CN112126601B - 一种贝莱斯芽孢杆菌及发酵方法与应用 - Google Patents

一种贝莱斯芽孢杆菌及发酵方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种贝莱斯芽孢杆菌Bacillus velezensis XW0513 CGMCC No.20474，其具有抗真菌的能力。本发明的一种贝莱斯芽孢杆菌对病原菌灰霉菌，根腐菌，尖镰孢菌黄瓜专化型，串珠镰孢菌，稻瘟菌，稻巨座壳和黄曲霉都有明显的抑制效果，抗真菌谱广。而对病原细菌则无抑菌作用。说明菌株XW0513对多种病原真菌具有较好的抑制效果。

Description

一种贝莱斯芽孢杆菌及发酵方法与应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一种贝莱斯芽孢杆菌及发酵方法与应用。
背景技术
在农作物病害日趋严重的今天，为保证农作物正常生长，提高产量，农药已成农业发展所需。因化学类农药价格低廉，种类多且见效快，所以，绝大多数地区仍以化学类农药为主。但是长期化学类农药的滥用已经造成了大范围的环境污染，危及了许多田间有益生物，同时也已严重威胁到人类的健康。所幸这种现象已经引起了全世界的广泛关注，随着人们的健康意识及环保意识日益增强，化学类农药在全球范围内正普遍被限制使用甚至被淘汰，而使用生物农药，其具有许多优点，诸如：(1)对人、畜及生态环境几乎没有影响；(2)对农产品无污染；(3)对靶标菌与害虫针对性极强；(4)可保护害虫天敌；(5)害虫及病原菌不易产生抗性。生物农药是防治植物病害最有效的途径之一，也是绿色农业最为理想的选择。因此，研究开发低毒、环境友好的绿色生物农药已经成为农药学领域必然的发展趋势。
芽孢杆菌(Bacillus)是一类产芽孢的革兰氏阳性菌，因芽孢杆菌具有抗逆性强、抗菌谱广及生长代谢速度快等优点，被广泛应用于植物病害的防治研究中。芽孢杆菌可以产生多种抑菌物质，与传统的抗生素不同，其主要是通过与微生物细胞膜发生作用，会导致膜内物质泄露，甚至会使细胞溶解直接致使细胞死亡。目前，许多研究都表明大部分贝莱斯芽孢杆菌的次级代谢产物具有广谱的抑病原菌活性，被用来增加农作物产量，保护生态环境及平衡农业生态系统。
现有文献报道中，如李姝江等从贝莱斯芽孢杆菌发酵液中纯化出了一种分子质量约为31.0ku的可以抑制暗孢节菱孢菌的抗菌蛋白，此蛋白耐高温，不耐酸碱，对紫外线及部分有机试剂敏感，Chen等研究了花生内生细菌贝莱斯芽孢杆菌LDO2，发现该菌株LDO2显著抑制花生病原菌的生长，对黄曲霉也抑制作用，导致其菌丝畸形。金疏桐等筛选出一株对金黄色葡萄球菌、伤寒沙门菌以及痢疾志贺菌都有拮抗作用的B.velezensis HBB5。但文献报道的贝莱斯芽孢杆菌的抑菌效果为仅可抑制某种特定菌种或可抑制1-2种农业致病菌，抗菌谱窄。
因此，亟需筛选出抑菌谱广、抑菌效果显著又稳定的芽孢杆菌在生物防治方面具有重要意义和广阔前景。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种贝莱斯芽孢杆菌。
本发明的第二个目的是提供一种贝莱斯芽孢杆菌的发酵方法。
本发明的第三个目的是提供一种贝莱斯芽孢杆菌在制备抗农作物真菌病药物的应用。
本发明的技术方案概述如下：
一种贝莱斯芽孢杆菌Bacillus velezensis XW0513 CGMCC No.20474，其具有抗真菌的能力。
所述真菌为灰霉菌，根腐菌，尖镰孢菌黄瓜专化型，串珠镰孢菌，稻瘟菌，稻巨座壳或黄曲霉。
上述贝莱斯芽孢杆菌的发酵方法，包括如下步骤：将landy液体培养基按比例为60-100ml/250ml的装液量加入培养容器中，按接种体积比为4-8％的比例将所述贝莱斯芽孢杆菌挑至landy液体培养基中，在28-32℃、180-220rpm，恒温摇床振荡培养46-50h，降温至4℃，离心，弃沉淀，上清液经0.45μm滤膜去除菌体，4℃保藏备用。
上述发酵方法优选为：将landy液体培养基按比例为80ml/250ml的装液量加入培养容器中，按接种体积比为6％的比例将所述贝莱斯芽孢杆菌挑至landy液体培养基中，在30℃、200rpm，恒温摇床振荡培养48h，降温至4℃，离心，弃沉淀，上清液经0.45μm滤膜去除菌体，4℃保藏备用。
上述一种贝莱斯芽孢杆菌在制备抗农作物真菌病药物的应用。
本发明的优点：
实验证明，本发明的一种贝莱斯芽孢杆菌Bacillus velezensis XW0513 CGMCCNO.20474对病原菌灰霉菌，根腐菌，尖镰孢菌黄瓜专化型，串珠镰孢菌，稻瘟菌，稻巨座壳和黄曲霉都有明显的抑制效果，抗真菌谱广。而对病原细菌则无抑菌作用。说明菌株XW0513对多种病原真菌具有较好的抑制效果。
附图说明
图1为Bacillus velezensis XW0513对茄链格孢菌的拮抗作用
图2为Bacillus velezensis XW0513复筛结果
图3为Bacillus velezensis XW0513的菌落形态
图4为Bacillus velezensis XW0513的扫描电子显微镜图片
图5为Bacillus velezensis XW0513的16S rDNA PCR扩增结果
图6为Neighbor-Joining法构建菌株Bacillus velezensis XW0513的16S rDNA系统发育树
图7为Bacillus velezensis XW0513在LB培养基中(37℃180r/min)的生长曲线
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明作进一步的说明。
实施例1
1.一种芽孢杆菌的获得：
取样时间：2018年6月。
取样地点：土壤采自天津市滨海新区(38°46′N,117°13′E)盐碱地中。
对样品的处理：样品梯度稀释：用无菌生理盐水对样品进行梯度稀释，选取10-10-10-7梯度稀释液进行试验。
筛选所用培养基：
营养琼脂(NA)培养基：蛋白胨10g，牛肉膏3g，氯化钠5g，蒸馏水定容至1L，调节pH为7.4，加入琼脂20g，121℃灭菌20min。
马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)培养基：马铃薯200g，葡萄糖20g，蒸馏水定容至1L，自然pH，加入琼脂20g，115℃灭菌30min。
Landy液体培养基：葡萄糖20g，L-谷氨酸5g，MgSO4·7H2O 0.5g，KH2PO41g，KCl0.2g，酵母提取物1g，L-苯丙氨酸0.02g，柠檬酸钠0.01g，硫酸铵2g，FeSO4·7H2O 5mg，MnSO4·H2O 10mg，CuSO4·5H2O 2mg，蒸馏水定容至1L，调节pH为7.0，115℃灭菌30min。
新微生物的分离：
1.平板初筛
1.1指示菌的选择
茄链格孢菌(Alternaria solani)用常规稀释平板法，以营养琼脂(NA)培养基做为分离培养基，分离样品中的细菌菌株。取各个浓度的样液0.1ml，均匀地涂布到NA培养基上，37℃过夜培养，挑取不同形态的单菌落针对以上指示菌进行平板对峙试验，即在已经生长5-6天的茄链格孢菌(Alternaria solani)平板上，打下直径为6mm的菌饼置于新鲜的PDA平板上，在距离菌饼2cm处接种所分离的细菌，30℃培养5天，挑选出有抑菌带的细菌进行划线纯化，将纯化出的单菌落重复进行对峙试验，最终确定有抑菌效果的细菌保存于NA斜面上，4℃保藏备用。
1.2平板筛选初筛结果
从土壤样品中分离出一株具有明显抑菌活性的细菌，它在30℃条件下与茄链格孢菌对峙6天后，抑菌带宽度为6.25mm，如图1所示。
2.平板筛选法复筛
2.1无菌发酵上清液的制备
将筛选出的有抑菌活性的细菌挑至landy液体培养基中，30℃、200rpm恒温摇床振荡培养48h，培养液在4℃条件下12000rpm离心10min，弃沉淀，上清液经0.45μm滤膜去除菌体，4℃保藏备用。
2.2采用琼脂扩散法
在已经生长5-6天的茄链格孢菌(Alternaria solani)平板上，打下直径为6mm的菌饼置于新鲜的PDA平板上，在距离菌饼2cm处用直径6mm打孔器以菌饼为中心打两个孔。每孔各加0.1ml上述制备的无菌发酵上清液，以无菌蒸馏水代替上清液为空白对照，于30℃恒温培养箱静置培养5天后，游标卡尺测量抑菌带宽度，每个处理三组平行，取平均值。
2.3平板筛选复筛结果
所得发酵液经高速离心去除菌体后，进行抑菌试验分析，发现30℃下培养6天后，出现了宽度为5.45mm的明显抑菌带，如图2所示，说明筛选出的细菌能够产生抑制茄链格孢菌生长的物质。将这株菌命名为XW0513。
3.菌种鉴定
3.1菌落形态特征与扫描电镜显微结构观察
将筛选出的XW0513接种到LB培养基平板，37℃恒温静置培养48h，观察菌落在固体培养基上的形态特征，包括其大小、颜色、隆起形状等。
扫描式电子显微镜观察：根据Deng等人方法，制备扫描电镜的样品。于扫描电子显微镜下观察其形态结构。
采用三区划线法将菌株XW0513接入固体LB培养基，37℃恒温培养，菌株生长情况见图3。由图可知，XW0513菌落呈近圆形，白色不透明，扁平状，表面与边缘褶皱，中央隆起，有粘性，革兰氏染色结果为革兰氏阳性。
扫描电镜可以直观的观察菌株的表面形态特征。图4是菌株XW0513扫描电镜图片。细胞大多呈杆状，长大于宽，大小为0.5～1×1.5～4μm。
3.2 16S rDNA鉴定及进化树的构建
3.2.1细菌DNA模板的制备
将菌株XW0513接种到LB固体平板上37℃，静置培养24h后，用牙签挑取单菌落至100μl ddH2O中，100℃金属浴加热10min，随后取出放置于-20℃冰箱30min。
3.2.2目标基因的扩增与回收
用上述制备的模板及普通的DNA聚合酶对目的基因进行扩增。
引物的设计：采用通用引物1492R：GGTTACCTTGTTACGACTT(SEQ ID No.1)
27F：AGAGTTTGATCCTGGCTCAG(SEQ ID No.2)
PCR反应体系：
Figure BDA0002694162780000041
PCR反应程序：
Figure BDA0002694162780000042
DNA片段的回收：PCR反应结束后，将PCR产物用1.5％的琼脂糖凝胶在120V电压下电泳40min，于长波紫外灯下切取所需目标条带，使用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(TIANgelMidi Purification Kit)按照说明书操作回收DNA片段为16S rDNA序列。
将提取扩增的菌株XW0513的16S rDNA序列经琼脂糖凝胶电泳后，结果如图5所示。DNA条带单一明亮，与Trans 2K PlusII DNA marker电泳结果比对，菌株XW0513的条带在1000～2000bp之间。序列长度为1,437bp(SEQ ID No.3)。
3.2.3 16S rDNA序列的测序及分析
DNA序列测定在北京擎科生物技术有限公司进行，将测序结果提交到NCBI数据库进行比对，并且搜索与测序结果相近的序列，使用MEGA7.0软件构建系统发育树。
经与GenBank数据库进行比对，结果表明菌株XW0513与菌株Bacillus velezensisstrain T49相似度达99.86％，结合系统发育树(如图6所示)，将菌株XW0513鉴定为Bacillus velezensis。
3.生理生化试验结果
参考《常见细菌系统鉴定手册》及第八版《伯杰氏细菌鉴定手册》，对菌株XW0513的部分生理生化性质进行了试验，得到表1、表2所示结果。菌株XW0513芽孢染色阳性，抗酸染色阴性，明胶液化阳性，可水解淀粉，不可利用柠檬酸盐与丙二酸盐。
表1菌株XW0513的部分生理生化特性
Figure BDA0002694162780000051
表2菌株XW0513的糖发酵试验结果
Figure BDA0002694162780000052
贝莱斯芽孢杆菌Bacillus velezensis XW0513于2020年7月31日保藏于中国微生物菌种保藏管道委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.20474，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。
4.菌株XW0513的生长曲线
菌株XW0513以1％(V/V)的接种量接入LB液体培养基中，37℃180rpm恒温振荡培养，得到如图7所示的生长曲线。菌株XW0513在培养基经历短暂的延缓期，在8h左右进入对数增长期，16h左右进入稳定期，此时期细胞总数达到最大值。
5.菌种的抑菌谱测定
对茄链格孢菌、黄瓜尖孢镰刀菌、香蕉尖孢镰刀菌、玉米茎腐病串珠镰刀菌、辣椒疫霉、马铃薯茎枯轮枝菌、棕竹拟茎点霉、香蕉炭疽菌、黄瓜疫霉菌、根腐菌、尖镰孢菌黄瓜专化型、葡萄座腔菌、黑腐皮壳菌、串珠镰孢菌、稻瘟菌、稻巨座壳菌、烟草疫霉菌、灰霉菌、禾谷镰孢菌、立枯丝核菌、黄曲霉采用平板对峙法，用抑菌带宽度来衡量其抑菌效果；对于病原细菌采用平板打孔扩散法，以抑菌圈直径来衡量其抑菌效果。
菌株XW0513与病原菌对峙培养后，结果如表3所示。在与供试病原菌对峙培养过程中，对病原菌茄链格孢菌、灰霉菌，根腐菌，尖镰孢菌黄瓜专化型，串珠镰孢菌，稻瘟菌，稻巨座壳菌和黄曲霉都有明显的抑制效果。而对病原细菌则无抑菌作用。说明菌株XW0513对多种病原真菌具有较好的抑制效果。
表3
Figure BDA0002694162780000061
实施例2
一种贝莱斯芽孢杆菌的发酵方法，包括如下步骤：将landy液体培养基按比例为80ml/250ml的装液量加入培养容器中，按接种体积比为6％的比例将所述贝莱斯芽孢杆菌挑至landy液体培养基中，在30℃、200rpm，恒温摇床振荡培养48h，降温至4℃，离心，弃沉淀，上清液经0.45μm滤膜去除菌体，4℃保藏备用。
对菌株XW0513进行Plackket Burman试验，根据Plackket Burman试验与最陡爬坡试验结果，设计中心组合(CCD)试验，通过以上实验，菌株XW0513对茄链格孢菌抑菌带宽度可达12.68mm，是优化前的2.33倍。
实施例3
一种贝莱斯芽孢杆菌的发酵方法，包括如下步骤：将landy液体培养基按比例为60ml/250ml的装液量加入培养容器中，按接种体积比为4％的比例将所述贝莱斯芽孢杆菌挑至landy液体培养基中，在28℃、180rpm，恒温摇床振荡培养50h，降温至4℃，离心，弃沉淀，上清液经0.45μm滤膜去除菌体，4℃保藏备用。
实施例4
一种贝莱斯芽孢杆菌的发酵方法，包括如下步骤：将landy液体培养基按比例为100ml/250ml的装液量加入培养容器中，按接种体积比为8％的比例将所述贝莱斯芽孢杆菌挑至landy液体培养基中，在32℃、220rpm，恒温摇床振荡培养46h，降温至4℃，离心，弃沉淀，上清液经0.45μm滤膜去除菌体，4℃保藏备用。
实验证明，实施例3、4的抑菌效果与实施例2的抑菌效果相似。
序列表
<110> 天津大学
<120> 一种贝莱斯芽孢杆菌及发酵方法与应用
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ggttaccttg ttacgactt 19
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
agagtttgat cctggctcag 20
<210> 3
<211> 1437
<212> DNA
<213> 贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)
<400> 3
tgaccttcgg cggctggctc cataaaggtt acctcaccga cttcgggtgt tacaaactct 60
cgtggtgtga cgggcggtgt gtacaaggcc cgggaacgta ttcaccgcgg catgctgatc 120
cgcgattact agcgattcca gcttcacgca gtcgagttgc agactgcgat ccgaactgag 180
aacagatttg tgggattggc ttaacctcgc ggtttcgctg ccctttgttc tgtccattgt 240
agcacgtgtg tagcccaggt cataaggggc atgatgattt gacgtcatcc ccaccttcct 300
ccggtttgtc accggcagtc accttagagt gcccaactga atgctggcaa ctaagatcaa 360
gggttgcgct cgttgcggga cttaacccaa catctcacga cacgagctga cgacaaccat 420
gcaccacctg tcactctgcc cccgaagggg acgtcctatc tctaggattg tcagaggatg 480
tcaagacctg gtaaggttct tcgcgttgct tcgaattaaa ccacatgctc caccgcttgt 540
gcgggccccc gtcaattcct ttgagtttca gtcttgcgac cgtactcccc aggcggagtg 600
cttaatgcgt tagctgcagc actaaggggc ggaaaccccc taacacttag cactcatcgt 660
ttacggcgtg gactaccagg gtatctaatc ctgttcgctc cccacgcttt cgctcctcag 720
cgtcagttac agaccagaga gtcgccttcg ccactggtgt tcctccacat ctctacgcat 780
ttcaccgcta cacgtggaat tccactctcc tcttctgcac tcaagttccc cagtttccaa 840
tgaccctccc cggttgagcc gggggctttc acatcagact taagaaaccg cctgcgagcc 900
ctttacgccc aataattccg gacaacgctt gccacctacg tattaccgcg gctgctggca 960
cgtagttagc cgtggctttc tggttaggta ccgtcaaggt gccgccctat ttgaacggca 1020
cttgttcttc cctaacaaca gagctttacg atccgaaaac cttcatcact cacgcggcgt 1080
tgctccgtca gactttcgtc cattgcggaa gattccctac tgctgcctcc cgtaggagtc 1140
tgggccgtgt ctcagtccca gtgtggccga tcaccctctc aggtgggcta cgcatcgtcg 1200
ccttggtgag ccgttacctc accaactagc taatgcgccg cgggtccatc tgtaagtggt 1260
agccgaagcc accttttatg tctgaaccat gcggttcaaa caaccatccg gtattagccc 1320
cggtttcccg gagttatccc agtcttacag gcaggttacc cacgtgttac tcacccgtcc 1380
gccgctaaca tcagggagca agctcccatc tgtccgctcg acttgcagta tagcact 1437

Claims (4)

1.一种贝莱斯芽孢杆菌Bacillus velezensis XW0513 CGMCC No.20474，其具有抗真菌的能力；所述真菌为茄链格孢菌、灰霉菌，根腐菌，尖镰孢菌黄瓜专化型，串珠镰孢菌，稻瘟菌，稻巨座壳或黄曲霉。
2.权利要求1的一种贝莱斯芽孢杆菌的发酵方法，其特征是包括如下步骤：将 landy液体培养基按比例为 60-100ml/250ml的装液量加入培养容器中，按接种体积比为4-8%的比例将所述贝莱斯芽孢杆菌挑至 landy 液体培养基中，在28-32℃、 180-220rpm ，恒温摇床振荡培养46-50h，降温至4℃，离心，弃沉淀，上清液经 0.45μm 滤膜去除菌体， 4℃保藏备用。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征是所述步骤为：将 landy 液体培养基按比例为80ml/250ml的装液量加入培养容器中，按接种体积比为6%的比例将所述贝莱斯芽孢杆菌挑至 landy 液体培养基中，在30℃、200rpm ，恒温摇床振荡培养48h，降温至4℃，离心，弃沉淀，上清液经 0.45μm 滤膜去除菌体， 4℃保藏备用。
4.权利要求1的一种贝莱斯芽孢杆菌在制备抗农作物真菌病药物的应用，所述真菌为茄链格孢菌、灰霉菌，根腐菌，尖镰孢菌黄瓜专化型，串珠镰孢菌，稻瘟菌，稻巨座壳或黄曲霉。
CN202011000604.8A 2020-09-22 2020-09-22 一种贝莱斯芽孢杆菌及发酵方法与应用 Active CN112126601B (zh)

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