CN110564625A - 一种抗盐碱黄柄曲霉菌及其分离方法和应用 - Google Patents

一种抗盐碱黄柄曲霉菌及其分离方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种抗盐碱黄柄曲霉菌及其分离方法和应用,在250.0g/L含有不同浓度NaCl的PDA培养基固体平板上涂布经过梯度稀释的秸秆粉悬浮液,处理重复3次,培养4‑15天后挑取生长良好的单菌落,接种于筛选培养基CMC‑Na固体培养基上,产生透明圈状的菌株,得到黄柄曲霉菌,保藏名称:黄柄曲霉W3;保藏编号:CGMCCNO.17973;本发明中的黄柄曲霉菌菌株可在高盐碱环境下降解秸秆,且在高盐碱环境下对秸秆的降解能力高,还可以直接用于田间的秸秆发酵等生物物质的分解,对次生盐渍化或连作障碍土壤的改良与环境污染处理能力高,可以产生良好的处理效果。

Description

一种抗盐碱黄柄曲霉菌及其分离方法和应用
技术领域
本发明涉及微生物学工程与技术领域,尤其涉及一种抗盐碱黄柄曲霉菌及其分离方法和应用。
背景技术
我国秸秆资源丰富,来源广泛,居世界首位,特别是农业改革以来,随着粮食产量的大幅增长,农作物秸秆产量也快速增加,已经成为我国秸秆资源的重要来源。随着科学技术的不断发展,秸秆的利用领域也得到了极大的拓展,如秸秆可作为燃料、饲料、基料(育苗基质)、工业原料等等。但目前农作物秸秆资源化综合利用率仍然较低,多为粗放处理,甚至直接在田间地头直接焚烧,既给环境造成严重的污染,也意味着肥料的大量流失,已引起了全社会的广泛关注;
高抗盐碱真菌是从高盐、高碱或高盐碱共存环境中分离的微生物资源,具有重要的研究、应用与开发价值,因此高抗盐碱真菌的挖掘、开发和利用意义重大。目前,人们已将这些高抗盐碱真菌应用于环境治理中,如盐碱地的修复改造、淤泥污水的净化处理,以及农业废弃物的循环利用等;
利用微生物降解秸秆并还田是改良土壤,特别是修复盐碱土壤的一种重要措施,但目前市面上的大部分微生物菌剂在正常土壤中可以发挥很好的作用,而在盐碱土壤中,由于高浓度的盐和高PH值的环境,这些菌株很难发挥应有的作用,为了是盐碱地秸秆能在短时间内被高效降解、实现肥料还田,从盐碱土壤中筛选高抗盐碱真菌是十分有必要的,因此本发明提出一种抗盐碱黄柄曲霉菌及其分离方法和应用,以解决现有技术中的不足之处。
发明内容
针对上述问题,本发明提出一种抗盐碱黄柄曲霉菌及其分离方法和应用,本发明中的黄柄曲霉菌菌株可在高盐碱环境下降解秸秆,且在高盐碱环境下对秸秆的降解能力高,还可以直接用于田间的秸秆发酵等生物物质的分解,对次生盐渍化或连作障碍土壤的改良与环境污染处理能力高,可以产生良好的处理效果。
本发明提出一种抗盐碱黄柄曲霉菌,所述抗盐碱黄柄曲霉菌于 2019年06月14日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心;保藏单位地址:北京市朝阳区北辰西路1号院3号;保藏名称:黄柄曲霉W3;分类命名:黄柄曲霉(Aspergillus flavipes);保藏编号:CGMCC NO.17973。
一种抗盐碱黄柄曲霉菌的分离方法,包括以下步骤:
步骤一:在250.0g/L含有不同浓度NaCl的PDA培养基固体平板上涂布经过梯度稀释的秸秆粉悬浮液,每个PDA培养基固体平板上处理重复3次;培养4-15天后挑取生长良好的单菌落保存备用;
步骤二:将步骤一中挑取后进行保存备用的单菌落接种于筛选培养基CMC-Na固体培养基上,产生透明圈状的菌株;
步骤三:将步骤二中产生的透明圈状的菌株进行保藏,并进行 ITS序列鉴定,以得出鉴定结果。
进一步改进在于:所述步骤一中PDA培养基由10g玉米秸秆粉、4g(NH4)2SO4、0.5gMgSO4·7H2O、2gKH2PO4、1g蛋白胨、16g琼脂和 1000mL去离子水组成。
进一步改进在于:所述步骤一中的秸秆粉悬浮液为4-6cm厚的含有秸秆样品的秸秆土壤表层土样于4℃保存、稀释并取上清液后得到秸秆粉悬浮液。
进一步改进在于:所述步骤一中PDA培养基PH值为10。
进一步改进在于:所述步骤三中透明圈状的菌株进行ITS序列鉴定之前需要进行形态学鉴定,将筛选得到的透明圈状的菌株接种到含 5%NaCL的PDA培养基上,在30℃的环境内培养5天,观察菌落形态。
进一步改进在于:所述步骤三中透明圈状的菌株进行ITS序列鉴定具体为:将扩增的ITS序列数据提交GenBank,利用NCBI网站上的在线软件Blast进行同源性比对。
进一步改进在于:所述步骤三中透明圈状的菌株进行ITS序列鉴定之后,还需要进行黄柄曲霉W3菌株抗盐性及最适盐浓度的鉴定、黄柄曲霉W3菌株生长PH测定、黄柄曲霉W3菌株产纤维素酶活性测定及菌株降解秸秆效果测定。
一种抗盐碱黄柄曲霉菌在环境污染处理的应用。
一种抗盐碱黄柄曲霉菌在盐碱地改造的应用。
本发明的有益效果为:本发明中的黄柄曲霉菌菌株可在高盐碱环境下降解秸秆,且在高盐碱环境下对秸秆的降解能力高,还可以直接用于田间的秸秆发酵等生物物质的分解,对次生盐渍化或连作障碍土壤的改良与环境污染处理能力高,可以产生良好的处理效果。
附图说明
图1为本发明黄柄曲霉菌落形态特征示意图。
图2为本发明分生孢子梗及分生孢子示意图。
图3为本发明菌株降解秸秆效果示意图。
具体实施方式
为了加深对本发明的理解,下面将结合实施例对本发明做进一步详述,本实施例仅用于解释本发明,并不构成对本发明保护范围的限定。
实施例一
一种抗盐碱黄柄曲霉菌的分离方法,包括以下步骤:
步骤一:在250.0g/L含有不同浓度NaCl的PDA培养基固体平板上涂布经过梯度稀释的秸秆粉悬浮液,每个PDA培养基固体平板上处理重复3次;培养4-15天后挑取生长良好的单菌落保存备用,其中 PDA培养基由10g玉米秸秆粉、4g(NH4)2SO4、0.5gMgSO4·7H2O、2gKH2PO4、 1g蛋白胨、16g琼脂和1000mL去离子水组成,DA培养基PH值为10,秸秆粉悬浮液为5cm厚的含有秸秆样品的秸秆土壤表层土样于4℃保存、稀释并取上清液后得到秸秆粉悬浮液;
步骤二:将步骤一中挑取后进行保存备用的单菌落接种于筛选培养基CMC-Na固体培养基上,产生透明圈状的菌株;
步骤三:将步骤二中产生的透明圈状的菌株进行保藏,并进行 ITS序列鉴定,ITS序列鉴定具体为:将扩增的ITS序列数据提交 GenBank,利用NCBI网站上的在线软件Blast进行同源性比对,菌株与曲霉属(Aspergillus floccosus)菌株GU566238.1的同源性达99%,使用生物信息学分析软件MEGA 7.0中的Maximum likelihood 方法构建系统发育树,进一步鉴定菌株为黄柄曲霉W3。
实施例二
根据图1、2所示,本实施例提出菌株的形态学鉴定:将筛选得到的透明圈状的菌株接种到含5%NaCL的PDA培养基上,30℃培养5 天,观察菌落形态,用镊子夹取灭菌的盖玻片,斜插到5%NaCL的PDA 培养基中部,在盖玻片正前方接种一个直径为7mm的菌片(菌丝面朝下),然后将平板放置在30℃恒温培养箱中,定期观察菌丝生长情况,待菌丝爬上盖玻片后,将与盖玻片相连的培养基切下,取出盖玻片,在显微镜下观察菌丝及孢子形态;
30℃的环境温度下,在含5%NaCL的PDA培养基上培养9天后,圆形菌落直径约为20.80-24.08mm,菌落呈现白色,菌体表面致密,生长后期产生大量孢子,孢子由菌体中心向外逐步扩散,菌落结构为毡毛状,菌落边缘为全缘,在培养过程中,培养基颜色由白色变为棕色,菌落表面有棕色液体渗出(如图1所示);
显微观察结果:分生孢子梗稍弯曲,黄褐色,壁光滑,顶囊近球形或卵形;分生孢子头初为辐射状,后呈疏松状(如图2所示),经形态学鉴定为黄柄曲霉W3。
实施例三
本实施例提出黄柄曲霉W3菌株高抗盐性及最适盐浓度的鉴定:配制梯度NaCl含量的PDA培养基(PH为7.0),其盐浓度(质量分数) 由0%增加到31%(饱和浓度),每级增加2%。将等量的黄柄曲霉W3 菌株接种于培养基中心位置,30℃培养1周,观察培养结果;
结果表明,在30℃的温度下,在0%-31%NaCl PDA培养基中,黄柄曲霉W3菌株均能生长,但是随着盐浓度增长,黄柄曲霉W3菌株生长明显受到抑制。在1%-5%浓度下生长相对较缓慢;5%-11%浓度下黄柄曲霉W3菌株生长加快,15%-25%浓度下黄柄曲霉W3菌株生长急剧变慢,27%-31%浓度下黄柄曲霉W3菌株基本不生长,因此可以得出,黄柄曲霉W3菌株具有抗盐的特性,属于高抗盐特性的真菌;
为了确定菌株生长的最适盐浓度,用上述系列盐梯度PD(不加琼脂且PH为7.0的马铃薯液体培养基)培养菌株,在25℃环境下摇培一周后,离心收集菌丝,用去离子水反复冲洗4次,在105℃下进行烘干,然后测定菌丝干重,比较后发现:菌株在5-11%浓度下的干重最大,所以其最适生长的盐浓度为5-11%。
实施例四
本实施例提出黄柄曲霉W3菌株生长PH测定:配制PH1.0-13.0 的酸碱梯度PDA培养基,添加NaCl至终浓度(质量分数)5%,接菌,在30℃环境下进行培养;
结果发现:黄柄曲霉W3菌株在不同PH的培养基上开始生长的时间不同,培养1天,在PH为3.0-9.0的培养基上可见菌丝生长,培养5天后在PH为10.0的培养基中可见菌丝生长,在PH为1.0、2.0、11.0、12.0和13.0的培养基中,始终未见菌丝生长,因此可以得出,黄柄曲霉W3菌株的生长PH范围为3.0-10.0;
为了确定黄柄曲霉W3菌株生长的最适PH范围,利用上述PH梯度进一步用PD液体培养基培养,在30℃环境下摇培1周后,离心收集菌丝,用去离子水反复冲洗4次,然在105℃下进行烘干,再比较菌丝干重,得出结果为:黄柄曲霉W3菌株在PH4.0-9.0范围内,黄柄曲霉W3菌株干重最大,因此,可以得出黄柄曲霉W3菌株的最适 PH范围为4.0-9.0。
实施例五
根据图3所示,本实施例提出黄柄曲霉W3菌株产纤维素酶活性及菌株降解秸秆效果测定:将等量的菌株接种到不含NaCL和含 5%NaCL的产酶培养基(由5.0g/L的CMC-Na、0.5g/L的酵母浸粉、 0.5g/L的酶水解干酪素、0.5g/L的酸水解干酪素、1.0g/L的Ca(NO3)2、0.2g/L的K2HPO4、0.25g/L的MgSO4·7H2O组成,PH为7.0)中,然后在30℃环境下摇培4天,使用DNA方法测定菌株产纤维素酶的活性,结果表明使用0%NaCl产酶培养基培养4天,酶活达到62.91U/mL,使用5%NaCl产酶培养基培养4天,酶活达到96.30U/mL;
在50mL锥形瓶中放入0.6g经搅碎机打碎的秸秆(长度为5mm),在121℃进行灭菌20min,然后向每个锥形瓶中接种3mL孢子悬液,调节孢子悬液浓度为1×105-1×107,置于30℃培养箱中培养,定期观察生长情况,结果表示:培养5天后,发现黄柄曲霉W3菌株可以在秸秆上生长,表明黄柄曲霉W3菌株能够降解秸秆(如图3所示)。
本发明中的黄柄曲霉菌菌株可在高盐碱环境下降解秸秆,且在高盐碱环境下对秸秆的降解能力高,还可以直接用于田间的秸秆发酵等生物物质的分解,对次生盐渍化或连作障碍土壤的改良与环境污染处理能力高,可以产生良好的处理效果。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和优点。本行业的技术人员应该了解,本发明不受上述实施例的限制,上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理,在不脱离本发明精神和范围的前提下,本发明还会有各种变化和改进,这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。

Claims (10)

1.一种抗盐碱黄柄曲霉菌,其特征在于:所述抗盐碱黄柄曲霉菌于2019年06月14日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心;保藏单位地址:北京市朝阳区北辰西路1号院3号;保藏名称:黄柄曲霉W3;分类命名:黄柄曲霉(Aspergillus flavipes);保藏编号:CGMCC NO.17973。
2.应用于权利要求1的一种抗盐碱黄柄曲霉菌的分离方法,其特征在于:包括以下步骤:
步骤一:在250.0g/L含有不同浓度NaCl的PDA培养基固体平板上涂布经过梯度稀释的秸秆粉悬浮液,每个PDA培养基固体平板上处理重复3次;培养4-15天后挑取生长良好的单菌落保存备用;
步骤二:将步骤一中挑取后进行保存备用的单菌落接种于筛选培养基CMC-Na固体培养基上,产生透明圈状的菌株;
步骤三:将步骤二中产生的透明圈状的菌株进行保藏,并进行ITS序列鉴定,以得出鉴定结果。
3.根据权利要求2所述的一种抗盐碱黄柄曲霉菌的分离方法,其特征在于:所述步骤一中PDA培养基由10g玉米秸秆粉、4g(NH4)2SO4、0.5gMgSO4·7H2O、2gKH2PO4、1g蛋白胨、16g琼脂和1000mL去离子水组成。
4.根据权利要求2所述的一种抗盐碱黄柄曲霉菌的分离方法,其特征在于:所述步骤一中的秸秆粉悬浮液为4-6cm厚的含有秸秆样品的秸秆土壤表层土样于4℃保存、稀释并取上清液后得到秸秆粉悬浮液。
5.根据权利要求2所述的一种抗盐碱黄柄曲霉菌的分离方法,其特征在于:所述步骤一中PDA培养基PH值为10。
6.根据权利要求2所述的一种抗盐碱黄柄曲霉菌的分离方法,其特征在于:所述步骤三中透明圈状的菌株进行ITS序列鉴定之前需要进行形态学鉴定,将筛选得到的透明圈状的菌株接种到含5%NaCL的PDA培养基上,在30℃的环境内培养5天,观察菌落形态。
7.根据权利要求2所述的一种抗盐碱黄柄曲霉菌的分离方法,其特征在于:所述步骤三中透明圈状的菌株进行ITS序列鉴定具体为:将扩增的ITS序列数据提交GenBank,利用NCBI网站上的在线软件Blast进行同源性比对。
8.根据权利要求2所述的一种抗盐碱黄柄曲霉菌的分离方法,其特征在于:所述步骤三中透明圈状的菌株进行ITS序列鉴定之后,还需要进行黄柄曲霉W3菌株抗盐性及最适盐浓度的鉴定、黄柄曲霉W3菌株生长PH测定、黄柄曲霉W3菌株产纤维素酶活性测定及菌株降解秸秆效果测定。
9.如权利要求1所述的一种抗盐碱黄柄曲霉菌在环境污染处理的应用。
10.如权利要求1所述的一种抗盐碱黄柄曲霉菌在盐碱地改造的应用。
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