の資化性およびクエン酸ナトリウム資化性が違うことから、新菌株と設定することが妥当であるとの結論に達した。
そこで本発明者らは、メチロバクテリウム エスピー ＲＦＳ−１０１２９株と命名し、保存サンプルを平成１４年１２月１１日付で独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託した（受託番号：ＦＥＲＭ Ｐ−１９１４９）。
【００２２】
以下に、メチロバクテリウム属に属し、セリン経路を有する細菌（以下単に本発明のメタノール資化性菌ともいう。）、特にメチロバクテリウム エスピー ＲＦＳ−１０１２９株を用いた本発明のＬ−セリン製造方法（培養法、反応法）の一実施態様を説明する。
【００２３】
培養法
本発明のメタノール資化性菌の培養は、炭素源、窒素源等を含む通常の栄養培地で行うことができる。
炭素源としては、例えばメタノール、メチルアミン、モノクロロメタン等のＣ１化合物等が挙げられる。特にメタノールから変換されるホルムアルデヒドは、セリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼの活性発現・維持、活性化が期待される等の理由から、メタノールが好ましい。炭素源（特にメタノール）の培地中の濃度は、通常０．１〜３．０％（ｗ／ｖ）、好ましくは０．５〜１．５％（ｗ／ｖ）である。
【００２４】
窒素源としては、無機窒素、有機窒素のいずれを用いることもできるが、無機窒素が好ましい。無機窒素としては、例えば燐安、硫安、硝安等が挙げられる。有機窒素としては、例えばコーン・スティープ・リカー、酵母エキス等が挙げられる。窒素源の培地中の濃度は、通常０．０１〜１．０％（ｗ／ｖ）、好ましくは０．１〜０．５％（ｗ／ｖ）である。
【００２５】
培地にはその他微量成分として、マグネシウム、鉄、マンガン、硫黄等の金属塩、リボフラビン等のビタミン類、ピロロキノリンキノン、葉酸等の補酵素類、グリシン等のアミノ酸類等も適宜使用することができる。これらの微量成分の培地中の濃度は、微生物の生育を害しない濃度であれば特に制限はない。
【００２６】
培地には、培養途中に上記炭素源、窒素源、微量成分等を途中添加することもできる。特に限定されないが、グリシンの添加はこれらの中でもＬ−セリン生産性向上に非常に有効である。
【００２７】
培養条件は、振とう培養・通気培養等の好気培養であればよく、培養温度、培地のｐＨ、培養時間等は、Ｌ−セリンが大量に生産されるように適宜選択することができる。培養温度は通常２５〜４０℃、好ましくは２５〜３０℃であり、培地のｐＨは通常ｐＨ５〜９、好ましくはｐＨ６〜８であり、培養時間は通常１〜７日間、好ましくは２〜４日間である。
【００２８】
反応法
上記のように培養した菌体、グリシンおよびメタノールを含む反応液中で反応させてＬ−セリンを製造する。
本発明のＬ−セリン製造方法は、反応液中のグリシンとメタノールの組成モル比が１：０．８〜１：５．５であり、好ましくは１：１〜１：５であり、特に好ましくは１：２〜１：５であることを特徴とする。組成モル比がグリシン１に対してメタノールが０．８未満のときは、セリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼの活性が低くなってしまい、セリン生成量が低くなり、グリシン１に対してメタノールが５．５を越えるときは、メタノールによるセリン生成反応阻害が著しくなる。
【００２９】
菌体は、培養液をそのまま、または濃縮して用いることができる。また、非破砕の菌体または菌体の破砕物のいずれも用いることもできるが、基質であるメタノールやグリジン等が、より酵素と接触しやすくなること、反応性が高くなる等の理由から、菌体の破砕物を用いることが好ましい。菌体の破砕処理方法は酵素を失活させることがなければどのような方法でも良いが、例えば、超音波破砕、浸透ショック破砕、ホモジナイザー破砕、ミル破砕、高圧破砕、凍結破砕等が挙げられる。破砕時の温度は、通常２０℃以下であり、好ましくは１０℃以下である。
非破砕菌体調製及び破砕処理菌体調製時の溶媒は特に限定されず、例えば水、生理食塩水、緩衝液等が使用可能であり、緩衝液が好ましい。
【００３０】
反応液中、メタノール濃度は、通常０．２〜１５％（ｗ／ｖ）、好ましくは２〜７％（ｗ／ｖ）であり、グリシン濃度は、通常０．１〜１５％（ｗ／ｖ）、好ましくは２〜６％（ｗ／ｖ）である。
反応液中、非破砕菌体または菌体の破砕物の濃度は、通常１〜３０％（ｖ／ｖ）、好ましくは２〜１５％（ｖ／ｖ）である。
反応液には、さらに緩衝液等を添加することもでき、用いられる緩衝液の濃度は通常５〜５００ｍＭ、好ましくは２０〜２００ｍＭである。また、反応液には、セリン産生活性を抑制させるものでなければ、その他の添加物を添加することもでき、例えば、無機金属塩、ビタミン類、補酵素類等を添加することができる。
本発明では、補酵素葉酸を添加せずに、グリシンとメタノールからＬ−セリンを製造することもできる。
【００３１】
反応は、静置、攪拌、振とうのいずれでもよいが、攪拌または振とうして行うことが好ましい。反応温度は、通常２５〜４０℃、好ましくは２５〜３５℃である。反応ｐＨは、通常ｐＨ５〜１０、好ましくはｐＨ７〜１０である。反応時間は、通常１〜７日間、好ましくは２〜５日間である。
【００３２】
上記の方法で生成したＬ−セリンは、イオン交換樹脂法、その他の公知の方法を組み合わせることにより採取できる。
【００３３】
【実施例】
以下、本発明を詳細に説明するために実施例を記載するが、本発明はこれらの実施例によって何ら限定されるものではない。
【００３４】
実施例１ 土壌からの新規Ｌ−セリン生産微生物のスクリーニング
（１）１次スクリーニング（メタノール資化性）
福井県内３６箇所より採取した土壌サンプルを、滅菌水にて懸濁し、上清を微生物サンプルとした。当該微生物サンプルを単一炭素源としてメタノールを含む合成培地Ａ（表１および表２）液体培地に一白金耳加え、３０℃で３日間培養を数度行って生育の確認をし、生育株を得た。
生育株は同培地組成の寒天培地で３０℃３日間培養し、単菌分離を行った。
（２）２次スクリーニング（Ｌ−セリン生産性）
１次スクリーニングで得られた生育株を単一炭素源としてメタノールを含む合成培地Ａ（表１および表２）液体培地５ ｍｌで３０℃３日間振とう培養を行った。次いで、同じ組成の培地１００ ｍｌにて３０℃３日間、数度集積培養を行った。生育した菌を集菌・生理食塩水で洗菌し、再懸濁した。得られた懸濁液を超音波破砕処理し、菌体の破砕物を得た。当該菌体の破砕物を含む菌懸濁液とグリシン・メタノールを含むＬ−セリン生産反応液Ｂ（表３） １ ｍｌを３０℃３日間、振とうし反応させた。得られた溶液について、ＨＰＬＣにてＬ−セリンの濃度を測定し、Ｌ−セリン生産性を確認した。
生産性のあったサンプルを選択・単菌化し保存した。これらの中からＬ−セリン高生産性の微生物１株ＲＦＳ−１０１２９を選択した。この分離菌株について前記の如く更に菌学的諸性質を調べた結果、新規菌株であることが判明しメチロバクテリウム エスピー ＲＦＳ−１０１２９株と命名した。
【００３５】
【表１】
【表２】
【表３】
実施例２（培養法）
０．８％（ｗ／ｖ）メタノールを含む合成培地Ａ（表１および表２）２０ ｍｌを入れた１００ｍｌ三角フラスコに同培地組成の保存寒天培地からメチロバクテリウム エスピー ＲＦＳ−１０１２９株を一白金耳植菌し、３０℃で３日間、１５０ ｒｐｍで振とう培養（種培養）を行った。次いで、種培養と同じ培地１００ ｍｌを入れた５００ ｍｌ三角フラスコに種培養から１％植菌し、３０℃で２日間、１５０ ｒｐｍで振とう培養（本培養）を行った。
【００３９】
実施例３（培養液をそのまま使用した反応法）
実施例２の本培養終了後、得られた培養液に対し最終０．３％（ｗ／ｖ）となるようにグリシンを注加した。メタノールは添加しないが培養液中に最終０．５５％（ｗ／ｖ）となる量残っている。当該溶液を３０℃で２日間、１５０ ｒｐｍで振とうし反応させ、Ｌ−セリンを製造した。菌体分離後の上清をＨＰＬＣで測定した。結果を表４に示す。
【００４０】
実施例４（濃縮非破砕菌体使用時の反応法）
実施例２の本培養終了後、得られた培養液を、８０００ ｒｐｍで１０分間遠心分離し、沈殿を回収した（集菌）。得られた沈殿を２０ ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８）で最終２０％ＰＣＶになるように再懸濁した。当該懸濁液０．５ ｍｌに、グリシンを最終５％（ｗ／ｖ）、メタノールを最終４．７％（ｗ／ｖ）となるように添加し、最終１ ｍｌとして、３０℃で３日間、１５０ｒｐｍで振とうして反応させ、Ｌ−セリンを製造した。菌体分離後の上清をＨＰＬＣで測定した。結果を表４に示す。
【００４１】
実施例５（濃縮破砕処理菌体使用時の反応法）
実施例２の本培養終了後、得られた培養液を、８０００ ｒｐｍで１０分間遠心分離し、沈殿を回収した（集菌）。得られた沈殿を２０ ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８）で最終２０％ＰＣＶになるように再懸濁した。当該懸濁液を、０．５秒×１０回照射（使用機器「ＰＯＷＥＲ ＳＯＮＩＣ Ｍｏｄｅｌ ５０」（ヤマト科学（株）））を２サイクル行って超音波破砕し、菌体の破砕物を得た。当該菌体の破砕物を含む懸濁液０．５ ｍｌに、グリシンを最終５％（ｗ／ｖ）、メタノールを最終２．１％（ｗ／ｖ）となるように添加し、最終１ ｍｌとして、３０℃で３日間、１５０ ｒｐｍで振とうして反応させ、Ｌ−セリンを製造した。菌体分離後の上清をＨＰＬＣで測定した。結果を表４に示す。
【００４２】
実施例６〜１２（濃縮破砕処理菌体使用時の反応法）
グリシンおよびメタノールを表４に示す各最終濃度となるように添加した以外は実施例５と同様にしてＬ−セリンを製造した。菌体分離後の上清をＨＰＬＣで測定した。結果を表４に示す。
【００４３】
実施例１３（濃縮破砕処理菌体使用時の反応法）
グリシンおよびメタノールを表４に示す各最終濃度となるように添加し、テトラヒドロ葉酸（ＴＨＦ）が１ ｍＭとなるように反応液に添加した以外は実施例５と同様にしてＬ−セリンを製造した。菌体分離後の上清をＨＰＬＣで測定した。結果を表４に示す。
【００４４】
実施例１４（濃縮破砕処理菌体使用時の反応法）
グリシンおよびメタノールを表４に示す各最終濃度となるように添加し、ピリドキサール５’−リン酸（Ｐ−５’−Ｐ）が０．５ ｍＭとなるように反応液に添加した以外は実施例５と同様にしてＬ−セリンを製造した。菌体分離後の上清をＨＰＬＣで測定した。結果を表４に示す。
【００４５】
比較例１（培養液をそのまま使用した反応法）
グリシンおよびメタノールを表４に示す最終濃度となるように添加した以外は実施例３と同様にしてＬ−セリンを製造した。菌体分離後の上清をＨＰＬＣで測定した。結果を表４に示す。
【００４６】
比較例２〜３（濃縮破砕処理菌体使用時の反応法）
グリシンおよびメタノールを表４に示す各最終濃度となるように添加した以外は実施例５と同様にしてＬ−セリンを製造した。菌体分離後の上清をＨＰＬＣで測定した。結果を表４に示す。
【００４７】
【表４】
【発明の効果】
本発明によれば、効率的なＬ−セリン製造方法が提供でき、また、当該方法に用いることができる新規メタノール資化性菌を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】メタノールとグリシンからＬ−セリンを生じる反応を表した概念図である。
Claims (5)
- メチロバクテリウム属に属し、セリン経路を有する細菌またはその破砕物を用いて、グリシンとメタノールとのモル比が１：０．８〜１：５．５であるグリシンとメタノールからＬ−セリンを製造するＬ−セリン製造方法。
- 細菌の破砕物を用いる、請求項１記載の方法。
- 細菌がメチロバクテリウム エスピー ＲＦＳ−１０１２９株である、請求項１または２記載の方法。
- 細菌がメタノールを炭素源として培養した細菌である、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
- メチロバクテリウム エスピー ＲＦＳ−１０１２９株。
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|---|---|---|---|---|
| CN101165172B (zh) * | 2007-10-15 | 2010-11-10 | 广西大学 | 一种重组甲基营养杆菌及其应用 |
| JP2015059110A (ja) * | 2013-09-19 | 2015-03-30 | ホーユー株式会社 | 染毛剤組成物 |
-
2003
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