CN101985627B - 一种新型酯酶及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种新型酯酶的DNA，它的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。它的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。还公开了含上述新型酯酶DNA的表达载体和重组酯酶及重组酯酶在降解拟除虫菊酯类农药残留中的应用，该新型酯酶及重组酯酶在大肠杆菌表达体系中具有高效的可溶性表达，且该重组酯酶对氯氟氰菊酯、氯氰菊酯、氰戊菊酯和溴氰菊酯等具有高效降解作用。

Description

一种新型酯酶及其应用

技术领域

本发明属于基因工程领域，具体涉及一种从海底泥中提取的新型酯酶及其表达载体、重组酯酶及重组酯酶在降解拟除虫菊酯农药残留中的应用。

背景技术

拟除虫菊酯类农药是继有机氯、有机磷和氨基甲酸酯类农药后根据天然除虫菊素的结构人工合成的一类仿生杀虫剂，其出现代表杀虫剂工业进入了超高效杀虫剂时代。拟除虫菊酯类农药的杀虫机理主要是影响昆虫的神经系统，杀虫活性强，杀虫效力一般比有机磷杀虫剂大100倍以上，且速效性好同时用量少、低残留，被广泛用于粮食、蔬菜和果树等多种作物。

长期接触拟除虫菊酯类农药即使是低剂量也会引起慢性疾病，有些类型还有致畸、致癌作用。而且菊酯类农药对水生动物的毒性较大，联合国粮农组织和《联邦食品安全法》已对其多种农药作出了进出口限制。随着人们生活水平的提高、环护意识的增强以及残留农药分析技术的进步，人们迫切的需要无农药残留污染的安全食品。因此，寻找一种有效方法消除或降低在农作物、食品和环境基质中拟除虫菊酯类农药残留已成为当前迫切需要解决的问题。

目前，有关拟除虫菊酯类农药的降解主要有物理、化学和生物三种方法。由于生物法较物理和化学法处理残留农药具有经济、高效、无二次污染等优点，成为当今的主要研究热点。利用微生物降解残留农药大多数是依靠胞内酶的酶解作用，降解酶去除残留农药降解具有作用底物浓度低、环境适应能力强和安全无毒等优点，但由于野生菌株大多产酶能力有限、发酵周期长、纯化复杂。因此，克隆农药降解酶基因，并利用工程菌作生物反应器来生产农药降解酶是将来主要的研究方向。目前已从可培养微生物中克隆到多种农药降解酶基因，然而这些降解酶基因在工程菌中表达时存在不可溶表达或表达条件要求苛刻问题，而且重组降解酶的低温酶活性和稳定性无法满足实际应用要求，不能达到快速有效降解残留农药的目的。为了解决这些问题，迫切需要从自然界中寻找更有潜力的菊酯类农药降解酶。

宏基因组学(Metagenomics)是以特定生态环境中微生物群体基因组的总和作为研究对象，以功能基因筛选和测序分析为研究手段，通过宏基因组文库的构建及基因克隆、异源表达等基本研究策略，筛选出有用的新基因及其产物，近年来随着微生物学和现代生命科学的迅猛发展而兴起的一门新兴学科。宏基因组学技术在挖掘和利用未培养微生物资源和筛选新颖生物活性物质方面表现出巨大的潜力，为生命科学提供了强有力的新方法，已成为当前国际上微生物学研究的前沿领域和热点。至今国内外学者已经通过该技术克隆到如淀粉酶、木聚糖酶、纤维素酶、酯酶等新基因，这些酶具有新颖的酶学特性及工业应用潜力。因此，采用该方法使充分利用环境中蕴藏的大量宝贵基因资源成为可能。到目前为止，国内外尚未有利用宏基因组技术从海底泥中发现新型广谱高效降解拟除虫菊酯类农药降解酶的研究报道。

发明内容

本发明的第一个目的在于提供一种新型酯酶的DNA。

本发明的第二个目的在于提供上述新型酯酶的宏基因组学克隆方法。

本发明的第三个目的在于提供含有上述新型酯酶的DNA的表达载体。

本发明的第四个目的在于提供利用上述表达载体构建的重组酯酶及其制备方法。

本发明的最后一个目的在于提供上述重组酯酶在降解拟除虫菊酯类农药残留中的应用。

本发明的第一个目的是通过如下技术方案来实现的：一种新型酯酶的DNA，它的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明提供的上述新型酯酶，它的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。

本发明的第二个目的是通过如下技术方案来实现的：一种新型酯酶的宏基因组学克隆方法，提取海底泥的总DNA并纯化，将纯化后的总DNA经BamHI酶切，连接pUC118载体，电击转化大肠杆菌DH5α高效感受态建立宏基因组文库，通过点平板和滴加底物显色法快速筛选得到阳性克隆子，经测序和BLAST比较并设计引物，从而克隆到目的片段。

本发明的第三个目的是通过如下技术方案来实现的：一种含有上述新型酯酶的DNA的表达载体。

本发明的第四个目的是通过如下技术方案来实现的：一种重组酯酶的制备方法，包括用上述表达载体转化寄主细胞，培养转化体，从培养物中获得重组酯酶。

上述重组酯酶的制备方法中，寄主细胞是大肠杆菌。

上述重组酯酶的制备方法，其具体过程为：包括用上述表达载体的目的片段经BamHI、HindIII双酶切，与pET-28a(+)载体连接，转化至大肠杆菌BL21(DE3)，经IPTG诱导，得到高效可溶性表达。

所述的IPTG终浓度为0.1-1.3mM，诱导温度为18-37℃。

本发明提供的重组酯酶，包括用上述表达载体转化寄主细胞，培养转化体，从培养物中获得重组酯酶的步骤的方法制备。

本发明的最后一个目的是通过如下技术方案来实现的：本发明所述重组酯酶在降解拟除虫菊酯类农药残留中的应用。

本发明的有益效果：

①.本发明从海底泥样品构建好的宏基因组文库中得到一个新的酯酶的DNA序列，通过基因工程技术对其功能研究，发现该序列在大肠杆菌中高效可溶表达，经蛋白纯化及SDS-PAGE电泳，得到一条单一的蛋白条带，初步确定分子量约为31.2KDa。

②.本发明将SEQ ID NO.1所示的DNA序列克隆到原核表达载体上，转化大肠杆菌感受态细胞，通过对阳性克隆子的诱导表达得到重组蛋白，研究其酶学性质，结果如下：

(1)在大肠杆菌表达体系中，该重组蛋白具有高效可溶性表达。

(2)用对硝基苯酚乙酸酯为底物，测得重组蛋白的最适反应温度为40℃，在温度低于60℃非常稳定，60℃保温2h后，相对酶活性保持在80％以上，在20℃和10℃条件下，分别为最高酶活性的76％和37％，表明该酶具有热稳定和冷适应性；最适反应pH为7.0，在pH 5.5-9.0，酶的相对活力保持在80％以上，说明其有较宽的pH酶解范围；测定金属离子和生化试剂对酶活力影响时发现，1mM Al³⁺对重组酯酶F816的酶活力有明显提高作用；1％(w/v)的TritonX-100和Tween-80对其酶活力均有不同程度的提高作用；Hg²⁺、Ag⁺和SDS则明显的抑制酶活力，其它离子和生化试剂对酶活性没有明显的影响。

③.本发明通过测定其酶学性质时发现对1mg/L的氯氟氰菊酯、氯氰菊酯、氰戊菊酯和溴氰菊酯有强降解作用，测定重组蛋白降解氯氟氰菊酯、氯氰菊酯、氰戊菊酯和溴氰菊酯，结果表明其降解率均超过90％，因此在去除果蔬拟除虫菊酯类农药残留方面有广阔的应用前景。

附图说明

图1为实施例1中的SDS-PAGE电泳图；

其中，M为标准蛋白分子量maker，1为重组蛋白粗提物，2为纯化的重组蛋白；

图2为重组蛋白降解底物对硝基苯酚乙酸酯的最适温度和热稳定性结果折线图；

其中1为最适温度折线图，2为热稳定性折线图；

图3为重组蛋白降解底物对硝基苯酚乙酸酯的最适pH和pH稳定性结果折线图；

其中1为最适pH折线图，2为pH稳定性折线图；

图4为氯氟氰菊酯、氯氰菊酯、氰戊菊酯和溴氰菊酯的降解气相色谱图。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明做进一步说明，但不以任何形式限制本发明。

实施例1宏基因组文库的建立和阳性克隆子的获得、基因克隆与表达

1、总DNA的提取：

称取6g样品，加入13.5mL DNA提取缓冲液(0.1M Tris，0.1M EDTA-Na，0.1M Na₃PO₄，1.5M NaCl，1％CTAB，pH值8.0)，剧烈振荡3-5min，加入200μL溶菌酶(100mg/ml)，反复颠倒5-6次，37℃水浴30min，加入1.5ml 20％SDS，65℃水浴1h(期间每隔15min上下颠倒几次)，8000r/min离心5min，取上清液，用等体积氯仿抽提2次，16000r/min离心10min，取上清，加入0.6倍体积的异丙醇，室温放置2h，20000r/min离心20min，弃上清，沉淀加5mL预冷的70％乙醇，20000r/min离心10min，收集DNA沉淀，风干，用适量TE缓冲液溶解。

2、试剂盒法纯化DNA：按照胶回收试剂盒说明书进行。

3、宏基因组电泳检测：用1％琼脂糖凝胶电泳检测总DNA的纯度和质量。

4、酶切总DNA：用限制性内切酶BamHI部分酶切总DNA，回收2-8kb的酶切片段，方法同试剂盒法纯化DNA。

5、酶切片段的电泳检测：方法同宏基因组电泳检测。

6、酶切片段的链接：将回收得到的酶切片段和pUC118/BamHI(BAP)载体连接过夜，向连接产物中加入0.6倍体积的异丙醇，室温沉淀1.5h，14000r/min离心20min，弃上清并向沉淀中加入70％无水乙醇洗涤2次，风干并加入适量dd H₂O重溶。

7、连接产物的转化：

吸取5μL的连接产物加入到100μL的大肠杆菌DH5α高效感受态中，2500V/cm(Eppdorf2510电击仪)电击1次，46℃热激6min，37℃，180rpm摇床培养45-60min，吸取30-40μL涂布于LB琼脂平板，37℃培养过夜。根据平板上菌落数目将剩余的转化产物涂布含氨苄青霉素(100μg/ml)、IPTG(1mM)和X-gal(24μg/ml)的LB平板。由此构建了一个库容量达15000个转化子、多样性好的宏基因组文库。

8、文库筛选和阳性克隆子的鉴定

将文库中所有的白板单菌落点种至两块含氨苄青霉素(100μg/ml)、IPTG(1mM)的LB固体培养基中，37℃培养24-48h，选择其中一块平板并将X-cap(80μg/ml)滴至菌落表面及周围，37℃放置30min后观察颜色反应。产生蓝色反应的即为阳性克隆。通过筛选得到一株阳性克隆子。

从另一块平板中将阳性克隆子挑出并接种至10mL含氨苄青霉素(100μg/ml)的LB液体培养基中，37℃、220r/min摇床培养过夜，取2mL菌体进行质粒提取，对插入片段测序，将测定的序列经过NCBI的BLASTn软件分析比较，发现该DNA由825个碱基组成，其核酸序列如SEQ ID NO.1所示，该DNA编码的多肽，含274个氨基酸，其氨基酸序列如SEQ IDNO.3所示，将其命名为F816。其中SEQ ID NO.2为SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.3的对照图。

9、基因片段的克隆

根据测序结果设计一对引物：F1和F2，引物两端引入能插入pET-28a(+)载体的HindIII和BamHI酶切位点，引物序列如下：

F1 5’-CGCGGATCC ATG AGT GAG CTG ACA TCA ATC TCC G

F2 5’-CCCAAGCTT TCA GGG GGC CAG CAA CTC

利用两条引物，以质粒pUC118-F816为模板进行PCR扩增反应，PCR体系如下：

条件为：94℃5min，94℃30sec，66℃30sec，72℃1min，30个循环，72℃10min。

用胶回收试剂盒将PCR产物纯化并用BamHI、HindIII于37℃双酶切24h，与用BamHI、HindIII双酶切的pET-28a(+)(Invitrogen)表达载体进行连接，取5μL重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)，转化液涂布含氨苄青霉素(100μg/ml)的LB固体培养基，37℃培养过夜，随机挑取10株单菌落接种提取质粒DNA，双酶切验证后，送交测序。

10、重组酯酶F816粗酶液的获得及分子量检测

将重组工程菌划线至含卡那霉素(50μg/ml)的LB固体培养基中，37℃培养过夜活化，随机挑取1株重组菌接种至含卡那霉素(50μg/ml)的LB液体培养基中，37℃、220r/min摇床培养过夜，按1∶100的接种量转接至50mL的含卡那霉素(50μg/ml)的LB液体培养基中，当生长至OD₆₀₀＝0.6-0.8时加入IPTG至终浓度1mM，30℃、200r/min摇床培养8-9小时(OD₆₀₀＝3)，其中IPTG终浓度为0.1-1.3mM，诱导温度为18-37℃均可。14000r/min离心5min，弃上清，将菌体重悬于50ml，0.05M的Tris-HCl(pH＝6.8)缓冲液中，用超声波破碎仪(Sonics公司)破碎细胞，4℃，14000r/min离心20min，收集上清，得到粗重组蛋白，将粗重组蛋白用Ni-NTAAgerose(QIAGEN)亲和柱纯化重组蛋白，亲和柱具体操作步骤按QIAGEN公司产品说明书进行。

将获得的粗重组蛋白和纯化后的重组蛋白进行SDS-PAGE凝胶电泳(10％)将粗酶液中蛋白的各个组分分开，用考马斯亮蓝R-250染色，蛋白maker估计酶蛋白的大小。通过蛋白纯化试剂盒纯化酶蛋白，SDS-PAGE电泳得到一条单一的蛋白条带。SDS-PAGE电泳结果表明，SEQ ID NO.1所述核苷酸序列所编码的多肽在大肠杆菌BL21(DE3)中得到高效表达，且所有重组蛋白均是可溶的，无包涵体形成，初步估计重组蛋白F816的分子量约为31.2kDa。(如附图1所示)。

用Quantity One software(BioRad Laboratories Inc.，Hercules，CA)软件分析蛋白表达量，结果显示本发明的多肽在大肠杆菌BL21(DE3)的总可溶表达蛋白中含量高达47.6％。

实施例2重组酯酶F816的酶学性质研究

称取11mg对硝基苯酚乙酸酯，先用1mL甲醇完全溶解，然后吸取0.4mL的对硝基苯酚乙酸酯溶液至9.6mL的0.05M Tris-HCl(pH＝6.8)缓冲液中，取100μL待测酶液加入2mL的对硝基苯酚乙酸酯溶液中，保温5min，同时以灭活的粗酶液做对照，405nm测定光吸收值，吸收值越大表明酶活力越高。

1、重组酯酶F816最适反应温度及热稳定性

将重组酯酶F816的粗酶液在20-80℃下进行酶促反应后，按上述方法测定其酶活性，得到其最适反应温度(以酶活力最高时记为100％)。在20-80℃下保温2h，40℃测定剩余酶活，得到酶的热稳定性。结果检测结果如附图2所示，重组酯酶F816的最适反应温度为40℃，温度低于40℃时，随温度的上升酶活力逐步提高，20℃时相对酶活力仍大于75％，当温度高于60℃时，酶活力随温度上升快速下降。

2、重组酯酶F816最适反应pH及pH稳定性

将重组酯酶F816的粗酶液在不同pH下进行酶促反应后，按上述方法测定其酶活性，得到其最适反应pH。在pH 3.5-10时保温24h，40℃测定剩余酶活，得到酶的pH稳定性(以酶活力最高时记为100％)。结果如附图3所示，重组酯酶F816的最适反应pH为7.0，在pH 5.5-9.0，酶的相对活力保持在80％以上，表明该酶有很宽的pH酶解范围，且pH对重组酯酶F816的影响很小。

3、不同离子和生化试剂对酶活力的影响

向重组酯酶F816的粗酶液酶促反应体系中加入1mM的各种离子和生化试剂，30℃保温24h，同时做不加任何离子和生化试剂的酶液做对照，按上述方法测定其酶活性，研究不同离子和生化试剂对酶活力的影响。检测结果如表2所示，1mM Al³⁺对重组酯酶F816的酶活力有明显的提高作用；1％(w/v)的Triton X-100和Tween-80对其酶活力均有不同程度的提高作用；Cu²⁺，Zn²⁺，Mn²⁺，Mg²⁺，Cd²⁺和Ca²⁺对酶活性没有任何影响；Hg²⁺和Ag⁺和1％(w/v)SDS对其酶活力则有明显的抑制作用，其他离子和生化试剂对酶活没有明显的影响。

表1离子及生化试剂对酶活力的影响

实施例3重组酯酶F816拟除虫菊酯农药的降解能力测定

本研究选取氯氟氰菊酯、氯氰菊酯、氰戊菊酯和溴氰菊酯为降解对象，用GC-2010气相色谱仪(日本岛津公司)进行定量分析，测定重组酯酶F816对拟除虫菊酯类农药的降解能力。

1、样品处理

取0.3mL粗酶液加入到1mL浓度为4mg/L的氯氟氰菊酯、氯氰菊酯、氰戊菊酯和溴氰菊酯中，空白对照则取0.3mL粗酶液加入到1mL pH 6.8的0.1M磷酸钾缓冲液中，分别再加pH 6.8的0.1M磷酸钾缓冲液至终体积为4mL，37℃反应60min，按1∶2(v/v)的比例在待测样品中加入正己烷，在恒温摇床上振荡20min(200r/min)，吸取上清并定容至1mL，准确吸取1μL用GC-2010气相色谱仪(日本岛津公司)进行定量分析。

GC-2010气相色谱仪，采用ECD检测器，RestekRTX-5色谱柱(30m×0.25mm×0.25μm)进行测定。操作条件：分流进样，分流比60∶1；进样量为1.0μL；进样口温度：250℃；柱流量：2.0mL/min；恒压方式，柱前压为50kPa；载气为高纯氮气，流速40mL/min；柱箱程序升温：150℃(保持1min)，以30℃/min的速度上升至270℃，保持10min；ECD检测器温度300℃，电流1nA，尾吹流量30mL/min。

检测结果如附图4所示，重组酯酶F816对氯氟氰菊酯、氯氰菊酯、氰戊菊酯和溴氰菊酯的降解率均在90％以上，其中对氯氰菊酯降解效果最理想，达到100％。

综上所述，本发明SEQ ID NO.1所述的来源于海底泥的DNA序列在大肠杆菌表达体系中高效可溶的表达重组蛋白，重组蛋白具有广谱高效降解果蔬中残留的拟除虫菊酯类农药作用，因此，可用于高效、廉价、大规模生产重组拟除虫菊酯降解酶，在果蔬、茶叶等残留拟除虫菊酯类农药降解中具有重要的应用潜力。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种新型酯酶的DNA，其特征是：它的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.一种新型酯酶，其特征是：它的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。

3.权利要求1所述的新型酯酶的宏基因组学克隆方法，其特征是：提取海底泥的总DNA并纯化，将纯化后的总DNA经BamHI酶切，连接pUC118载体，电击转化大肠杆菌DH5α高效感受态建立宏基因组文库，通过点平板和滴加底物显色法快速筛选得到阳性克隆子，经测序和BLAST比较并设计引物，从而克隆到目的片段。

4.一种包含权利要求1所述的新型酯酶的DNA的表达载体。

5.一种重组酯酶的制备方法，其特征是：包括用权利要求4所述的表达载体转化寄主细胞，培养转化体，从培养物中获得重组酯酶。

6.根据权利要求5所述的重组酯酶的制备方法，其特征是：其中寄主细胞是大肠杆菌。

7.根据权利要求6所述的重组酯酶的制备方法，其特征是：其具体过程为：包括用权利要求4所述的表达载体的目的片段连接在pUC118/BamHI(BAP)载体上，然后经BamHI、HindIII双酶切，与pET-28a(+)载体连接，转化至大肠杆菌BL21，经IPTG诱导，得到高效可溶性表达。

8.根据权利要求7所述的重组酯酶的制备方法，其特征是：所述的IPTG终浓度为0.1-1.3mM，诱导温度为18-37℃。

9.一种重组酯酶，其特征是：包括用权利要求4所述的表达载体转化的寄主细胞，培养转化体，从培养物中获得重组酯酶的步骤的方法制备。

10.权利要求9所述的重组酯酶在降解拟除虫菊酯农药残留中的应用。

Images