CN113969247A - 一种抑制烟草病害病原菌的细菌及应用 - Google Patents

一种抑制烟草病害病原菌的细菌及应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种细菌，该细菌为贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)WY2；保藏地点：北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCCNo.6662。本发明的贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)WY2能实现对烟草根腐病的有效控制，相对防效在以上60％；还对黑胫病菌、灰霉病菌、菌核病菌、靶斑病菌、霉变病菌、赤星病菌等具有很好的抑菌作用。本发明的防治效果好，具有较高的推广应用价值。

Description

一种抑制烟草病害病原菌的细菌及应用
技术领域
本发明属于一种抑制烟草病害病原菌的细菌技术领域，包括获取方法及应用技术领域。
背景技术
烟草是我国重要的经济作物之一，是国家财税的重要经济来源，但病虫害的发生严重影响烟草生产。近年来，随着气候变化与耕作模式的改变，烟草病害的发生逐年加重。烟草病害中发生普遍且危害较重的病害有黑胫病、赤星病和病毒病，其次为青枯病、野火病、角斑病、根黑腐病和根结线虫病，仅这8种病害的发生面积就占全国总种植烟面积的50％及以上，占由病虫害造成烟草行业总产值损失的80％以上。近年来，随着烟草种植区域、栽培管理措施、全球气候变暖等因素的改变，烟草镰刀菌根腐病的发生逐年加重。这些病害的发生严重制约了烟草的产量。
烟草镰刀菌根腐病主要由尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)侵染引起的真菌性病害，于烟草的苗床期和大田生长期均可发生，感病烟株根系腐烂破坏维管系统，阻碍地上部的水分吸收和地下部的营养吸收，最终导致植株死亡。该病害为典型的土传病害，在云南省各烟区均有发生，严重的地块可达30％以上。
对烟草镰刀菌根腐病的防治方法有化学药剂、农业措施和生物防治等。化学防治方法虽然防治效果较好，但因其存在农药残留和容易产生耐药性等问题，影响烟叶的安全性，其应用受到限制。农业措施主要是通过高起垄、提沟培土，保证田间排水通畅，对病害防控效果较弱。生物防治由于其防效高、专一性强、环境友好，以及不易产生抗药性等优点，因而受到青睐。
目前，用于防治烟草镰刀菌根腐病的微生物报道尚无。
发明内容
本发明正是为了解决上述问题缺陷，提供一种抑制烟草病害病原菌的细菌及应用。
本发明采用如下技术方案实现。
一种细菌，该细菌为贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)WY2；保藏地点：北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所；保藏单位名称：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏编号为CGMCC No.6662。保藏证明中建议的分类命名为：枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis。
上述的贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)WY2在用于抑制烟草镰刀菌根腐病菌(Fusarium oxysporum)中的应用。
上述的贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)WY2在用于抑制烟草黑胫病菌(Phylophthora nicotianae)中的应用。
上述的贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)WY2在用于抑制烟草灰霉病菌(Botrytis cinerea)中的应用。
上述的贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)WY2在用于抑制烟草菌核病菌(Sclerotinia sclerotiorum)中的应用。
上述的贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)WY2在用于抑制烟草靶斑病菌(Thanatephorus cucumeris)中的应用。
上述的贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)WY2在用于抑制烟草霉变病菌(Rhizopus oryzae)中的应用。
上述的贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)WY2在用于抑制烟草赤星病菌(Alternaria alternata)中的应用。
上述的贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)WY2的获取方法，包括分离、筛选及纯化工序，具体包括：
A、分离：取经检验表面灭菌彻底的烟株组织0.4～0.6g，与灭菌钢珠一并放入2mL灭菌离心管中，加入400～700μL无菌水，用组织研磨器研磨2～4min，频率为20～40r/s。梯度稀释研磨后的组织液至10-4，每梯度各取100～300μL匀浆液涂分离培养基，每处理重复4次。25～30℃黑暗培养36～72h后根据菌落形态、颜色等不同挑取单菌落，重新于分离培养基上划线纯化，挑取划线培养的单菌落移入分离培养基试管斜面保存；
培养条件为：25～30℃，时间14～30h；
分离培养基成分以g/L计为：蛋白胨3.0～7.0，牛肉膏2～4.0，氯化钠6.0～10.0，琼脂15～18，pH 6.8～7.5；
B、筛选：采用平板对峙法，用直径0.5～0.8cm的打孔器将烟草根腐病菌尖孢镰刀菌菌丝块贴接于筛选培养基平皿中心，两侧对称划线接种内生细菌，以只接烟草根腐病菌尖孢镰刀菌菌丝的处理为对照；恒温培养，待对照长满全皿时，检查对峙培养结果，记录抑菌带的宽度，根据两菌菌落发展速度、菌落之间有无抑制带、菌落边缘的菌丝是否发生稀疏和萎缩的现象等来判断分离的内生细菌对病原菌有无拮抗作用，每个处理3次重复；
培养条件为：26～30℃，时间16～32h；
筛选培养基成分以g/L计为：马铃薯180～220，葡萄糖18～25，琼脂15～18，加蒸馏水至1000mL，pH 6.8～7.4；
C、纯化：将筛选出的菌株用纯化培养基平板进行划线纯化，获得长势旺盛的单菌落，即贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)WY2；
培养条件为：25～30℃，时间14～30h；
纯化培养基成分以g/L计为：蛋白胨8.0～12.0、牛肉浸膏2.0～4.0、氯化钠4.0～6.0、琼脂15.0～19.0，pH 7.0～7.5。
进一步为，本发明上述步骤A所述的烟株组织为烟株的根或茎。
进一步为，本发明上述步骤A所述的烟株组织优选为烤烟“云烟87”的根和/或茎，其植烟土壤为烤烟“云烟87”的植烟土壤。
进一步为，本发明上述步骤A所述的分离优选将0.4g烟株组织，与灭菌钢珠一并放入2mL灭菌离心管中，加入600μL无菌水，用组织研磨器研磨3min，频率为30r/s。获得组织匀浆。
进一步为，本发明上述步骤A所述的培养条件优选为28℃，时间24h。
进一步为，本发明上述步骤B所述的烟草镰刀菌根腐病病原为尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)。
进一步为，本发明上述步骤B所述的培养条件优选为28℃，时间24h。
进一步为，本发明上述步骤C所述的培养条件优选为28℃，时间24h。
上述的贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)WY2的应用方法，包括发酵和接种工序，具体包括：
a、发酵：首先将贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)WY2接种到斜面培养基上，得到发酵种子；
培养条件为：25～30℃，时间48～72h；
斜面培养基成分以g/L计为：蛋白胨8.0～12.0、牛肉浸膏2.0～4.0、氯化钠4.0～6.0、琼脂15.0～19.0，pH 7.0～7.5；
然后将发酵种子接种到种子培养液中，接种量为3～5v/v％，摇瓶装液量为25～35v/v％，得到发酵菌剂；
培养条件为：25～30℃，时间48～72h；
种子培养液成分以g/L计为：胰蛋白胨8.0～12.0、酵母浸膏4.0～6.0、氯化钠4.0～6.0，pH7.0～7.5；
b、接种：在烟苗移栽后10～14d后，将发酵菌剂稀释1～4倍，按照每株烟50～200mL灌至烟叶根茎处。
进一步为，本发明上述步骤a所述的发酵，摇瓶的转速为180～225r/min。
进一步为，本发明上述步骤a所述的培养条件优选为28℃，时间48h。
进一步为，本发明上述步骤a所述的发酵菌剂的有效活菌数为1×1010～1×1012CFU/mL。
进一步为，本发明上述步骤b所述的接种也可以在育苗期与旺长前期进行。
进一步为，本发明上述步骤b所述的烟叶包括烤烟、雪茄烟、白肋烟或晒烟中的任一种。
进一步为，本发明上述步骤b所述的烟叶优选烤烟。
本发明的有益效果为，本发明所述贝莱斯芽孢杆菌WY2可应用于烟草镰刀菌根腐病的防治，具有以下优点：
1、本发明所述贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)WY2是一种烟草镰刀菌根腐病的高效生防菌，对烟株根腐病的相对防效在60％以上；
2、本发明所述贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)WY2能在含有0～85g/LNaCl，pH3.0～10.0的培养基中生长，生长温度范围为4～60℃，具有良好的抗逆性，能充分适应烟叶调制过程中的温、湿度环境变化和水、热交换特点，定殖效果好，活性高；
3、本发明所述贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)WY2大量存在于烟株组织与植烟土壤中，来源广泛，易于分离、培养；
4、本发明所述贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)WY2生产工艺简单，成本低廉，施用便利，且所述贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)Z002处理的烟叶无农药残留，对人、畜无害，有利于该菌株的工业化生产和应用普及；
5、本发明所述贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)WY2具有广谱性杀菌作用，对包括烟草黑胫病菌(Phylophthora nicotianae)、烟草灰霉病菌(Botrytis cinerea)、烟草菌核病菌(Sclerotinia sclerotiorum)、烟草靶斑病菌(Thanatephorus cucumeris)、烟草霉变病菌(Rhizopus oryzae)、烟草赤星病菌(Alternaria alternata)均具有较强的抑菌能力，即对上述6种烟草病害具有较好的生防潜力。
下面结合附图和具体实施方式本发明做进一步解释。
附图说明
图1为本发明对烟草镰刀菌根腐病菌(Fusarium oxysporum)的抑制效果图(CK为对照)。
图2为本发明贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)WY2培养24h的菌落形态图。
图3为本发明对烟草黑胫病菌(Phylophthora nicotianae)的抑制效果图。
图4为本发明对烟草灰霉病菌(Botrytis cinerea)的抑制效果图。
图5为本发明对烟草菌核病菌(Sclerotinia sclerotiorum)的抑制效果图。
图6为本发明对烟草靶斑病菌(Thanatephorus cucumeris)的抑制效果图。
图7为本发明对烟草霉变病菌(Rhizopus oryzae)的抑制效果图。
图8为本发明对烟草赤星病菌(Alternaria alternata)的抑制效果图。
图9为本发明利用MEGA7软件构建的系统发育树。
具体实施方式
本发明的第一目的在于提供一株能实现高效防治烟草镰刀菌根腐病的贝莱斯芽孢杆菌WY2。
本发明的第二目的在于提供所述贝莱斯芽孢杆菌WY2的获取方法。
本发明的第三目的在于提供所述贝莱斯芽孢杆菌WY2在烟草镰刀菌根腐病防治中的应用。
本发明的第四目的在于提供所述贝莱斯芽孢杆菌WY2在在烟草黑胫病、灰霉病、菌核病、靶斑病、霉变病、赤星病中的应用。
本发明的第一目的是这样实现的：
一株贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)命名为WY2，经生物学特性检测和16S rDNA序列分析鉴定为贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)的一个株系，是从烟株组织中分离得到，已于2012年10月31日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所，邮编：100101)，其保藏编号为CGMCC No：6662。
本发明的第二目的是这样实现的：
一种所述贝莱斯芽孢杆菌的获取方法，包括分离、筛选及纯化工序，具体包括：
A、分离：取经检验表面灭菌彻底的烟株组织0.4～0.6g，与灭菌钢珠一并放入2mL灭菌离心管中，加入400～700μL无菌水，用组织研磨器研磨2～4min，频率为20～40r/s。梯度稀释研磨后的组织液至10-4，每梯度各取100～300μL匀浆液涂分离培养基，每处理重复4次。25～30℃黑暗培养36～72h后根据菌落形态、颜色等不同挑取单菌落，重新于分离培养基上划线纯化，挑取划线培养的单菌落移入分离培养基试管斜面保存；
培养条件为：25～30℃，时间14～30h；
分离培养基成分以g/L计为：蛋白胨3.0～7.0，牛肉膏2～4.0，氯化钠6.0～10.0，琼脂15～18，pH 6.8～7.5；
B、筛选：采用平板对峙法，用直径0.5～0.8cm的打孔器将烟草根腐病菌尖孢镰刀菌菌丝块贴接于筛选培养基平皿中心，两侧对称划线接种内生细菌，以只接烟草根腐病菌尖孢镰刀菌菌丝的处理为对照；恒温培养，待对照长满全皿时，检查对峙培养结果，记录抑菌带的宽度，根据两菌菌落发展速度、菌落之间有无抑制带、菌落边缘的菌丝是否发生稀疏和萎缩的现象等来判断分离的内生细菌对病原菌有无拮抗作用，每个处理3次重复；
培养条件为：26～30℃，时间16～32h；
筛选培养基成分以g/L计为：马铃薯180～220，葡萄糖18～25，琼脂15～18，加蒸馏水至1000mL，pH 6.8～7.4；
C、纯化：将筛选出的菌株用纯化培养基平板进行划线纯化，获得长势旺盛的单菌落，即贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)WY2；
培养条件为：25～30℃，时间14～30h；
纯化培养基成分以g/L计为：蛋白胨8.0～12.0、牛肉浸膏2.0～4.0、氯化钠4.0～6.0、琼脂15.0～19.0，pH 7.0～7.5。
本发明的第三目的是这样实现的：
一种所述贝莱斯芽孢杆菌WY2在烟草镰刀菌根腐病防治中的应用，包括发酵和接种工序，具体包括：
a、发酵：首先将贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)WY2接种到斜面培养基上，得到发酵种子；
培养条件为：25～30℃，时间48～72h；
斜面培养基成分以g/L计为：蛋白胨8.0～12.0、牛肉浸膏2.0～4.0、氯化钠4.0～6.0、琼脂15.0～19.0，pH 7.0～7.5；
然后将发酵种子接种到种子培养液中，接种量为3～5v/v％，摇瓶装液量为25～35v/v％，得到发酵菌剂；
培养条件为：25～30℃，时间48～72h；
种子培养液成分以g/L计为：胰蛋白胨8.0～12.0、酵母浸膏4.0～6.0、氯化钠4.0～6.0，pH7.0～7.5；
b、接种：在烟苗移栽后10～14d后，将发酵菌剂稀释1～4倍，按照每株烟50～200mL灌至烟叶根茎处。
本发明的第四目的是这样实现的：
一种所述贝莱斯芽孢杆菌WY2在烟草黑胫病、灰霉病、菌核病、靶斑病、霉变病、赤星病中的应用，具体包括：
筛选：采用平板对峙法，用直径0.5～0.8cm的打孔器将烟草镰刀菌根腐病菌尖孢镰刀菌菌丝块贴接于筛选培养基平皿中心，两侧对称划线接种内生细菌，以只接烟草黑胫病菌、灰霉病菌、菌核病菌、靶斑病菌、霉变病、赤星病菌菌丝块的处理为对照。恒温培养，待对照长满全皿时，检查对峙培养结果，记录抑菌带的宽度，根据两菌菌落发展速度、菌落之间有无抑制带、菌落边缘的菌丝是否发生稀疏和萎缩的现象等来判断分离的内生细菌对病原菌有无拮抗作用，每个处理3次重复；
培养条件为：26～30℃，时间48～60h；
筛选培养基成分以g/L计为：马铃薯180～220，葡萄糖18～25，琼脂15～18，加蒸馏水至1000mL，pH 6.8～7.4。
一株贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)WY2，已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，其保藏编号为CGMCC No：6662。
所述菌株为革兰氏阳性，芽孢椭圆形，不膨大，存在于菌体中，在培养基上菌落呈圆形，直径1～3mm，乳白色，粗糙不透明，为需氧菌。所述菌株可在含有0～85g/L NaCl，pH3.0～10.0的培养基中生长，生长温度范围为4～60℃。
所述菌株对烟草镰刀菌根腐病菌(Fusarium oxysporum)、、烟草黑胫病菌(Phylophthora nicotianae)、烟草灰霉病菌(Botrytis cinerea)、烟草菌核病菌(Sclerotinia sclerotiorum)、烟草靶斑病菌(Thanatephorus cucumeris)、烟草霉变病菌(Rhizopus oryzae)和烟草赤星病菌(Alternaria alternata)具有较强的抑制能力。
所述菌株对烟草镰刀菌根腐病菌的相对防效在60％以上。
所述菌株的获取方法，包括分离、筛选及纯化工序，具体包括：
A、分离：取经检验表面灭菌彻底的烟株组织0.4～0.6g，与灭菌钢珠一并放入2mL灭菌离心管中，加入400～700μL无菌水，用组织研磨器研磨2～4min，频率为20～40r/s。梯度稀释研磨后的组织液至10-4倍，每梯度各取100～300μL匀浆液涂分离培养基，每处理重复4次。25～30℃黑暗培养36～72h后根据菌落形态、颜色等不同挑取单菌落，重新于分离培养基上划线纯化，挑取划线培养的单菌落移入分离培养基试管斜面保存；
培养条件为：25～30℃，时间40～55h；
分离培养基成分以g/L计为：蛋白胨3.0～7.0，牛肉膏2.0～4.0，氯化钠6.0～10.0，琼脂15～18，pH 6.8～7.5；
B、筛选：采用平板对峙法，用直径0.5～0.8cm的打孔器将烟草镰刀菌根腐病菌菌丝块贴接于筛选培养基平皿中心，两侧对称划线接种内生细菌，以只接烟草镰刀菌根腐病菌尖孢镰刀菌菌丝块的处理为对照。恒温培养，待对照长满全皿时，检查对峙培养结果，记录抑菌带的宽度，根据两菌菌落发展速度、菌落之间有无抑制带、菌落边缘的菌丝是否发生稀疏和萎缩的现象等来判断分离的内生细菌对病原菌有无拮抗作用，每个处理3次重复；
培养条件为：26～30℃，时间16～32h；
筛选培养基成分以g/L计为：马铃薯180～220，葡萄糖18～25，琼脂15～18，加蒸馏水至1000mL，pH 6.8～7.4；
C、纯化：将筛选出的菌株用纯化培养基平板进行划线纯化，获得长势旺盛的单菌落，即贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)WY2；
培养条件为：25～30℃，时间14～30h；
纯化培养基成分以g/L计为：蛋白胨8.0～12.0、牛肉浸膏2.0～4.0、氯化钠4.0～6.0、琼脂15.0～19.0，pH 7.0～7.5。
步骤A所述的烟株组织为烟株的根或茎。
步骤A所述的烟株组织优选为烤烟“云烟87”的根和/或茎，其植烟土壤为烤烟“云烟87”的植烟土壤。
步骤A所述的分离优选将0.4g烟株组织，与灭菌钢珠一并放入2mL灭菌离心管中，加入600μL无菌水，用组织研磨器研磨3min，频率为30r/s。获得组织匀浆。
步骤A所述的培养条件优选为28℃，时间24h。
步骤B所述的烟草镰刀菌根腐病病原为尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)。
步骤B所述的培养条件优选为28℃，时间24h。
步骤C所述的培养条件优选为28℃，时间24h。
一种贝莱斯芽孢杆菌WY2在烟草镰刀菌根腐病防治中的应用，包括发酵和接种工序，具体包括：
a、发酵：首先将贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)WY2接种到斜面培养基上，得到发酵种子；
培养条件为：25～30℃，时间48～72h；
斜面培养基成分以g/L计为：蛋白胨8.0～12.0、牛肉浸膏2.0～4.0、氯化钠4.0～6.0、琼脂15.0～19.0，pH 7.0～7.5；
然后将发酵种子接种到种子培养液中，接种量为3～5v/v％，摇瓶装液量为25～35v/v％，得到发酵菌剂；
培养条件为：25～30℃，时间48～72h；
种子培养液成分以g/L计为：胰蛋白胨8.0～12.0、酵母浸膏4.0～6.0、氯化钠4.0～6.0，pH7.0～7.5；
b、接种：在烟苗移栽后10～14d后，将发酵菌剂稀释1～4倍，按照每株烟50～200mL灌至烟叶根茎处。
步骤a所述的发酵，摇瓶转速为180～225r/min。
步骤a所述的培养条件优选为28℃，时间48h。
步骤a所述的发酵菌剂的有效活菌数为1×1010～1×1012CFU/mL。
步骤b所述的接种也可以在育苗期与旺长前期进行。
步骤b所述的烟叶包括烤烟、雪茄烟、白肋烟或晒烟中的任一种。
步骤b所述的烟叶优选烤烟。
下面结合具体的实施例对本发明的具体实施方式进行更加详细的说明：
实施例1
——贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)WY2的获取
A、分离：
取经检验表面灭菌彻底的烟株茎部组织0.4g，与灭菌钢珠一并放入2mL灭菌离心管中，加入600μL无菌水，用组织研磨器研磨3min，频率为30r/s。梯度稀释研磨后的组织液至10-4，每梯度各取200μL匀浆液涂分离培养基(蛋白胨5.0g，牛肉膏3.0g，氯化钠8.0g，琼脂15.0g，pH 7.0)，每处理重复4次。28℃黑暗培养48h后根据菌落形态、颜色等不同挑取单菌落，重新于分离培养基上划线纯化，挑取划线培养的单菌落移入分离培养基试管斜面保存；
B、筛选：
采用平板对峙法，用直径0.5cm的打孔器将烟草镰刀菌根腐病菌尖孢镰刀菌菌丝块贴接于筛选培养基(马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂15g，加蒸馏水至1000mL，pH 7.2)平皿中心，在距菌饼中心3cm的两侧对称划线接种内生细菌，以只接烟草镰刀菌根腐病菌尖孢镰刀菌菌丝块的处理为对照。28℃恒温培养，待对照长满全皿时，检查对峙培养结果，记录抑菌带的宽度，根据两菌菌落发展速度、菌落之间有无抑制带、菌落边缘的菌丝是否发生稀疏和萎缩的现象等来判断分离的内生细菌对病原菌有无拮抗作用，每个处理3次重复。
C、纯化：
将筛选到的菌株用纯化培养基(蛋白胨10.0g、牛肉浸膏3.0g、氯化钠5.0g、琼脂15g，pH 7.2)平板进行划线纯化，置于28℃培养24h，获得长势旺盛的单菌落。
试验结果：结果从198株烟草内生细菌中筛选出一株对烟草镰刀菌根腐病具有良好抑菌能力的菌株，命名为WY2。
菌株WY2与尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)对峙培养时，尖孢镰刀菌的气生菌丝体稀疏，仅在菌饼周围形成菌丝，而在对照平板中菌丝已布满培养皿；尖孢镰刀菌在平板内的生长也受到限制，菌株WY2拮抗尖孢镰刀菌在培养基内的生长可形成的平均抑菌带为6.67mm(表1和图1)。菌株WY2不仅抑制尖孢镰刀菌气生菌丝的生长，还抑制菌丝在培养基内的生长，说明菌株WY2可能通过多种机制抑制尖孢镰刀菌。
表1WY2菌株对烟草镰刀菌根腐病菌的拮抗作用试验结果
Figure BDA0003345804900000091
Figure BDA0003345804900000101
实施例2
——贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)WY2的鉴定与保藏
(1)贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)WY2的鉴定
对上述选育的菌株WY2，通过常规方法进行生物学分析与分子生物学方法鉴定。分子鉴定方法如下：细菌基因组DNA的提取试剂盒，方法参见试剂盒说明书。PCR扩增选用引物F27/R1492，常规条件扩增，扩增产物经胶回收后，连接于载体pEAZY-T5 Zero载体，热激转化大肠杆菌感受态细胞DH5α，挑取菌落以M13F/M13R为引物进行菌落PCR鉴定。阳性克隆送上海生工生物技术有限公司进行序列测定。
试验结果记录如下：
1、培养特征：该菌株于28℃在NA平板培养基上培养，培养初期菌落淡乳白色，脓状，圆形，边缘整齐，表面湿润；培养后期菌落淡黄色，扁平中心无凸起，边缘不整齐，表面干燥，褶皱不明显(见图2)；在液体培养基中静止培养，表面形成白色菌膜。上述形态特征与《常见细菌系统鉴定手册》(东秀珠等编著.科学出版社.2001年)中描述的芽孢杆菌属形态特征基本一致，初步判断WY菌株为芽孢杆菌。
2、形态特征：该菌株于28℃培养，在显微镜下，芽孢中生或端生，椭圆形，不膨大。抗酸染色阴性，无荚膜，能运动，鞭毛周生。菌体平均大小为0.60～0.80μm×2.0～2.9μm，革兰氏染色为阳性。
3、稳定性特征：该菌株可在含有0～85g/L NaCl，pH 3.0～10.0的培养基中生长，生长温度范围为4～60℃，最适宜生长温度为28～35℃，最适宜pH值为7.0～7.2。
4、16S rDNA序列分析：将该菌株的16S rDNA序列与NCBI数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)BLASTn比对rRNA/ITS数据库，发现其与芽孢杆菌属的16S rDNA序列同源性达到，其与标准菌株Bacillus velezensisFZB42序列同源性为99.74％，与Bacillus nakamurai模式菌株NRRL B-41091序列同源性为99.60％，与Bacillusvallismortis模式菌株DSM 11031序列同源性为99.47％，与Bacillus amyloliquefaciens模式菌株DSM 7序列同源性为99.39％。利用MEGA7软件构建系统发育树，结果(见图3)WY2菌株与贝莱斯芽孢杆菌FZB42聚为一支，说明WY2为贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)，并且是一个新株系。
该菌株通过序列比对和生物学特性将WY2菌株鉴定为贝莱斯芽孢杆菌(Bacillusvelezensis)。
本发明所述的WY2菌株其16S rDNA序列见序列表。
(2)贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)WY2的保藏
通过上述鉴定结果，确认菌株WY2为贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)的一个株系，命名为WY2。已于2012年10月31日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所，邮编：100101)，其保藏编号为CGMCC No：6662。
实施例3
——贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)WY2对烟草镰刀菌根腐病的防治试验
试验在云南省玉溪市澄江县进行，烟草品种为“云烟87”。
试验方法：
a、发酵：从-80℃超低温冰箱活化菌株WY2于斜面培养基(蛋白胨10.0g、牛肉浸膏3.0g、氯化钠5.0g、琼脂15.0g，pH 7.0)，置于28℃恒温培养箱培养48h；挑取一环菌接种于含有10mL种子培养液(蛋白胨10.0g、牛肉浸膏3.0g、氯化钠5.0g、琼脂15.0g，pH 7.0)的50mL离心管内，置于28℃恒温培养箱培养48h；再将种子液转接至含有1000mL发酵培养基中(蛋白胨10.0g、牛肉浸膏3.0g、氯化钠5.0g、琼脂15.0g，pH 7.0)，置于28℃恒温培养箱培养72h，得到发酵菌剂；
b、接种：试验在玉溪市澄江县进行，在烟苗移栽后10～14d后，将发酵菌剂稀释1～4倍，按照每株烟50～200mL灌至烟叶根茎处，设置3次重复。14d后调查各处理的发病等级，并计算病情指数和相对防效。烟株发病程度按病害等级划分为0、1、3、5、7和9级(表2)，病情指数＝100×∑(各级病株数×各级代表值)/(调查总株数×最高级代表值)，生防菌相对防效＝100×(对照组病情指数-处理组病情指数)/(对照组病情指数)。
表2烟草镰刀菌根腐病病情等级划分
等级 描述
0 全株无病
1 植株稍矮化，少数根坏死，中下部叶片褪绿(或变色)
3 植株高比健康株矮1/4-1/3，半数根坏死，1/2-1/3叶片萎蔫；
5 植株高比健康株矮1/3-1/2，大部分根坏死，2/3以上叶片萎蔫；
7 植株高比健康株矮1/2以上，根全部坏死；
9 基本死亡
试验结果：由表3数据可知，菌株WY2对烟草镰刀菌根腐病的防治效果较好。灌施WY2发酵液的处理，调查病情指数为4.59；而灌施发酵液培养基的处理病情指数为11.85。结果表明，经WY2菌剂发酵液对烟株灌根处理后，可有效防治烟草镰刀菌根腐病的发生，相对防效达61.27％。
表3菌株WY2对烟草镰刀菌根腐病防效的对比试验结果
处理 病情指数 相对防效(％)
WY2液体制剂 4.59b 61.27％
CK 11.85a -
实施例4
——贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)WY2对6种烟草病原菌的抑制试验
实施例4除以下试验及结果不同外，其余操作步骤与实施例1相同。
试验中分别以烟草黑胫病菌、烟草灰霉病菌、烟草菌核病菌、烟草靶斑病菌、烟草霉变病菌、烟草赤星病菌为指示菌，检测WY2菌株对上述病原菌的抑菌能力。
试验结果：从表4可见，贝莱斯芽孢杆菌WY2对供试的6种重要的烟草病害病原菌均具有较强的抑菌作用，对烟草靶板病菌、霉变病菌的抑菌作用超强。说明WY2菌株对烟草黑胫病菌(Phylophthora nicotianae)、烟草灰霉病菌(Botrytis cinerea)、烟草菌核病菌(Sclerotinia sclerotiorum)、烟草靶斑病菌(Thanatephorus cucumeris)、烟草霉变病菌(Rhizopus oryzae)、烟草赤星病菌(Alternaria alternata)均有较强的抑制能力，即对上述6种烟草病害具有较好的生防潜力。
表4贝莱斯芽孢杆菌WY2对6种烟草病原菌的抑制能力
Figure BDA0003345804900000121
SEQUENCE LISTING
AGAGTTTGATCCTGGCTCAGGACGAACGCTGGCGGCGTGCCTAATACATGCAAGTCGAGCGGACAGATGGGAGCTTGCTCCCTGATGTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCTGTAAGACTGGGATAACTCCGGGAAACCGGGGCTAATACCGGATGGTTGTCTGAACCGCATGGTTCAGACATAAAAGGTGGCTTCGGCTACCACTTACAGATGGACCCGCGGCGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCGACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGTTTTCGGATCGTAAAGCTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTGCCGTTCAAATAGGGCGGCACCTTGACGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGGGCTCGCAGGCGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCCCGGCTCAACCGGGGAGGGTCATTGGAAACTGGGGAACTTGAGTGCAGAAGAGGAGAGTGGAATTCCACGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATGTGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTCTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAAGTGTTAGGGGGTTTCCGCCCCTTAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGACTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCTCTGACAATCCTAGAGATAGGACGTCCCCTTCGGGGGCAGAGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGATCTTAGTTGCCAGCATTCAGTTGGGCACTCTAAGGTGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGACAGAACAAAGGGCAGCGAAACCGCGAGGTTAAGCCAATCCCACAAATCTGTTCTCAGTTCGGATCGCAGTCTGCAACTCGACTGCGTGAAGCTGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGAGAGTTTGTAACACCCGAAGTCGGTGAGGTAACCTTTATGGAGCCAGCCGCCGAAGGTGGGACAGATGATTGGGGTGAAGTCGTAACAAGGTAACCG
以上所述的仅是本发明的部分具体实施例，方案中公知的具体内容或常识在此未作过多描述。应当指出，上述实施例不以任何方式限制本发明，对于本领域的技术人员来说，凡是采用等同替换或等效变换的方式获得的技术方案均落在本发明的保护范围内。本申请要求的保护范围应当以其权利要求的内容为准，说明书中的具体实施方式等记载可以用于解释权利要求的内容。
<110>云南省烟草农业科学研究院
<120>一种抑制烟草病害病原菌的细菌及应用
<160> 1
<210> 1
<211> 1512
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
AGAGTTTGATCCTGGCTCAGGACGAACGCTGGCGGCGTGCCTAATACATGCAAGTCGAGCGGACAGATGGGAGCTTGCTCCCTGATGTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCTGTAAGACTGGGATAACTCCGGGAAACCGGGGCTAATACCGGATGGTTGTCTGAACCGCATGGTTCAGACATAAAAGGTGGCTTCGGCTACCACTTACAGATGGACCCGCGGCGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCGACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGTTTTCGGATCGTAAAGCTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTGCCGTTCAAATAGGGCGGCACCTTGACGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGGGCTCGCAGGCGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCCCGGCTCAACCGGGGAGGGTCATTGGAAACTGGGGAACTTGAGTGCAGAAGAGGAGAGTGGAATTCCACGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATGTGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTCTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAAGTGTTAGGGGGTTTCCGCCCCTTAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGACTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCTCTGACAATCCTAGAGATAGGACGTCCCCTTCGGGGGCAGAGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGATCTTAGTTGCCAGCATTCAGTTGGGCACTCTAAGGTGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGACAGAACAAAGGGCAGCGAAACCGCGAGGTTAAGCCAATCCCACAAATCTGTTCTCAGTTCGGATCGCAGTCTGCAACTCGACTGCGTGAAGCTGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGAGAGTTTGTAACACCCGAAGTCGGTGAGGTAACCTTTATGGAGCCAGCCGCCGAAGGTGGGACAGATGATTGGGGTGAAGTCGTAACAAGGTAACCG

Claims (10)

1.一种细菌，该细菌为贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)WY2；保藏地点：北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所；保藏单位名称：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏编号为CGMCC No.6662。
2.权利要求1所述的贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)WY2在用于抑制烟草镰刀菌根腐病菌(Fusarium oxysporum)中的应用。
3.权利要求1所述的贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)WY2在用于抑制烟草黑胫病菌(Phylophthora nicotianae)中的应用。
4.权利要求1所述的贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)WY2在用于抑制烟草灰霉病菌(Botrytis cinerea)中的应用。
5.权利要求1所述的贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)WY2在用于抑制烟草菌核病菌(Sclerotinia sclerotiorum)中的应用。
6.权利要求1所述的贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)WY2在用于抑制烟草靶斑病菌(Thanatephorus cucumeris)中的应用。
7.权利要求1所述的贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)WY2在用于抑制烟草霉变病菌(Rhizopus oryzae)中的应用。
8.权利要求1所述的贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)WY2在用于抑制烟草赤星病菌(Alternaria alternata)中的应用。
9.权利要求1所述的贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)WY2的获取方法，包括分离、筛选及纯化工序，具体包括：
A、分离：取经检验表面灭菌彻底的烟株组织0.4～0.6g，与灭菌钢珠一并放入2mL灭菌离心管中，加入400～700μL无菌水，用组织研磨器研磨2～4min，频率为20～40r/s。梯度稀释研磨后的组织液至10-4，每梯度各取100～300μL匀浆液涂分离培养基，每处理重复4次。25～30℃黑暗培养36～72h后根据菌落形态、颜色等不同挑取单菌落，重新于分离培养基上划线纯化，挑取划线培养的单菌落移入分离培养基试管斜面保存；
培养条件为：25～30℃，时间14～30h；
分离培养基成分以g/L计为：蛋白胨3.0～7.0，牛肉膏2～4.0，氯化钠6.0～10.0，琼脂15～18，pH 6.8～7.5；
B、筛选：采用平板对峙法，用直径0.5～0.8cm的打孔器将烟草根腐病菌尖孢镰刀菌菌丝块贴接于筛选培养基平皿中心，两侧对称划线接种内生细菌，以只接烟草根腐病菌尖孢镰刀菌菌丝的处理为对照；恒温培养，待对照长满全皿时，检查对峙培养结果，记录抑菌带的宽度，根据两菌菌落发展速度、菌落之间有无抑制带、菌落边缘的菌丝是否发生稀疏和萎缩的现象等来判断分离的内生细菌对病原菌有无拮抗作用，每个处理3次重复；
培养条件为：26～30℃，时间16～32h；
筛选培养基成分以g/L计为：马铃薯180～220，葡萄糖18～25，琼脂15～18，加蒸馏水至1000mL，pH 6.8～7.4；
C、纯化：将筛选出的菌株用纯化培养基平板进行划线纯化，获得长势旺盛的单菌落，即贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)WY2；
培养条件为：25～30℃，时间14～30h；
纯化培养基成分以g/L计为：蛋白胨8.0～12.0、牛肉浸膏2.0～4.0、氯化钠4.0～6.0、琼脂15.0～19.0，pH 7.0～7.5。
10.根据权利要求2所述的贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)WY2的应用方法，包括发酵和接种工序，具体包括：
a、发酵：首先将贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)WY2接种到斜面培养基上，得到发酵种子；
培养条件为：25～30℃，时间48～72h；
斜面培养基成分以g/L计为：蛋白胨8.0～12.0、牛肉浸膏2.0～4.0、氯化钠4.0～6.0、琼脂15.0～19.0，pH 7.0～7.5；
然后将发酵种子接种到种子培养液中，接种量为3～5v/v％，摇瓶装液量为25～35v/v％，得到发酵菌剂；
培养条件为：25～30℃，时间48～72h；
种子培养液成分以g/L计为：胰蛋白胨8.0～12.0、酵母浸膏4.0～6.0、氯化钠4.0～6.0，pH 7.0～7.5；
b、接种：在烟苗移栽后10～14d后，将发酵菌剂稀释1～4倍，按照每株烟50～200mL灌至烟叶根茎处。
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