CN101165172B - 一种重组甲基营养杆菌及其应用 - Google Patents

一种重组甲基营养杆菌及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种重组甲基营养杆菌及其应用。本发明的重组甲基营养杆菌是将glyA基因插入到载体pLAFR3的多克隆位点，得到重组表达载体pLAFRg，再将pLAFRg通过三亲本杂交导入到甲基营养杆菌MB200中，得到重组甲基营养杆菌MB202。MB202在10mg甘氨酸，50mg甲醇，108-109CFU菌体量，pH8.5的50mM Tris-HCl至终体积1mL的条件下，32℃摇床培养48小时，L-丝氨酸的产量达11.5mg/mL；MB202在32℃条件下，发酵培养12小时后，丝氨酸羟甲基转移酶的酶活达115U。本发明在利用重组甲基营养杆菌MB202的静息细胞生产L-丝氨酸、在处理甲醇废水中都有具有十分广泛的应用前景。

Description

一种重组甲基营养杆菌及其应用
技术领域
本发明涉及一种重组甲基营养杆菌及其应用。
背景技术
L-丝氨酸属生糖氨基酸，是组成蛋白质的20种基本氨基酸之一。L-丝氨酸虽属于非必需氨基酸，但具有许多重要的生理功能和作用：L-丝氨酸是合成嘌呤、胸腺嘧啶、胆碱的前体；L-丝氨酸的羟基经磷酸化作用后，能衍生出具重要生理功能的磷丝氨酸，磷丝氨酸具有解除疲劳、恢复体力等功效；L-丝氨酸具有稳定滴眼液pH值的作用，且滴眼后无刺激性；L-丝氨酸是重要的自然保湿因子(NMF)之一，是皮肤角质层保持水分的主要角色，高级化妆品中的关键添加剂；同时丝氨酸的衍生物也具有优良的药用和生物活性，如α一取代丝氨酸被应用于设计肽，而且是免疫抑制剂ISP(多球壳菌素myriocin，嗜热菌杀酵母素thermozymocidin)和免疫激活剂、神经鞘真菌素E等生物活性物质的有效组成部分；由L-丝氨酸制成的偶氮丝氨酸常用于治疗肿瘤。
在世界氨基酸生产行业中，L-丝氨酸是工业化生产难度较大的氨基酸。虽然L-丝氨酸可从蚕丝水解液中提取，但是，其得率低、成本高、利润薄。由于技术原因，我国目前还不能大规模地生产L-丝氨酸，国内使用的L-丝氨酸基本靠国外进口。目前L-丝氨酸的生产方法主要有蛋白质水解法、化学法和微生物发酵法三种方法。国内主要采用蛋白质水解法生产L-丝氨酸，但其产量低、效率低、成本高，国外应用较多的方法是利用微生物发酵生产L-丝氨酸。
L-丝氨酸处于氨基酸代谢的中间位置，在体内代谢运转速度极快。与其他氨基酸相比，L-丝氨酸很难直接利用微生物发酵法生产。现有的L-丝氨酸生产方法大多采用以甘氨酸、甘氨酸三甲内盐或甘油酸为前体利用微生物发酵生产，所采用的微生物种类较多，大致可以分为两类，即甲基营养型细菌和异养型细菌(如嗜甘氨酸棒杆菌、诺卡氏菌等)。其中研究得最多、L-丝氨酸产量最高的是甲基营养型细菌。
甲基营养型细菌是一类可以利用甲醇等单碳化合物作为唯一碳源和能源进行生长的微生物。根据其利用碳源情况的不同，甲基营养型细菌可以分为以下三类：1、严格甲基营养型细菌(obligate methylotrophs)，如Methylobacillu.s，此类细菌只能利用单碳化合物作为唯一碳源进行生长；2、限制性兼性甲基营养型细菌(restrictedfacultative methylotrophs)，如Methylophilu.s，此类细菌除了能在以单碳化合物为碳源的培养基上生长外，还能利用小范围的多碳化合物作为碳源和能源；3、典型的兼性甲基营养型细菌(typical facultative methylotrophs)，如Methylovoru.s，此类细菌比限制性兼性甲基营养型细菌利用的多碳化合物的类型更多。由于甲基营养型细菌具有极为相似的形态学和代谢机制的特点，用于分类到不同属或种的标准还得根据其遗传和生理生化特性来决定。
能进行发酵生产L-丝氨酸的微生物种类丰富，包括Hyphomicrobium sp.、Methylobacterium sp.、Pseudomonas sp.、Nocardia sp.、Sarcina sp.等。目前已经分离到多株产L-丝氨酸的甲基营养型细菌菌株。如Izumi等筛选鉴定到1株产L-丝氨酸的嗜甲基生丝微菌(Hyphomicrobium methyloborum)菌株KM146，KM146菌株在含48mg/ml甲醇、100mg/ml甘氨酸、30mg/ml菌体、Tris-HCl(pH9.0)0.05mmol/ml的反应体系中，于28℃振动培养3天后，可以生成24mg/ml的L-丝氨酸，摩尔转化率为17％。Yoshida等筛选到一株生丝微菌(Hyphomicrobium sp.)菌株NCIB10099，NCIB10099菌株在含88mg/ml甲醇、100mg/ml甘氨酸、40mg/ml菌体、Tris-HCl(pH9.0)的反应体系中，于28℃振动培养3天，可以生成43mg/ml的L-丝氨酸。1986年，Sirirote等报道了利用扭曲甲基杆菌(Methylobacterium extorquens)菌株NR1生产L-丝氨酸的情况，研究表明，在甲醇浓度为10mg/ml、甘氨酸浓度为100mg/ml、细胞浓度为30.94mg/ml、溶解氧为0.5ppm、反应温度为30℃、控制pH的条件下，反应24小时，可以获得24.9mg/ml的L-丝氨酸。Hagishita等从土壤中分离到产L-丝氨酸的甲基杆菌(Methylobacterium sp.)菌株MN43，研究表明，在甲醇浓度为104mg/ml、甘氨酸浓度为50mg/ml的条件下，反应5天后，可以获得65mg/ml的L-丝氨酸，摩尔转化率为93％。这是目前已报道的利用甲醇和甘氨酸生产L-丝氨酸产量和摩尔转化率最高的一株甲基营养型细菌。Morinaga等分离到一株兼性甲基营养型细菌MS31，鉴定为假单胞菌(Pseudomonas sp.)，在培养后期添加甘氨酸和甲醇后，MS31菌株可以积累2.5mg/ml的L-丝氨酸。通过诱变获得的邻甲基丝氨酸抗性突变体S395可以积累10-12mg/ml的L-丝氨酸。
丝氨酸羟甲基转移酶基因(glyA)广泛存在于各种生物体中，是生物体中的一种重要基因，并能自身编码产生丝氨酸羟甲基转移酶(serine hydroxymethyltransferase，SHMT)。自然界中的细菌体内一般都含有glyA基因，如细菌中的E.coli。在体外条件下，当有一定浓度的四氢叶酸存在时，SHMT可以催化甲醛和甘氨酸可逆的合成L-丝氨酸。
发明内容
本发明的目的是提供一种重组甲基营养杆菌。
本发明的重组甲基营养杆菌，是将丝氨酸羟甲基转移酶基因插入到原核细胞表达载体的多克隆位点，得到重组表达载体，再将所述重组表达载体导入大肠杆菌中得到重组菌，以该重组菌作为供体菌，以转入帮助质粒pRK2073或pRK2013(购自Promega公司)的重组大肠杆菌为帮助菌，以甲基营养杆菌(Methylobacterium sp.)MB200为受体菌，通过三亲本杂交将所述重组表达载体导入到甲基营养杆菌(Methylobacteriumsp.)MB200中，得到重组甲基营养杆菌。
所述原核细胞表达载体可为现有的能在大肠杆菌细胞内表达复制的载体，如pLAFR3。
所述重组表达载体为将所述丝氨酸羟甲基转移酶基因插入到pLAFR3的多克隆位点，得到的重组表达载体pLAFRg。
其中，所述丝氨酸羟甲基转移酶的氨基酸序列如GenBank Accession NumberL33463所示。
所述三亲本杂交是将供体菌、协助菌与受体菌混合起来，使菌体细胞紧密接触，供体中的质粒在协助质粒的帮助下通过接合转移方式导入受体菌中。
所述丝氨酸羟甲基转移酶基因的编码序列具体可为序列表中序列1的自5’端第79-1383位核苷酸。其中，自5’端第79-1383位核苷酸是该基因的开放阅读框架，自5’端第79-81位核苷酸为该基因的起始密码子ATG，自5’端第1381-1383位核苷酸为该基因的终止密码子TAA。
所述三亲本杂交中的供体菌为将pLAFRg导入大肠杆菌(如DH5α)中得到的重组菌；所述帮助菌为将帮助质粒pRK2073或pRK2013(购自Promega公司)导入大肠杆菌(如DH5α)得到的重组菌。
其中，所述重组甲基营养杆菌具体可为甲基营养杆菌(Methylobacterium sp.)MB202，已于2007年8月8日保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC，地址为：中国武汉武汉大学)，保藏登记号为CCTCC № M207126。
本发明的第二个目的是提供一种生产丝氨酸羟甲基转移酶的方法。
本发明所提供的生产丝氨酸羟甲基转移酶的方法，是发酵培养所述重组甲基营养杆菌，得到丝氨酸羟甲基转移酶。
所述发酵培养的培养基按照如下方法配制：(NH4)2HPO43g、K2HPO4 2g、NaCl1g、MgSO4·7H2O 0.2g、FeSO4·7H2O 10mg、MnSO4·4-6H2O 5mg，维生素B1 10μg、核黄素20μg、泛酸钙20μg、维生素B6 20μg、生物素1μg、对氨基苯甲酸10μg，加水到1000ml，pH7.0，灭菌后加入体积百分比为1.25％的甲醇；所述发酵的培养温度为28-32℃；培养时间为48-72小时。
本发明的第三个目的是提供一种生产L-丝氨酸的方法。
本发明所提供的生产L-丝氨酸的方法，是培养上述重组甲基营养杆菌的静息细胞，得到L-丝氨酸。
所述静息细胞的培养体系为：甘氨酸10-60mg，甲醇50-100mg，菌体108-109CFU，pH8.5的50mM Tris-HCl至终体积1mL；所述培养温度为28-37℃，所述培养时间为48-72小时。
本发明构建的重组甲基营养杆菌能通过发酵培养生产丝氨酸羟甲基转移酶，丝氨酸羟甲基转移酶的酶活力达到115U，是出发菌株MB200的3.5倍；还能够通过培养重组甲基营养杆菌的静息细胞转化甘氨酸和甲醇生产L-丝氨酸，L-丝氨酸的产量达11.5mg/mL，与出发菌株MB200相比，提高了5倍。而且本发明生产L-丝氨酸的方法中，利用甲醇和甘氨酸为原料，成本低，可以获得较高的利润。本发明的重组甲基营养杆菌在生产L-丝氨酸、丝氨酸羟甲基转移酶和处理甲醇废水中都有具有十分广阔的应用前景。
附图说明
图1：MB200基因组DNA分别经BamHI、HindIII酶切后的Southern杂交结果
图2：基因文库的菌落原位杂交免疫反应显影
图3：glyA基因在大肠杆菌中的表达
图4：重组菌株MB202提取质粒的酶切验证结果
图5：野生菌株MB200生长时期与SHMT酶活情况分析
图6：重组菌株MB202生长时期与SHMT酶活情况分析
图7：薄层层析检测MB202静息细胞反应液中L-丝氨酸与甘氨酸
图8：L-丝氨酸与甘氨酸标准溶液混合后的定量分析
图9：MB200静息细胞反应液中L-丝氨酸与甘氨酸的定量检测
图10：MB202静息细胞反应液中L-丝氨酸与甘氨酸的定量检测
具体实施方式
本发明实施例中所用到的材料包括：大肠杆菌(Escherichia coli)Tuner(DE3)(购自Novagen公司)；载体为pLAFR3(购自Promega公司)；抗生素、限制性内切酶、修饰酶、TaqE、dNTP、pGEM T-easy载体试剂盒购自Promega公司，其它化学试剂购自广西蓝天实业有限公司。
在本发明实施例中所用到的培养基：
培养甲基营养杆菌的medium II培养基(即M培养基)：(1000ml)(NH4)2HPO4 3g、K2HPO4 2g、NaCl 1g、MgSO4·7H2O 0.2g、FeSO4·7H2O 10mg、MnSO4·4-6H2O 5mg，微量元素：维生素B1 10μg、核黄素20μg、泛酸钙20μg、维生素B6 20μg、生物素1μg、对氨基苯甲酸10μg，加水到1000ml，pH7.0，灭菌后在超净台内加入1.25％(体积百分比)的甲醇，固体培养基加入11g的琼脂粉。
LA培养基的组成(1000ml)：10.0g胰蛋白胨(购自Oxoid公司)；5.0g酵母浸出粉(购自Difco公司)；5.0g NaCl；pH7.0，琼脂粉1.2％。
实施例1、重组甲基营养杆菌MB202的制备
一、glyA基因的克隆
1、三亲本杂交的受体菌-甲基营养杆菌(Methylobacterium sp.)MB200 CGMCC No 1526的筛选
从广西隆安县某沼气池中采集泥样0.5g，加入到含100ml medium III液体培养基的三角瓶中，32℃摇床培养3天，将培养好的菌液按1％的接种量转接到100mlmediumII液体培养基中继续于32℃摇床培养3天，取100μl上述菌液稀释涂布于medium II固体培养基上，32℃培养3天，待长出菌落后，用接种环挑取单菌落接种于mediumII固体培养基上，将长出的单菌落分别编号，其中编号为MB200的菌株经鉴定为甲基营养杆菌(Methylobacterium sp.)，其保藏号为CGMCC No 1526。
2、探针的制备
根据Methylobacterium extorquens AM1的glyA基因序列(GenBank AccessionNumber L33463)使用vector NTI软件设计合成了一对丝氨酸羟甲基转移酶部分基因的特异引物GF和GR，GF为5’-CGACTCCTTCTTCTCGGCTC-3’，GR为5’-CGTTCTTGTTGCAGGTGATG-3’，以MB200的基因组DNA为模板，PCR扩增得到大小约0.65Kb的DNA片段，该片段经序列测定后发现与M.extorquens AM1的glyA基因序列相似性达到95％，确定从MB200中扩增到部分glyA基因片段。作为下一步Southern杂交的探针。
3、Southern杂交
根据Vector NTI软件分析的探针酶切位点图谱，选择适当的限制性内切酶对MB200的基因组DNA进行Southern杂交验证。用限制性内切酶BamHI、HindIII分别完全酶切MB200基因组DNA，将PCR产物经Promega公司的杂交专用试剂盒标记后作为探针，杂交之前的基因组DNA酶切、电泳、转膜等按文献所述方法进行(YoshitakeTanaka，Kazumi Araki and Kiyoshi Nakayama.1980，Strain improvement of Nocardiabutanica for microbial conversion of glycine into L-serine.Ferment.Technol.58(2)：163-166.)，然后58℃预杂交2-4h，以随机引物标记试剂盒标记探针，65℃杂交过夜，在严格条件下洗膜，压磷屏，用Amersham Biosciences公司的Typhoon 9410扫描成像。结果表明用BamHI、HindIII两种酶分别酶切处理MB200基因组DNA，均出现阳性杂交带，阳性杂交带的大小分别为3.5Kb、22Kb左右，结果如图1所示，其中，M为1Kb DNA Marker；1为BamHI酶切结果；2为HindIII酶切结果。根据基因大小和阳性印记片段的大小，选用BamHI酶切基因组DNA的产物作为构建文库的外源DNA。
4、基因文库构建
为了获得完整的glyA基因，在构建以pGEM-3Zf(+)(购自Promega公司)为载体的文库时，将MB200的基因组DNA用BamHI完全酶切，回收3.5Kb附近的酶切片段用于文库的构建。将上述回收的3.5Kb附近的酶切片段与经过相同酶切后去磷酸化的质粒载体pGEM-3Zf(+)相连接，形成重组表达质粒。将连接产物用电脉冲方法导入宿主感受态细胞DH5α内，经过1小时的预培养后，涂布于含有X-gal(40μg/ml)、IPTG(40μg/ml)、氨苄青霉素(Amp)(50μg/ml)的LA平板上，37℃恒温培养过夜，筛选得到约3000个白色转化子。
5、菌落原位杂交
将所获得的白色菌落按相应位置点在杂交尼龙膜上，置于含Amp的LA平板上培养12小时，待菌落大小在2mm左右时，用Southern杂交的方法进行菌落原位杂交，结果如图2。结果得到10个可能的阳性菌落。
6、阳性克隆序列分析
将其中一个阳性菌落提取质粒，酶切验证后，送至大连宝生物公司进行测序。测序结果表明，该阳性菌含有序列表中序列1所示的DNA序列。其中，序列自5’端的第79-1383位核苷酸为glyA基因的开放阅读框(Open Reading Frame，ORF)，编码如GenBank Accession Number L33463所示的glyA；自5’端的第79-81位核苷酸为glyA基因的起始密码子ATG，自5’端的第1381-1383位核苷酸为glyA基因的终止密码子TAA。
7、glyA基因在大肠杆菌中的表达
根据上述测序的基因序列设计引物P1(5’-CTAGGATCCCATGAGCGCCGGAACTG-3’)、P2(5’-ACGAAGCTTGTTGTAGATCGGGAAGC-3’)，下划线分别为BamHI和HindIII的酶切位点，以10ng MB200的基因组DNA为模板，PCR扩增序列1的自5’端第79-1383位核苷酸，其它反应物按说明书添加，反应程序为96℃2min，95℃50sec，61℃50sec，72℃1.5min，30个循环，72℃5min。将该PCR产物进行测序，结果表明该PCR扩增产物的核苷酸序列是序列表中序列1的自5’端第79-1383位核苷酸。
将该PCR扩增得到的产物经琼脂糖凝胶电泳再经试剂盒纯化，用BamHI和HindIII双酶切该片段，回收后连接到用同样酶切处理的pET-blue(购自Novagen公司)载体上，将该重组表达载体命名为pET：og，然后将重组表达载体pET：og导入到大肠杆菌Tuner(DE3)(购自Novagen公司)中，得到了重组表达菌株Tuner(pet：og)。同时，将pET-blue转入大肠杆菌Tuner(DE3)中，得到重组菌株Tuner(pet：blue)。
接种Tuner(pet：og)于3ml L3培养基中，培养过夜。将3ml菌液全部加入到盛有100ml LB液体培养基的250ml三角瓶中，振荡培养。当OD600到0.4-0.6时加入IPTG至终浓度为1.0mM，诱导培养4-5小时左右。将诱导表达的菌液于10000rpm，4℃离心，收集菌体。超声波破碎细胞，15000rpm离心20min去除细胞残留物，将上清液进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，检测SHMT蛋白是否表达及其可溶性，检测结果如图3所示，其中，1：纯化的SHMT蛋白(用Ni柱亲和层析纯化。具体方法：将上述细胞破碎后离心的上清液装填Ni-NTA亲和层析柱，按常规方法上Ni+层析柱：先平衡层析柱，平衡缓冲液(20mmol/L Tirs-HC1，0.5mol/L NaCl，5mmol/L咪唑pH7.9)；低速上样后，再用同样的平衡缓冲液洗柱以去除杂蛋白；最后洗脱目的蛋白，洗脱缓冲液(20mmol/L Tirs-HC1，0.5mol/L NaCl，10-200mmol/L咪唑)，收集洗脱峰，得到纯化的SHMT蛋白)，2：从上至下依次为116.0，66.2，45.0，35.0，25.0，18.4，14.4kDa的蛋白质分子量标准，菌株Tuner(pet：og)的诱导表达结果，4：对照菌株Tuner(pet：blue)的诱导表达结果。结果表明，得到48kDa的SHMT，且该蛋白可溶。
二、三亲本杂交制备重组甲基营养杆菌MB202
将上述步骤一的7中得到的PCR产物经HindIII和BamHI酶切后连接到用同样酶切处理的pLAFR3(购自Promega公司)载体上，得到重组表达质粒，将该重组表达质粒命名为pLAFRg，将pLAFRg导入大肠杆菌DH5α感受态细胞中，得到的重组菌作为供体菌；将帮助质粒pRK2073(购自Promega公司)转入大肠杆菌DH5α感受态细胞中，得到的重组大肠杆菌作为帮助菌；以甲基营养杆菌(Methylobacterium sp.)MB200为受体菌，通过三亲本杂交将pLAFRg导入到甲基营养杆菌(Methylobacteriumsp.)MB200中，得到重组甲基营养杆菌MB202。具体方法如下：
将上述供体菌、帮助菌、受体菌三种菌都培养到对数生长期，将以上菌液按照1∶1∶4的体积比混合均匀，离心收集菌体，TE洗3次，然后点到共培养基(M+20％(体积百分含量)LB)平板上，32℃共培养2-3天。挑取单菌落稀释涂布到含四环素(15ug/ml)和萘啶酮酸(50ug/ml)两种抗生素的M培养基平板上进行筛选，得到的筛选子进一步提取质粒用HindIII和BamHI进行双酶切鉴定，其中编号为MB202的菌株的质粒酶切鉴定结果如图4，其中，M为1Kb DNA Marker，泳道1为从重组甲基营养杆菌MB202中提取的质粒，泳道2为该质粒经HindIII和BamHI酶切后的酶切结果。说明甲基营养杆菌(Methylobacterium sp.)MB202是将重组表达质粒pLAFRg导入到甲基营养杆菌(Methylobacterium sp.)MB200得到的重组甲基营养杆菌。甲基营养杆菌(Methylobacterium sp.)MB202已于2007年8月8日保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC，地址为：中国武汉武汉大学)，保藏登记号为CCTCC №M207126。
实施例2、甲基营养杆菌(Methylobacterium sp.)MB202 CCTCC № M207126生产丝氨酸羟甲基转移酶和L-丝氨酸的能力检测
一、甲基营养杆菌(Methylobacterium sp.)MB202 CCTCC № M207126生产丝氨酸羟甲基转移酶
为了确定菌株的SHMT酶活力与生长时期的关系，将菌株MB200和MB202分别接种于medium II液体培养基中，于32℃培养12小时后，每3小时测定一次菌液的OD600值，并收集0.6mg的湿菌体(2×106-2×107CFU)测定酶活。
其中酶活的测定方法是：1ml酶反应体系中含50mM磷酸缓冲液(pH8.5)，0.05mmol/ml DL-3-苯基丝氨酸，0.05umol/ml磷酸吡哆醛，0.03％CTAB及0.6mg的湿菌体(2×106-2×107CFU)，反应温度45℃，酶活力单位以每小时产生1umol苯甲醛的量为一个酶活力单位。
实验设3次重复，检测结果如图5和图6所示，表明甲基营养杆菌(Methylobacterium sp.)MB200 CGMCC No 1526在培养33小时酶活达到最高，每毫克菌体的酶活为33U±4U(平均值±标准差)，即33U±4U/3.3×106-3.3×107CFU；甲基营养杆菌(Methylobacterium sp.)MB202 CCTCC № M207126在培养36小时，酶活达到最高，每毫克菌体的酶活为115U±5U(平均值±标准差)，即115U±5U/3.3×106-3.3×107CFU。MB202的最高酶活是MB200最高酶活的3.5倍。图5和图6中的数据是3次重复的平均值。
二、生产L-丝氨酸
1、静息细胞培养
接种一环甲基营养杆菌(Methylobacterium sp.)MB202 CCTCC № M207126到10mLmedium II培养基中，32℃摇床培养3天。然后转接1mL培养物到100mL新鲜的mediumII培养基中，继续32℃摇床培养到OD600为0.8-1.0(即培养24-32小时)，4℃条件下，8000rpm离心10分钟收集菌体。同时，以相同方法培养的甲基营养杆菌(Methylobacterium sp.)MB200 CGMCC No 1526作为对照。将收集的菌体用生理盐水洗3次后，按以下次序将各成分在指形瓶内混合：Tris-HCl(pH8.5)50mM，甘氨酸10mg，甲醇50mg，菌体30mg(108-109CFU)，加50mM Tris-HCl(pH8.5)至终体积1mL。置于32℃摇床上培养48hr，13000rpm离心10分钟，取上清液，-20℃保存待测。
其中，上述摇床的转速为200rpm，离心半径为135mm。
2、L-丝氨酸检测
(1)L-丝氨酸定性分析：DNS-氨基酸聚酰胺薄膜层析
采用聚酰胺薄膜(10×10cm)。吸取培养上清液于EP管中，加入等体积的DNS-Cl丙酮溶液。于40℃恒温箱保温30分钟，移入80℃烘箱10分钟。加入1mol/L盐酸至pH2-3，加入水饱和的乙酸乙酯充分混匀。取上层液点样，以苯∶冰醋酸(9∶1)为展开剂展开，在紫外光下看到黄色荧光，采用L-丝氨酸(购自Sigma公司，产品目录号为CA-118)和甘氨酸(购自Sigma公司，产品目录号为CA-066.)作对照，通过与对照比较判断有L-丝氨酸的产生。DNS-氨基酸聚酰胺薄膜层析结果如图7所示，其中，CK：L-丝氨酸标准品和甘氨酸标准品混合液的薄膜层析结果，1：待测样品的薄膜层析结果。
(2)L-丝氨酸定量分析：反应体系离心取上清液送广西分析测试研究中心测定，采用日本日立公司的氨基酸自动分析仪L-8800 AAA system hanager，柱子为26223C柱，检测L-丝氨酸的含量和甘氨酸的残留量。结果如图8、9、10所示，其中，图8：L-丝氨酸与甘氨酸标准溶液混合后的定量分析结果，图9：甲基营养杆菌(Methylobacterium sp.)MB200 CGMCC № 1526发酵反应液中L-丝氨酸与甘氨酸的定量检测结果，图10：甲基营养杆菌(Methylobacterium sp.)MB202 CCTCC № M207126发酵反应液中L-丝氨酸与甘氨酸的定量检测结果。3次重复实验的结果表明，甲基营养杆菌(Methylobacterium sp.)MB202 CCTCC № M207126每毫升反应体系中L-丝氨酸的含量为11.5mg±0.2mg(平均值±标准差)，即11.5mg±0.2mg/108-109CFU，甲基营养杆菌(Methylobacterium sp.)MB200 CGMCC № 1526每毫升反应体系中L-丝氨酸的含量为2.8mg±0.2mg(平均值±标准差)，即2.8mg±0.2mg/108-109CFU。
                            序列表
<160>1
<210>1
<211>1383
<212>DNA
<213>甲基营养杆菌(Methylobacterium sp.)
<400>1
gtgcctgaaa aacacccccg tgaacgccga cgggaaacgg gtgggtttgc ccgtaaacaa     60
ggaaaagagg ctacgctcat gagcgccgga actgcgtccg acaacaccgc cctcgacacc    120
ttcttttcgg ctcatcttgc cgagaccgat ccggagatcg ccaaggcgat ttcgcaggag    180
ctcggccggc agcagcatga gatcgagctg atcgcctccg agaacatcgt ctcgcgcgcc    240
gtgctcgaag cgcagggctc cgtgctcacc aacaagtacg cggagggcta tccgggccgg    300
cgctactacg gtggctgcca gttcgtcgac atcgccgagg agctcgccat cgaccgcgcc    360
aagcgcctgt tcggctgcgg cttcgccaac gtgcagccga attccggctc acaggcgaac    420
cagggtgtgt tcatggccct gatgcagccg ggcgacacct tcctcggcct cgacctcgcc    480
gccggcggtc acctcaccca cggcgccccc ccgaacgtct cgggcaagtg gttcaagccg    540
gtctcctaca ccgtgcgccg cgaggaccag cgcatcgaca tggagcaggt cgagcgtctc    600
gcccaggaac acaagccgaa ggtgatcatc gccggcggct cgggctatcc gcgtcactgg    660
gacttcgcga agttccgtga gatcgccgat tcggtcggcg ccttcttctt cgtcgacatg    720
gcccacttcg ccggcctcgt cgccgcgggc ctgcacccgt cgcccttccc gcatgcccat    780
gtcgccacca cgacgaccca caagaccctg cgcggccccc gcggcggcat gatcctgacg    840
aacgacgagg cgctggccaa gaagttcaac tcggcgatct tccccggcct ccagggcggt    900
ccgctgatgc acgtcatcgc cgccaaggcc gtggccttcg gcgaggcgct gaagcccgag    960
ttcaagatct acgcgaagca ggtcatcgac aacgcccgcg cgctggccga caccatcatc   1020
tcgggcggct acgacatcac ctcgggcggc accgacaacc acctgatgct ggtcgacctg   1080
cagcggaagg gcctgaccgg caaggcggcc gaggcggccc tgtcgcgggc cgacatcacc   1140
tgcaacaaga acggcgtgcc gttcgacccg cagaagccga ccatcacctc cggcatccgc   1200
ctcggcaccc cggccagcac gacccgcggc ttcggcgtcg ccgagttcaa gcaggtcggg   1260
tcgttgatcg tcgaggtgct cgacggtctc gccgagaagg gtgagggcgg cgatgcgtcg   1320
gtcgaggcgg cggtcaagga gaaggtccac gccctgaccg atcgcttccc gatctacaac   1380
taa                                                                 1383

Claims (3)

1.甲基营养杆菌(Methylobacterium sp.)MB202，其保藏号为CCTCC No M207126。
2.一种生产丝氨酸羟甲基转移酶的方法，是发酵培养权利要求1所述的重组甲基营养杆菌，得到丝氨酸羟甲基转移酶；
所述发酵培养的培养基按照如下方法配制：(NH4)2HPO4 3g、K2HPO4 2g、NaCl 1g、MgSO4·7H2O 0.2g、FeSO4·7H2O 10mg、MnSO4·4-6H2O 5mg，维生素B1 10μg、核黄素20μg、泛酸钙20μg、维生素B620μg、生物素1μg、对氨基苯甲酸10μg，加水到1000ml，pH 7.0，灭菌后加入体积百分比为1.25％的甲醇；所述发酵的培养温度为32℃；培养时间为12-48小时。
3.一种生产L-丝氨酸的方法，是培养权利要求1所述的重组甲基营养杆菌的静息细胞，得到L-丝氨酸；
所述静息细胞的培养体系为：甘氨酸10-60mg，甲醇50-100mg，菌体108-109CFU，pH8.5的50mM Tris-HCl至终体积1mL；所述培养温度为32℃，所述培养时间为48小时。
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欧倩等.丝氨酸生产菌的筛选及静息细胞培养系统中L - 丝氨酸的合成.氨基酸和生物资源28 3.2006,28(3),41-44.
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