WO2021071029A1 - 바실러스 벨레젠시스 ce 100 균주 및 이를 이용한 식물병원균 방제용 조성물 - Google Patents

바실러스 벨레젠시스 ce 100 균주 및 이를 이용한 식물병원균 방제용 조성물 Download PDF

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WO2021071029A1
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bacillus
present
culture
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PCT/KR2020/001218
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김길용
마웅 처이퉤
전현덕
이동률
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전남대학교산학협력단
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/07—Bacillus

Definitions

  • the present invention relates to a composition for controlling plant pathogens comprising Bacillus velezensis CE 100 strain, a method of culturing it, a cell body, a culture medium, a culture filtrate, or a combination thereof as an active ingredient, and a method for controlling plant pathogens using the same.
  • a composition for controlling plant pathogens comprising Bacillus velezensis CE 100 strain, a method of culturing it, a cell body, a culture medium, a culture filtrate, or a combination thereof as an active ingredient, and a method for controlling plant pathogens using the same.
  • the present invention was made by task number 316032-5 under the support of the Agency for Agriculture, Forestry and Food Technology Planning and Evaluation, and the research management institution for the project is the Agency for Agriculture, Forestry and Food Technology Planning and Assessment, the name of the research project is "Agricultural Life Industry Technology Development Project”, and the name of the research project is " Development of Korean-style eco-friendly standard cultivation technology and organic processed food additive production technology", the host institution is Chonnam National University, and the research period is from May 19th to December 31st, 2020.
  • Plant diseases caused by bacterial fungal viruses and nematodes are a major factor in reducing crop yields.
  • Various methods, including cultural practices and pesticide application, have been used to protect crops from damage caused by the pathogens.
  • microbial agents including bacteria and fungi
  • bacteria and fungi are used to control plant pathogens, some of which have been introduced to the organic farming market.
  • bacterial antagonists especially Bacillus species, possess endospores and potential colonization in the plant rhizome.
  • Bacillus species is known as a promising candidate for controlling soil-borne fungal diseases due to its surprising properties such as fast growth rate, long-term survival in soil, and high stability even under extreme conditions.
  • Bacillus species has the characteristics of producing plant growth-promoting hormones, cider pores, lytic enzymes, and antifungal metabolites, and raising the level of defense of the plant immune system against pathogen penetration. Through these characteristics, Bacillus species is well known as a plant growth promoter.
  • biological control agents have a problem that it is difficult to compete with indigenous microorganisms inhabiting the soil and the roots of plants due to dilution to reduce production costs.
  • the present inventors have made intensive research efforts to develop a method for mass cultivation of strains excellent in controlling plant pathogens and Bacillus strains. As a result, a novel Bacillus strain and a mass cultivation method thereof were identified, thereby completing the present invention.
  • Another object of the present invention is to provide a method for culturing Bacillus velezensis CE 100 strains.
  • Another object of the present invention is to provide a composition for controlling plant pathogens comprising Bacillus velezensis CE 100 strain.
  • Another object of the present invention is to provide a method for controlling plant pathogens using Bacillus velezensis CE 100 strain.
  • Another object of the present invention is to provide a use for controlling plant pathogens of Bacillus velezensis CE 100 strain.
  • the present inventors conducted a study on Bacillus velezensis CE 100 and a method of culturing the same, which is effective in black spot disease caused by Diaporthe citri.
  • the present invention is Bacillus velezensis (Bacillus velezensis) CE 100 strain, its cultivation method, a composition for controlling plant pathogens containing as an active ingredient, a cell body, a culture medium, a culture filtrate, or a combination thereof, and a plant pathogen control using the same It's about the method.
  • An example of the present invention relates to Bacillus velezensis (Bacillus velezensis) CE 100 strain.
  • the Bacillus bellesensis CE 100 strain may have a 16s rRNA sequence comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1, for example, may have a 16s rRNA sequence consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 .
  • the Bacillus Bellesensis CE 100 strain was deposited as of July 31, 2019 at the Institute of Agricultural Biotechnology, located in Wanju-gun, Jeollabuk-do, and was awarded the accession number KACC 81101BP.
  • the Bacillus belegensis CE 100 strain of the present invention may be a Bacillus belegensis CE 100 strain of accession number KACC 81101BP.
  • Bacillus bellegensis CE 100 strain of the present invention has a control activity against plant pathogens.
  • Another example of the present invention relates to a method of cultivating Bacillus bellesensis CE 100 strain comprising the following steps:
  • An obtaining step to obtain the product of the culturing step is a step to obtain the product of the culturing step.
  • the Bacillus belegensis strain may be a Bacillus belegensis CE 100 strain.
  • the Bacillus bellesensis CE 100 strain may have a 16s rRNA sequence comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1, for example, may have a 16s rRNA sequence consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 .
  • the Bacillus Bellesensis CE 100 strain may be a Bacillus Bellesensis CE 100 strain of accession number KACC 81101BP.
  • the culture medium for bacterial culture is not limited as long as it is a medium in which the Bacillus bellegensis strain can grow, and for example, trypton soy liquid medium, nutrient liquid medium, LB medium (lysogeny broth), PB medium, It may be, but is not limited thereto.
  • the amount of the culture medium for bacterial culture is 300 to 700 L, 350 to 700 L, 400 to 700 L, 450 to 700 L, 500 to 700 L, 300 to 650 L, 350 to 650 L, 400 to 650 L, 450 to 650 L, 500 to 650 L, 300 to 600 L, 350 to 600 L, 400 to 600 L, 450 to 600 L, 500 to 600 L, 300 to 550 L, 350 to 550 L, 400 to 550 L, It may be 450 to 550 L, for example, 500 to 550 L, but is not limited thereto.
  • the culturing step may be performed by plate cultivation, solid cultivation, liquid cultivation, etc., and for example, it may be performed by liquid cultivation suitable for mass production and easy to obtain a culture filtrate, but is limited thereto. It is not.
  • the culturing step is 20 to 70°C, 20 to 65°C, 20 to 60°C, 20 to 55°C, 20 to 50°C, 20 to 45°C, 20 to 40°C, 20 to 35°C, 20 to 30 °C, 25 to 70 °C, 25 to 65 °C, 25 to 60 °C, 25 to 55 °C, 25 to 50 °C, 25 to 45 °C, 25 to 40 °C, 25 to 35 °C, 25 to 30 °C, 30 to 70 °C, 30 to 65 °C, 30 to 60 °C, 30 to 55 °C, 30 to 50 °C, 30 to 45 °C, 30 to 40 °C, 30 to 35 °C, 35 to 70 °C, 35 to 65 °C, 35 to 60 °C, 35 to 55 °C, 35 to 50 °C, 35 to 45 °C, 35 to 40 °C, 40 to 70 °C, 40 to 65 °C, 40 to 60 °C,
  • the culturing step is 3 to 20 days, 4 to 20 days, 5 to 20 days, 6 to 20 days, 7 to 20 days, 8 to 20 days, 9 to 20 days, 10 to 20 days, 4 to 19 Days, 5 to 19 days, 6 to 19 days, 7 to 19 days, 8 to 19 days, 9 to 19 days, 10 to 19 days, 4 to 18 days, 5 to 18 days, 6 to 18 days, 7 to 18 Days, 8 to 18, 9 to 18, 10 to 18, 4 to 17, 5 to 17, 6 to 17, 7 to 17, 8 to 17, 9 to 17, 10 to 17 Days, 4 to 16 days, 5 to 16 days, 6 to 16 days, 7 to 16 days, 8 to 16 days, 9 to 16 days, 10 to 16 days, 4 to 15 days, 5 to 15 days, 6 to 15 Days, 7 to 15 days, 8 to 15 days, 9 to 15 days, 10 to 15 days, 4 to 14 days, 5 to 14 days, 6 to 14 days, 7 to 14 days, 8 to 14 days, 9 to 14 Days, 10 to 14 days, 4 to 13 days, 5 to 13 days, 6
  • the culturing step is pH 3 to 10, pH 3 to 9, pH 3 to 8, pH 3 to 7, pH 3 to 6, 4 to 9, pH 4 to 8, pH 4 to 7, pH 4 to 6, may be performed at pH 5 to 9, pH 5 to 8, and pH 5 to 7, for example, may be performed at pH 5 to 6. Since it is performed under low pH conditions, contamination can be minimized during cultivation without a separate sterilization process.
  • the obtaining step can be obtained through a known obtaining method.
  • the result of the culturing step may be a cell body of a strain, a culture solution, a concentrated culture solution, a dried product of the culture solution, a culture filtrate, a concentrated culture filtrate, or a dried product of the culture filtrate, but is not limited thereto.
  • the cultivation method of the present invention is performed under high temperature and low pH conditions, contamination during cultivation can be minimized without a separate sterilization process.
  • the culture method of the present invention can minimize contamination during culture without a separate sterilization process by the active metabolites produced by the CE 100 strain during the culture process.
  • the active metabolite may be one or more selected from the group consisting of phenylacetic acid, methyl hippurate, and antifungal peptide.
  • the antifungal peptide is N-Valyl-L-Ornithine, L-valyl-L-isoleucyl-L-alanyl-L-Orinithine, Cyclo (dehydro-Ala-Val), Cyclo (Gly-Leu), ( It may be (S)-2-hydropropanoyl)-L-(leucine) and N-Acetyl-L-Leucine, but is not limited thereto.
  • Another example of the present invention is a bacterial cell of Bacillus velezensis CE 100 strain, a culture solution, a concentrated culture solution, a dried product of the culture solution, a culture filtrate, a concentrated culture filtrate, a culture filtrate, or a combination thereof as an active ingredient. It relates to a composition for controlling plant pathogens containing.
  • the Bacillus belegensis CE 100 strain is the same as described above.
  • plant pathogen refers to pathogenic fungi (fungi) and bacteria that invade plants and cause loss and damage to leaves, stems, roots or fruits of plants.
  • the plant pathogens are Diaporthe citri , Sclerotinia sclerotiorum , Sclerotium cepivorum , gray pattern pathogens ( Monilinia fructicola ), Botrytis cinerea ( Botrytis cinerea ), Collectotrichum acutatum , Botryotinia fuckeliana , Cylindrocarpon destructans , Septoria Glycines , Glomerella Glomerella cingulate , Fusarium solani , Rhizoctonia solani , Pyricularia grisea , Phytophthora drechsleri , Botryosperia Botryosphaeria dothidea , Colletotrichum gloeosporioides , Fusarium grminearum , Phytophthora capsici , Phytophthora nicotiana nicotiana , Alternaria porri ,
  • composition for controlling plant pathogens of the present invention may be prepared in any suitable formulation such as emulsifiers, liquids, wettable powders, powders, particles, oil solutions, aerosols or flowables.
  • composition for controlling plant pathogens of the present invention when prepared as a pesticide, it may be prepared by mixing with an appropriate solid carrier, liquid carrier, gaseous carrier, surfactant, dispersant, and/or auxiliary agent for other preparations, but is not limited thereto. .
  • the solid carrier may include talc, bentonite, clay, kaolin, diatomaceous earth, vermiculite, white carbon and calcium carbonate, but is not limited thereto.
  • the liquid carrier includes alcohols such as methanol, n-hexanol and ethanol glycol; Ketones such as acetone, methyl ethyl ketone, and cyclohexanone; aliphatic hydrocarbons such as n-hexane, kerosene and kerosene; Aromatic hydrocarbons such as toluene, xylene and methylnaphthalene; Ethers such as diethyl ether, dioxane and tetrahydrofuran; Esters such as ethyl acetate; Nitriles such as acetonitrile and isobutyl nitrile; Acid amides such as dimethylformamide and dimethylacetamide; Vegetable oils such as soy milk and cottonseed oil, dimethyl sulfoxide; And water may be included, but are not limited thereto.
  • alcohols such as methanol, n-hexanol and ethanol glycol
  • Ketones such
  • the gaseous carrier may include LPG, air, nitrogen, carbon dioxide, and dimethyl ether, but is not limited thereto.
  • composition for controlling plant pathogens of the present invention may generally be used as it is or after dilution.
  • the method of applying the composition for controlling plant pathogens of the present invention may be applied to the plant itself (applied to stems and leaves), applied to the soil (mixed with the soil or re-fertilized), applied to the field waterway, and applied to the seed. , But is not limited thereto.
  • Another example of the present invention relates to a method for controlling plant pathogens using Bacillus velezensis CE 100 strain.
  • the plant pathogens are Diaporthe citri , Sclerotinia sclerotiorum , Sclerotium cepivorum , gray pattern pathogens ( Monilinia fructicola ), Botrytis cinerea ( Botrytis cinerea ), Collectotrichum acutatum , Botryotinia fuckeliana , Cylindrocarpon destructans , Septoria Glycines , Glomerella Glomerella cingulate , Fusarium solani , Rhizoctonia solani , Pyricularia grisea , Phytophthora drechsleri , Botryosperia Botryosphaeria dothidea , Colletotrichum gloeosporioides , Fusarium grminearum , Phytophthora capsici , Phytophthora nicotiana nicotiana , Alternaria porri ,
  • the plants are sesame leaves, lettuce, cabbage, ssam vegetables, eggplant, potatoes, sweet potatoes, peppers, carrots, green onions, strawberries, garlic, melon, parsley, radish, cherry tomatoes, Chinese cabbage, leek, ginger, spinach, watermelon, Onion, zucchini, cucumber, corn, chives, melon, paprika, bell pepper, beans, tomato, pumpkin, persimmon tree, citrus tree, pear tree, peach tree, apple tree, citron tree, prunus tree, pine tree, bluetail, kiwi, Vine, Hallabong tree, Fern, Gomchwi, Jujube, Bellflower, Aralia, Bokbunja, Blueberry, Eoseongcho, Ginseng, Mulberry, Schisandra chinensis, Sesame, Chrysanthemum, Artichoke, Rose, Hemp, Wheat, Rice, Barley, Lotus root, etc. And, for example, it may be a citrus tree, but is not limited there
  • the application step may be applied to the plant itself (applied to stems and leaves), applied to the soil (mixed with soil or over-fertilized), applied to a field waterway and applied to seeds, but is limited thereto. no.
  • the present invention relates to a composition for controlling plant pathogens comprising Bacillus velezensis CE 100 strain, a method of culturing it, a cell body, a culture medium, a culture filtrate, or a combination thereof as an active ingredient, and a method for controlling plant pathogens using the same.
  • the strain of the present invention can be usefully used for controlling various plant pathogens, and when the strain of the present invention is cultivated by the culture method of the present invention, a sufficient amount of enzymes and metabolites exist without contamination even in a non-sterile environment. It is easy to use industrially because it can be cultured in large quantities.
  • 1A is a photograph showing the cultivation result of Bacillus bellegensis CE 100 strain in TSA medium according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 1B is a photograph showing the results of culturing Bacillus bellegensis CE 100 strain in TSA medium according to an embodiment of the present invention with a microscope.
  • Figure 2 is a graph showing the results of phylogenetic analysis based on the 16s rRNA nucleotide sequence of Bacillus bellegensis CE 100 strain according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 3 is a photograph showing a result of culturing Bacillus bellegensis CE 100 strain in PBA medium according to an embodiment of the present invention under various temperature conditions.
  • Figure 4 is a photograph showing the results of culturing Bacillus bellegensis CE 100 strain in PBA medium according to an embodiment of the present invention under various pH conditions.
  • 5A is a photograph showing the results of an antagonistic effect on D.citri of Bacillus bellegensis CE 100 strain according to an embodiment of the present invention.
  • 5B is a photograph showing the results of an antagonistic effect on S.sclerotiorum of Bacillus bellegensis CE 100 strain according to an embodiment of the present invention.
  • 5C is a photograph showing the results of an antagonistic effect on S. cepivorum of Bacillus bellegensis CE 100 strain according to an embodiment of the present invention.
  • 5D is a photograph showing the results of an antagonistic effect on M.fructicola of Bacillus bellegensis CE 100 strain according to an embodiment of the present invention.
  • 5e is a Phoma spp of Bacillus bellegensis CE 100 strain according to an embodiment of the present invention. This is a photograph showing the results of an antagonistic effect on.
  • 5F is a photograph showing the results of an antagonistic effect on B. cinerea of Bacillus bellegensis CE 100 strain according to an embodiment of the present invention.
  • 5G is a photograph showing the results of an antagonistic effect on C. acutatum of Bacillus bellegensis CE 100 strain according to an embodiment of the present invention.
  • 5H is a photograph showing the results of an antagonistic effect on B.fuckeliana of Bacillus bellegensis CE 100 strain according to an embodiment of the present invention.
  • 5I is a photograph showing the results of an antagonistic effect on C.destructans of Bacillus bellegensis CE 100 strain according to an embodiment of the present invention.
  • 5j is a photograph showing the results of an antagonistic effect on P.infestans of Bacillus bellegensis CE 100 strain according to an embodiment of the present invention.
  • 5K is a photograph showing the results of an antagonistic effect on S.glycines of Bacillus bellegensis CE 100 strain according to an embodiment of the present invention.
  • 5L is a photograph showing the results of an antagonistic effect on G. cingulata of Bacillus bellegensis CE 100 strain according to an embodiment of the present invention.
  • 5m is a photograph showing the results of an antagonistic effect on F. oxysporum of Bacillus bellegensis CE 100 strain according to an embodiment of the present invention.
  • 5N is a photograph showing the results of an antagonistic effect on F.solani of Bacillus bellegensis CE 100 strain according to an embodiment of the present invention.
  • 5o is a photograph showing the results of an antagonistic effect on P.nicotianae of Bacillus bellegensis CE 100 strain according to an embodiment of the present invention.
  • 5P is a photograph showing the results of an antagonistic effect of Bacillus bellegensis CE 100 strain against R.solani according to an embodiment of the present invention.
  • 5q is a photograph showing the results of an antagonistic effect of Bacillus bellegensis CE 100 strain against P.grisea according to an embodiment of the present invention.
  • 5R is a photograph showing the results of an antagonistic effect on P.drechsleri of Bacillus bellegensis CE 100 strain according to an embodiment of the present invention.
  • 5s is a photograph showing the results of an antagonistic effect on B.dothidea of Bacillus bellegensis CE 100 strain according to an embodiment of the present invention.
  • 5T is a photograph showing the results of an antagonistic effect of Bacillus bellegensis CE 100 strain against C.gloeosporioides according to an embodiment of the present invention.
  • 5u is a photograph showing the results of an antagonistic effect on F. graminearum of Bacillus bellegensis CE 100 strain according to an embodiment of the present invention.
  • 5V is a photograph showing the results of an antagonistic effect on P. capsici of Bacillus bellegensis CE 100 strain according to an embodiment of the present invention.
  • 5W is a photograph showing the results of an antagonistic effect on A.porri of Bacillus bellegensis CE 100 strain according to an embodiment of the present invention.
  • 5X is a photograph showing the results of an antagonistic effect on P. carotovorum of Bacillus bellegensis CE 100 strain according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 6 is a graph showing the inhibition rate of mycelium growth against various pathogens of Bacillus bellegensis CE 100 strain according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 7 is a graph showing the inhibition rate of mycelium growth against various fungi of the volatile compound of Bacillus bellegensis CE 100 strain according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 8a is a photograph showing the results of observing the mycelial growth inhibition and mycelial transformation for D.citri of the Bacillus bellegensis CE 100 strain volatile compound according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 8b is a photograph showing the results of observing the mycelial growth inhibition and mycelial transformation of S.sclerotiorum of the volatile compound of Bacillus bellesensis CE 100 strain according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 8c is a photograph showing the results of observing the mycelial growth inhibition and mycelial transformation of the volatile compound of Bacillus bellesensis CE 100 strain according to an embodiment of the present invention for S. cepivorum.
  • 8D is a photograph showing the results of observing the mycelial growth inhibition and mycelial transformation of the volatile compound of Bacillus bellegensis CE 100 strain according to an embodiment of the present invention to M.fructicola.
  • Figure 8e is a Bacillus bellegensis CE 100 strain of the volatile compound Phoma spp according to an embodiment of the present invention. This is a photograph showing the results of observing mycelial growth inhibition and mycelial transformation.
  • 8F is a photograph showing the results of observing the mycelial growth inhibition and mycelial transformation of the volatile compound of Bacillus bellesensis CE 100 strain according to an embodiment of the present invention against B.cinerea.
  • Figure 8g is a photograph showing the results of observing the mycelial growth inhibition and mycelial transformation of the volatile compound of Bacillus bellesensis CE 100 strain according to an embodiment of the present invention for C. acutatum.
  • Figure 8h is a photograph showing the results of observing the mycelial growth inhibition and mycelial transformation of the volatile compound of Bacillus bellegensis CE 100 strain according to an embodiment of the present invention for B.fuckeliana.
  • Figure 8i is a photograph showing the results of observing the mycelial growth inhibition and mycelial transformation for C.destructans of Bacillus bellegensis CE 100 strain volatile compounds according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 8j is a photograph showing the results of observing the mycelial growth inhibition and mycelial transformation for P.infestans of Bacillus bellegensys CE 100 strain volatile compounds according to an embodiment of the present invention.
  • 8K is a photograph showing the results of observing mycelial growth inhibition and mycelial transformation for S.glycines of a Bacillus bellegensis CE 100 strain volatile compound according to an embodiment of the present invention.
  • 8L is a photograph showing the results of observing the mycelial growth inhibition and mycelial transformation of the volatile compound of Bacillus bellegensis CE 100 strain according to an embodiment of the present invention against G.cingulata.
  • 9A is a photograph showing the results of observing the mycelial growth inhibition and mycelial transformation of the volatile compound of Bacillus bellegensis CE 100 strain according to an embodiment of the present invention for F.oxysporum.
  • 9B is a photograph showing the results of observing the mycelial growth inhibition and mycelial transformation of the volatile compound of Bacillus bellegensis CE 100 strain according to an embodiment of the present invention for F.solani.
  • 9C is a photograph showing the results of observing the mycelial growth inhibition and mycelial transformation of the volatile compound of Bacillus bellesensis CE 100 strain according to an embodiment of the present invention for P.nicotianae.
  • 9D is a photograph showing the results of observing the mycelial growth inhibition and mycelial transformation of the volatile compound of Bacillus bellegensis CE 100 strain according to an embodiment of the present invention for R.solani.
  • 9E is a photograph showing the results of observing the mycelial growth inhibition and mycelial transformation of the volatile compound of Bacillus bellegensis CE 100 strain according to an embodiment of the present invention against P.grisea.
  • 9F is a photograph showing the results of observing mycelial growth inhibition and mycelial transformation for P.drechsleri of a Bacillus bellegensis CE 100 strain volatile compound according to an embodiment of the present invention.
  • 9G is a photograph showing the results of observing the mycelial growth inhibition and mycelial transformation of B.dothidea of the volatile compound of Bacillus bellegensis CE 100 strain according to an embodiment of the present invention.
  • 9H is a photograph showing the results of observing mycelial growth inhibition and mycelial transformation for C.gloeosporioides of a volatile compound of Bacillus bellegensis CE 100 strain according to an embodiment of the present invention.
  • 9I is a photograph showing the results of observing the mycelial growth inhibition and mycelial transformation of the volatile compound of Bacillus bellegensis CE 100 strain according to an embodiment of the present invention for F.graminearum.
  • 9J is a photograph showing the results of observing the mycelial growth inhibition and mycelial transformation of the volatile compound of Bacillus bellegensis CE 100 strain according to an embodiment of the present invention for P.capsici.
  • 9K is a photograph showing the results of observing the mycelial growth inhibition and mycelial transformation of A.porri of the volatile compound of Bacillus bellesensis CE 100 strain according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 10a is a graph showing the result of co-inoculation of Bacillus bellegensis CE 100 strain and Fectobacterium carotoborum in TSB medium according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 10b is a graph showing the result of inoculation of Fectobacterium carotoborum in TSB medium according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 10c is a graph showing the results of inoculation of Bacillus bellegensis CE 100 strain in TSB medium according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 11a is a photograph of the observation result of cultivation by co-inoculation of Bacillus bellegensis CE 100 strain and Fectobacterium carotoborum in TSA medium according to an embodiment of the present invention.
  • 11B is a photograph of a result of observing culture by inoculating Bacillus bellegensis CE 100 strain in TSA medium according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 11c is a photograph of the result of observing culture by inoculating Fectobacterium carotoborum in TSA medium according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 12a is a photograph showing the results of measuring the growth degree of Bacillus bellegensis CE 100 strain in a mass incubator for each day according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 12b is a photograph showing the results of measuring the growth degree of Bacillus bellegensis CE 100 strain in a mass incubator for each day according to an embodiment of the present invention.
  • 13A is a graph showing the results of measuring CFU/ml by mass culturing Bacillus bellegensis CE 100 strain according to an embodiment of the present invention in PB medium.
  • 13B is a graph showing the results of measuring pH by mass culturing Bacillus bellegensis CE 100 strain according to an embodiment of the present invention in PB medium.
  • FIG. 14 is a graph showing the degree of inhibition of mycelium growth at various concentrations of a culture filtrate derived from a mass culture PB medium of Bacillus bellegensis CE 100 strain according to an embodiment of the present invention.
  • 15 is a photograph showing the result of observing with the naked eye the degree of inhibition of mycelium growth at various concentrations of a culture filtrate derived from a mass cultured PB medium (LP-CE) of Bacillus bellegensis CE 100 strain according to an embodiment of the present invention to be.
  • LP-CE mass cultured PB medium
  • Figure 16 shows the inhibition rate of conidia germination in 10% (a), 30% (b), 50% (c), 70% (d) of the culture filtrate of Bacillus bellegensis CE 100 strain according to an embodiment of the present invention It is a graph showing.
  • FIG. 17 is a result of conidia germination in Bacillus bellegensis CE 100 strain culture filtrate (a) 10%, (b) 30%, (c) 50% and (d) 70% according to an embodiment of the present invention This is a picture showing.
  • 19 is a graph showing chitinase activity according to temperature conditions of Bacillus bellegensis CE 100 strain according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 20 is a graph showing the glucanase activity according to the temperature conditions of Bacillus bellegensis CE 100 strain according to an embodiment of the present invention.
  • 21 is a graph showing the protease activity according to the temperature conditions of Bacillus bellegensis CE 100 strain according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 22 is a graph showing chitinase activity according to pH conditions of Bacillus bellegensis CE 100 strain according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 23 is a graph showing the glucanase activity according to the pH condition of Bacillus bellegensis CE 100 strain according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 24 is a graph showing chitinase activity according to pH conditions of Bacillus bellegensis CE 100 strain according to an embodiment of the present invention.
  • 25 is a photograph showing the results of confirming the production of cider pores of Bacillus bellegensis CE 100 strain according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 26 is a Bacillus bellegensis CE 100 strain according to an embodiment of the present invention (a) 1:5 diluted culture solution, (b) 1:3 diluted culture solution and (c) diaforte siteri treated with undiluted culture solution This is a picture showing the results for infected leaves.
  • FIG. 27 shows the results of treating a tree planted in a potted plant with Bacillus bellegensis CE 100 strain (CE) or an antifungal agent according to an embodiment of the present invention.
  • CE Bacillus bellegensis CE 100 strain
  • FIG. 28 is a graph showing the incidence of black spots after treatment with Bacillus bellegensis CE 100 strain (CE) or an antifungal agent on a tree planted in a pot according to an embodiment of the present invention.
  • CE Bacillus bellegensis CE 100 strain
  • Bacillus velezensis CE 100 Bacillus velezensis CE 100, a strain isolated from soil used in a tomato pot experiment; hereinafter, CE 100 strain
  • CE 100 strain Bacillus velezensis CE 100, a strain isolated from soil used in a tomato pot experiment; hereinafter, CE 100 strain
  • 1A and 1B the CE 100 strain was streaked on tryptone soybean agar (TSA) to obtain pure colonies. Then, the obtained culture was cultured in Tryptone soy broth (TSB) for 3 days at 30° C. and 130 rpm using a shaking incubator. The resulting bacterial culture was adjusted to 10 7 CFUs/mL, treated with 50% (v/v) glycerol and stored frozen at -80°C for further experiments.
  • Fig. 2 shows the results of phylogenetic analysis based on the 16s rRNA nucleotide sequence of the CE 100 strain.
  • Diaforte Siteri FA Wolf (KACC, Accession No. 45782), a fungal pathogen that causes melanose in citrus fruits, is called potato dextrose agar (hereinafter, referred to as “potato dextrose agar”). PDA) at 26°C for 14 days. Then, a conidial suspension of the diaporte siteri was prepared by the method described in Ko et al, 2012. A 5 mm diameter mycelial plug was collected using a sterile cork borer, and then incubated in PDA at 26° C. for 14 days.
  • a fungal plug was inoculated on oat meal agar (hereinafter, OA), incubated at 26° C. for 14 days, and then cultured for 14 days under room temperature fluorescent lamp conditions. Thereafter, 10 ml of sterile distilled water was added to the fully saturated plate, and the mycelium was scraped off using a sterile spatula. The obtained conidia were filtered using sterilized miracloth (CALBIOCHEM). The number of conidia was measured using a hemocytometer at 150x magnification under a microscope (Olympus BX41, Japan), and was adjusted to 1.0 ⁇ 10 8 conidia/ml.
  • PB Pink-Brown
  • M-1000 model name: M-1000, MC-biotec, Korea
  • PB medium the CE 100 strain was cultivated in the range of 25 °C to 50 °C and 4 to 10 pH (Fig. 3 and Fig. 4).
  • the antagonistic action of the CE 100 strain was assayed through a replacement culture method (Yoon et al., 2012). Bacillus strains were linearly plated on one side of each PDA plate, and various fungal plugs described in Table 1 below were inoculated on the other side of the plate coated with the CE 100 strain. A plate inoculated with only pathogenic fungi was used as a control. The plate was incubated at 25° C. for 14 days.
  • CE 100 strain has the effect of inhibiting the growth of various pathogenic fungal causative agents and bacterial pathogens including diaporte siteri.
  • the inhibition of mycelial growth of volatile compounds produced by the CE 100 strain was confirmed through a volatile plate assay. Specifically, 50 uL of the CE 100 strain culture solution was dispensed into the PBA medium at 10 7 CFU/mL. Thereafter, the mycelial plugs of each pathogen described in Table 2 below were inoculated in the center of the PDA medium, and the plate inoculated with the pathogen was turned over to face the CE 100 strain plate. Thereafter, the plate was sealed with a tape, and cultured at 26° C. from 3 to 20 days depending on the growth degree of each pathogenic fungus. Thereafter, the degree of inhibition of mycelium and mycelial growth of each pathogen was measured, and the results are shown in Table 3 and FIG. 7.
  • the volatile plate analysis results show that the CE 100 strain has a strong inhibitory activity against various plant pathogens.
  • the pathogen hyphae was twisted along the branches of the hyphae by the volatile compounds produced by the CE 100 strain. This indicates that the hyphae of the treated group exhibited an abnormal structure when compared to the control group, normal hyphae.
  • Example 3 CE 100 strain and Fectobacterium carotoborum ( Pectobacterium carotovorum ) Co-cultivation of CE 100 strains for bacterial growth inhibition ability assay
  • TSB medium was co-inoculated with the CE 100 strain and the bacterial pathogen Fectobacterium carotoborum.
  • CE 100 strain and Fectobacterium carotoborum were co-inoculated with TSA medium and cultured.
  • TSA medium inoculated with each bacterium alone was used as a control. After inoculation, the growth degree of the colony was observed every day, and the results are shown in FIGS. 11A to 11C.
  • the growth of the CE 100 strain was maximally grown at 2.67 ⁇ 10 5 CFUs/mL on the third day of culture.
  • the growth of the CE 100 strain showed a relatively constant pattern during the entire experimental process.
  • the pH of the medium in which the CE 100 strain was cultured reached a pH of 4.75, the lowest point on the first day, and then steadily increased to reach a pH of 5.86.
  • the bacterial cultures on days 5, 7, and 10 obtained in the small and large-scale culture steps were centrifuged at 12,000 rpm for 15 minutes to obtain a supernatant, The supernatant was filtered using Whatman filter paper No.6. The remaining live bacteria were completely removed using a syringe filter. The resulting culture filtrate was mixed with a PDA medium that had been autoclaved in advance, the final concentration was 10%, 30%, and 50%, and the temperature was adjusted to 60°C. Thereafter, a diaporte siteri fungal plug having a diameter of 2 mm was inoculated in the center of each plate.
  • the bacterial culture filtrate obtained in the mass culture step was mixed with an autoclaved PDB (Potato Dextrose Broth) liquid medium to obtain a final concentration of 10% and 30%. , 50% and 70%. Then, 1.0 x 10 6 conidia/ml of 100uL diaporte siteri conidial suspension was inoculated into each tube, so that the total volume was 1 mL. The conidia suspension inoculated in PDB liquid medium without bacterial culture filtrate was used as a control, and the same experiment was performed a total of three times.
  • PDB Panato Dextrose Broth
  • the number of germinated conidia was measured using a hemocytometer at 150x magnification under a microscope (Olympus BX41, Japan), and the percent germination inhibition was calculated using the following equation, and the results are shown in Table 8 and FIGS. 16 to 17 Shown in.
  • 2% agar and various substrates e.g., 2% casein to confirm protease activity, 2% starch to confirm amylase activity, 1% to confirm glucanase activity
  • Laminarin, 1% colloidal chitin for checking chitinase activity were mixed.
  • Cellulase medium was prepared using 0.5 g of cellulose, 0.1 g of Congo red, and 20 g of agar per liter.
  • a medium to be used for detecting lipase activity was prepared using 0.1 g of phenol red, 20 g of agar, and 20 ml of olive oil per liter (PH 7.3).
  • chitinase activities of chitinase, glucanase, and protease were quantitatively analyzed using a UV spectrophotometer under various pH and temperature conditions.
  • the same colony was cultured by inoculating 5uL of CE 100 strain (10 7 CFU/mL) in TSA medium at 30°C. Then, each colony was inoculated in PB medium having various temperature (30, 40 and 50° C.) and pH (6, 7 and 8) conditions. Then, the enzyme activity was measured every day for 10 days.
  • Fig. 18 shows the results of qualitatively confirming the enzyme activity of the CE 100 strain.
  • the enzyme activity according to the temperature of the CE 100 strain is shown in Figs. 19 to 21 and Tables 9 to 11, and the enzyme activity according to the pH is shown in Figs. 22 to 24 and Tables 12 to 14.
  • the CE 100 strain exhibited glucanase, protease, chitinase, lipase and cellulase activities, but did not show amylase activity.
  • the chitinase activity showed the highest activity at 50 °C and the highest activity on the 5th and 7th days of cultivation at each temperature.
  • the glucanase activity showed the highest activity at 40° C., the highest activity at day 3 for each temperature, and gradually decreased.
  • the protease activity exhibited the highest activity at 30°C, and almost no activity at 50°C. The results of cultivation at 30 °C and 40 °C showed the highest activity on the 3rd day, and the activity gradually decreased thereafter.
  • the chitinase activity exhibited the highest activity at pH6 and the highest activity on the 2nd and 7th days of culture at each temperature.
  • the glucanase activity showed the highest activity at pH 6, and showed a similar level of activity after the 3rd day regardless of the pH value.
  • the protease activity showed the highest activity at pH 8, and showed the highest activity on day 8 regardless of the pH value.
  • the protease activity showed an overall degree of activity regardless of the pH level or the culture day.
  • Example 8 CE 100 strain of cider pore production confirmation
  • CAS (chromeazurol S) agar medium was used to confirm the production of siderophore, an iron chelating agent produced by the CE 100 strain.
  • the CE 100 strain culture was inoculated on CAS agar medium and cultured at 30°C for 5 days. Orange coloration around the CE 100 strain colony indicates the production of ciderpores.
  • Fig. 25 shows the results of confirming the production of side pores of the CE 100 strain.
  • the CE 100 strain produces cider pores as the area around the inoculated place of the CE 100 strain is discolored in orange.
  • Siderophores are substances produced when the CE100 strain chelates iron, and by creating this substance, it easily absorbs iron, and pathogenic strains (which require iron) absorb iron quickly before absorbing it. It is known that the strain interferes with the absorption of iron and induces the immune system to inhibit or reduce the invasion of pathogens.
  • the culture filtrate of the CE 100 strain showed five enzyme activities (glucanase, protease, chitinase, lipase, and cellulase), but did not show amylase activity.
  • a preliminary leaf experiment was performed to confirm the bioprotective activity of the CE 100 strain culture solution against diaporte siteri.
  • a culture solution of 1:3, 1:5 was prepared by mixing the CE 100 strain culture solution obtained through the mass culture process and distilled water. Young leaves isolated from citrus trees were immersed in each culture solution for 30 minutes and air dried for 2 hours. Leaves immersed in distilled water were used as a control. Thereafter, the leaves obtained by immersion in the culture solution and distilled water were immersed in a conidia suspension of diaforte siteri (1.0 x 10 6 conidia/mL) for 30 minutes, and stored in a plastic container at 25° C. for 7 days under dark conditions.
  • CE 100 strain was cultured at 50° C. for 7 days using PB medium and mass culture.
  • Each bacterial culture solution was diluted (1:1, v:v) with distilled water, 2.0 X 10 5 CFU/mL, and the culture solution was treated on the leaf surface and air-dried for 2 hours.
  • Dithiano a commercially available synthetic antifungal agent, was treated on the leaves according to the manufacturer's recommendations and air-dried for 2 hours. The group treated with water on the leaves was used as a control.
  • the conidia suspension (1.0 x 10 6 conidia/mL) of diaporte siteri was treated on the surface of the leaf.
  • the inoculated plants were grown at 28 ⁇ 2° C. and 60% relative humidity.
  • the onset of dark spotted disease was investigated 20 days after treatment with the conidia suspension of diaporte siteri.
  • the disease incidence was measured by counting the number of leaves with brown lesions and yellow borders on the edges of each treated plant, and the results are shown in FIGS. 27 to 28 and Table 16.
  • the present invention relates to a composition for controlling plant pathogens comprising Bacillus velezensis CE 100 strain, a method of culturing it, a cell body, a culture medium, a culture filtrate, or a combination thereof as an active ingredient, and a method for controlling plant pathogens using the same.
  • a composition for controlling plant pathogens comprising Bacillus velezensis CE 100 strain, a method of culturing it, a cell body, a culture medium, a culture filtrate, or a combination thereof as an active ingredient, and a method for controlling plant pathogens using the same.

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Abstract

본 발명은 바실러스 벨레젠시스 (Bacillus velezensis) CE 100 균주, 이의 배양 방법, 이의 균체, 배양액, 배양여과액 또는 이들의 조합을 유효성분으로 포함하는 식물병원균 방제용 조성물 및 이를 이용한 식물병원균 방제 방법에 관한 것으로, 본 발명의 균주는 다양한 식물병원균에 대한 방제에 유용하게 사용할 수 있으며, 본 발명의 균주는 본 발명의 배양 방법으로 배양하는 경우 비멸균 환경에서도 배양이 가능하여 산업적 이용에 용이하다.

Description

바실러스 벨레젠시스 CE 100 균주 및 이를 이용한 식물병원균 방제용 조성물
본 발명은 바실러스 벨레젠시스 (Bacillus velezensis) CE 100 균주, 이의 배양 방법, 이의 균체, 배양액, 배양여과액 또는 이들의 조합을 유효성분으로 포함하는 식물병원균 방제용 조성물 및 이를 이용한 식물병원균 방제 방법에 관한 것이다.
본 발명은 농림식품기술기획평가원의 지원 하에서 과제번호 316032-5에 의해 이루어진 것으로서, 상기 과제의 연구관리전문기관은 농림식품기술기획평가원, 연구사업명은 "농생명산업기술개발사업", 연구과제명은 "한국형 친환경 표준 재배기술 및 유기가공 식품 첨가물 생산기술 개발", 주관기관은 전남대학교, 연구기간은 2016.05.19 ~ 2020.12.31이다.
박테리아 진균 바이러스 및 선충류에 의해 발생하는 식물 질병은 작물 생산량을 감소시키는 주요한 요인이다. 상기 병원체에 의한 피해로부터 작물을 보호하기 위해 재배법 (cultural practices) 및 농약 살포 (pesticide application) 등을 포함하는 다양한 방법이 사용되고 있다.
상기 방법 중 농약 살포는 일반적으로 가장 효과적이고 단시간에 작물을 보호하기 위한 방법이다. 그러나, 작물에 대한 빈번한 합성 진균제 (fungicide)의 사용은 환경에 해로운 영향을 미치고, 항진균제 저항성 균주의 발생을 야기한다. 따라서, 작물 보호에 있어 안정성이 높은 유망한 대안을 고려해야 할 필요가 있다. 이러한 화학 진균제의 대체와 관련하여, 효과적인 미생물 제제는 식물 질병의 생물방제로서 지속 가능한 친환경농업의 주요 허용물질로 떠올랐다.
세균 및 진균을 비롯한 다양한 종류의 미생물제제가 식물병원체 방제에 사용되고, 그들 중 일부는 유기농업자재시장에 소개되었다. 이들 미생물제제 중에서 세균 길항제, 특히 바실러스 종은 식물 근권에서 내생포자와 잠재적인 군락형성을 갖추고 있다.
또한, 바실러스 종은 극한조건에서도 빠른 성장속도, 토양에서의 장기생존, 높은 안정성 같은 놀라운 특성으로 인해 토양 매개 진균성 질환을 방제하기 위한 유망한 후보로 알려져 있다.
또한, 바실러스 종은 식물 성장 촉진 호르몬, 사이더포어, 용균효소, 항진균 대사산물을 생산하고 병원체 침투에 대한 식물 면역 시스템의 방어 수준을 높여주는 특징을 가지고 있다. 이러한 특징을 통해 바실러스 종은 식물 생장 촉진제로서의 잘 알려져 있다.
그러나, 상술한 생물학적 방제제의 대량 배양 및 실제 현장 적용은 많은 제한이 있다. 상기 제한의 예로, 값 비싼 접종 설비 (inoculating facilities) (배양기 및 실험용 상업적 성장 배지), 성장 배지의 멸균, 배지의 오염 및 표적 병원체를 통제하기 위한 일관성의 상실 등이 있다. 또한, 생물학적 방제제는 생산 비용을 줄이기 위한 희석으로 인해 토양과 식물의 근권에 서식하는 토착 미생물과 경쟁하기가 어렵다는 문제도 있다.
본 발명자들은 식물병원균 방제 효과가 뛰어난 균주와 바실러스 균주의 대량 배양 방법을 개발하고자 예의 연구 노력하였다. 그 결과, 신규한 바실러스 균주 및 이의 대량 배양 방법을 규명함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서, 본 발명의 목적은 바실러스 벨레젠시스 (Bacillus velezensis) CE 100 균주를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 바실러스 벨레젠시스 (Bacillus velezensis) CE 100 균주의 배양 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 바실러스 벨레젠시스 (Bacillus velezensis) CE 100 균주를 포함하는 식물병원균 방제용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 바실러스 벨레젠시스 (Bacillus velezensis) CE 100 균주를 이용한 식물병원균 방제 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 바실러스 벨레젠시스 (Bacillus velezensis) CE 100 균주의 식물병원균 방제 용도를 제공하는 것이다.
본 발명자는 다이아포르테 사이트리 (Diaporthe citri)에 의한 검은점무늬병에 효과가 좋은 바실러스 벨레젠시스 (Bacillus velezensis) CE 100 및 이의 배양 방법에 대한 연구를 수행하였다.
이에, 본 발명은 바실러스 벨레젠시스 (Bacillus velezensis) CE 100 균주, 이의 배양 방법, 이의 균체, 배양액, 배양여과액 또는 이들의 조합을 유효성분으로 포함하는 식물병원균 방제용 조성물 및 이를 이용한 식물병원균 방제 방법에 관한 것이다.
이하 본 발명을 더욱 자세히 설명하고자 한다.
본 발명의 일 예는 바실러스 벨레젠시스 (Bacillus velezensis) CE 100 균주에 관한 것이다.
본 발명에 있어서 바실러스 벨레젠시스 CE 100 균주는 서열번호 1의 염기서열을 포함하는 16s rRNA 서열을 갖는 것일 수 있으며, 예를 들어, 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 16s rRNA 서열을 갖는 것일 수 있다.
본 발명에 있어서 바실러스 벨레젠시스 CE 100 균주는 전라북도 완주군에 소재한 농업생명공학연구원에 2019년 7월 31일 자로 기탁하여 수탁번호 KACC 81101BP를 수여 받았다.
본 발명의 바실러스 벨레젠시스 CE 100 균주는 수탁번호 KACC 81101BP의 바실러스 벨레젠시스 CE 100 균주인 것일 수 있다.
본 발명의 바실러스 벨레젠시스 CE 100 균주는 식물병원균에 대하여 방제활성을 가진다.
본 발명의 다른 일 예는 다음의 단계를 포함하는 바실러스 벨레젠시스 CE 100 균주의 배양 방법에 관한 것이다:
세균 배양용 배지에 바실러스 벨레젠시스 (Bacillus velezensis) 균주를 접종하는 단계;
균주를 배양하는 배양 단계; 및
배양 단계의 결과물을 수득하는 수득 단계.
본 발명에 있어서 바실러스 벨레젠시스 균주는 바실러스 벨레젠시스 CE 100 균주인 것일 수 있다.
본 발명에 있어서 바실러스 벨레젠시스 CE 100 균주는 서열번호 1의 염기서열을 포함하는 16s rRNA 서열을 갖는 것일 수 있으며, 예를 들어, 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 16s rRNA 서열을 갖는 것일 수 있다.
본 발명에 있어서 바실러스 벨레젠시스 CE 100 균주는 수탁번호 KACC 81101BP의 바실러스 벨레젠시스 CE 100 균주인 것일 수 있다.
본 발명에 있어서 세균 배양용 배지는 바실러스 벨레젠시스 균주가 생장할 수 있는 배지라면 크게 제한되지 않으며, 예를 들어, 트립톤 소이 액체 배지, 영양 액체 배지, LB 배지 (lysogeny broth), PB 배지 등인 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서 세균 배양용 배지의 양은 300 내지 700 L, 350 내지 700 L, 400 내지 700 L, 450 내지 700 L, 500 내지 700 L, 300 내지 650 L, 350 내지 650 L, 400 내지 650 L, 450 내지 650 L, 500 내지 650 L, 300 내지 600 L, 350 내지 600 L, 400 내지 600 L, 450 내지 600 L, 500 내지 600 L, 300 내지 550 L, 350 내지 550 L, 400 내지 550 L, 450 내지 550 L, 예를 들어, 500 내지 550 L인 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서 배양 단계는 평판 배양, 고체 배양, 액체 배양 등으로 수행하는 것일 수 있으며, 예를 들어, 배양여과액을 얻기 용이하고 대량생산에 적합한 액체 배양으로 수행하는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서 배양 단계는 20 내지 70 ℃, 20 내지 65 ℃, 20 내지 60 ℃, 20 내지 55 ℃, 20 내지 50 ℃, 20 내지 45 ℃, 20 내지 40 ℃, 20 내지 35 ℃, 20 내지 30 ℃, 25 내지 70 ℃, 25 내지 65 ℃, 25 내지 60 ℃, 25 내지 55 ℃, 25 내지 50 ℃, 25 내지 45 ℃, 25 내지 40 ℃, 25 내지 35 ℃, 25 내지 30 ℃, 30 내지 70 ℃, 30 내지 65 ℃, 30 내지 60 ℃, 30 내지 55 ℃, 30 내지 50 ℃, 30 내지 45 ℃, 30 내지 40 ℃, 30 내지 35 ℃, 35 내지 70 ℃, 35 내지 65 ℃, 35 내지 60 ℃, 35 내지 55 ℃, 35 내지 50 ℃, 35 내지 45 ℃, 35 내지 40 ℃, 40 내지 70 ℃, 40 내지 65 ℃, 40 내지 60 ℃, 40 내지 55 ℃, 40 내지 50 ℃, 40 내지 45 ℃, 45 내지 70 ℃, 45 내지 65 ℃, 45 내지 60 ℃, 45 내지 55 ℃, 예를 들어, 45 내지 50 ℃에서 수행하는 것일 수 있다. 일반적으로 미생물이 생존하기 어려운 환경인 고열 조건 하에서 바실러스 CE 100 균주는 생존가능 하기 때문에 고온에서 배양함으로써 다른 바람직하지 않은 미생물을 제거 가능하다.
본 발명에 있어서 배양 단계는 3 내지 20 일, 4 내지 20 일, 5 내지 20 일, 6 내지 20 일, 7 내지 20 일, 8 내지 20 일, 9 내지 20 일, 10 내지 20 일, 4 내지 19 일, 5 내지 19 일, 6 내지 19 일, 7 내지 19 일, 8 내지 19 일, 9 내지 19 일, 10 내지 19 일, 4 내지 18 일, 5 내지 18 일, 6 내지 18 일, 7 내지 18 일, 8 내지 18 일, 9 내지 18 일, 10 내지 18 일, 4 내지 17 일, 5 내지 17 일, 6 내지 17 일, 7 내지 17 일, 8 내지 17 일, 9 내지 17 일, 10 내지 17 일, 4 내지 16 일, 5 내지 16 일, 6 내지 16 일, 7 내지 16 일, 8 내지 16 일, 9 내지 16 일, 10 내지 16 일, 4 내지 15 일, 5 내지 15 일, 6 내지 15 일, 7 내지 15 일, 8 내지 15 일, 9 내지 15 일, 10 내지 15 일, 4 내지 14 일, 5 내지 14 일, 6 내지 14 일, 7 내지 14 일, 8 내지 14 일, 9 내지 14 일, 10 내지 14 일, 4 내지 13 일, 5 내지 13 일, 6 내지 13 일, 7 내지 13 일, 8 내지 13 일, 9 내지 13 일, 10 내지 13 일, 4 내지 12 일, 5 내지 12 일, 6 내지 12 일, 7 내지 12 일, 8 내지 12 일, 9 내지 12 일, 10 내지 12 일, 4 내지 11 일, 5 내지 11 일, 6 내지 11 일, 7 내지 11 일, 8 내지 11 일, 9 내지 11 일, 10 내지 11 일, 4 내지 10 일, 5 내지 10 일, 6 내지 10 일, 7 내지 10 일, 8 내지 10 일, 9 내지 10 일이다.
본 발명에 있어서 상기 배양 단계는 pH 3 내지 10, pH 3 내지 9, pH 3 내지 8, pH 3 내지 7, pH 3 내지 6, 4 내지 9, pH 4 내지 8, pH 4 내지 7, pH 4 내지 6, pH 5 내지 9, pH 5 내지 8, pH 5 내지 7에서 수행되는 것일 수 있으며, 예를 들어, pH 5 내지 6에서 수행되는 것일 수 있다. 낮은 pH 조건 하에서 수행되기 때문에 별도의 멸균 과정 없이 배양 시 오염을 최소화할 수 있다.
본 발명에 있어서 상기 수득 단계는 공지의 수득 방법을 통해 수득할 수 있다.
본 발명에 있어서 상기 배양 단계의 결과물은 균주의 균체, 배양액, 농축 배양액, 배양액의 건조물, 배양 여과액, 농축 배양 여과액 또는 배양 여과액의 건조물인 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 배양 방법은 고온 및 낮은 pH 조건 하에서 수행되기 때문에 별도의 멸균 과정 없이 배양 시 오염을 최소화할 수 있다.
본 발명의 배양 방법은 CE 100 균주가 배양과정에서 생성하는 활성 대사산물에 의해 별도의 멸균 과정 없이 배양 시 오염을 최소화할 수 있다.
본 발명에 있어서 상기 활성 대사산물은 페닐아세트산 (phenylacetic acid), 메틸 마노산염 (methyl hippurate) 및 항진균성 펩타이드(antifungal peptide)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것일 수 있다.
본 발명에 있어서 상기 항진균성 펩타이드는 N-Valyl-L-Ornithine, L-valyl-L-isoleucyl-L-alanyl-L-Orinithine, Cyclo(dehydro-Ala-Val), Cyclo (Gly-Leu), ((S)-2-hydropropanoyl)-L-(leucine) 및 N-Acetyl-L-Leucine 등인 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 다른 일 예는 바실러스 벨레젠시스 (Bacillus velezensis) CE 100 균주의 균체, 배양액, 농축 배양액, 배양액의 건조물, 배양 여과액, 농축 배양 여과액, 배양 여과액 또는 이들의 조합을 유효성분으로 포함하는 식물병원균 방제용 조성물에 관한 것이다.
상기 바실러스 벨레젠시스 CE 100 균주는 기 설명한 바와 동일하다.
본 명세서 상의 용어 "식물병원균"은 식물에 침입하여 식물의 잎, 줄기, 뿌리 또는 과실을 손실 및 손상을 일으키는 병원성 곰팡이(진균) 및 세균을 의미한다.
본 발명에 있어서 상기 식물병원균은 다이아포르테 사이트리 (Diaporthe citri), 균핵병균 (Sclerotinia sclerotiorum), 스클레로티움 세피보룸 (Sclerotium cepivorum), 잿빛 무늬 병원균 (Monilinia fructicola), 보트리티스 시네레아 (Botrytis cinerea), 코레토트리쿰 아큐타툼 (Collectotrichum acutatum), 보트리오티니아 퍼켈리아나 (Botryotinia fuckeliana), 실린드로카폰 데스트럭탄스 (Cylindrocarpon destructans), 셉토리아 글리시네스 (Septoria Glycines), 글로메렐라 신굴레이트 (Glomerella cingulate), 푸사리움 솔라니 (Fusarium solani), 리족토니아 솔라니 (Rhizoctonia solani), 피리쿨라리아 그리세아 (Pyricularia grisea), 파이토프토라 드레크슬레리 (Phytophthora drechsleri), 보트리오스페리아 도치데아 (Botryosphaeria dothidea), 콜레토트리쿰 글로에오스포리오이데스 (Colletotrichum gloeosporioides), 푸사리움 글라민아룸 (Fusarium grminearum), 파이토프토라 캡시사이 (Phytophthora capsici), 파이토프토라 니코티아나 (Phytophthora nicotianae), 알터나리아 포리 (Alternaria porri), 포마속 균들 (Phoma spp), 파이토프토라 인페스탄스 (Phytophthora infestans) 및 펙토박테리움 카로토보룸 (Pectobacterium carotovorum)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니며, 예를 들어, 다이아포르테 사이트리인 것일 수 있다.
본 발명의 식물병원균 방제용 조성물의 제형은 유화제, 액제, 수화제, 분말제, 입자, 오일용액, 에어로졸 또는 플로어블제 (flowables) 등의 임의의 적합한 제형으로 제조될 수 있다.
본 발명의 식물병원균 방제용 조성물이 농약으로 제조되는 경우, 적당한 고체 담체, 액체 담체, 가스상 담체, 계면활성제, 분산제 및/또는 기타제제용 보조제와 혼합하여 제조되는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서 상기 고체 담체는 탈크, 벤토나이트, 클레이, 카올린, 규조토, 질석, 화이트카본 및 탄산칼슘 등을 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서 상기 액체 담체는 메탄올, n-헥산올 및 에탄올 글리콜 등의 알코올류; 아세톤, 메틸에틸케톤 및 시클로헥사논 등의 케톤류; n-헥산, 케로신 및 등유 등의 지방족 탄화수소류; 톨루엔, 크실렌 및 메틸나프탈렌 등의 방향족 탄화수소류; 디에틸에테르, 디옥산 및 테트라히드로퓨란 등의 에테르류; 에틸아세테이트 등의 에스테르류; 아세토니트릴 및 이소부틸니트릴 등의 니트릴류; 디메틸포름아미드 및 디메틸아세트아미드 등의 산아미드류; 두유 및 면실유 등의 식물유류 디메틸술폭사이드; 및 물이 포함된 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서 상기 가스상 담체는 LPG, 공기, 질소, 이산화탄소 및 디메틸에테르가 포함된 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 식물병원균 방제용 조성물은 일반적으로 그대로 또는 희석 후에 사용되는 것일 수 있다.
본 발명의 식물병원균 방제용 조성물의 적용 방법으로는 식물 자체에 적용 (줄기 및 잎에 적용), 토양으로의 적용 (토양과 혼화 또는 덧거름), 현장 용수로의 적용 및 종자로의 적용인 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 일 예는 바실러스 벨레젠시스 (Bacillus velezensis) CE 100 균주를 이용한 식물병원균 방제 방법에 관한 것이다.
본 발명에 있어서 상기 식물병원균은 다이아포르테 사이트리 (Diaporthe citri), 균핵병균 (Sclerotinia sclerotiorum), 스클레로티움 세피보룸 (Sclerotium cepivorum), 잿빛 무늬 병원균 (Monilinia fructicola), 보트리티스 시네레아 (Botrytis cinerea), 코레토트리쿰 아큐타툼 (Collectotrichum acutatum), 보트리오티니아 퍼켈리아나 (Botryotinia fuckeliana), 실린드로카폰 데스트럭탄스 (Cylindrocarpon destructans), 셉토리아 글리시네스 (Septoria Glycines), 글로메렐라 신굴레이트 (Glomerella cingulate), 푸사리움 솔라니 (Fusarium solani), 리족토니아 솔라니 (Rhizoctonia solani), 피리쿨라리아 그리세아 (Pyricularia grisea), 파이토프토라 드레크슬레리 (Phytophthora drechsleri), 보트리오스페리아 도치데아 (Botryosphaeria dothidea), 콜레토트리쿰 글로에오스포리오이데스 (Colletotrichum gloeosporioides), 푸사리움 글라민아룸 (Fusarium grminearum), 파이토프토라 캡시사이 (Phytophthora capsici), 파이토프토라 니코티아나 (Phytophthora nicotianae), 알터나리아 포리 (Alternaria porri), 포마속 균들 (Phoma spp), 파이토프토라 인페스탄스 (Phytophthora infestans) 및 펙토박테리움 카로토보룸 (Pectobacterium carotovorum)으로 이루어진 군에서 선택되는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서 상기 식물은 깻잎, 상추, 양배추, 쌈채류, 가지, 감자, 고구마, 고추, 당근, 대파, 딸기, 마늘, 메론, 미나리, 무, 방울토마토, 배추, 부추, 생강, 시금치, 수박, 양파, 애호박, 오이, 옥수수, 쪽파, 참외, 파프리카, 피망, 콩, 토마토, 호박, 감 나무, 감귤 나무, 배 나무, 복숭아 나무, 사과 나무, 유자 나무, 자두 나무, 잣 나무, 참다래, 키위, 포도 나무, 한라봉 나무, 고사리, 곰취, 대추, 도라지, 두릅, 복분자, 블루베리, 어성초, 인삼, 오디, 오미자, 참깨, 국화, 아티초크, 장미, 마, 밀, 벼, 보리, 연근 등인 것일 수 있으며, 예를 들어, 감귤 나무인 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서 상기 적용 단계는 식물 자체에 적용 (줄기 및 잎에 적용), 토양으로의 적용 (토양과 혼화 또는 덧거름), 현장 용수로의 적용 및 종자로의 적용인 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
[미생물기탁]
기탁기관명: 농업생명공학연구원
수탁번호: KACC81101BP
수탁일자: 2019.07.31
[기탁증]
Figure PCTKR2020001218-appb-I000001
본 발명은 바실러스 벨레젠시스 (Bacillus velezensis) CE 100 균주, 이의 배양 방법, 이의 균체, 배양액, 배양여과액 또는 이들의 조합을 유효성분으로 포함하는 식물병원균 방제용 조성물 및 이를 이용한 식물병원균 방제 방법에 관한 것으로, 본 발명의 균주는 다양한 식물병원균에 대한 방제에 유용하게 사용할 수 있으며, 본 발명의 균주는 본 발명의 배양 방법으로 배양하는 경우 비멸균 환경에서도 오염 없이 충분한 양의 효소와 대사산물이 존재하도록 대량 배양 가능하여 산업적 이용에 용이하다.
도 1a는 본 발명의 일 실시예에 따른 바실러스 벨레젠시스 CE 100 균주의 TSA 배지에서의 배양 결과를 보여주는 사진이다.
도 1b는 본 발명의 일 실시예에 따른 바실러스 벨레젠시스 CE 100 균주의 TSA 배지에서의 배양 결과를 현미경으로 관찰한 결과를 보여주는 사진이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 바실러스 벨레젠시스 CE 100 균주의 16s rRNA 염기서열을 바탕으로 계통분석한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 바실러스 벨레젠시스 CE 100 균주의 PBA 배지에서 다양한 온도조건으로 배양한 결과를 보여주는 사진이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 바실러스 벨레젠시스 CE 100 균주의 PBA 배지에서 다양한 pH조건으로 배양한 결과를 보여주는 사진이다.
도 5a는 본 발명의 일 실시예에 따른 바실러스 벨레젠시스 CE 100 균주의 D.citri에 대한 길항 작용 실험 결과를 보여주는 사진이다.
도 5b는 본 발명의 일 실시예에 따른 바실러스 벨레젠시스 CE 100 균주의 S.sclerotiorum에 대한 길항 작용 실험 결과를 보여주는 사진이다.
도 5c는 본 발명의 일 실시예에 따른 바실러스 벨레젠시스 CE 100 균주의 S.cepivorum에 대한 길항 작용 실험 결과를 보여주는 사진이다.
도 5d는 본 발명의 일 실시예에 따른 바실러스 벨레젠시스 CE 100 균주의 M.fructicola에 대한 길항 작용 실험 결과를 보여주는 사진이다.
도 5e는 본 발명의 일 실시예에 따른 바실러스 벨레젠시스 CE 100 균주의 Phoma spp.에 대한 길항 작용 실험 결과를 보여주는 사진이다.
도 5f는 본 발명의 일 실시예에 따른 바실러스 벨레젠시스 CE 100 균주의 B.cinerea에 대한 길항 작용 실험 결과를 보여주는 사진이다.
도 5g는 본 발명의 일 실시예에 따른 바실러스 벨레젠시스 CE 100 균주의 C.acutatum에 대한 길항 작용 실험 결과를 보여주는 사진이다.
도 5h는 본 발명의 일 실시예에 따른 바실러스 벨레젠시스 CE 100 균주의 B.fuckeliana에 대한 길항 작용 실험 결과를 보여주는 사진이다.
도 5i는 본 발명의 일 실시예에 따른 바실러스 벨레젠시스 CE 100 균주의 C.destructans에 대한 길항 작용 실험 결과를 보여주는 사진이다.
도 5j는 본 발명의 일 실시예에 따른 바실러스 벨레젠시스 CE 100 균주의 P.infestans에 대한 길항 작용 실험 결과를 보여주는 사진이다.
도 5k는 본 발명의 일 실시예에 따른 바실러스 벨레젠시스 CE 100 균주의 S.glycines에 대한 길항 작용 실험 결과를 보여주는 사진이다.
도 5l는 본 발명의 일 실시예에 따른 바실러스 벨레젠시스 CE 100 균주의 G.cingulata에 대한 길항 작용 실험 결과를 보여주는 사진이다.
도 5m는 본 발명의 일 실시예에 따른 바실러스 벨레젠시스 CE 100 균주의 F.oxysporum에 대한 길항 작용 실험 결과를 보여주는 사진이다.
도 5n는 본 발명의 일 실시예에 따른 바실러스 벨레젠시스 CE 100 균주의 F.solani에 대한 길항 작용 실험 결과를 보여주는 사진이다.
도 5o는 본 발명의 일 실시예에 따른 바실러스 벨레젠시스 CE 100 균주의 P.nicotianae에 대한 길항 작용 실험 결과를 보여주는 사진이다.
도 5p는 본 발명의 일 실시예에 따른 바실러스 벨레젠시스 CE 100 균주의 R.solani에 대한 길항 작용 실험 결과를 보여주는 사진이다.
도 5q는 본 발명의 일 실시예에 따른 바실러스 벨레젠시스 CE 100 균주의 P.grisea에 대한 길항 작용 실험 결과를 보여주는 사진이다.
도 5r는 본 발명의 일 실시예에 따른 바실러스 벨레젠시스 CE 100 균주의 P.drechsleri에 대한 길항 작용 실험 결과를 보여주는 사진이다.
도 5s는 본 발명의 일 실시예에 따른 바실러스 벨레젠시스 CE 100 균주의 B.dothidea에 대한 길항 작용 실험 결과를 보여주는 사진이다.
도 5t는 본 발명의 일 실시예에 따른 바실러스 벨레젠시스 CE 100 균주의 C.gloeosporioides에 대한 길항 작용 실험 결과를 보여주는 사진이다.
도 5u는 본 발명의 일 실시예에 따른 바실러스 벨레젠시스 CE 100 균주의 F.graminearum에 대한 길항 작용 실험 결과를 보여주는 사진이다.
도 5v는 본 발명의 일 실시예에 따른 바실러스 벨레젠시스 CE 100 균주의 P.capsici에 대한 길항 작용 실험 결과를 보여주는 사진이다.
도 5w는 본 발명의 일 실시예에 따른 바실러스 벨레젠시스 CE 100 균주의 A.porri에 대한 길항 작용 실험 결과를 보여주는 사진이다.
도 5x는 본 발명의 일 실시예에 따른 바실러스 벨레젠시스 CE 100 균주의 P.carotovorum에 대한 길항 작용 실험 결과를 보여주는 사진이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 바실러스 벨레젠시스 CE 100 균주의 다양한 병원체에 대한 균사체 성장 억제율을 나타낸 그래프이다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따른 바실러스 벨레젠시스 CE 100 균주 휘발성 화합물의 다양한 진균에 대한 균사체 성장 억제율을 나타낸 그래프이다.
도 8a는 본 발명의 일 실시예에 따른 바실러스 벨레젠시스 CE 100 균주 휘발성 화합물의 D.citri에 대한 균사체 성장 억제 및 균사 변형을 관찰한 결과를 보여주는 사진이다.
도 8b는 본 발명의 일 실시예에 따른 바실러스 벨레젠시스 CE 100 균주 휘발성 화합물의 S.sclerotiorum에 대한 균사체 성장 억제 및 균사 변형을 관찰한 결과를 보여주는 사진이다.
도 8c는 본 발명의 일 실시예에 따른 바실러스 벨레젠시스 CE 100 균주 휘발성 화합물의 S.cepivorum에 대한 균사체 성장 억제 및 균사 변형을 관찰한 결과를 보여주는 사진이다.
도 8d는 본 발명의 일 실시예에 따른 바실러스 벨레젠시스 CE 100 균주 휘발성 화합물의 M.fructicola에 대한 균사체 성장 억제 및 균사 변형을 관찰한 결과를 보여주는 사진이다.
도 8e는 본 발명의 일 실시예에 따른 바실러스 벨레젠시스 CE 100 균주 휘발성 화합물의 Phoma spp.에 대한 균사체 성장 억제 및 균사 변형을 관찰한 결과를 보여주는 사진이다.
도 8f는 본 발명의 일 실시예에 따른 바실러스 벨레젠시스 CE 100 균주 휘발성 화합물의 B.cinerea에 대한 균사체 성장 억제 및 균사 변형을 관찰한 결과를 보여주는 사진이다.
도 8g는 본 발명의 일 실시예에 따른 바실러스 벨레젠시스 CE 100 균주 휘발성 화합물의 C.acutatum에 대한 균사체 성장 억제 및 균사 변형을 관찰한 결과를 보여주는 사진이다.
도 8h는 본 발명의 일 실시예에 따른 바실러스 벨레젠시스 CE 100 균주 휘발성 화합물의 B.fuckeliana에 대한 균사체 성장 억제 및 균사 변형을 관찰한 결과를 보여주는 사진이다.
도 8i는 본 발명의 일 실시예에 따른 바실러스 벨레젠시스 CE 100 균주 휘발성 화합물의 C.destructans에 대한 균사체 성장 억제 및 균사 변형을 관찰한 결과를 보여주는 사진이다.
도 8j는 본 발명의 일 실시예에 따른 바실러스 벨레젠시스 CE 100 균주 휘발성 화합물의 P.infestans에 대한 균사체 성장 억제 및 균사 변형을 관찰한 결과를 보여주는 사진이다.
도 8k는 본 발명의 일 실시예에 따른 바실러스 벨레젠시스 CE 100 균주 휘발성 화합물의 S.glycines에 대한 균사체 성장 억제 및 균사 변형을 관찰한 결과를 보여주는 사진이다.
도 8l는 본 발명의 일 실시예에 따른 바실러스 벨레젠시스 CE 100 균주 휘발성 화합물의 G.cingulata에 대한 균사체 성장 억제 및 균사 변형을 관찰한 결과를 보여주는 사진이다.
도 9a는 본 발명의 일 실시예에 따른 바실러스 벨레젠시스 CE 100 균주 휘발성 화합물의 F.oxysporum에 대한 균사체 성장 억제 및 균사 변형을 관찰한 결과를 보여주는 사진이다.
도 9b는 본 발명의 일 실시예에 따른 바실러스 벨레젠시스 CE 100 균주 휘발성 화합물의 F.solani에 대한 균사체 성장 억제 및 균사 변형을 관찰한 결과를 보여주는 사진이다.
도 9c는 본 발명의 일 실시예에 따른 바실러스 벨레젠시스 CE 100 균주 휘발성 화합물의 P.nicotianae에 대한 균사체 성장 억제 및 균사 변형을 관찰한 결과를 보여주는 사진이다.
도 9d는 본 발명의 일 실시예에 따른 바실러스 벨레젠시스 CE 100 균주 휘발성 화합물의 R.solani에 대한 균사체 성장 억제 및 균사 변형을 관찰한 결과를 보여주는 사진이다.
도 9e는 본 발명의 일 실시예에 따른 바실러스 벨레젠시스 CE 100 균주 휘발성 화합물의 P.grisea에 대한 균사체 성장 억제 및 균사 변형을 관찰한 결과를 보여주는 사진이다.
도 9f는 본 발명의 일 실시예에 따른 바실러스 벨레젠시스 CE 100 균주 휘발성 화합물의 P.drechsleri에 대한 균사체 성장 억제 및 균사 변형을 관찰한 결과를 보여주는 사진이다.
도 9g는 본 발명의 일 실시예에 따른 바실러스 벨레젠시스 CE 100 균주 휘발성 화합물의 B.dothidea에 대한 균사체 성장 억제 및 균사 변형을 관찰한 결과를 보여주는 사진이다.
도 9h는 본 발명의 일 실시예에 따른 바실러스 벨레젠시스 CE 100 균주 휘발성 화합물의 C.gloeosporioides에 대한 균사체 성장 억제 및 균사 변형을 관찰한 결과를 보여주는 사진이다.
도 9i는 본 발명의 일 실시예에 따른 바실러스 벨레젠시스 CE 100 균주 휘발성 화합물의 F.graminearum에 대한 균사체 성장 억제 및 균사 변형을 관찰한 결과를 보여주는 사진이다.
도 9j는 본 발명의 일 실시예에 따른 바실러스 벨레젠시스 CE 100 균주 휘발성 화합물의 P.capsici에 대한 균사체 성장 억제 및 균사 변형을 관찰한 결과를 보여주는 사진이다.
도 9k는 본 발명의 일 실시예에 따른 바실러스 벨레젠시스 CE 100 균주 휘발성 화합물의 A.porri에 대한 균사체 성장 억제 및 균사 변형을 관찰한 결과를 보여주는 사진이다.
도 10a는 본 발명의 일 실시예에 따라 바실러스 벨레젠시스 CE 100 균주와 펙토박테리움 카로토보룸을 TSB배지에 공접종한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 10b는 본 발명의 일 실시예에 따라 펙토박테리움 카로토보룸을 TSB배지에 접종한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 10c는 본 발명의 일 실시예에 따라 바실러스 벨레젠시스 CE 100 균주를 TSB배지에 접종한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 11a는 본 발명의 일 실시예에 따라 바실러스 벨레젠시스 CE 100 균주와 펙토박테리움 카로토보룸을 TSA배지에 공접종하여 배양한 것을 관찰한 결과 사진이다.
도 11b는 본 발명의 일 실시예에 따라 바실러스 벨레젠시스 CE 100 균주를 TSA배지에 접종하여 배양한 것을 관찰한 결과 사진이다.
도 11c는 본 발명의 일 실시예에 따라 펙토박테리움 카로토보룸을 TSA배지에 접종하여 배양한 것을 관찰한 결과 사진이다.
도 12a는 본 발명의 일 실시예에 따른 바실러스 벨레젠시스 CE 100 균주의 대량 배양기에서의 성장 정도를 날짜 별로 측정한 결과를 나타낸 사진이다.
도 12b는 본 발명의 일 실시예에 따른 바실러스 벨레젠시스 CE 100 균주의 대량 배양기에서의 성장 정도를 날짜 별로 측정한 결과를 나타낸 사진이다.
도 13a는 본 발명의 일 실시예에 따른 바실러스 벨레젠시스 CE 100 균주를 PB배지에서 대량 배양하여 CFU/ml를 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 13b는 본 발명의 일 실시예에 따른 바실러스 벨레젠시스 CE 100 균주를 PB배지에서 대량 배양하여 pH를 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 14는 본 발명의 일 실시예에 따른 바실러스 벨레젠시스 CE 100 균주의 대량 배양 PB 배지 유래 배양여과액의 다양한 농도에서의 균사체 성장 억제 정도를 나타낸 그래프이다.
도 15은 본 발명의 일 실시예에 따른 바실러스 벨레젠시스 CE 100 균주의 대량 배양 PB 배지(LP-CE) 유래 배양여과액의 다양한 농도에서의 균사체 성장 억제 정도를 육안으로 관찰한 결과를 나타낸 사진이다.
도 16은 본 발명의 일 실시예에 따른 바실러스 벨레젠시스 CE 100 균주 배양여과액 10%(a), 30%(b), 50%(c), 70%(d)에서의 분생 포자 발아 억제율을 나타낸 그래프이다.
도 17은 본 발명의 일 실시예에 따른 바실러스 벨레젠시스 CE 100 균주 배양여과액 (a) 10%, (b) 30%, (c) 50% 및 (d) 70%에서의 분생 포자 발아 결과를 나타낸 사진이다.
도 18은 본 발명의 일 실시예에 따른 바실러스 벨레젠시스 CE 100 균주의 효소 활성을 정성적으로 확인한 결과를 나타낸 사진이다.
도 19는 본 발명의 일 실시예에 따른 바실러스 벨레젠시스 CE 100 균주의 온도 조건에 따른 키티나아제 활성을 나타낸 그래프다.
도 20은 본 발명의 일 실시예에 따른 바실러스 벨레젠시스 CE 100 균주의 온도 조건에 따른 글루카나아제 활성을 나타낸 그래프다.
도 21은 본 발명의 일 실시예에 따른 바실러스 벨레젠시스 CE 100 균주의 온도 조건에 따른 프로테아제 활성을 나타낸 그래프이다.
도 22는 본 발명의 일 실시예에 따른 바실러스 벨레젠시스 CE 100 균주의 pH 조건에 따른 키티나아제 활성을 나타낸 그래프이다.
도 23은 본 발명의 일 실시예에 따른 바실러스 벨레젠시스 CE 100 균주의 pH 조건에 따른 글루카나아제 활성을 나타낸 그래프이다.
도 24는 본 발명의 일 실시예에 따른 바실러스 벨레젠시스 CE 100 균주의 pH 조건에 따른 키티나아제 활성을 나타낸 그래프이다.
도 25는 본 발명의 일 실시예에 따른 바실러스 벨레젠시스 CE 100 균주의 사이더포어의 생산을 확인한 결과를 나타낸 사진이다.
도26은 본 발명의 일 실시예에 따른 바실러스 벨레젠시스 CE 100 균주 (a) 1:5 희석 배양액, (b) 1:3 희석 배양액 및 (c) 희석하지 않은 배양액을 처리한 다이아포르테 사이트리 감염 잎에 대한 결과를 나타낸 사진이다.
도 27은 본 발명의 일 실시예에 따라 화분에 심어진 나무에 바실러스 벨레젠시스 CE 100 균주(CE) 또는 항진균제를 처리한 결과를 나타낸다.
도 28은 본 발명의 일 실시예에 따라 화분에 심어진 나무에 바실러스 벨레젠시스 CE 100 균주(CE) 또는 항진균제를 처리한 후의 검은점무늬병 발생율을 나타낸 그래프이다.
바실러스 벨레젠시스 (Bacillus velezensis) CE 100 KACC 81101BP.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
준비예 1. 박테리아 균주의 준비 및 동정
박테리아 균주로 바실러스 벨레젠시스 CE 100 (Bacillus velezensis CE 100, 토마토 화분(pot) 실험에 쓰인 토양에서 분리한 균주; 이하, CE 100 균주) 균주를 사용하였다. 도 1a 및 도 1b에서와 같이, 상기 CE 100 균주를 트립톤 소이빈 한천배지 (tryptone soybean agar; TSA)에 선상도말 (streak) 하여 순수한 배양균 (pure colonies)을 획득하였다. 그 다음, 획득한 배양균을 트립톤 소이 액채 배지 (Tryptone soy broth; TSB)에서 3일 동안 30 ℃ 및 130 rpm으로 쉐이킹 인큐베이터 (shaking incubator)를 이용해 배양하였다. 그 결과물인 박테리아 배양액을107 CFUs/mL로 조정하였으며, 추가실험을 위해 50%(v/v) 글리세롤(glycerol)로 처리하여 -80℃로 냉동보관 하였다. CE 100 균주의 16s rRNA 염기서열을 바탕으로 계통 분석한 결과를 도 2에 나타내었다.
서열번호 명명 서열목록 (5' -> 3') 비고
1 CE 100 16s rRNA AGAGATAGGACGTCCCCTTCGGGGGCAGAGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGATCTTAGTTGCCAGCATTCAGTTGGGCACTCTAAGGTGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGACAGAACAAAGGGCAGCGAAACCGCGAGGTTAAGCCAATCCCACAAATCTGTTCTCAGTTCGGATCGCAGTCTGCAACTCGACTGCGTGAAGCTGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGAGAGTTTGTAACACCCGAAGTCGGTGAGGTAACCTTTATGGAGCCAGCCGCCGAAGGTGGGACAGATGATTGGGGTGAAGTCGTAACAAGGTAGCCGTATCGGAAGGTGCGCTGAACCCCCCCC
준비예 2. 병원성 진균의 준비
감귤류 (citrus)에서 검은점무늬병 (melanose)을 일으키는 병원성 진균 (fungal pathogen)인, 다이아포르테 사이트리 F.A. Wolf (농업미생물은행(KACC), 접근번호 45782)는 감자 포도당 한천배지 (potato dextrose agar; 이하, PDA)에서 26℃에서 14일 동안 계대배양 하였다. 그 다음, 상기 다이아포르테 사이트리의 분생포자 현탁물 (conidial suspension)을 Ko et al, 2012에서 기술한 방법으로 준비하였다. 멸균 코르크 보어 (Cork borer)를 사용하여 5 mm 직경의 균사체 플러그 (mycelial plug)를 채취한 다음, PDA에서 26℃로 14일 동안 배양하였다. 분생포자의 발생을 유도하기 위하여 진균 플러그 (fungal plug)를 오트밀 한천배지 (oat meal agar; 이하, OA)에 접종하여 26℃로 14일 동안 배양 후, 실온 형광등 조건으로 14일 동안 배양하였다. 그 후, 완전히 포화된 플레이트에 10 ml 멸균 증류수를 첨가하여 멸균 주걱 (spatula)를 이용하여 균사체 (mycelium)를 긁어냈다. 수득된 분생포자는 멸균된 미라클로스 (miracloth; CALBIOCHEM)를 이용해 여과하였다. 분생포자의 수는 현미경 (Olympus BX41, Japan)하에서 150x 배율로 헤모사이토미터 (hemocytometer)를 이용하여 측정하였고, 1.0×108 conidia/ml로 조정하였다.
준비예 3. 감귤나무 재배 방법
3년된 감귤나무 묘묙 (mandarin seedlings, Jeju Island, South Korea)을 토양 (bed soil), 질석(vermiculite) 및 화강암 조각(granite fragments)을 2:1:1 부피비로 함유한 배양토를 플라스틱 화분 (30 cm X 25 cm)에 담은 후 심었다. 감귤나무 묘목은 전남대학교에서 1년간 온실 상태에서 재배되었으며, 1주일 간격으로 물을 주었다.
준비예 4. 저비용 배지와 배양기의 준비
박테리아 균주를 저비용으로 대량 배양하기 위해, 탄소원 및 무기염류 등을 포함하는Pink-Brown (PB) 배지를 박테리아 균주의 대량 증식을 위해 사용하였다. 또한, 균주의 대량생산을 위해 저가의 배양기 (1 톤, 모델명: M-1000, MC-biotec, 대한민국)를 개발하였다. 실험은 M-1000 배양기와 500L의 비멸균 PB배지를 이용하여 수행하였다. PB 배지에서 CE 100 균주는 25 ℃내지 50 ℃ 및 4 내지 10 pH범위에서 배양 가능하였다 (도 3 및 도 4).
실시예 1. CE 100 균주의 길항 작용의 검정
CE 100 균주의 길항 작용을 대치 배양법 (Yoon et al., 2012)을 통해 검정하였다. 바실러스 균주는 각 PDA 플레이트의 한쪽 면에 선상도말 하였으며, 하기 표 1에 기재된 다양한 균류 플러그를 CE 100 균주가 도말된 플레이트의 다른 면에 접종하였다. 병원성 진균만 접종한 플레이트를 대조군으로 하였다. 상기 플레이트를 25℃로 14일 동안 배양하였다.
세균성 병원체의 억제를 관찰하기 위해, TSA 배지에 10uL의 펙토박테리움 카로토보룸 (Pectobacteriumcarotovorum)을 107 CFU/mL로 도말하였고, 병원체 접종 플레이트 중앙에 CE 100 균주를 107 CFU/mL로 도말하였다. CE 100 균주의 집락 주변의 억제 구역 (inhibition zone)은 접종 4일 후에 관찰하여, 그 결과를 도 5에 나타내었으며, 병원성 진균 및 세균의 성장 억제는 하기 계산식을 이용하여 계산하여, 그 결과를 표 2 및 도 6에 나타내었다.
[계산식 1]
Figure PCTKR2020001218-appb-I000002
병원성 진균/세균 처리 균주 억제율(%) 항진균/항균 활성
D.citri B.velezensis CE 100 73.81±0.0 +++
S.sclerotiorum 49.72±0.0 +
S.cepivorum 76.35±4.2 +++
M.fructicola 56.52±0.0 ++
Phoma spp. 60.68±3.9 ++
B.cinerea 52.83±0.0 ++
C.acutatum 61.21±2.1 ++
B.fuckeliana 55.83±1.8 ++
C.destructans 53.66±2.1 ++
P.infestans 77.53±2.0 +++
S.glycines 55.26±9.5 ++
G.cingulata 39.74±2.9 +
F.oxysporum 46.70±2.5 +
F.solani 46.11±2.6 +
P.nicotianae 70.07±3.1 +++
R.solani 54.97±2.4 ++
P.grisea 48.41±1.4 +
P.drechsleri 62.00±4.0 ++
B.dothidea 55.77±3.3 ++
C.gloeosporioides 56.41±2.9 ++
F.graminearum 57.05±1.1 ++
P.capsici 30.77±4.0 +
A.porri 56.41±0.0 ++
(-)30% 이하의 억제율, (+) 30 %에서 50%사이의 억제율, (++) 50 %에서 70 % 사이의 억제율, (+++) 70%에서 100% 사이의 억제율
도 5 내지 도 6 및 표 2에서 확인할 수 있듯이, CE 100 균주는 다이아포르테 사이트리를 포함하는 다양한 병원성 진균 원인체 및 세균성 병원체의 성장 억제 효과가 있음을 확인하였다.
실시예 2. CE 100 균주의 진균성 병원체에 대한 성장 억제검정
CE 100 균주에 의해 생성되는 휘발성 화합물의 균사체 성장억제는 휘발성 플레이트 분석 (volatile plate assay)을 통해 확인하였다. 구체적으로, PBA 배지에 50 uL의 CE 100 균주 배양액을 107 CFU/mL로 분주하였다. 그 후, 하기 표 2에 기재된 각 병원체의 균사체 플러그를 PDA 배지 중앙에 접종하였고, 병원체를 접종한 플레이트를 뒤집어 CE 100 균주 플레이트와 마주보게 두었다. 그 후, 상기 플레이트를 테이프를 이용하여 봉인하고, 26℃에서 각 병원성 진균의 성장정도에 따라 3일에서 20일까지 배양하였다. 그 후, 각 병원체의 균사체 및 균사 성장 억제 정도를 측정하여, 그 결과를 표 3 및 도 7에 나타내었다.
또한, 각 플레이트균사체의 균사 변형 (hyphal deformation of the mycelium)은 현미경 (Olympus BX41, Japan)을 이용하여 확인하여, 그 결과를 도 8 및 도 9에 나타내었다.
병원성 진균/세균 처리 균주 억제율(%) 항진균/항균 활성
D.citri B.velezensis CE 100 00.00±0.0 -
S.sclerotiorum 18.39±7.8 -
S.cepivorum 40.00±14.9 +
M.fructicola 2.40±1.3 -
Phoma spp. 32.93±8.5 +
B.cinerea 40.84±0.5 +
C.acutatum 14.29±1.7 -
B.fuckeliana 36.07±8.7 +
C.destructans 17.45±12.3 -
P.infestans 32.11±5.7 +
S.glycines 26.61±1.6 -
G.cingulata 34.68±0.9 +
F.oxysporum 13.37±4.8 -
F.solani 5.78±2.7 -
P.nicotianae 0.00±0.0 -
R.solani 18.47±4.8 -
P.grisea 10.40±0.4 -
P.drechsleri 26.94±3.1 -
B.dothidea 25.12±2.2 -
C.gloeosporioides 32.80±3.3 +
F.graminearum 13.59±8.1 -
P.capsici 3.31±3.0 -
A.porri 50.61±11.1 ++
P.carotovorum 00.00±0.0 -
(-)30% 이하의 억제율, (+) 30 %에서 50%사이의 억제율, (++) 50 %에서 70 % 사이의 억제율, (+++) 70%에서 100% 사이의 억제율
표 3 및 도 7에서 확인할 수 있듯이, 휘발성 플레이트 분석 결과는 CE 100 균주가 다양한 식물병원균에 대해 강한 억제 활성을 가지는 것을 보여준다. 또한, 도 8 및 도 9에서 확인할 수 있듯이, CE 100 균주가 생산한 휘발성 화합물에 의해 병원체 균사의 형태는 균사의 가지를 따라 뒤틀리는 형상을 나타내었다. 이는 대조군인 정상 균사와 비교했을 때 처리 군의 균사는 비정상인 구조를 나타낸 것이다.
실시예 3. CE 100 균주와 펙토박테리움 카로토보룸 ( Pectobacterium carotovorum )의 공동 배양을 통한 CE 100 균주의 세균 성장 억제 능력 검정
다른 세균의 존재 하에 그 세균의 성장을 억제하는 CE 100 균주의 경쟁능력을 입증하기 위해 TSB배지에 CE 100 균주와 박테리아 병원체인 펙토박테리움 카로토보룸을 공동접종 하였다.
구체적으로, 100 uL CE 100 균주 108 CFU/mL와 150 uL 펙토박테리움 카로토보룸 108 CFU/mL를 TSB배지에서 130rpm으로 30℃에서 6일 동안 배양하였다. 각각의 세균을 단독으로 접종한 TSB배지를 대조군으로 사용하였다. 매일 시료를 채취하여 두 개의 세균의 수를 CFU/mL로 측정하여, 그 결과를 도 10a 내지 도 10c 및 표 4 내지 표 6에 나타내었다.
또한, CE 100 균주와 펙토박테리움 카로토보룸을 TSA배지에 공동접종하여 배양하였다. 각각의 세균을 단독으로 접종한 TSA배지를 대조군으로 사용하였다. 접종 후 매일 집락의 성장정도를 관찰하여, 그 결과를 도 11a 내지 도 11c에 나타내었다.
Day (s) after co-inoculation Log CFU mL-1
B. velezensis CE 100 P. carotovorum
0 5.85 6.53
1 6.43 8.17
2 5.92 7.98
3 5.71 5.6
4 7.60 0
5 8.30 0
6 8.45 0
Day (s) after co-inoculation P. carotovorum (Log CFU mL-1)
0 6.78
1 8.40
2 8.80
3 8.92
4 8.83
5 8.58
6 8.42
Day (s) after co-inoculation B. velezensis CE 100 (Log CFU mL-1)
0 6.03
1 6.08
2 6.71
3 8.51
4 8.27
5 8.15
6 8.30
도 10a 및 표 4에서 확인할 수 있듯이, 펙토박테리움 카로토보룸은 2일차부터 그 수가 감소하기 시작하여 4일차에는 관찰되지 않는 양상을 보였다. 또한, 도 11에서 확인할 수 있듯이, 펙토박테리움 카로토보룸 단독으로 접종한 배지에서와는 달리 CE 100 균주와의 공동배양을 통해 펙토박테리움 카로토보룸의 성장이 억제되는 양상을 보였다.
실시예 4. CE 100 균주의 대량 배양에서의 pH변화와 성장 패턴 확인
배양일에 따른 대량 배양(현장 수준)에서의 pH 변화와 균의 성장의 패턴을 확인하기 위해, CE 100 균주 100 ul (107 CFUs/mL)를 1% TSA 플레이트 (직경 150 mm)에 멸균 유리 비드 (sterile glass beads)를 사용하여 분주하였고, 3일 동안 30℃에서 배양하였다. 균주 플레이트에서 획득한 배양균을 비멸균 PB 배지 500 L를 이용하여, 중온성 세균의 성장을 억제하기 위한 50℃ 조건에서 각각 다른 배양기에서 배양하였다. 각각의 배양기에서 채취된 시료를 10일 동안 매일 세포수 및 pH 변화를 관찰하였다. CE 100 균주의 대량 배양기에서의 성장 정도를 날짜별로 측정한 결과를 도 12에서 나타내었으며, CE 100 균주의 PB배지에서 대량 배양하여 CFU/ml및 pH로 측정한 결과를 도 13에 나타내었다.
도 12에서 확인할 수 있듯이, CE 100 균주의 성장은 배양 3일차에 2.67x 105 CFUs/mL로 최대 성장하였다. 또한, 도 13에서 확인할 수 있듯이, CE 100 균주의 성장은 전체 실험과정 동안 비교적 일정하게 유지되는 양상을 나타내었다. CE 100 균주가 배양된 배지의 PH는 1일차에 최저점인 pH 4.75까지 도달하고, 그 후 꾸준히 증가하여 pH 5.86까지 도달하였다.
실시예 5. CE 100 균주 배양 여과액의 진균 균사체 성장 억제 검정
표적 병원성 진균의 균사체(Mycelial) 성장 억제를 확인하기 위해, 소량 배양 및 대량 배양 단계에서 획득한 5, 7, 및 10 일째의 세균 배양액을 12,000rpm, 15분 동안 원심분리하여 상층액을 획득하고, 그 상층액을 Whatman filter paper No.6를 이용하여 여과하였다. 남아 있는 살아있는 균들은 주사기용 여과기 (syringe filter)를 이용하여 완전히 제거하였다. 생성된 배양 여과액을 미리 오토클레이브한 PDA배지와 혼합하여 최종 농도를 10%, 30%, 50%로 하고 60℃로 온도를 조정하였다. 그 후, 직경 2mm의 다이아포르테 사이트리 진균 플러그 (fungal plug)를 각 플레이트의 중앙에 접종하였다. 배양 여과액 없는(0%) PDA 플레이트에서 자란 병원체를 대조군으로 사용하였다. 균사체 성장 억제는 접종 후14일 동안 측정되었고, 억제 퍼센트는 하기 계산식을 기초로 하여 결정하였다. 또한, 각 플레이트 균사체의 균사 변형 (hyphal deformation of the mycelium)은 현미경 (Olympus BX41, Japan)을 이용하여 확인하여, 그 결과를 도 14 내지 도 15 및 표 7에 나타내었다.
[계산식 2]
Figure PCTKR2020001218-appb-I000003
C: 대조군에서의 진균 콜로니의 직경
T: 처리군에서의 진균 콜로니의 직경
BCF concentration Mycelial growth inhibition (%)
5 Days BCF 7 Days BCF 10 Days BCF
10% 47.17 43.95 52.01
30% 55.64 54.03 49.59
50% 62.01 63.31 59.27
도 14 내지 도 15및 표 7에서 확인할 수 있듯이, 다이아포르테 사이트리 균사체의 성장이 상술한 방법으로 제조된 다양한 농도의 배양 여과액에 의해 억제됨을 확인하였다. 대량 배양된 PB 배지의 배양 여과액은 농도 증가에 따라 억제 수준도 증가하였다. 특히, 5일차 및 7일차 LP-CE 유래 50% BCF (bacterial culture filtrates) 처리군에서 각각 59.27% 및 63.31%의 억제율을 보였다. 7일차 ST-CE 유래 50% BCF 처리군에서는 63.31%의 억제율을 보였다.
또한, 현미경으로 관찰한 결과, CE 100 균주 배양 여과액을 처리한 병원체 균사 (hyphal)의 형태는 팽창하고 균사의 가지를 따라 뒤틀리는 형상을 나타내었다. 이는 대조군인 정상 균사와 비교했을 때 처리군의 균사는 비정상인 구조를 나타낸 것이다.
실시예 6. CE 100 균주 배양 여과액의 분생포자 발아 억제 검정
다이아포르테 사이트리 분생포자 발아 (conidial germination)의 억제를 조사하기 위해, 대량 배양단계에서 얻어진 박테리아 배양 여과액을 오토클레이브한 PDB (Potato Dextrose Broth)액체배지와 혼합하여 최종 농도를 10%, 30%, 50% 및 70%로 하였다. 그 후, 1.0 x 106 분생포자/ml의 100uL 다이아포르테 사이트리 분생포자 현탁물 (conidial suspension)을 각각의 튜브에 접종하여, 총 부피가 1 mL가 되도록 하였다. 박테리아 배양 여과액 없는 PDB 액체배지에 접종된 분생포자 현탁물을 대조군으로 하였으며, 같은 실험을 총 3회 수행하였다. 발아된 분생포자의 수는 현미경 (Olympus BX41, Japan) 하에서 150x 배율로 헤모사이토미터를 이용하여 측정하였고, 발아 억제 퍼센트는 하기 식을 이용하여 계산하였으며, 그 결과를 표 8 및 도 16 내지 도 17에 나타내었다.
[계산식 3]
Figure PCTKR2020001218-appb-I000004
GC: 대조군에서의 발아수준(%)
GT: 처리군에서의 발아수준(%)
배양 여과액 포자 발아 억제율(%)
10% 30% 50% 70%
B. velezensis CE 100 9.27 29.85 86.71 98.3
대조군 0
표 8 및 도 16 내지 도 17에서 확인할 수 있듯이, 바실러스 벨레젠시스 CE 100의 배양 여과액이 D.citri분생포자의 발아에 강한 억제효과를 나타내는 것을 보여주었다. 배양 여과액의 농도는 발아 억제 수준에 영향을 준다. CE 100 균주는 가장 높은 농도(70 %)를 사용하는 경우에 96% 이상의 발아 억제율을 나타내었다. 배양 여과액의 분생포자 발아 억제는 농도의존적이며, 이는 대조군의 경우 24시간 후에 분생포자가 100% 발아한 것과는 분명한 차이가 있는 것이다. 상기 결과는 포자발아 억제효과가 배양여과액에 포함된 다양한 항진균 대사 산물과 용해 효소 활성과 관련이 있음을 시사한다.
실시예 7. CE 100 균주의 효소 활성 분석
다양한 효소 활성을 관찰하기 위한 배지를 제조하기 위해 2% 한천과 다양한 기질 (예를 들어, 프로테아제 활성 확인을 위한 2% 카제인, 아밀라아제 활성 확인을 위한 2% 전분, 글루카나아제 활성 확인을 위한 1% 라미나린, 키티나아제 활성 확인을 위한 1% 콜로이드성 키틴)을 혼합하였다. 셀룰라아제 배지는 셀룰로오스 0.5g, 콩고 레드 0.1g, 리터 당 한천 20 g을 사용하여 제조하였다. 리파아제 활성 검출에 사용할 배지를 페놀레드 0.1 g, 한천 20 g, 리터 당 올리브 오일 20ml (PH 7.3)를 사용하여 제조하였다.
상술한 각 한천 배지에CE 100 균주 5uL (107CFU/mL)를 각 배지의 중앙에 접종하여 30℃에서 3일동안 배양하였다. 그 후, 플레이트에 요오드 용액(요오드 1g, 요오드화 칼륨 5g, 증류수 330 ml)을 첨가하였다. 웰 주변의 투명대 (clear zone)의 발달은 각 효소의 활성을 나타낸다.
또한, 키티나아제, 글루카나아제 및 프로테아제의 활성을 다양한 pH 및 온도 조건에서 UV 분광기 (UV spectrophotometer)를 이용하여 정량적으로 분석하였다. 30℃에서 TSA 배지에 CE 100 균주 5uL (107CFU/mL)를 접종하여 동일한 집락 (colony)을 배양하였다. 그 후, 각 집락을 다양한 온도 (30, 40 및 50 ℃) 및 pH (6, 7 및 8) 조건을 가지는 PB 배지에 접종하였다. 그 후, 효소활성을 10일 동안 매일 측정하였다. CE 100 균주의 효소 활성을 정성적으로 확인한 결과를 도 18에 나타내었다. CE 100 균주의 온도에 따른 효소활성을 도 19 내지 도 21 및 표 9 내지 표 11에 나타내었으며, pH에 따른 효소활성을 도 22 내지 24 및 표 12 내지 표 14에 나타내었다.
Day (s) after inoculation Chitinase activity (U/mL)
30°C 40°C 50°C
1 46.29 ± 3.73 52.61 ± 7.92 24.48 ± 7.07
2 52.33 ± 6.19 54.03 ± 7.25 50.01 ± 5.16
3 33.03 ± 4.48 32.72 ± 4.09 33.51 ± 6.81
4 42.84 ± 2.36 40.52 ± 1.20 43.79 ± 1.94
5 47.42 ± 6.84 37.04 ± 6.54 60.44 ± 9.81
6 41.08 ± 3.66 41.14 ± 2.51 58.37 ± 3.30
7 33.95 ± 3.81 51.17 ± 1.31 73.08 ± 0.00
8 17.07 ± 4.77 43.29 ± 3.11 70.02 ± 1.54
9 11.56 ± 4.67 32.00 ±5.16 63.24 ± 1.24
10 13.66 ± 1.41 24.31 ± 3.26 58.79 ± 6.81
Day (s) after inoculation β-1,3-Glucanase activity (U/mL)
30°C 40°C 50°C
1 4.50 ± 0.33 5.38 ± 0.06 3.41 ± 0.25
2 4.62 ± 0.43 5.38 ± 0.18 4.11 ± 0.90
3 5.29 ± 1.12 5.41 ± 1.10 5.00 ± 0.71
4 4.55 ± 0.40 4.42 ± 0.28 4.40 ± 0.97
5 4.26 ± 0.40 4.13 ± 0.18 4.38 ± 0.81
6 3.85 ± 0.39 3.63 ± 0.23 3.98 ± 0.75
7 3.76 ± 0.21 3.79 ± 0.13 3.96 ± 0.40
8 3.61 ± 0.28 3.61 ± 0.19 3.86 ± 0.44
9 3.47 ± 0.28 3.47 ± 0.24 3.86 ± 0.67
10 3.77 ± 0.06 3.86 ± 0.01 4.32 ± 0.49
Day (s) after inoculation Protease activity (U/mL)
30°C 40°C 50°C
1 15.55 ± 1.87 15.77 ± 1.14 0.36 ± 0.30
2 13.10 ± 1.42 11.58 ± 0.72 0.95 ± 0.12
3 29.24 ± 0.67 21.19 ± 1.04 0.40 ± 0.17
4 25.59 ± 1.84 13.85 ± 2.33 1.45 ± 0.14
5 12.77 ± 3.57 3.94 ± 1.35 0.62 ± 0.23
6 16.04 ± 1.71 2.14 ± 1.07 1.23 ± 0.21
7 8.99 ± 0.62 2.34 ± 0.78 1.60 ± 0.23
8 8.45 ± 0.34 2.51 ± 0.74 1.64 ± 0.23
9 10.00 ± 0.89 2.52 ± 0.22 2.11 ± 0.24
10 8.49 ± 1.48 2.86 ± 0.72 1.96 ± 0.07
Day (s) after inoculation Chitinase activity (U/mL)
pH 6 pH 7 pH 8
1 80.07 ± 7.05 22.28 ± 2.65 20.85 ± 4.44
2 96.11 ± 9.41 62.39 ± 16.51 63.29 ± 11.58
3 87.08 ± 7.85 61.72 ± 17.27 61.24 ± 13.45
4 71.56 ± 5.05 52.45 ± 9.12 50.28 ± 3.22
5 80.38 ± 4.12 73.01 ± 13.12 50.72 ± 10.10
6 70.35 ± 2.94 69.99 ± 16.52 53.00 ± 17.88
7 73.70 ± 4.32 77.10 ± 3.38 51.57 ±16.49
8 71.09 ± 4.28 70.82 ± 8.14 52.60 ±17.35
9 72.35 ± 4.35 61.50 ± 10.86 49.86 ± 19.95
10 75.63 ± 4.69 53.43 ± 20.35 49.79 ± 18.67
Day (s) after inoculation β-1,3-Glucanase activity (U/mL)
pH 6 pH 7 pH 8
1 6.50 ± 0.64 3.83 ± 0.05 3.71 ± 0.05
2 6.66 ± 0.76 4.35 ± 0.67 4.19 ± 0.43
3 5.34 ± 1.56 4.75 ± 1.54 4.63 ± 1.29
4 5.21 ± 0.27 4.37 ± 0.36 4.45 ± 0.25
5 5.42 ± 0.09 5.09 ± 0.48 4.24 ± 0.19
6 5.14 ± 0.17 4.90 ± 0.54 4.41± 0.38
7 5.25 ± 0.30 5.19 ± 0.03 4.25 ± 0.62
8 5.12 ± 0.30 4.84 ± 0.41 4.12 ± 0.65
9 4.38 ± 0.16 3.99 ± 0.28 3.62 ± 0.43
10 4.64 ± 0.24 4.09 ± 0.42 3.75 ± 0.35
Day (s) after inoculation Protease activity (U/mL)
pH 6 pH 7 pH 8
1 4.70 ± 0.80 3.38 ± 0.39 4.11 ± 0.07
2 4.16 ± 0.16 3.87 ± 0.21 4.53 ± 0.27
3 3.98 ± 0.25 4.03 ± 0.55 4.76 ± 0.09
4 3.98 ± 0.27 3.91 ± 0.84 4.63 ± 0.26
5 4.53 ± 0.01 4.74 ± 0.33 4.91 ± 0.17
6 4.75 ± 0.28 4.49 ± 0.33 4.90 ± 0.10
7 5.54 ± 0.37 5.25 ± 0.43 5.72 ± 0.24
8 4.00 ± 0.18 3.56 ± 0.28 4.29 ± 0.28
9 5.20 ± 0.48 4.43 ± 0.60 5.12 ± 0.65
10 5.14 ± 0.40 4.38 ± 0.50 5.30 ± 0.37
도 18에서 확인할 수 있듯이, CE 100 균주는 글루카나아제, 프로테아제, 키티나아제, 리파아제 및 셀룰라아제 활성을 나타냈으며, 아밀라아제 활성은 나타내지 않았다.
도 19 및 표 9에서 확인할 수 있듯이, 키티나아제 활성은 50 ℃에서 가장 높은 활성을 나타냈으며 각 온도별로 배양 5일차 및 7일차에서 가장 높은 활성을 나타내었다. 또한, 도 20 및 표 10에서 확인할 수 있듯이, 글루카나아제 활성은 40 ℃에서 가장 높은 활성을 나타냈으며, 각 온도 별로 3일차에 최고 활성을 나타내고 점차 감소하는 양상을 보였다. 또한, 도 21 및 표 11에서 확인할 수 있듯이, 프로테아제 활성은 30 ℃에서 가장 높은 활성을 나타냈으며, 50 ℃ 에서는 거의 활성을 나타내지 않았다. 30 ℃ 및 40 ℃에서 배양한 결과는 3일차에 가장 높은 활성을 나타냈으며 이후로는 활성이 점차 감소하는 양상을 보였다.
도 22 및 표 12에서 확인할 수 있듯이, 키티나아제 활성은 pH6에서 가장 높은 활성을 나타냈으며 각 온도 별로 배양 2일차 및 7일차에 가장 높은 활성을 나타내었다. 또한, 도 23 및 표 13에서 확인할 수 있듯이, 글루카나아제 활성은 pH 6에서 가장 높은 활성을 나타냈으며, pH 수치에 관계없이 3일차 이후로는 비슷한 활성 수준을 나타내었다. 또한, 도 24 및 표 13에서 확인할 수 있듯이, 프로테아제 활성은 pH 8에서 가장 높은 활성을 나타냈으며, pH 수치에 관계없이 8일차에 가장 높은 활성을 나타내었다. 또한, 프로테아제 활성은 pH 수치나 배양일차에 관계없이 전반적으로 일정한 활성 정도를 보였다.
실시예 8. CE 100 균주의 사이더포어 생산 확인
CE 100 균주에 의해 생산되는 철 킬레이트화제인 사이더포어 (siderophore)의 생산을 확인하기 위해 CAS (chromeazurol S) 한천배지를 이용하였다. 구체적으로, CE 100 균주 배양액을 CAS한천 배지에 접종하고 30℃에서 5일 동안 배양하였다. CE 100 균주 집락 주변으로 주황색으로 변색하는 것은 사이더포어의 생산을 의미한다. CE 100 균주의 사이드포어 생산여부를 확인한 결과를 도 25에 나타내었다.
도 25에서 확인할 수 있듯이, CE 100 균주를 접종한 곳 주변이 주황색으로 변색하는 것으로 보아 CE 100 균주가 사이더포어를 생산한다는 것을 알 수 있다. 사이더포어 (Siderophores)는 CE100 균주가 철분을 킬레이트 할 때 생성하는 물질이 이며, 이 물질을 생성하여 철분을 쉽게 흡수하며 병원성 균주 (철분을 필요로 함)가 철분을 흡수하기 전 먼저 빨리 흡수하여 병원성 균주가 철분 흡수하는 것을 방해하며, 면역체계에서 병원균 침입을 방해하는 혹은 감소하게 하는 것을 유도한다고 알려져 있다.
실시예 9. CE 100 균주 배양여과액의 정성적 효소 활성 분석
실시예 7에서 설명한 각 한천 배지에 8mm 웰을 만들고 대량 배양이기의 7일차 배양액에서 여과된 박테리아 배양 여과액 100uL를 각 배지에 접종하여 30 ℃에서 1일 동안 배양하였다. 그 후, 플레이트에 요오드 용액 (요오드 1g, 요오드화 칼륨 5g, 증류수 330 ml)을 첨가하였다. 웰 주변의 투명대 (clear zone)의 발달은 각 효소의 활성을 나타낸다. CE 100 균주의 대량 배양에서 얻은 배양 여과액의 효소 활성을 정성적으로 확인하여, 그 결과를 표 15에 나타내었다.
배양여과액 효소
아밀라아제 셀룰라아제 키티나아제 글루카나아제 프로테아제 리파아제
CE 100 - + + + + +
(+): 효소 활성; (-): 효소비활성
표 15에서 확인할 수 있듯이, CE 100 균주의 배양 여과액은 5가지 효소 활성 (글루카나아제, 프로테아제, 키티나아제, 리파아제 및 셀룰라아제)을 나타냈으며, 아밀라아제 활성은 나타내지 않았다.
실시예 10. CE 100 균주 배양여과액의 검은점무늬병 방제 효과 검정
10-1. 감귤 나무 잎
다이아포르테 사이트리에 대한 CE 100 균주 배양액의 생체 방어 활성을 확인하기 위해 예비 잎 실험 (preliminary leaf experiment)을 수행하였다. 대량 배양 과정을 통해 얻은 CE 100 균주 배양액과 증류수를 혼합하여 1:3, 1:5의 비율의 배양액을 제조하였다. 감귤 나무에서 분리한 어린 잎을 각 배양액에 30분 동안 침지하고 2시간동안 공기 건조하였다. 증류수에 침지한 잎을 대조군으로 사용하였다. 그 후, 배양액 및 증류수에 침지하여 얻은 잎을 다이아포르테 사이트리의 분생 현탁액 (1.0 x 106분생포자/mL)에 30분간 침지하고, 암실 조건 하에서 25 ℃의 플라스틱 용기에 7일간 보관하였다. 진균 감염을 위한 습도 유지와 건조상태로부터 잎을 보호하기 위해, 젖은 멸균 페이퍼 타월을 용기에 함께 보관하였다. 균류 (fungal) 포자 접종 후 7일째에 잎의 갈색 병변의 발생을 검사하여, 그 결과를 도 26에 나타내었다.
도 26a에서 확인할 수 있듯이, 대조군의 경우에는 약 90%의 잎이 감염되었다. 또한, 도 26b에서 확인할 수 있듯이, 5배 희석한 배양액의 경우에도 감염은 심각한 양상을 보였다. 그러나, 도 26c에서 확인할 수 있듯이, 3배 희석한 배양액에서는 일부 잎에서만 감염을 나타내었다. 또한, 도 26d에서 확인할 수 있듯이, 희석을 하지 않은 배양액의 경우에는 질병의 증상을 나타내지 않았다. 상기 결과로부터 질병의 방제 값(%)는 배양액의 희석정도에 의존한다는 사실을 알 수 있다. 감귤류 나무 잎에서는 배양액의 희석 정도가 높을수록 질병의 방제율은 낮아졌다.
10-2. 감귤 나무
화분에서 자란 동일한 4년생 감귤나무를 사용하였다. 모든 잎과 작은 가지가 제거된 각 감귤나무를 전남대학교의 온실에서 재배하였다. 감귤나무에 새로운 잎이 돋아날 때, 검은점무늬 방제를 위한 실험에 이용하였다.
실험을 위해 네 가지 종류의 처리군 [CE 100대량 배양액 (CE), 합성 항진균제(F) 및 대조군(Con)]을 사용하였고, 각 감귤나무를 무작위로 정렬하였다. CE 100 균주를 PB배지 및 대량 배양이기를 이용하여 7일 동안 50 ℃에서 배양하였다. 각 박테리아 배양액 2.0 X 105 CFU/mL을 증류수를 이용해 희석 (1:1, v:v)하였고, 상기 배양액을 잎 표면에 처리하여 2시간 동안 공기 건조하였다. 제품화된 합성 항진균제인 디티아논 (dithiano)을 제조사의 권장 사항에 따라 잎에 처리한 후 2시간 동안 공기 건조하였다. 잎에 물을 처리한 군을 대조군으로 이용하였다. 그 후, 다이아포르테 사이트리의 분생포자 현탁물 (1.0 x 106분생포자/mL)을 잎의 표면에 처리하였다. 접종된 식물을 28 ± 2 ℃및 60% 상대습도에서 재배하였다. 검은점무늬병의 발병은 다이아포르테 사이트리의 분생포자 현탁물 처리 20일 후에 조사하였다. 질병 발생률은 각 처리 식물에 갈색 병변과 함께 가장자리에 노란색 경계가 있는 잎의 수를 세어 측정하여, 그 결과를 도 27 내지 도 28 및 표 16에 나타내었다.
Treatment Disease incidence (%)
Control 46.28 ± 9.55
CE 100 9.32 ± 1.22
F 3.51± 1.78
도 27에서 확인할 수 있듯이, CE 100 균주의 감귤나무에 대한 엽면살포 (foliar spray)는 다이아포르테 사이트리에 의한 검은점무늬병에 대한 방제에 뛰어난 효과가 있음을 확인하였다.
또한, 도 28 및 표 16에서 확인할 수 있듯이, 제품화된 항진균제를 처리한 감귤나무의 경우 가장 낮은 질병 발생 (3.51%)을 보였다. 병원체 접종 20일차에CE 100 균주를 처리한 군에서(9.32% 및 11.25%) 대조군(46.28%)과 비교했을 때 질병 발생율이 감소한 양상을 보였다.
즉, 상기 결과를 통해 실제 판매되는 항진균제와 CE 100 균주의 경우 검은점무늬병 방제에 있어 비슷한 효과를 발휘한다는 사실을 알 수 있다.
본 발명은 바실러스 벨레젠시스 (Bacillus velezensis) CE 100 균주, 이의 배양 방법, 이의 균체, 배양액, 배양여과액 또는 이들의 조합을 유효성분으로 포함하는 식물병원균 방제용 조성물 및 이를 이용한 식물병원균 방제 방법에 관한 것이다.

Claims (10)

  1. 수탁번호 81101BP로 수탁된 바실러스 벨레젠시스 (Bacillus velezensis) CE 100 균주.
  2. 다음의 단계를 포함하는 수탁번호 81101BP로 수탁된 바실러스 벨레젠시스 (Bacillus velezensis) CE 100 균주의 배양 방법:
    세균 배양용 배지에 바실러스 벨레젠시스 CE 100 균주를 접종하는 접종 단계;
    접종된 바실러스 균주를 배양하는 배양 단계; 및
    배양 단계의 결과물을 수득하는 단계.
  3. 제2항에 있어서, 상기 배양 단계는 20℃ 내지 70℃ 에서 수행하는 것인, 배양 방법.
  4. 제2항에 있어서, 상기 배양 단계는 3 내지 20 일 동안 수행하는 것인, 배양 방법.
  5. 제2항에 있어서, 상기 배양 단계는 pH 4 내지 9에서 수행하는 것인, 배양 방법.
  6. 수탁번호 81101BP로 수탁된 바실러스 벨레젠시스 (Bacillus velezensis) CE 100 균주의 균체, 배양액, 농축 배양액, 배양액의 건조물, 배양 여과액, 농축 배양 여과액, 배양 여과액 또는 이들의 조합을 유효성분으로 포함하는 식물병원균 방제용 조성물.
  7. 제6항에 있어서, 상기 식물병원균은 다이아포르테 사이트리 (Diaporthe citri), 균핵병균 (Sclerotinia sclerotiorum), 스클레로티움 세피보룸 (Sclerotium cepivorum), 잿빛 무늬 병원균 (Monilinia fructicola), 보트리티스 시네레아 (Botrytis cinerea), 코레토트리쿰 아큐타툼 (Collectotrichum acutatum), 보트리오티니아 퍼켈리아나 (Botryotinia fuckeliana), 실린드로카폰 데스트럭탄스 (Cylindrocarpon destructans), 셉토리아 글리시네스 (Septoria Glycines), 글로메렐라 신굴레이트 (Glomerella cingulate), 푸사리움 솔라니 (Fusarium solani), 리족토니아 솔라니 (Rhizoctonia solani), 피리쿨라리아 그리세아 (Pyricularia grisea), 파이토프토라 드레크슬레리 (Phytophthora drechsleri), 보트리오스페리아 도치데아 (Botryosphaeria dothidea), 콜레토트리쿰 글로에오스포리오이데스 (Colletotrichum gloeosporioides), 푸사리움 글라민아룸 (Fusarium grminearum), 파이토프토라 캡시사이 (Phytophthora capsici), 파이토프토라 니코티아나 (Phytophthora nicotianae), 알터나리아 포리 (Alternaria porri), 포마속 균들 (Phoma spp), 파이토프토라 인페스탄스 (Phytophthora infestans) 및 펙토박테리움 카로토보룸 (Pectobacterium carotovorum)으로 이루어진 군에서 선택되는 것인, 식물병원균 방제용 조성물.
  8. 다음의 단계를 포함하는 식물병원균 방제 방법:
    수탁번호 81101BP로 수탁된 바실러스 벨레젠시스 (Bacillus velezensis) CE 100 균주의 균체, 배양액, 농축 배양액, 배양액의 건조물, 배양 여과액, 농축 배양 여과액, 배양 여과액 또는 이들의 조합을 적용시키는 적용 단계.
  9. 제8항에 있어서, 상기 식물병원균은 다이아포르테 사이트리 (Diaporthe citri), 균핵병균 (Sclerotinia sclerotiorum), 스클레로티움 세피보룸 (Sclerotium cepivorum), 잿빛 무늬 병원균 (Monilinia fructicola), 보트리티스 시네레아 (Botrytis cinerea), 코레토트리쿰 아큐타툼 (Collectotrichum acutatum), 보트리오티니아 퍼켈리아나 (Botryotinia fuckeliana), 실린드로카폰 데스트럭탄스 (Cylindrocarpon destructans), 셉토리아 글리시네스 (Septoria Glycines), 글로메렐라 신굴레이트 (Glomerella cingulate), 푸사리움 솔라니 (Fusarium solani), 리족토니아 솔라니 (Rhizoctonia solani), 피리쿨라리아 그리세아 (Pyricularia grisea), 파이토프토라 드레크슬레리 (Phytophthora drechsleri), 보트리오스페리아 도치데아 (Botryosphaeria dothidea), 콜레토트리쿰 글로에오스포리오이데스 (Colletotrichum gloeosporioides), 푸사리움 글라민아룸 (Fusarium grminearum), 파이토프토라 캡시사이 (Phytophthora capsici), 파이토프토라 니코티아나 (Phytophthora nicotianae), 알터나리아 포리 (Alternaria porri), 포마속 균들 (Phoma spp), 파이토프토라 인페스탄스 (Phytophthora infestans) 및 펙토박테리움 카로토보룸 (Pectobacterium carotovorum)으로 이루어진 군에서 선택되는 것인, 식물병원균 방제 방법.
  10. 제8항에 있어서, 상기 적용은 식물 자체에 적용, 토양으로의 적용, 현장 용수로의 적용 및 종자로의 적용인 것인, 식물병원균 방제 방법.
PCT/KR2020/001218 2019-10-07 2020-01-23 바실러스 벨레젠시스 ce 100 균주 및 이를 이용한 식물병원균 방제용 조성물 WO2021071029A1 (ko)

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