CN108949584A - 一种抗盐耐碱的土曲霉菌株、其its序列及应用 - Google Patents

一种抗盐耐碱的土曲霉菌株、其its序列及应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种抗盐耐碱的土曲霉菌株、其ITS序列及应用，所述土曲霉菌株的保藏名称为絮状土曲霉JYJ‑5菌株，保藏编号为CGMCC 15368，该菌株具有抗盐耐碱的特性，能够在钠盐环境和碱性环境中长期良好的生长，其中在钠盐浓度为5‑15％(克/毫升)的高盐条件下以及在pH为7‑12的碱性条件下能够良好的生长；本发明提供的菌株在改造盐碱地中具有广阔的应用前景。

Description

一种抗盐耐碱的土曲霉菌株、其ITS序列及应用
技术领域
本发明属于微生物工程与技术领域，具体涉及一种抗盐耐碱的土曲霉菌株、其ITS序列及应用。
背景技术
随着经济的高速发现，环境问题变得日益严峻，土地盐碱化、农业废弃物污染、淤泥污水污染等问题日益突出。
关于改良盐碱土地的研究已经有近百年的历史了，总体来说，盐碱地的改良主要通过水利改良、农业技术改良、生物改良、化学改良等方法。水利改良需要建立完善的排水灌溉系统；农业改良主要通过深耕、平整土地、增施有机肥等手段增强土壤渗透性能，加速盐分淋洗；化学改良通过对碱土、苏打盐土施加石膏，黑矾等改良剂，降低或者消除土壤的减分，改良土壤理化性质。这些方法都在一定程度上改良了土壤，但是，其中的大部分方法工艺复杂，成本高，或者会对土壤环境造成二次污染，因此不适合大规模的使用。而微生物在自然界的生存能力强，能够适应恶劣的环境，具有较高的利用价值，利用微生物进行修复改造盐碱地、处理污水、处理农业废弃物，变废为宝，简单方便，不会对环境造成二次污染。但是目前同时具有抗盐耐碱特性的微生物种类有限，同时在正常的环境中能够净化污水、分解农业废弃物的微生物在高盐碱的土地中的活性受到极大的抑制，很难发挥其作用。
发明内容
为了解决以上的技术问题，本发明提供一种具有抗盐耐碱的土曲霉菌株及其在治理土地盐碱化、降解秸秆以及发酵秸秆饲料中的应用。
本发明的目的是提供一种抗盐耐碱的土曲霉菌株。
本发明的另一目的是提供一种上述抗盐耐碱土曲霉菌株的ITS序列。
本发明的再一目的是提供上述土曲霉菌株在改良盐碱地中的应用。
本发明的再一目的是提供一种上述土曲霉菌株发酵得到的抗盐耐碱的土曲霉菌剂。
本发明提供的抗盐耐碱的土曲霉菌株，保藏名称为絮状土曲霉JYJ-5，属于絮状土曲霉(Aspergillus floccosus)，该菌株于自吉林省长春市地区的土壤中分离得到，已于2018年3月19日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC15368。本发明提供的絮状土曲霉JYJ-5具有抗盐耐碱的特性，能够在钠盐环境中生长，其最适宜生长的钠盐的浓度为5-15％(克/毫升)；絮状土曲霉JYJ-5在pH为2.5-12范围内均能够生长，在pH为7-12的碱性环境中也能够良好的生长。
上述絮状土曲霉JYJ-5的ITS序列如SEQ ID NO:1所示。
将扩增的ITS序列数据提交GenBank。利用NCBI网站上的在线软件Blast进行同源性比对，JYJ-5菌株与曲霉属(Aspergillus floccosus.)菌株NN058828的同源性达100％；获取与JYJ-5菌株序列同源性相关菌株基因及该属菌的模式菌株16S rDNA序列，使用系统发育树软件Clustalx和MEGA5.05软件中的Neighbor-Joining法构建系统发育树。初步鉴定JYJ-5菌株为曲霉属(Aspergillus floccosus.)菌株。
絮状土曲霉JYJ-5菌株具有以下的形态特征：
将筛选得到的抗盐耐碱菌株接种到查氏琼脂培养基上，在30℃培养一周，观察菌落形态并镜检其产孢结构和菌丝形态。结果表明在30℃于查氏琼脂平板上培养1周后，菌落呈圆形或近圆形、中心凸起。用挑针取菌落表层菌丝，制成玻片，进行显微观察：菌丝和孢子梗光滑，分生孢子梗直立生长，梗顶膨大，呈球状，在小梗顶端萌发分生孢子，分生孢子为球形单胞。
根据生物学的形态特征鉴定及其ITS序列鉴定，本发明提供的菌株为土曲霉菌种。
由于本发明得到的抗盐耐碱的土曲霉菌株能够在钠盐环境中生长，能够在钠盐浓度为5-15％(克/毫升)的环境中长期良好的生长，能够用于改造盐碱地，所述盐碱地为钠盐环境。
本发明提供的抗盐耐碱的土曲霉菌株能够在pH为2.5-12的环境下生长，在pH为7-12的碱性条件下良好的生长，并且能够分泌有机酸，因此能够用于改造盐碱地。所述盐碱地的pH为7-12。
经本发明提供的含上述抗盐耐碱的土曲霉菌株发酵得到的抗盐耐碱的土曲霉菌剂也在本发明的保护范围。
本发明的有益效果为：
本发明提供一种抗盐耐碱的土曲霉菌株、其ITS序列及应用，本发明提供的絮状土曲霉JYJ-5菌株，具有抗盐耐碱的特性，能够在钠盐环境和碱性环境中长期良好的生长，其中在钠盐浓度为5-15％(克/毫升)的高盐条件下以及在pH为7-12的碱性条件下能够良好的生长；本发明提供的菌株在改造盐碱地中具有广阔的应用前景。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本发明提供的土曲霉菌落形态特征图；
图2是本发明提供的土曲霉菌落的分生孢子；
图3是本发明提供的土曲霉菌落的分生孢子梗；
图4是本发明提供的土曲霉菌落的分生孢子头。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明的技术方案进行详细的描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所得到的所有其它实施方式，都属于本发明所保护的范围。
实施例1
絮状土曲霉JYJ-5菌株的分离
菌株的分离：分离菌株的土壤样品来自吉林省长春市。在采集地利用五点取样法进行样品的采集，取土壤耕层30cm深范围内土壤，装入已灭菌处理的玻璃瓶带回实验室备用。采用稀释涂布法，将稀释后澄清的土壤上清液涂布于添加NaCl至150.0g/L的马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)上，在pH＝10条件下培养4天，经过3轮筛选分离到一株抗盐耐碱的真菌菌株—絮状土曲霉JYJ-5，该菌株已于2018年3月19日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC 15368。
实施例2
絮状土曲霉JYJ-5菌株的鉴定
1.菌株形态鉴定：将实施例1筛选得到的絮状土曲霉JYJ-5接种到查氏琼脂培养基上，在30℃培养一周，观察菌落形态并镜检其产孢结构和菌丝形态。温度为30℃在查氏琼脂平板上培养1周后，菌落呈圆形或近圆形、中心凸起，如图1所示。用挑针取菌落表层菌丝，制成玻片，进行显微观察：菌丝和孢子梗光滑，分生孢子梗直立生长，梗顶膨大，呈球状，在小梗顶端萌发分生孢子，如图3和图4所示。所述分生孢子为球形单胞，如图2所示。经形态学鉴定为土曲霉。
2.絮状土曲霉JYJ-5菌株ITS序列测定
将扩增的ITS序列数据提交GenBank。利用NCBI网站上的在线软件Blast进行同源性比对，JYJ-5菌株与曲霉属(Aspergillus floccosus.)菌株NN058828的同源性达100％；获取与JYJ-5菌株序列同源性相关菌株基因及该属菌的模式菌株16S rDNA序列，使用系统发育树软件Clustalx和MEGA 5.05软件中的Neighbor-Joining法构建系统发育树。初步鉴定JYJ-5菌株为曲霉属(Aspergillus floccosus.)菌株。
实施例3
絮状土曲霉JYJ-5抗盐耐碱性及最适盐浓度的鉴定
1.絮状土曲霉JYJ-5最适盐浓度的测定：配制梯度NaCl含量的PDA培养基，所述培养基的pH为7.0，其盐浓度由1wt％增加到31wt％(饱和浓度)，每级增加2％，以不添加NaCl的PDA为对照组。将等量的菌株接种于培养基中心位置，在30℃下培养1周。结果发现，在30℃的温度下，在0％-31％NaClPDA培养基中，菌株均能生长，但是随着盐浓度增长，菌株生长明显受到抑制。在1％-5％浓度下生长相对较缓慢；5％-15％浓度下菌株生长加快，17％-25％浓度下菌株生长急剧变慢，27％-31％浓度下菌体基本不生长，因此，该菌株具有抗盐的特性，属于抗盐特性的真菌。
为了确定菌株生长的最适盐浓度，用上述系列盐梯度PD(马铃薯液体培养基，不加琼脂)(pH7.0)培养菌株，25℃摇培一周后，离心收集菌丝，用去离子水反复冲洗4次，105℃下烘干测定菌丝干重，比较发现菌株在5-15％浓度下的干重最大，其最适生长的盐浓度为5-15％。
2.絮状土曲霉JYJ-5生长pH测定
配制pH为1.0-13.0的酸碱梯度PDA培养基，添加NaCl至终浓度为5wt％，接菌，在25℃下培养1周后记录菌株的生长情况。研究发现，不同pH的培养基上菌株开始生长的时间不同。培养1d后，pH2.5-9.0的培养基中有菌丝生长；3d后pH10.0培养基中有菌丝生长；4d后，pH11.0培养基中有菌丝生长；7d后pH12.0培养基中有菌丝生长。而极端酸碱环境(pH1.0、2.0和13.0)下均无菌丝生长。结果表明本发明提供的絮状土曲霉JYJ-5菌株能够适应pH范围是2.5-12.0。
为了进一步确定该菌株生长的最适pH范围，利用上述pH梯度进一步用PD液体培养基培养，在25℃摇培1周后，离心收集菌丝，用去离子水反复冲洗4次，105℃下烘干，比较菌丝干重。菌株在pH6-8范围内，菌体干重最大，因此，本发明提供的絮状土曲霉JYJ-5菌株的最适pH范围为6-8。
实施例4
发酵菌株对盐碱土中pH和全盐量影响的鉴定
将发酵菌株液体制剂施入吉林省大安市丰收村盐碱地。春天翻耕灌水3d后，加入有机肥料，进行搅混；15d后进行耙田平整，种植水稻，插秧分蘖前期均匀施入发酵菌剂，秋天进行收获。空白对照组的土壤pH为10.2、全盐量为0.19％，水稻无法正常分蘖；施入絮状土曲霉JYJ-5发酵菌株实验组的土壤pH为8.7、全盐量为0.06％，水稻能够正常的生长，分蘖；具体的鉴定结果如表1所示。其中的效果为试验点数据与空白参照点数据之差与空白参照点数据的百分比。从表1的结果可以看出本发明提供的絮状土曲霉JYJ-5发酵得到的菌剂处理盐碱地之后，pH下降14.7％，钠离子的浓度降低73.8％，全盐量降低67.6％，本发明提供的菌剂能够有效改善盐碱地的状况，使得盐碱地适于种植。
表1本发明提供的絮状土曲霉JYJ-5菌剂处理对盐碱土的影响
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。
SEQUENCE LISTING
<110> 长春中农煦丰生物科技有限公司
<120> 一种抗盐耐碱的土曲霉菌株、其ITS序列及应用
<130> 2018
<160> 1
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 547
<212> DNA
<213> 未知
<400> 1
cgagtgcggg tcctcgtggc ccaacctccc acccgtgact attgtacctt gttgcttcgg 60
cgggcccgcc agcttgctgg ccgccggggg gcgtctcgcc cccgggcccg tgcccgccgg 120
agaccccaac atgaaccctg ttctgaaagc ttgcagtctg agttgtgatt ctttgcaatc 180
agttaaaact ttcaacaatg gatctcttgg ttccggcatc gatgaagaac gcagcgaaat 240
gcgataacta atgtgaattg cagaattcag tgaatcatcg agtctttgaa cgcacattgc 300
gccccctggt attccggggg gcatgcctgt ccgagcgtca ttgctgccct caagcccggc 360
ttgtgtgttg ggtcctcgtc ccccggctcc cgggggacgg gcccgaaagg cagcggcggc 420
accgcgtccg gtcctcgagc gtatggggct ttgtcttccg ctctgtaggc ccggccggcg 480
cccgccgacg catttttttg caacttgttt ttttccaggt tgacctcgga tcaggtaggg 540
atacccg 547

Claims (6)

1.一种抗盐耐碱的土曲霉菌株，其特征在于，所述菌株的保藏名称为絮状土曲霉JYJ-5，保藏编号为CGMCC 15368。
2.权利要求1所述的抗盐耐碱的土曲霉菌株的ITS序列，其特征在于，所述ITS序列如SEQ ID NO:1所示。
3.权利要求1所述的抗盐耐碱的土曲霉菌株在改造盐碱地中的应用。
4.根据权利要求3所述的抗盐耐碱的土曲霉菌株在改造盐碱地中的应用，其特征在于，所述盐碱地为钠盐环境。
5.根据权利要求3所述抗盐耐碱的土曲霉菌株在改造盐碱地中的应用，其特征在于，所述盐碱地的pH为7-12。
6.一种抗盐耐碱的土曲霉菌剂，其特征在于，由含有权利要求1所述的抗盐耐碱的土曲霉菌株经发酵得到。
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