WO2015183003A1 - 벼 근권에서 분리된 신규 식물 내생세균 바실러스 오리지콜라 및 이를 이용한 천연식물 보호 및 식물 강화제 개발 - Google Patents

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호세인모하마드토파잘
정유진
김근곤
이정은
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    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/07—Bacillus

Definitions

  • the present invention relates to plant endogenous microorganisms and microbial preparations containing the same, and more particularly to a novel microbial Bacillus oryzicola and a microbial preparation containing the same.
  • the present invention is supported by the Ministry of Food, Agriculture, Forestry and Fisheries in 2010, 'Next Generation Biological Pesticide Development Project' (Task No .: 10044909, Title: Development of effective and sustained wide range of probiotic crop protection agents) and the Ministry of Trade, Industry and Energy in 2013. It was derived from a study conducted as part of the Industrial Convergence Source Technology Development Project (Task No .: 808015-3-2, Task name: Development of next-generation microbial material for plant disease control using antagonistic microorganisms (2010-2013)). .
  • microbial products are selected from microorganisms with a specific function in the environment, formulated after mass cultivation, and treated with foliar spray or granulated soil to control pests or to be used as microbial fertilizers or plant fortifying agents (see Non-Patent Document 1).
  • Microorganisms used here are widely distributed in the natural environment such as soil, plant roots, and the ocean, and are widely used in environmentally friendly agriculture because they are diverse and secrete various metabolites.
  • There are three ways to use microorganisms including using microorganisms themselves, using metabolites produced by microbial fermentation, and using microbial metabolites as leading compounds for synthesizing new pesticides.
  • antagonistic microorganisms capable of inhibiting plant pathogens, plant growth-promoting myobacterial bacteria (PGPR) and plant endophytic microorganisms, which promote plant growth, are in most cases, especially plant disease resistance by these microorganisms.
  • PGPR plant growth-promoting myobacterial bacteria
  • plant endophytic microorganisms which promote plant growth
  • Endogenous bacteria are defined as bacteria that live in living healthy plant tissues and give various benefits without causing substantial harm to plants.
  • plant endogenous bacteria are present in the spaces between cells or between cells, inducing direct and indirect resistance to plant pests and stress, and are known to have a great influence on plant growth.
  • endogenous bacteria are nitrogen fixation, solubilization of phosphoric acid, production of siderophore, production of active hormones, production of antimicrobial substances or disease resistance of plants to prevent disease infection and promote plant growth. It is considered (refer nonpatent literature 1-4).
  • Such endogenous bacteria are friendly to the host plant and can be symbiotic to the tissues of the host plant without being recognized as pathogens (see Non-Patent Document 5).
  • Some endogenous bacteria can use one or more mechanisms simultaneously to promote plant growth and control disease, and different mechanisms may be applied at different times during the lifetime of the plant.
  • Plant genes may be altered by the presence of bacteria, and these altered genes may provide clues to the effects of endogenous bacteria in plants (see Non-Patent Document 6). Plant endogenous bacteria multiply in cells, usually with a high overall density at the root and at the beginning of the stem, and gradually decreasing toward the upper part of the plant such as stems and leaves, and in the case of corn leaves, the density is log10 3 to log10 7 cfu / g.
  • Bacillus Bacillus
  • Pseudomonas Pseudomonas
  • Enterobacter Enterobacter
  • Agrobacterium Agrobacterium
  • Rice is one of the top five crops in the world, causing a lot of production losses due to various diseases. Among them, damage caused by hospital fungi, such as blast and leaf blight, causes fatal losses in crop production, and has been effectively controlled by breeding resistant varieties and developing chemical fungicides. However, in addition to the kidney disease and bacterial diseases such as alder disease and leaf blight, which are mainly caused by seed transmission occurs a lot depending on the region, causing a lot of damage in recent years have been difficult to control. These pathogens overwinter in paddy soils and surrounding weed tissues, and especially in warm and humid conditions, rice is vulnerable to germs, so it is difficult to control once the onset begins. The control of these pathogens has been mainly dependent on chemical fungicides, but most of the use of fungicides has a problem of environmental pollution or human toxicity, increasing the interest in environmentally friendly biological pesticides that can replace them.
  • Bacillus Bacillus subtilis
  • Bacillus Fu milreoseu Bacillus pumilus
  • Bacillus amyl Lowry Quebec Patience B.
  • amyloliquefaciens is, and the strains most antimicrobial material used in the product It is known to have a mechanism of directly inhibiting germs or to induce host disease resistance by secreting cyclic peptides such as initurin and surfactin.
  • Bacillus sp. Forms endospores that can survive in poor natural environments for long periods of time, and because of their good antibacterial properties, many researchers have published their findings for the biological control of plant diseases. See Patent Document 10).
  • This strain was first identified in Korea in 2010 and identified as having the ability to promote plant growth (see Non-Patent Document 1), and subsequently isolated from ginseng, tomato, and potato roots in China, which has the effect of inhibiting pathogens and promoting plant growth. Have been reported (see Non-Patent Documents 11 to 13). However, in these studies, the strain had no effect on the induction of disease resistance or other disease inhibition of host plants other than the antibacterial activity against phytopathogens.
  • the research on rice root microorganisms of rice was mainly conducted by researchers in Korea and China, which are rice growing regions. Recently, a study on the comparison of the root cell bacterial populations by the growing seasons of conventional and non-cultivated rice was presented.
  • Non-Patent Document 14 has also been reported that the various species of Bacillus (Bacillus sp.), Waist Bacillus (Paenibacillus sp.) And Pseudomonas (Pseudomonas sp.) Paper peeling of inhibiting a pathogen in oryzae or tall pathogen growth in the rhizosphere of rice plant (Non-patent Document 15 Reference).
  • Non-Patent Documents 16 and 17 This is considered to be due to the relatively low control effect because it is based only on the mechanism of inhibiting pathogens when separating antagonistic bacteria. Therefore, in order to take advantage of the characteristics of the strain for more effective control of the antimicrobial activity, host disease resistance resistance and growth promoting effect at the same time it is necessary to search for and develop a new multifunctional microorganism that can strengthen the plant.
  • Non-Patent Document 1 Madhaiyan, M., Poongguzhali, S., Kwon, SW, and Sa, TM (2010). Bacillus methylotrophicus sp. nov., a methanol-utilizing, plant-growth-promoting bacterium isolated from rice rhizosphere soil. Int J Syst Evol Microbiol 60: 2490-2495.
  • Non-Patent Document 2 Chert, C., Bauske, EM, Musson, G., Rodriguez-Kabana, R., and Kloepper, JW (1995). Biological control of Fusarium wilt of cotton by use of endophytic bacteria. Biol Cont 5: 10-16.
  • Non-Patent Document 3 Costa, JM, & Loper, JE (1994). Characterization of siderophore production by the biological control agent Enterobacter cloacae . Mol. Plant-Microbe Interact. 7: 440-448.
  • Non-Patent Document 4 Wakelin, SA, Warren, RA, Harvey, PR, Ryder, MH (2004). Phosphate solubilization by Penicillium spp. closely associated with wheat roots. Biology and Fertility of Soils 40: 36-43.
  • Non-Patent Document 5 Rosenblueth, M., & Martinez-Romero, E. (2006). Bacterial endophytes and their interactions with hosts. Molecular Plant-Microbe Interactions 19: 827-837.
  • Non-Patent Document 6 de Matos Nogueira, E., Vinagre, F., Masuda, HP, Vargas, C., de P, VLM., Da Silva, FR, dos Santos, RV, Baldani, JI, Gomes Ferreira, PC , and Hemerley. (2001). Expression of sugarcane genes induced by inoculation with Gluconacetobacter diazotrophicus and Herbaspirillum rubrisubalbicans. Genet. Mol. Biol. 24: 199-206.
  • Non-Patent Document 7 Bibi, F., Yasir, M., Song, GC, Lee, SY, and Chung, YR (2012). Diversity and characterization of endophytic bacteria associated with tidal flat plants and their antagonistic effects on oomycetous plant pathogens. Plant pathol j 28: 20-31.
  • Non-Patent Document 8 Cao, C., Park, S., and McSpadden, G. (2010). Biopesticide controls of plant diseases: resources and products for organic farmenrs in Ohio. Fact Sheet, Agricultural and Natural Resources. SAG-18-10 The Ohio State Univeristy.
  • Non-Patent Document 9 Lee, S. K., Sohn, H. B., Kim, G. G., and Chung, Y. R. (2006). Enhancement of biological control of Botrytis cinerea on cucumber by foliar sprays and bedpotting mixes of Trichoderma harzianum YC459 and its application on tomat in the greenhouse. Plant Pathol J 22: 283-288.
  • Non-Patent Document 10 Park, Kyung Suk. (2011). Development Status of Microbial Pesticides and the Importance of Bacillus Microorganisms. Industrial Chemistry Prospect 14 (4): 1-11.
  • Non-Patent Document 11 Kim, BK, Chung, JH, Kim, SY, Jeong, H., Kang, SG, Kwon, SK, Lee, CH, Song, JY, Yu, DS, Ryu, CM, and Kim, JF (2012). Genome sequence of the leaf-colonizing bacterium Bacillus sp strain 5B6, isolated from a cherry tree. J Bacteriol 194: 3758-3759.
  • Non-Patent Document 12 Ma, L., Cao, YH, Cheng, MH, Huang, Y., Mo, MH, Wang, Y., Yang, JZ, and Yang, FX (2013). Phylogenetic diversity of bacterial endophytes of Panax notoginseng with antagonistic characteristics towards pathogens of root-rot disease complex. Ant van Leeuwen 103: 299-312.
  • Non-Patent Document 13 Yan, X., He, L., Song, G., and Wang, R. (2011). Antagonistic bioactivity of endophytic strains isolated from Salvia mitiorrhiza . Afr J Biotech 10: 15117-15122.
  • Non-Patent Document 14 Aslam, Z., Yasir, M., Yoon, H. S., Jeon, C. O., and Chung, Y. (2013). Diversity of the bacterial community in the rice rhizosphere managed under conventional and no-tillage practices. J Microbiol 51: 747-756.
  • Non-Patent Document 15 Yang, J. H., Liu, H. X., Zhu, G. M., Pan, Y. L., Xu, L. P., and Guo, J. H. (2008). Diversity analysis of antagonists from rice-associated bacteria and their application in biocontrol of rice diseases. J Appl Microbiol 104: 91-104.
  • Non-Patent Document 16 Gatson, JW, Benz, BF, Chandrasekaran, C., Satomi, M., Venkateswaran, K., and Hart, ME (2006). Bacillus tequilensis sp. nov., isolated from a 2000-year-old Mexican shaft-tomb, is closely related to Bacillus subtilis . Int J Syst Evol Microbiol 56: 1475-1484.
  • Non-Patent Document 17 Sumpavapol, P., Tongyonk, L., Tanasupawat, S., Chokesajjawatee, N., Luxananil, P., and Visessanguan, W. (2010). Bacillus siamensia sp. nov., isolated from salted crab ( poo-khem ) in Thailand. Int J Syst Evol Microbiol 60: 2364-2370.
  • the present invention can suppress the growth of plant pathogenic fungi and bacteria in a way that can compensate for the above disadvantages, and at the same time act specifically on rice, a host plant, to induce disease resistance and promote plant growth.
  • the purpose of the present invention is to develop and provide a new microbial agent having all of microbial fertilizer efficacy, plant reinforcing effect and plant protection effect by separating, mass culturing and formulating a new multifunctional plant endogenous bacterium.
  • Bacillus ducks have a DNA-related values (DNA-DNA relatedness value) - the present invention, the novel microorganism Bacillus origination coke (Bacillus oryzicola), or the Bacillus origination coke (Bacillus oryzicola) and at least 70% DNA in order to solve the aforementioned problems Gicola ( Bacillus oryzicola ) is provided.
  • DNA-DNA relatedness value DNA-related values
  • Gicola Bacillus oryzicola
  • Bacillus origination coke (Bacillus oryzicola) is Bacillus origination coke (Bacillus oryzicola) comprises a 16S rRNA having the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2.
  • Bacillus duck Bacillus oryzicola
  • Bacillus oryzicola Bacillus duck ( Bacillus oryzicola ) YC7007 (Accession Number: KCCM11275P) or Bacillus ORIGICA ( Bacillus oryzicola ) YC7010 (Accession Number: KACC 18228) characterized in that Gicola ( Bacillus oryzicola ) is provided.
  • Bacillus origination coke (Bacillus oryzicola), characterized in that with the Bacillus origination coke (Bacillus oryzicola) Plant disease resistance inducing effect.
  • the plant disease provides Bacillus oryzicola ( Bacillus oryzicola ), characterized in that at least one selected from the group consisting of rice bran blight, rice blight blight, rice ear blight and rice stingray disease .
  • Bacillus origination coke (Bacillus oryzicola) is Bacillus origination coke (Bacillus oryzicola), characterized in that further has a plant pathogen inhibiting efficacy, plant growth promoting effect and enhance plant efficiency.
  • the plant growth promoting effect provides a Bacillus origola ( Bacillus oryzicola ) characterized in that the plant growth promoting effect on rice.
  • the present invention also provides a microbial preparation for fertilizer, plant protection and plant fortification containing the microorganism, its culture solution or culture filtrate as an active ingredient.
  • the present invention it is possible to simultaneously inhibit the growth of important phytopathogenic fungi and bacteria of crops, and antibiotics by using a multifunctional bacterium Bacillus orzicola having both the disease resistance induction and the promoting effect of host plants.
  • a product containing multi-functional bacteria that not only directly inhibit phytopathogenic bacteria by secreting substances, promoting growth and host systemic disease resistance inducing substances, but also acting specifically on rice to promote growth and induce systemic disease resistance. It is possible to provide an excellent microbial agent capable of simultaneously serving as a natural plant protectant, plant enhancer and microbial fertilizer than any bacteria reported so far.
  • 1 is a nucleotide sequence of 16S rRNA gene of YC7007 strain (a) and YC7010 strain (b),
  • Figure 2 is a phylogenetic tree made by 16S rRNA gene sequence analysis of YC7007 strain
  • Figure 3 is a photograph showing the result of the gene comparison analysis of similar strains using the gene analysis (BOX-PCR) of the YC7007 strain,
  • Figure 4 is a comparison photo for each treatment group illustrating the effect of rice blight control
  • Figure 5 is a comparison photo for each treatment group to explain the effect of controlling rice leaf blight
  • FIG. 6 is a graph (a) and photograph (b) showing the antimicrobial effect of each culture period of the culture filtrate of YC7007 strain;
  • Figure 9 is a photograph (A) and graph (B) showing the results of the systemic resistance induction activity against YB7007 strain against bacterial blight and panicle blight of rice.
  • the present inventors can suppress the growth of plant pathogens and bacteria in a wide range, and at the same time, isolate and mass-cultivate a multifunctional plant endogenous bacterium that has a specific effect on rice, which is a host plant, to induce disease resistance and promote plant growth. This has led to the discovery of new strains that can be used as new forms of biopesticides with microbial fertilizer efficacy.
  • the new microorganism is not only Bacillus oryzicola , but also Goris et al. (Goris, J., Konstantinidis, KT, Klappenbach, JA, Coenye, T., Vandamme, P., and Tiedje, J M. (2007) DNA-DNA hybridization values and their relationship to whole-genome sequence similarities.70-DNA association values of DNA-DNA hybridization according to Int J Syst Evol Microbiol 57: 81-91) Microorganisms showing relatedness values should also be interpreted as being included in Bacillus oryzicola of the present invention.
  • Microorganisms exhibiting a DNA-DNA association value of 70% or more may be treated as the same microorganism as Bacillus oryzicola of the present invention.
  • the Bacillus orzicola may include 16S rRNA having a nucleotide sequence as set forth in SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2, and the Bacillus orzicola ( Bacillus oryzicola ) May be Bacillus oryzicola YC7007 (accession number: KCCM11275P) or Bacillus oryzicola YC7010 (accession number: KACC 18228).
  • the YC7007 strain was isolated from the internal roots of rice growing in paddy fields at Gyeongsang National University. First, in order to separate plant endogenous bacteria, the surface of the root cut pieces was immersed in 1% sodium hypochlorite (NaOCl) solution for 10 minutes to sterilize the surface. These pieces were placed on 1 / 10TSA medium (Tryptic Soy Broth 3g, agar 16g / 1 liter of distilled water), and cultured for about 2 to 3 days while observing the growth of bacteria on the surface to confirm surface sterilization.
  • NaOCl sodium hypochlorite
  • the isolated YC7007 strain was Gram-positive, motility, cells were rod-shaped (0.6 ⁇ m wide, 1.8-2.6 ⁇ m long), formed endospores, and were unable to grow under anaerobic conditions.
  • the results of examining the physiological and biochemical characteristics of this strain and similar species are shown in Table 1 below, and DNA-DNA correlation values are shown in Table 2 below.
  • the results for all strains used in Table 1 are the findings according to the analytical method.
  • the physiological and biochemical properties of the YC7007 strain were compared with other similar Bacillus species, and were grown at pH 4.5 and pH 12, in 14% salt solution, at 60 ° C, gelatin degradation, Carboxymethyl cellulose undigested, arbutin, dilactose, starch, glycogen, gentiose digestion, naphthol-ace-bias-phosphohydrolase, N-acecyl-beta-glucosaminidase enzyme in API kit test
  • Important phenotypic characteristics such as YC7007 strains can be confirmed that different from the related species.
  • Figure 2 shows the phylogenetic tree made by 16S rRNA gene sequence analysis of the YC7007 strain.
  • the intersection number in FIG. 2 represents the bootstrap value resulting from 1000 iterations.
  • amyloliquefaciens B. methylotrophicus , B. siamensis , B. subtilis and B. tequilensis were all 50.4% or less, and they were identified as different species. If the DNA-DNA association value between similar species is 70% or more, it is recognized as the same species, and if it is lower than this value, it is regarded as another species (Goris, J., Konstantinidis, KT, Klappenbach, JA, Coenye, T., Vandamme, P., and Tiedje, J M. (2007) .DNA-DNA hybridization values and their relationship to whole-genome sequence similarities.Int J Syst Evol Microbiol 57: 81-91).
  • Figure 3 shows the result of the gene comparison analysis compared with the related species strain using the genetic analysis (BOX-PCR) of the YC7007 strain.
  • Polymerase for gene analysis (BOX-PCR) was used as Platinum Taq DNA polymerase High Fidelity (Invitrogen), and primer was used as BOXAR1 (5'-CATCGGCAAGGCGACGCTGACG-3 ').
  • PCR conditions include initial denaturation at 95 ° C. for 7 minutes, denaturation, annealing and extension at 90 ° C. for 30 seconds, 40 ° C. for 1 minute, Finally, the final extension was amplified by reacting at 72 ° C for 10 minutes for 3 minutes at 72 ° C.
  • M represents a 1 kb marker
  • 1 represents a YC7007 strain
  • 2 represents a Bacillus methylotrophicus KACC13105 strain
  • 3 represents a Bacillus siamensis PD-A10 T strain.
  • the microorganism of the present invention was identified as a new strain based on the physiological, biochemical, and molecular biological results obtained above, and named its name is Bacillus oryzicola YC7007 strain and dated April 18, 2012.
  • accession number KCCM11275P was assigned by the Korean Culture Center of Microorganisms (KCCM).
  • the taxonomic description for the new Bacillus oryzicola is as follows.
  • Aerobic, bacilli (0.6-1.0 ⁇ 2.5-2.8 ⁇ m), which are Gram-positive bacteria and can form endogenous spores, with cells alone or in pairs.
  • the flora When incubated for 24 hours in 1/10 TSA medium, the flora is creamy white, convex in the middle, and has a regular edge. It grows at a temperature of 20-60 °C, pH 4.5-12, and sodium chloride (NaCl) concentration 0-13%.
  • Antibiotic resistance test showed resistance to chloramphenicol at a concentration of 30 ⁇ g / ml, but 10 ⁇ g / ml ampicillin, gentamicin, penicillin and 30 ⁇ g / ml tetracycline There was no resistance to tetracyclin, streptomycin, vancomycin, or kanamycin.
  • the major fatty acids were anteiso-C 15: 0 and iso-C 15: 0 .
  • the antibacterial activity of endogenous bacteria YC7007 was found in four important plant pathogenic fungi: Gibberella fujikuroi (paddy leg disease), Pythium ultimum (mozzarella disease), Bipolaris oryzae (rice stalk disease), Magnaporthe grisea (three rice fever), and three pathogenic bacteria ( Burkholderia).
  • Gibberella fujikuroi paddy leg disease
  • Pythium ultimum mimethium ultimum
  • Bipolaris oryzae rice stalk disease
  • Magnaporthe grisea three rice fever
  • Burkholderia three pathogenic bacteria
  • glumae byeoal blight
  • Xanthomonas oryzae pv. oryzae Xanthomonas oryzae pv. faces organisms were confirmed by a black (confrontation bioassay) how to suppress the irradiation growth of the oryzae (rice huinip
  • the pathogenic fungi and YC7007 strains inhibit growth by using a paper disc method in 1 / 5PDA and 1 / 10TSA of growth medium (16g agar / 1 liter of distilled water) including potato agar sugar medium (PDB, Difco) Was investigated.
  • a paper disk (5 mm in diameter) was placed 1 cm from the edge of the incubator, 100 ⁇ l of the strain culture was soaked into the paper disk, and then placed in the middle of the pathogen fungal mycelium disk (6 mm) grown for 4 days in PDA medium. According to the incubation at 24 ⁇ 28 °C 4-6 days.
  • Bacterial inhibitory effect of culture filtrate produced by strain YC7007 was shaken (120rpm) at 28 °C for 72 hours in gastric culture medium except agar, and the culture solution was filtered by millipore filter after centrifugation. The filtrate was used.
  • the inhibitory effect after the treatment for 10 minutes in hot water maintained at each treatment temperature was investigated.
  • Table 4 shows the results of the antimicrobial activity of the main phytopathogenic fungi and major phytopathogenic bacteria of the YC7007 strain.
  • Inhibition distance +, ⁇ 3 mm; ++, 4-5 mm; +++, 6-8 mm; ++++,> 8 mm.
  • the antimicrobial activity of the phytopathogenic fungi of the endogenous bacteria YC7007 strain is slightly different depending on the medium, but it can be seen that exhibited 3 to 10 mm mycelial growth inhibition effect.
  • the antimicrobial activity against phytopathogenic bacteria of the endogenous bacterium YC7007 strain 1 / 10TSA was 4 ⁇ 10mm
  • the culture filtrate showed a growth inhibitory effect of 3 ⁇ 8mm.
  • Inhibition distance +, ⁇ 3 mm; ++, 4-5 mm; +++, 6-8 mm; ++++, 8-10 mm.
  • Rice Blister Blight (RSB) is sterilized by putting an appropriate amount of bran into a 1L culture bottle and then pathogen R. solani AG1. After inoculation of the strain was incubated for 7 days in a 25 °C incubator. The bottle inoculation was crushed into a moderately finely cultivated mycelium mass and inoculated evenly in the pot where Nakdong rice of the 4-5 leaves treated with the drug was incubated and incubated for 7 days in a wet room (25 ° C). The lesion area ratio formed in the sheath was investigated.
  • Tomato gray mold disease was inoculated with the pathogen, Botrytis cinerea ( B. cinerea ) in potato agar medium and cultured in a 25 °C thermostat was used as inoculum.
  • Botrytis cinerea B. cinerea
  • the bottle was inoculated with spores harvested using a hemocytometer to make a spore concentration of 3x10 5 spores / ml and sprayed with tomato seedlings (2 to 3 leaves) treated with the drug.
  • Inoculated tomato seedlings were placed in a 20 ° C. wet room (relative humidity of 95% or more) to induce onset for 3 days, and then the lesion area ratio was examined.
  • Tomato late blight was inoculated with the pathogen P. infestans strain in oatmeal medium and cultured in an incubator at 20 °C to form a jujube sac.
  • Pathogen inoculation was harvested by adding sterile distilled water and spore suspension having a spore concentration of 3 ⁇ 10 4 spore sacs / ml. They were put in a refrigerator and subjected to a low temperature treatment so that the yuzu was spilled to prepare a yuzu suspension. This was sprayed onto the drug-treated tomato seedlings (two to three leaves). Tomato seedlings inoculated with the pathogens were treated in a 20-degree wethouse for 2 days and inoculated in a constant temperature and humidity room.
  • Wheat red rust is a pathogen, P. recondita , is a live parasite. Therefore, the spores formed in wheat seedlings were used as inoculum while the plants were passaged directly to plants.
  • five seed grains (variety: silver onion) were sown in disposable pots (4.5cm in diameter) and treated with a single leaf seedling seedling grown in a greenhouse for 8 days, and then inoculated (spore 0.11g / 1) was sprayed. Inoculated wheat seedlings were incubated at 20 ° C. for 1 day and then transferred to a constant temperature and humidity room at 20 ° C. with a relative humidity of 70% to induce onset.
  • Barley powdery mildew (BPM) is a pathogen, B. graminis f. Sp.hordei , is a live parasite, and was used as an inoculum in barley seedlings as a barley seedling in the laboratory. Pharmacokinetic investigation was carried out by dispensing five barley seeds (variety: copper barley) in a disposable pot (diameter: 4.5 cm), spraying the medicinal plants on the first leaf seedlings grown for 8 days in a greenhouse, air-dried in the greenhouse, and then on the treated barley. Powdery mildew spores were inoculated. Inoculated barley seedlings were placed in a constant temperature and humidity room at 20-23 ° C and a relative humidity of about 60% for 7 days, and then the area ratio was investigated.
  • Pepper anthrax was inoculated with the pathogen C. coccodes in oatmeal medium and incubated at 25 ° C. for 10 days to harvest the formed spores and adjust the spore concentration to 2 ⁇ 10 5 spores per ml.
  • the spore suspension was prepared.
  • the spore suspension prepared in the pepper seedlings (3-4 leaves) treated with the drug was sprayed and put in a wet bed (25 °C) and treated for 2 days and then developed in a constant temperature and humidity room (25 °C, 75% RH). Three days after the inoculation, the lesion area formed on the pepper leaves was examined.
  • the control value was calculated by calculating according to the following formula 1 from the disease area ratio obtained from the bottle irradiation.
  • Table 6 shows the results of the control effect on the major plant diseases of the YC7007 strain.
  • the pathogen suspension was incubated in R2A medium for 24 hours and then centrifuged to suspend bacterial cells in a 10 mM MgSO 4 solution and to adjust the concentration appropriately.
  • the degree of lesion necrosis was examined. The incidence was divided into 0-3 (0: no symptom, 1: small necrotic spot, 2: several necrotic spots, large gallbladder, 3: total necrosis), and the control value was calculated by calculating the degree of disease inhibition on the control. .
  • Benzothiadiazole (BTH) a 1 mM solution, was used as a control agent for inducing rice disease resistance.
  • Table 7 shows the results of investigation of the control effect of rice bran blight by soil treatment of YC7007 strain, and in FIG.
  • the strain treatment group leaves the control group treated only pathogens with leaf path length of 2.0 mm, incidence of 1.1
  • the length of disease was 17.4mm and the incidence was much less than that of 2.4.
  • the control value was 54%, which was equivalent to 57% of BTH, the control drug.
  • necrosis degree was examined. The incidence is divided into 0-9 (0: no symptom, 1: small necrotic spot, 2-4: several necrotic spots combined, medium reed, 5-8: several necrotic spots combined, large reed, 9: total necrosis)
  • the control value was calculated by calculating the degree of disease inhibition for the control.
  • Table 8 shows the results of investigation of the control effect of rice leaf blight by soil treatment of YC7007 strain, and in Fig. 5 shows a comparison picture for each treatment group to explain the effect of control of rice leaf blight.
  • Rice seedlings (Dongjin 1) grown in plant growth conditions (28 ⁇ 30 °C, relative humidity 80% or more) for 2 weeks are transferred to sterile or non-sterile rice cultivation soil and planted immediately after suspension (10 5 ⁇ 10 7 cfu / ml) 15 ml) was aliquoted into topsoil (150 g). After 3 days of treatment, G. fujikuroi ( 5 ⁇ 10 5 cfu / g) was inoculated at 1.5 g / pot in 10 seedlings per repetition in three repetitions. The incidence of the disease was examined after placing it on growth for 10-30 days after inoculation.
  • the incidence was divided into 0-5 (0: no symptom, 1: leaf slightly yellowing and stem dwarfism, 2 ⁇ 3: leaf yellowing and stem tallening, 5: total necrosis), and the control group calculated the degree of disease inhibition for the control. Calculated by
  • Table 9 shows the results of investigating the control effect of rice stinging disease by soil treatment of YC7007 strain.
  • Table 10 shows the results of investigating rice growth promoting efficacy of the YC7007 strain.
  • the YC7007 strains were treated in rice growing soils and grown in pots to investigate the growth promoting effect of each growing season. It was much longer than 19.3cm and 7.7cm, and stem length was 27.4% more and even 52% more numbered.
  • the YC7007 strain treatment group also showed a 10.8% increase in stem length and 32% more crushed number in the extracting season, confirming the effect of promoting the growth of rice by the YC7007 strain treatment.
  • the production of antimicrobial substances was investigated in 1 / 10TSB liquid medium.
  • the degree of inhibitory effect of the antimicrobial substance was confirmed by measuring the fungal hyphae or bacterial cell growth inhibition distance formed around the paper disk by the above-described disk diffusion method.
  • the YC7007 strain was incubated at 28 ° C. for 72 hours in a liquid medium (180rpm), centrifuged at 9000 g for 10 minutes, and the culture filtrate was filtered with a Millipore filter (0.2 ⁇ m), and then the antimicrobial activity was measured for each culture time.
  • FIG. 6 is a graph (a) and photograph (b) showing the antimicrobial effect of each culture period of the YC7007 strain culture filtrate
  • Figure 7 is a graph showing the antibacterial effect of the temperature treatment of the YC7007 strain culture filtrate.
  • Bacteria culture obtained by culturing the strain in a large fermenter (1 ton or more) or cells obtained after centrifugation were mixed at 1: 100 with clay minerals such as kaolin, bentonite, and peat and dried at low temperature. After uniformly pulverized to prepare a solid in the form of a powder. At the same time, the bacterial cultures were also mixed with the clay minerals 1: 100 to prepare a liquid suspension.
  • Rice is a staple food of more than half of the world's population and is estimated to have produced about 7.45 billion tons in 2013. It is the most produced in Asia, but the disease is a major limiting factor, causing losses of 24 to 41% annually (Annonymous 2014. Rice market monitor.In: Monthly report, Food and Agriculture Organization of the United Nations , vol. 17 , iss. 1, pp 1-4 (http://www.fao.org/3/a-i3735e.pdf); Savary, S., Willocquet, L., Elazegui, FA, Castilla, NP and Teng, PS 2000. Rice pest constrainsts in tropical Asia: Quantification of yield losses due to rice pests in a range of production situations.Plant Dis. 84: 357-369.).
  • Biological control using antagonistic bacteria can be implemented as an environmentally safe and concentrated disease management means.
  • Bacillus Bacillus (Bacillus), bulk holde Ria (Burkholderia), Rai simple emitter (Lysobacter), biologically for a wide variety of microorganisms cheat prevention of many crop diseases such as O (Pantoea), Pseudomonas (Pseudomonas), and Streptomyces (Streptomyces) to the panto Although it is used as a control agent, only a few studies have been reported on the biological control of rice disease (Bouizgarne, B. 2013. Bacteria for plant growth promotion and disease management.In: Bacteria in agrobiology, Disease mangement, ed.
  • Rice blast and sheath blight were effectively controlled by Bacillus vallismortis EXTN-1 and two antagonistic bacterial strains Pseudomonas fluorescens mc75 and pc78 (Choi, GJ, Kim, JC, Park, EJ, Choi, YH, Jang, KS, Lim, HK, Cho, KY and Lee, SW 2006. Biological control activity of two isolates of Pseudomonas fluorescens against rice sheath blight.Plant Pathol. 22: 289-294 .; Park, KS, Paul, D. and Yeh, WH 2006. Bacillus vallismortis EXTN-1 mediated growth promotion and disease suppression in rice.Plant Pathol. J.
  • Fusarium parent nilri formate methoxy (Fusarium moniliforme), and Fusarium Fu chikuwa Roy (F. Fujikuroi) of rice tall bottle (bakanae) and byeomo rot (seedling rot of rice) also antagonistic bacteria Pseudomonas fluorescein sense (P. Fluorescens) by And Bacillus cereus (Kazempour, MN and Elahinia, SA 2007. Biological control of Fusarium fujikuroi , the causal agent of bakanae disease by rice associated antagonistic bacteria.Bulg . J. Agric. Sci. 13: Rosales, AM and Mew, TW 1997.
  • Bacillus spp. Produce endospores and persist in the natural environment for a long time after treatment (Hu, X., Roberts, DP, Maul, JE, Emche, SE, Liao, X., Guo, X., Liu, Y ., McKenna, LF, Buyer, JS and Liu, S. 2011.
  • Formulations of the endophytic bacterium Bacillus subtilis Tu-100 suppress Sclerotinia sclerotiorum on oilseed rape and improve plant vigor in field trials conducted at separate locations.Can.J. Microbiol . 57: 539-546.).
  • Bacillus amylorequisition is a Bacillus species that is widely used for biological control of many plant diseases in other hosts. Bacillus amyloliquefaciens ), Bacillus subtilis ( Bacillus subtilis ), Bacillus pastry ( Bacillus pasteurii ), Bacillus cereus ( B. cereus ), Bacillus pumilus ( Bacillus pumilus ), Bacillus mycoides ( Bacillus mycoides ) And Bacillus sp. Bacillus sphaericus (Kloepper, J. W., Ryu, C. M. and Zhang, S. 2004. Induced systemic resistance and promotion of plant growth by Bacillus spp.
  • amyloliquefaciens ) IN937 is a baby pole ( Arabidopsis ) Is a bacterial pathogen, Erwinia carotobora ( Erwinia carotovora subsp. carotovora (Ryu et al., 2004). Also, Bacillus cereus ( B. cereus ) AR156 and Bacillus subtilis ( B. subtilis ) Is a baby pole ( Arabidopsis Induce resistance in Pseudomonas aureus ( Pseudomonas syringae pv. tomato The plant growth promoting rhizobacterium has been proven to control DC3000 (Niu, D. D., Liu, H.
  • Bacillus cereus AR156 induces systemic resistance in Arabidopsis thaliana by simultaneously activating salicylate-and jasmonate / ethylene dependent signaling pathways. Mol. Plant-Microbe Interact . 24: 533-542.). Some of these Bacillus species are characterized by antifungal, antibacterial, plant growth promoting and resistance inducing activity in host plants (Park, KS, Paul, D., Kim, JS and Park, JW 2009. L-alanine augments Rhizobacteria induced systemic resistance in cucumber. Folia microbiol .
  • Endogenous bacterial strains were isolated from the roots of rice collected from the paddy soil of Gyeongsang National University farm (Jinju, Korea). Samples were washed several times with running water for separation for 5 minutes with 70% ethanol, surface sterilization with 1.2% sodium hypochlorite (NaOCl) solution for 10 minutes, and finally several times with sterile distilled water. The washed sections were placed in 1/10 TSA (one-tenth strength tryptic soy broth agar) for 3 days at 28 ° C. and bacterial growth was observed.
  • TSA one-tenth strength tryptic soy broth agar
  • Non-Patent Document 7 After confirming that there was no bacterial colonies, the sample sections were again sterilized with 70% ethanol for several seconds, and sterilized distilled water was put into an autoclave and crushed into sterilized bowls and mortars (see Non-Patent Document 7). After diluting a portion of the grinding solution 10 times sequentially in autoclaved water, a portion of this (0.1 ml) was placed in 1/10 TSA medium supplemented with cycloheximide and the plates were incubated at 30 ° C. for 3 days. Bacterial colonies grown on the medium were selected based on the distinct colony morphology. Purely isolated bacterial strains were passaged in 1/10 TSA medium and stored at ⁇ 70 ° C. for subsequent use.
  • a medium containing 10 g of protease peptone, 10 g of yeast extract, 4 g of ammonium chloride, 4 g of magnesium sulfate, 10 g of glucose and 15 g of agar was prepared for culturing bacterial strains.
  • the antagonistic activity of bacterial strains was evaluated by measuring the mycelial growth inhibition region of the fungal pathogen in PDA (potato dextrose agar) medium using an in vitro control bioassay (see Non-Patent Document 7).
  • PDA potato dextrose agar
  • in vitro control bioassay see Non-Patent Document 7.
  • Bulk holde Ria methoxy glue for antimicrobial test B. glumae
  • KACC10359 janto Pseudomonas duck material X. oryzae pv.
  • R2A the KACC 10208 (one-half strength R2A ) and YGC medium (10 g glucose, 30 g CaCO 3 , 5 g yeast extract and 15 g agar per liter distilled water were grown, respectively, and inhibitory activity was tested using the diffusion paper disc method.
  • Culture filtrate of bacterial strain YC7007 was prepared at different incubation times by centrifugation (5,000 g , 10 min) and filtration through Millipore filters (0.2 ⁇ m) from the culture.
  • Xanthomonas duck ( X. oryzae pv. Oryzae ) Induction of resistance by YC7007 species to bacterial blight and panicle blight by KACC 10208 and B. glumae KACC10359 respectively was tested.
  • Oryza sativa L. cultivar Dongjin was surface sterilized with 1.2% sodium hypochlorite solution for 10 minutes and 70% ethanol for 5 minutes, then rinsed three times with sterile distilled water, and stored for 3 days in a dark room at 30 ° C for germination. Replaced daily. Germinated seeds were sown in commercial soil (Nursery Soil, Dasuran Sangto, Youngnong Sun Up, Korea) and placed in a greenhouse for cultivation.
  • a plastic pot (9.5 ⁇ 8 ⁇ 7 cm 3) containing about 150 g of autoclaved top soil at 121 ° C. for 20 minutes per day for 2 days.
  • the bacterial cells were incubated for 2 days in a liquid mass culture medium on a rotary vibrator (160 rpm, 28 ° C.) and centrifuged (5,000 g , 10 min) to obtain a suspension and a buffer (10 mM MgSO). 4 ) at various concentrations (5.6 ⁇ 10 5 , 3.6 ⁇ 10 6 , 2 ⁇ 10 7 CFU / ml).
  • YC7007 During two weeks of seeding, the cell suspension of YC7007 (15 ml) was irrigated in a plastic pot containing autoclaved soil (150 g). Optimal concentrations (2 ⁇ 10 7 CFU / ml) of YC7007 were used in further resistance induction experiments against bacterial blight and panicle blight. Culture filtrate of YC7007 strain prepared from 60 h culture diluted 10-fold with 10 mM magnesium sulfate was sprayed onto the leaves until drops formed to confirm control effect. The bacterial pathogens were then inoculated 5 days after treatment with YC7007. Buffer was used as a control and all experiments were performed with 10 plants in three replicates for each treatment.
  • KACC10359 and Xanthomonas duck ( X. oryzae pv. Oryzae) KACC 10208 were prepared. Cultures of B. glumae were centrifuged (5,000 g, 10 min) and cell pellets suspended in buffer (10 mM MgSO 4 ) adjusted to 6 ⁇ 10 7 CFU / ml concentration. Pin-prick bioassay was performed for inoculation of the B. glumae suspension.
  • Oryzae was prepared in the same manner as in the case of B. glumae , and the concentration was 1.2 ⁇ 10 7 CFU / ml. Was adjusted. Clipping bioassay for bacterial blight was performed by cutting the upper leaves using scissors in suspension. The incidence was assessed according to the 1-9 point method 7 days after inoculation (Misra, JK, Mew, TW and Merca, SD 1994. Field inspection.In: A manual of rice seed health testing, eds. By TW Mew and JK Misra, pp. 52-55.International Rice Research Institute, Philippines. The disease reduction rate was calculated according to the following equation.
  • Bacterial suspension (15 ml) was again irradiated to the tilling stage (day 30) and growth was recorded in the booting stage 40 days after bacterial treatment from the tiller (day 70).
  • Growth promotion activity experiments were carried out using 10 plants in three replicates for each treatment in test tube and pot experiments, and buffers were used as controls.
  • 16S rRNA genes were amplified from the genome DNA extracted with a commercial extraction kit (Intron Biotech, Seoul, Korea) using bacterial universal primers 27F and 1492R and sequencing the purified PCR products (GenoTech Inc., Daejeon, (Lane, DJ 1991. 16S / 23S rRNA sequencing.In: Nucleic acid techniques in bacterial systematics , eds. By E. Stackebrandt and M. Goodfellow, pp. 115-175. Chichester: Wiley.).
  • the 16S rRNA gene sequences of the strains were compared with those obtained from the NCBI and the EzTaxon-e database server (Kim, OS, Cho, YJ, Lee, K., Yoon, SH, Kim, M., Na, H., Park, SC, Jeon, YS, Lee, JH, Yi, H., Won, S. and Chun, J. 2012.
  • EzTaxon- e a prokaryotic 16S rRNA gene sequence database with phylotypes that represent uncultured species.Int . J. Syst. Evol. Microbiol. 62: 716-721.).
  • the neighbor-joining method a new method for reconstructing phylogenetic trees. Mol. Biol. Evol. 4: 406-425.), Maximum-parsimony; Fitch, WM 1972.
  • MEGA 5 molecular evolutionary genetics analysis using maximum likelihood, evolutionary distance, and maximum parsimony methods.Mol. Biol. Evol . 28: 2731-2739.) (Felsenstein, J.
  • the cell morphology was observed using an optical microscope (Nikon, ⁇ 1000), and the presence of flagella was observed by transmission electron microscope (Hitachi, model H-600) using a cell culture grown for 24 hours in 28 °C R2A medium. .
  • Gram reactions were investigated using the kit (bioMerieux Gram stain kit) according to the manufacturer's instructions. Hydrolysis experiments of the strain were performed using casein, esculin, gelatin, starch, L-tyrosine, urea, Tween 20 and Tween 80 according to standard protocols (Smibert, RM). and Krieg, NR 1994. Phenotypic characterization.In: Methods for general and molecular bacteriology , eds. by P.
  • Sphingosinicella vermicomposti sp.nov . Isolated from vermicompost, and emended description of the genus Sphingos inicella.Int . J. Syst.Evol.Microbiol. 60: 580-584.).
  • Fatty acid methyl esters analysis was performed according to the instructions of the microbial identification system (MIB; Microbial ID, Inc.). Extracts were analyzed by GC (Agilent 6890) and identified by comparing fatty acid profiles with TSBA 40 database provided by Sherlock software (ver. 4.0). Extracting an amino acid of whole cell hydrolysates of the bacterial strain by Staneck and Roberts method (Stanek, JL and Roberts, GD 1974. Simplified approach to identification of aerobic actinomycetes by thin-layer chromatography Appl Microbiol 28:... 226-231.) According to the analysis. Extract isoprenoid quinones and follow the method of Komagata and Suzuki ( Komagata, K. and Suzuki, K. 1987.
  • Dragendorff reagent (Sigma-Aldrich; St. Louis, Mo) was used for phosphatidylcholine detection.
  • a phosphomolybdic acid solution (Sigma-Aldrich; St. Louis, Mo)
  • the total lipid profile was detected by heating at 150 ° C for 10 minutes.
  • strains YC7007 and YC7010
  • YC7007 have the highest similarity to B. siamensis and have strong antagonistic activity against F. fujikuroi (> 20 mm inhibition). zone) (see Table 11 below).
  • YC7007 also showed strong antagonistic activity in the PDA with a suppression range of 10-29 mm against other rice pathogens B. oryzae , M. grisea , F. fukikuroi and other major plant pathogens (see Table 12 below).
  • Culture filtrates of strain YC7007 prepared from different cultivation times were also F. fujikuroi and two major seed-derived bacterial pathogens, B. glumae and xanthomonas duck. ( X.
  • oryzae pv. Oryzae showed a good growth inhibitory ability (see Figure 8).
  • 60 h-old culture broth filtrate (X. oryzae oryzae pv.) Fusarium Fu chikuwa Roy (F. fujikuroi) in each of the culture medium, and the re-janto Pseudomonas duck The most potent activity was shown as inhibition ranges of 30 mm, 24 mm and 19.7 mm for each B. glumae .
  • the YC7007 strain was examined for systemic resistance inducing activity against bacterial blight and panicle blight of rice.
  • the incidence of leaf rot was 1.4, compared to the control (2.5) after YC7007 strains of three different concentrations (5.6 ⁇ 10 5 , 3.6 ⁇ 10 6 and 2 ⁇ 10 7 CFU / ml) were irrigated in soil.
  • the YC7007 strain was found to have significant growth promoting activity ( p ⁇ 0.05) compared to the control at all experimental stages such as rice seedlings, harvesters and water harvesters.
  • the length of shoots in the test tube was 11.67 cm to 19.33 cm in the seedlings, 36.45 cm to 46.33 cm in the harvester, and 55.33 cm in the extractor by treatment of bacterial suspension (2 ⁇ 10 7 CFU / ml) in the rice root area. Each increased to 61.0 cm.
  • the root length increased from 2.67 cm to 7.67 cm in seedlings, and the numbers of tillers also increased from 1.9 to 2.9 in the handset and 5.3 to 7.0 in the extractor (see Table 14 below).
  • 16S rRNA gene sequence of the two strains is 1,513 bp in sequence, identically aligned except for two nucleotides (database accession numbers KP203893 (YC7007) and KP201498 (YC7010 T ) in GenBank / EMBL / DDBJ). (See Figure 1). 16S rRNA gene sequencing revealed that the two strains were in the same clade with the same branch length in the phylogenetic tree, B. siamensis KACC 15859 T (99.67%), and Bacillus methylotrophicus ( B.
  • strains are Gram-positive, motile, rod-shaped, and show good growth at 13-60 ° C. (optimal 28-30 ° C.) and pH 4-12 (optimum pH 7). These strains were able to grow in 0.1 TSA medium containing 1-13% (w / v) sodium chloride but no sodium chloride was required for growth. These strains are resistant to chloramphenicol at a concentration of 30 ⁇ g / ml. These strains also contained meso-diaminopimelic acid as the antagonist diamino acid in the cell wall peptidoglycan and MK-7 as the major respiratory quinone system. Other physiological and biochemical characteristics of the YC7007 and YC7010 strains are summarized in Table 1 above.
  • Major fatty acids of YC7007 and YC7010 strains were anteiso-C 15: 0 (38.4 and 32.0%) and iso C 15: 0 (28.1 and 27.7%), respectively.
  • Other cellular fatty acid profiles of YC7010 are C 16: 0 (7.7%), iso C 17: 0 (6.4%), anteiso-C 17: 0 (5.3%), iso C 16: 0 (5.2%), C 18: 0 (5.1%), C 16: 1 ⁇ 7 c alcohol (3.4%), iso C 14: 0 (2.9%), iso-C 17: 1 ⁇ 10 c (1.7%), C 16: 1 ⁇ 11 c (1.4%), C 14: 0 (1.1%), and C 20: 1 ⁇ 7 c (0.2%) (see Table 3 above).
  • G + C content of YC7007 and YC7010 strain genomic DNA was 50.5 mol% and 51.2 mol%, respectively. These strains exhibited a polar lipid profile consisting of phosphatidylethanolamine (PE), phosphatidylglycerol (PG), diphosphatidylglycerol (DPG), unknown glycolipid (GL), and unknown aminolipids (AL1-2).
  • PE phosphatidylethanolamine
  • PG phosphatidylglycerol
  • DPG diphosphatidylglycerol
  • GL unknown glycolipid
  • A1-2 unknown aminolipids
  • Bacillus original cola YC7010 Bacillus oryzicola YC7010 T sp. nov.
  • Cells are Gram-positive, rod-shaped (0.8-0.9 ⁇ 2.0-3.0 ⁇ m). Colonies grown on 28 ° C R2A agar medium for 2 days are white-cream, round, flat elevation with an entire margin. The cells are motile with a single polar flagella. The cell wall contains meso-diaminopimelic acid as antagonist diamino acid. Cells usually appear singly or in pairs, catalase-positive and oxidase-negative, and grow at 13-60 ° C. and pH 4-12.0. Casein and gelatin hydrolysis are positive but negative for starch, Tween 20, Tween 80, tyrosine and carboxymethyl cellulose.
  • the API ZYM kit also showed esterase (C4), esterase lipase (C8), naphthol-AS-Bl-phosphohydrolase and Nphthol-AS-Bl-phosphohydrolase.
  • Enzymatic activity of acetyl- ⁇ -glutosaminidase (N-acetyl- ⁇ -glucosaminidase), but lipase (C-14), leucine arylamidase, valine arylamida dehydratase (valine arylamidase), aryl cysteine amidase (cystine arylamidase), galactosidase azepin trypsin (trypsin), ⁇ - chymotrypsin ( ⁇ -chymotrypsin), ⁇ - galactosidase ( ⁇ -galactosidase), ⁇ - go ( It does not show activity against ⁇ -galactosidase, ⁇ -glucosidase
  • the YC7007 and YC7010 strains which are most similar to B. siamensis , are the most important rice seed-derived pathogen, F. fujikuroi , as a bacanae pathogen. It showed potent antagonistic activity that inhibits mycelial growth.
  • the culture filtrate of YC7007 also has potent inhibitory activity against bake, bacterium blight and grain rot, and thus can be regarded as a strain producing antifungal substances.
  • Some Bacillus genera produce some peptides and lipopeptides, such as fengycin, iturin and surfactin, and have been reported to have good inhibitory effects on plant pathogens (Bais, HP, Fall, R.
  • the culture filtrate of YC7007 also reduced the onset of panicle blight and bacterial blight by more than 70% compared to the control.
  • B. subtilis 2.5 ⁇ 10 8 CFU / ml
  • B. cereus Cell suspension treatment of AR156 5 ⁇ 10 8 CFU / ml
  • the plant growth promoting rhizobacterium Bacillus cereus AR156 induces systemic resistance in Arabidopsis thaliana by simultaneously activating salicylate-and jasmonate / ethylene dependent signaling pathways Mol.Plant -Microbe Interact .
  • Bacillus subtilis and B. Bacillus cereus AR156 has a bacterial concentration (10 8 CFU / ml) 100 times higher than YC7007 (10 6 CFU / ml), which is not practical for practical use in production farms.
  • the optimal concentration of bacteria should be below 10 7 CFU / ml, considering the dilution factor in the end use of the user (Chen, XH, Scholz, R., Borriss, M., Junge, H., Mogel, G., Kunz, S. and Borriss, R. 2009.
  • YC7007 strains are expected to have direct and / or indirect interactions between pathogens as bacterial suspensions with antagonistic activity against pathogens are irradiated to the root of rice and foliar injection of culture filtrate.
  • Panicle blight and bacterial blight are controlled by irrigation or spray treatment, where YC7007 strains are induced systemic resistance (ISR) or systemic acquired resistance (SAR) in preventing disease. ) seems to be control by acting through (Ahn, IP, Lee, SW and Suh, SC 2007.
  • ISR induced systemic resistance
  • SAR systemic acquired resistance
  • Rhizobacteria induced priming in Arabidopsis is dependent on ethylene, jasmonic acid, and NPR1 Mol Plant-Microbe Interact 20:... 759- 768 .; Niu et al., 2011).
  • the reaction mechanism needs to be determined in terms of hormonal signaling through the salicylic, jasmonic or ethylene pathways in the SAR or ISR.
  • Bacillus species are commercialized as biological pesticides because of their long-term persistence in adverse environments over long periods of time. Some have functioned in many plants by inducing systemic resistance (Hu et al., 2011; Kloepper et al., 2004). B. vallismortis EXTN-1 and B. cereus were used to control rice blast, rice sheath blight, and bakanae Kazempour and Elahinia, 2007; Park et al., 2006). It is considered to be the first report in this study that Bacillus strain YC7007 has long-term sustained activity in inducing resistance in rice to major bacterial diseases of panicle blight and bacterial blight.
  • the YC7007 strain has been shown to be effective in promoting rice growth by applying a single bacterial suspension to seedlings immediately after germination.
  • the YC7007 strain increased shoot and root lengths by 1.1-2.9 times in seedlings, harvesters, and extractors, and 1.3 times in the shooters and extractors, compared to the control group.
  • Induction of host resistance is known to have a negative effect on host plants in that they inhibit growth associated with plant hormones of gibberellic acid and auxin.
  • Immune system are each rice and Arabidopsis thaliana (Arabidopsis), at least in part, hormones and interaction bra Sino steroid (brassinosteroids) and taking advantage of inhibiting gibberellin acid and auxin through the (negative cross talk) from by the silicic acid (salicylic acid) (De Vleesschauwer, D., Van Buyten, E., Satoh, K., Balidion, J., Mauleon, R., Choi, IR, Vera Cruz, C., Kikuchi, S. and Hofte, M.
  • the YC7007 strain is a good candidate for the development of biological control agents having the versatility of inducing resistance and promoting growth in rice without side effects.
  • the YC7007 strain has antifungal and antibacterial activity through antibiotic production.
  • Two endogenous strains named YC7007 and YC7010, in the present invention were further characterized based on multiphase studies, including 16S rRNA gene sequence, DNA-DNA hybridization, fatty acid analysis and other physical and biochemical experiments. Both strains have been identified as new species of the genus Bacillus in the same clade with the same branch length in the phylogenetic tree. The total sequence branching ratio of the two strains was the same, but different from other related species in the phylogenetic branching. The YC7007 and YC7010 strains showed 100% similarity and showed very high DNA-DNA association values of 91.5%, indicating that the two strains are the same Bacillus species. B. siamensis , B.
  • YC7010 strain is a new species (Goris, J., Konstantinidis, KT, Klappenbach, JA , Coenye, T., Vandamme, P. and Tiedje, JM 2007. DNA-DNA hybridization values and their relationship to whole genome sequence similarities.Int . J. Syst.Evol.Microbiol .
  • the major cellular fatty acids of YC7007 and YC7010 were anteiso-C 15: 0 and iso C 15: 0 , identical to other related species of the genus Bacillus. Small amounts of other fatty acids in the two strains were different from those of the late Bacillus strains.
  • Each bacterium has a unique fatty acid profile, the fatty acid analysis is used as an effective means in bacterial classification (Kampfer, P. 1994. Limits and possibilities of total fatty acid analysis for classification and identification of Bacillus species. Syst. Appl. Microbiol 17: 86-98).
  • the major isoprenoid quinones of the YC7007 and YC7010 strains were MK-7 (menaquinone-7), like the base strains of the genus Bacillus (Chen, JH, Tian, XR, Ruan, Y., He, ZQ, Tang, SK, Li, WJ, Shi, H. and Chen, YG 2015.Bacillus crassostreae sp., Nov. , Isolated from an oyster in the South China Sea.Int . J.
  • the two strains YC7007 and YC7010 belonged to the genus Bacillus, thus suggesting the YC7007 and YC7010 strains as a new species and Bacillus oryzicola YC7010 T as reference strain. sp. nov.).
  • the endogenous strain B. oryzicola YC7007 is a strain having multifunctional activity in rice, which has direct inhibition of fungal and bacterial pathogens, induces systemic resistance, and promotes plant growth. It can be used practically as a microbial inoculant.
  • SEQ ID NO: 1 is the nucleotide sequence of 16S rRNA gene of Bacillus oryzicola YC7007 strain according to the present invention.
  • SEQ ID NO: 2 is a nucleotide sequence of 16S rRNA gene of Bacillus oryzicola YC7010 strain according to the present invention.

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Abstract

식물 병원 진균 및 세균의 생육을 광범위하게 억제할 수 있고 동시에 기주 식물인 벼에 특이적으로 작용하여 병 저항성 유도 및 식물생육 촉진 효과를 모두 갖는 다기능 식물 내생세균을 분리, 대량 배양하여 제제화 함으로써 미생물 비료 효능도 가진 새로운 형태의 생물 농약으로 이용될 수 있는 신균주가 개시된다. 본 발명은 신규 미생물 바실러스 오리지콜라(Bacillus oryzicola) 또는 상기 바실러스 오리지콜라(Bacillus oryzicola)와 70% 이상의 디엔에이-디엔에이 연관 값(DNA-DNA relatedness value)을 보유한 바실러스 오리지콜라(Bacillus oryzicola)를 제공한다.

Description

벼 근권에서 분리된 신규 식물 내생세균 바실러스 오리지콜라 및 이를 이용한 천연식물 보호 및 식물 강화제 개발
본 발명은 식물 내생 미생물 및 이를 함유한 미생물 제제에 관한 것으로, 보다 상세하게는 신규 미생물 바실러스 오리지콜라(Bacillus oryzicola) 및 이를 함유한 미생물 제제에 관한 것이다.
본 발명은 본 발명은 2010년 농림수산식품부에서 지원하는 '차세대생물농약개발사업'(과제고유번호: 10044909, 과제명: 효과지속형 광범위 프로바이오틱 작물 보호제 개발)과 2013년 산업통상부에서 지원하는 '산업융합원천기술개발사업'(과제고유번호: 808015-3-2, 과제명: 길항 미생물을 이용한 식물병 방제용 차세대 미생물소재 개발(2010-2013))의 일환으로 수행된 연구로부터 도출된 것이다.
세계적으로 지난 수십여 년간 곡류, 채소, 과수 등 농작물의 수량을 증가시키기 위하여 해마다 많은 양의 화학 비료와 병, 해충 및 잡초 방제를 위한 화학농약을 사용해 왔다. 이와 같은 계속적인 화학비료 및 농약 사용에 의하여 토양 산성화, 지력 손실, 환경오염과 생태계 파괴, 인축독성, 병해충 및 잡초의 농약에 대한 저항성 유발 등의 문제가 지속적으로 제기되고 있다. 또한 대기 중 이산화탄소 량의 증가로 인한 이상 기후 변화로 지속적인 한발 및 농토의 염류 축적으로 작물의 안정적인 생산이 위협받고 있는 실정이다.
국내외에서는 이러한 문제들을 해결하기 위하여 화학 비료 및 농약의 사용량을 감축하고자 노력하고 있으며, 특히 우리나라에서는 1999년 최초로 친환경농업 육성법을 제정한 이후 현재까지 제3차 친환경농업 육성 정책을 추진해오고 있다. 이 계획의 목표는 2015년까지 2011년 대비 약 15% 정도의 화학비료 및 농약 사용량을 감축하는 것이다. 이와 동시에 사회적으로는 생활수준 향상으로 인한 안전 식품에 대한 국민의 요구가 증가되고 있고, 농업 생산 환경 및 자연 생태계의 보존을 지향하는 유기농업이나 자연농법 등의 친환경농업이 급속히 확대되고 있어, 화학비료 및 농약을 대체할 수 있는 미생물을 이용한 비료 및 생물농약 개발에 대한 연구가 급격히 증가되고 있다. 최근 다국적 기업에서는 화학비료와 농약 사용의 한계점을 인식하고 이를 보완할 수 있는 생물학적 작용제, 즉 식물활성 강화제를 개발하여 판매하고 있으며, 다른 한편으로는 가뭄이 심하거나 염류가 집적된 지역에서도 생장 가능한 내건성 작물 종자 육종 등을 진행하고 있다. 이렇게 개발된 미생물 제품들은 특정 기능이 있는 미생물을 환경에서 선발하여 대량 배양 후 제제화하여 엽면 살포 또는 입제로 토양 처리함으로써 병해충을 방제하거나 미생물 비료 또는 식물강화제로 이용되기도 한다(비특허문헌 1 참조).
여기에 사용되는 미생물들은 토양, 식물근권, 해양 등 자연환경에 널리 분포되어 있으면서 그 종류가 다양하고 여러 종의 대사산물을 분비하기 때문에 친환경농업에 효과적으로 이용되고 있다. 미생물의 이용 방법으로는 크게 3가지로 나눌 수 있는데, 미생물 자체를 이용하는 방법, 미생물 발효에 의해 생산되는 대사 물질을 이용하는 방법, 새로운 농약 합성을 위한 선도 화합물로 미생물 대사 물질을 이용하는 방법 등이다. 이 중에서도 식물 병원균을 억제할 수 있는 길항 미생물, 식물 생육을 촉진시키는 식물생육 촉진 근권세균(PGPR) 및 식물 내생(endophytic) 미생물의 직접 사용에 의한 경우가 대부분이며, 특히 이들 미생물에 의한 식물병 저항성 연구가 많이 진행되고 있다.
최근 10여년 간 여러 미생물 중에서도 식물 내생세균에 대한 연구가 국내외적으로 활발하게 이루어지고 있는데, 내생세균은 살아 있는 건강한 식물 조직 내에 살면서 식물에는 실질적인 해를 주지 않고 여러 가지 이점을 주는 세균으로 정의되고 있다. 일반적으로 식물 내생세균은 식물세포 사이의 공간이나 세포 내에 존재하기도 하며 직·간접적으로 식물의 병해충, 스트레스에 대한 저항성을 유도하기도 하고 식물 생장에도 큰 영향을 주는 것으로 알려져 있다. 보다 구체적으로는 내생세균은 질소 고정, 인산의 가용화, 철분 착화합 물질(siderophore) 생산, 활성 호르몬의 생성, 항균물질 생산 또는 식물의 병 저항성을 유도하여 병 감염을 방지하고 식물생장을 촉진하는 것으로 여겨진다(비특허문헌 1 내지 4 참조). 이러한 내생세균은 기주 식물과 친화적이며 병원균으로 인식되지 않고 기주 식물의 조직에 공생할 수 있다(비특허문헌 5 참조). 어떤 특정 내생세균은 하나 또는 그 이상의 기작을 동시에 이용하여 식물생장 촉진과 병 방제 효과를 낼 수 있고, 식물의 일생 동안 각 다른 시기에 다른 기작이 적용될 수도 있다. 식물 유전자는 세균이 존재함으로써 바뀔 수도 있으며, 이렇게 변화된 유전자가 식물에서의 내생세균의 효과에 대한 실마리를 제공하기도 한다(비특허문헌 6 참조). 식물 내생세균은 세포 내에서 증식하는데, 보통 뿌리와 줄기 시작 부분에서 전체 밀도가 높고, 줄기, 잎 등의 식물체 윗부분으로 갈수록 점점 줄어들며, 옥수수 잎의 경우에는 그 밀도가 log103~log107cfu/g 정도로 밝혀졌다. 현재까지 분리된 내생세균은 바실러스(Bacillus), 슈도모나스(Pseudomonas), 엔테로박터(Enterobacter), 아그로박테리움(Agrobacterium) 등 50여개 속에서 130여 종이 알려져 있으며, 이들은 토마토, 감자, 옥수수 및 벼와 같은 경제적으로 중요한 작물의 생장 및 병 발생을 억제하여 작물의 생산을 증진시킨다.
벼는 세계 5대 작물 중의 하나로 여러 가지 병에 의하여 많은 생산 손실이 일어나고 있다. 그 중에서도 도열병, 잎집무늬마름병 등 병원 진균에 의한 피해는 작물 생산에 치명적인 손실을 일으키는 것으로 현재까지 저항성 품종 육종, 화학 살균제 개발 등을 통하여 효과적으로 방제되고 되고 있다. 그러나, 이 외에 주로 종자전염에 의해 발병되는 키다리병이나 세균병인 알마름병 및 흰잎마름병 등도 지역에 따라 많이 발생하여 큰 피해를 주는데 최근 들어 방제에 많은 어려움을 겪고 있다. 이들 병원균은 논토양이나 주위 잡초 조직에서 월동하며 특히 따뜻하고 습한 조건에서는 벼가 병균에 취약하므로 일단 한번 발병이 시작되면 방제하기가 어렵다. 이러한 병원균의 방제는 주로 화학 살균제에 의존해 왔으나 대부분의 살균제 사용은 환경오염이나 인축독성 위험 문제가 있어 이를 대체할 수 있는 친환경적인 생물 농약에 대한 관심이 커지고 있다.
현재까지 개발되어 판매되고 있는 식물병 방제용 생물농약은 국내외적으로 수십 여 종에 이르고 있는데, 이들 중 효과가 있다고 인정된 것은 주로 세균 바실러스(Bacillus)와 곰팡이인 트리코데르마(Trichoderma)를 이용하여 만든 제품이다(비특허문헌 7 내지 10 참조). 바실러스(Bacillus) 제품에 사용된 종류는 바실러스 서브틸리스(B. subtilis), 바실러스 푸밀러스(B. pumilus) 및 바실러스 아밀로리퀘페이션스(B. amyloliquefaciens)가 있으며, 이 균주들은 거의 대부분이 항균물질인 이투린(iturin), 서팩틴(surfactin) 등의 고리형 펩티드(cyclic peptide)를 분비하여 병균을 직접 억제하는 기작을 갖고 있거나 기주의 병 저항성을 유도하는 것으로 알려져 있다. 바실러스(Bacillus sp.)는 내생포자(endospore)를 형성하여 좋지 않은 자연 환경에서도 오랜 기간 생존할 수 있고, 항균 능력이 좋은 이유로 많은 연구자들이 식물병의 생물학적 방제를 위하여 연구 결과를 발표하고 있다(비특허문헌 10 참조). 앞서 언급한 종류 외에 최근 새로운 내생세균 바실러스 메칠로트로피쿠스(Bacillus methylotrophicus)에 대한 몇 건의 연구 결과가 보고되었다. 이 균주는 2010년 우리나라에서 처음으로 분리 명명되어 식물생장 촉진 능력이 있는 것으로 확인 되었고(비특허문헌 1 참조), 이어서 중국에서 인삼, 토마토, 감자 근권에서 분리되어 병원균 억제능력과 식물생육 촉진 효과가 있다고 보고되었다(비특허문헌 11 내지 13 참조). 그러나 이들 연구에서는 이 균주가 식물병원균에 대한 항균력 외에 기주 식물의 병 저항성 유도 또는 다른 병 억제에 대한 결과는 없다. 벼의 근권 미생물에 대한 연구는 주로 벼 재배 지역인 한국, 중국 등의 연구자에 의하여 많이 진행 되었는데, 최근 관행 및 무경운 벼의 생육시기별 근권 세균 군집 비교에 대한 연구가 발표되었다. 이 연구 결과 프로티오박테리아(Proteobacteria)에 속하는 세균들의 군집이 무경운 벼에서 더 많이 발견되었고, 관행 농업 벼 근권에서는 상대적으로 퍼미큐티스(Firmicutes)에 속하는 다양한 세균, 특히 바실러스(Bacillus sp.) 종이 높은 비율로 발견되었다(비특허문헌 14 참조). 또한 벼의 근권에서 병원균인 도열병균 또는 키다리병원균 생장을 억제하는 여러 종의 바실러스(Bacillus sp.), 패니바실러스(Paenibacillus sp.) 및 슈도모나스(Pseudomonas sp.) 종이 분리되었다고 보고되었다(비특허문헌 15 참조). 벼의 근권에 살고 있는 여러 세균 종의 다양성에 대한 연구가 일부 진행되었으나 본 발명에서 제시하고자 하는 바와 같이 벼에 특징적으로 작용하면서 다양한 기능을 가진 새로운 세균에 대한 연구는 전혀 없다. 이 외에도 특수한 환경에서 분리된 바실러스(Bacillus sp.) 종류에 대하여 많은 연구가 진행되었지만 실제로 상품화되어 식물병 방제에 효과적으로 사용되는 것은 몇 종에 불과하다(비특허문헌 16 및 17 참조). 이것은 길항 세균을 분리할 때 단순히 병원균을 억제하는 기작만을 기준으로 삼았기 때문에 상대적으로 방제 효과가 낮은 것이 한 원인일 것으로 생각된다. 따라서, 이 균주의 특성을 살리면서 보다 효과적인 방제를 위하여 항균 활성, 기주 식물의 병 저항성 유도 능력 및 생육 촉진 효과를 동시에 보유함으로써 식물을 강화시킬 수 있는 새로운 다기능 미생물의 탐색과 개발이 필요하다.
[비특허문헌]
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이에 본 발명은 상기의 단점을 보완할 수 있는 한 방법으로 식물 병원 진균 및 세균의 생육을 광범위하게 억제할 수 있고 동시에 기주 식물인 벼에 특이적으로작용하여 병 저항성 유도 및 식물생육 촉진 효과를 모두 갖는 신규 다기능 식물 내생세균을 분리, 대량 배양하여 제제화 함으로써 미생물 비료 효능, 식물 강화 효능 및 식물보호 효능을 모두 가진 새로운 미생물 제제를 개발하여 제공하는 것을 그 목적으로 하고 있다.
상기 과제를 해결하기 위하여 본 발명은, 신규 미생물 바실러스 오리지콜라(Bacillus oryzicola) 또는 상기 바실러스 오리지콜라(Bacillus oryzicola)와 70% 이상의 디엔에이-디엔에이 연관 값(DNA-DNA relatedness value)을 보유한 바실러스 오리지콜라(Bacillus oryzicola)를 제공한다.
또한 상기 바실러스 오리지콜라(Bacillus oryzicola)는 서열번호 1 또는 서열번호 2로 기재되는 염기서열을 갖는 16S rRNA를 포함하는 것을 특징으로 하는 바실러스 오리지콜라(Bacillus oryzicola)를 제공한다.
또한 상기 바실러스 오리지콜라(Bacillus oryzicola)는 바실러스 오리지콜라(Bacillus oryzicola) YC7007(수탁번호: KCCM11275P) 또는 바실러스 오리지콜라(Bacillus oryzicola) YC7010(수탁번호: KACC 18228)인 것을 특징으로 하는 바실러스 오리지콜라(Bacillus oryzicola)를 제공한다.
또한 상기 바실러스 오리지콜라(Bacillus oryzicola)는 식물병 저항성 유도 효능을 갖는 것을 특징으로 하는 바실러스 오리지콜라(Bacillus oryzicola)를 제공한다.
또한 상기 식물병은 벼 알마름병, 벼 흰잎마름병, 벼 이삭마름병 및 벼 키다리병으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는 바실러스 오리지콜라(Bacillus oryzicola)를 제공한다.
또한 상기 바실러스 오리지콜라(Bacillus oryzicola)는 식물병원균 억제 효능, 식물생육 촉진 효능 및 식물 강화 효능을 더 갖는 것을 특징으로 하는 바실러스 오리지콜라(Bacillus oryzicola)를 제공한다.
또한 상기 식물생육 촉진 효능은 벼에 대한 식물생육 촉진 효능인 것을 특징으로 하는 바실러스 오리지콜라(Bacillus oryzicola)를 제공한다.
또한 상기 미생물, 이의 배양액 또는 배양여액을 유효성분으로 함유하는 비료용, 식물 보호용 및 식물 강화용 미생물 제제를 제공한다.
이러한 본 발명에 따르면, 작물의 중요한 식물병원 진균 및 세균의 생장을 동시에 억제할 수 있고, 기주 식물의 병 저항성 유도 및 생육촉진 효과를 모두 갖는 다기능 세균 바실러스 오리지콜라(Bacillus oryzicola)를 이용, 항생물질, 생육촉진 및 기주의 전신성 병 저항성 유도 물질을 분비하여 식물병원균을 직접 억제할 뿐만 아니라 벼에 특이적으로 작용하여 생육 촉진, 전신성 병 저항성 유도 능력을 동시에 모두 지닌 다기능 세균을 함유한 제제로서, 지금까지 보고된 어느 세균보다도 천연 식물 보호제, 식물 강화제 및 미생물 비료로서의 역할을 동시에 수행할 수 있는 우수한 미생물 제제를 제공할 수 있게 된다.
도 1은 YC7007 균주(a) 및 YC7010 균주(b)의 16S rRNA 유전자의 염기서열,
도 2는 YC7007 균주의 16S rRNA 유전자 서열 분석으로 만든 계통수,
도 3은 YC7007 균주의 유전자 분석(BOX-PCR)을 이용한 유사 균주 대비 유전자 비교 분석 결과를 나타낸 사진,
도 4는 벼 알마름병 방제효과를 설명하는 처리구별 비교 사진,
도 5는 벼 흰잎마름병 방제효과를 설명하는 처리구별 비교 사진,
도 6은 YC7007 균주 배양여액의 배양기간별 항균 효과를 나타낸 그래프(a) 및 사진(b),
도 7은 YC7007 균주 배양여액의 온도 처리별 항균 효과를 나타낸 그래프,
도 8은 YC7007 균주의 배양여액에 의한 주요 종자 유래 세균 병원균의 성장 억제능을 나타낸 그래프,
도 9는 YC7007 균주에 대하여 벼의 흰잎마름병(bacterial blight) 및 이삭마름병(panicle blight)에 대한 전신 저항성 유도 활성을 조사한 결과를 나타낸 사진(A) 및 그래프(B).
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 상세히 설명하기로 한다. 이에 앞서, 본 명세서 및 청구범위에 사용된 용어나 단어는 통상적이거나 사전적인 의미로 한정해서 해석되어서는 아니 되며, 발명자는 그 자신의 발명을 가장 최선의 방법으로 설명하기 위해 용어의 개념을 적절하게 정의할 수 있다는 원칙에 입각하여, 본 발명의 기술적 사상에 부합하는 의미와 개념으로 해석되어야만 한다. 따라서, 본 명세서에 기재된 실시예의 구성은 본 발명의 가장 바람직한 일실시예에 불과할 뿐이고 본 발명의 기술적 사상을 모두 대변하는 것은 아니므로, 본 출원 시점에 있어서 이들을 대체할 수 있는 다양한 균등물과 변형예들이 있을 수 있음을 이해하여야 한다.
본 발명자들은 식물 병원 진균 및 세균의 생육을 광범위하게 억제할 수 있고 동시에 기주 식물인 벼에 특이적으로 작용하여 병 저항성 유도 및 식물생육 촉진 효과를 모두 갖는 다기능 식물 내생세균을 분리, 대량 배양하여 제제화 함으로써 미생물 비료 효능도 가진 새로운 형태의 생물 농약으로 이용될 수 있는 신 균주를 발견하였다.
즉 논에서 분리된 세균을 탐색한 결과 새로운 종의 세균이 상기 효능을 모두 구비한 것을 확인하였고, 이에 대한 16S rRNA 유전자의 염기서열 결정 및 분석과 DNA-DNA 상동성 실험 등을 수행한 결과, 바실러스 속(Bacillus sp.)에 속하는 신종 미생물로 동정되어 "바실러스 오리지콜라(Bacillus oryzicola) YC7007"로 명명하였다.
본 발명에서 신종 미생물은 바실러스 오리지콜라(Bacillus oryzicola) 뿐 아니라 Goris 등의 논문(Goris, J., Konstantinidis, K. T., Klappenbach, J. A., Coenye, T., Vandamme, P., and Tiedje, J M. (2007). DNA-DNA hybridization values and their relationship to whole-genome sequence similarities. Int J Syst Evol Microbiol 57:81-91)에 따라 DNA-DNA 교잡(hybridization)을 한 경우 70% 이상의 DNA-DNA 연관성 값(relatedness value)을 나타내는 미생물도 본 발명의 바실러스 오리지콜라(Bacillus oryzicola)에 포함되는 것으로 해석되어야 한다. 즉 Goris 등의 논문에 제시된 기준에 따라 DNA-DNA 혼성화를 한 경우 70% 이상의 DNA-DNA 연관성 값을 나타내는 미생물은 본 발명의 바실러스 오리지콜라(Bacillus oryzicola)와 동일한 미생물로 취급될 수 있다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면 상기 바실러스 오리지콜라(Bacillus oryzicola)는 서열번호 1 또는 서열번호 2로 기재되는 염기서열을 갖는 16S rRNA를 포함할 수 있고, 또한 상기 바실러스 오리지콜라(Bacillus oryzicola)는 바실러스 오리지콜라(Bacillus oryzicola) YC7007(수탁번호: KCCM11275P)또는 바실러스 오리지콜라(Bacillus oryzicola) YC7010(수탁번호: KACC 18228)일 수 있다.
이하, 실시예를 들어 본 발명을 상세히 설명하기로 한다. 본 실시예에서는 YC7007 균주에 관한 실험 중심의 실시예 1과, YC7010 균주에 관한 실험 중심의 실시예 2로 나누어 설명한다.
실시예 1
YC7007 균주의 분리 및 동정
(1) YC7007 균주의 분리
YC7007 균주는 진주시 경상대학교 시험포장의 논토양에서 자라는 벼의 뿌리 내부조직에서 분리되었다. 먼저, 식물 내생세균을 분리하기 위하여 뿌리 절단 조각의 표면을 1% 차아염소산나트륨(NaOCl) 용액에 10분간 담구어 표면을 살균하였다. 이 조각들을 1/10TSA 배지(Tryptic Soy Broth 3g, 한천 16g / 증류수 1ℓ)에 올려 놓고, 2~3일 정도 배양하면서 표면에서 세균 생장 여부를 관찰하면서 표면 살균 여부를 확인하였다. 조각의 표면 살균이 확인된 뿌리 조각 1.0g을 취하여 고압멸균기에서 살균된 증류수 9.0㎖를 넣어 살균된 주발과 절구로 마쇄하였다. 이 마쇄된 액 0.1㎖를 취하여 살균된 증류수 0.9㎖에 넣어 10배씩 희석(10-3)하고 순차적으로 10배씩 추가 희석(10-4 및 10-5)하였고, 희석액을 1/10TSA 배지에 3등분하여 분주한 후 고르게 도말하였다. 이 배양기를 28℃에서 2~3주 동안 배양하고 생육된 단일 집락을 순수하게 분리하였고, 이를 YC7007 균주로 명명하였다.
(2) YC7007 균주의 동정
상기 분리된 YC7007 균주의 동정을 위하여, 하기와 같이 형태학적 특성, 생리·생화학적 특성에 관한 조사를 수행하였다. 상기 분리된 YC7007 균주와 유사한 표준균주(type species)를 대상으로, 형태학적 특성은 주사전자현미경으로 조사하였고, 생리·생화학적 특성은 본 발명자가 개발한 분석 방법과 일반적인 분석법을 사용하여 조사하였다(비특허문헌 7 참조).
분리된 YC7007 균주는 그람(Gram) 양성으로 운동성이 있고, 세포는 막대형(폭 0.6㎛, 길이 1.8~2.6㎛)이고, 내생포자를 형성하였으며, 혐기성 조건에서는 생장이 불가능하였다. 이 균주와 유사한 종과의 생리·생화학적 특성을 조사한 결과를 하기 표 1에 나타내었고, DNA-DNA 연관성 값은 하기 표 2에 나타내었다. 표 1에서 사용된 모든 균주에 대한 결과는 상기 분석 방법에 따른 조사 결과이다.
표 1
Figure PCTKR2015005342-appb-T000001
표 1을 참조하면, YC7007 균주의 생리·생화학적 특성을 유사한 다른 바실러스(Bacillus) 종들과 비교한 결과, pH 4.5와 pH 12에서 생장, 14% 소금 용액에서 생장, 60℃에서 생장, 젤라틴 분해, 카복시메칠 셀루로즈 미분해, API kit 시험의 아부틴, 디락토스, 전분, 글리코겐, 겐티비오스 분해, 나프톨-에이에스-비아이-포스포하이드로라제, 엔-아세칠-베타-글루코스아미니다제 효소 등의 중요한 표현형적 특성에서 YC7007 균주가 근연종들과 다른 점을 확인할 수 있다.
한편, YC7007 균주의 16S rRNA 유전자의 염기서열(1513bp, 도 1 참조)을 결정하고, GenBank/EMBL/DDBJ의 데이터베이스와 상동성 검색을 수행하여 계통학적 위치를 검토하였다. 도 2에서는 YC7007 균주의 16S rRNA 유전자 서열 분석으로 만든 계통수를 나타내고 있다. 도 2에서 교점 숫자는 1000 반복에서 나온 부트스트랩 값(bootstrap value)을 나타낸다.
YC7007 균주와 근연종과의 상이성을 확실하게 하기 위하여 디엔에이-디엔에이 교잡(DNA-DNA hybridization)을 조사하고 그 결과를 하기 표 2에 나타내었다. 실험 방법은 DIG DNA Labelling and Detection kit(Roche Applied Science)를 이용하고 Lee 등의 논문(Lee, S. H., Shim, J. K., Kim, J. M., Choi, H. K. & Jeon, C. O. (2011). Henriciella litoralis sp. nov., isolated from a tidal flat, transfer of Maribaculum marinum Lai et al. 2009 to the genus Henriciella as Henriciella aquimarina nom. nov. and emended description of the genus Henriciella. Int J Syst Evol Microbiol 61: 722-727)을 참고하여 수행하였다. 추출된 유전체 DNA(genomic DNA)를 각기 다른 농도로 희석한 다음 수산화나트륨(NaOH) 용액을 가하고 80℃의 열을 주어 변성시킨다. 그 후 Hybond-N+ 나일론 막(Amersham Pharmacia Biotech)에 3반복으로 붙여 올린다. 제한효소 HaeIII를 처리하고 얻은 각각의 DNA 조각들은 균주 간 교차 교잡(hybridization)을 위한 표지된 DNA 프로브(Labelled DNA probe)로 사용되었고, 혼성화와 세척(washing) 온도는 지시 매뉴얼대로 수행하였다. digoxigenin(DIG)-dUTP와 혼성체(hybrids)로 표지된 랜덤 초회 DNA(labelled random primed DNA)는 DIG High Prime DNA Labelling kit(Roche Applied Science)를 사용한 효소 면역분석(enzyme immunoassay)에 의해 나일론 막(nylon membrane)에 검지(detect)되었다. 교잡 신호(hybridization signals)는 scanner(HP Scanjet 3770)와 Adobe Photoshop(v. 7.0)를 사용하여 확인 및 분석하였다. 표적 DNA(Target DNA)와 프로브(Probe)의 교잡 신호(hybridization signal)를 100%로 잡았다. 균주들 사이의 DNA-DNA 연관성(relatedness) 수치는 희석을 통한 자가-교잡(self-hybridization)의 신호(signal)의 강도에 의해 계산하였다. 그 결과 YC7007 균주가 YC7010 균주와는 연관성 값이 91.5% 이었으나 나머지 바실러스 아밀로리퀘페이션스(B. amyloliquefaciens), 바실러스 메칠로트로피쿠스(B. methylotrophicus), 바실러스 시아멘시스(B. siamensis), 바실러스 서브틸리스(B. subtilis), 바실러스 테퀼렌시스(B. tequilensis)와는 모두 50.4% 이하로 이들 종과는 다른 종으로 확인되었다. 유사한 종 간의 디엔에이-디엔에이 연관성 값이 70% 이상의 경우에만 동일 종으로 인정되며, 이 값보다 낮을 경우에는 다른 종으로 인정된다(Goris, J., Konstantinidis, K. T., Klappenbach, J. A., Coenye, T., Vandamme, P., and Tiedje, J M. (2007). DNA-DNA hybridization values and their relationship to whole-genome sequence similarities. Int J Syst Evol Microbiol 57:81-91).
표 2
Figure PCTKR2015005342-appb-T000002
YC7007 균주와 근연종 간의 지방산 분석을 수행하고 그 결과를 하기 표 3에 나타내었다. 표 3을 참조하면 YC7007 균주가 근연종과 전체적인 패턴은 유사하나 C16:1 ω7c alcohol, C16:1 ω11c은 발견되지 않았고, 다른 지방산의 양은 약간의 차이가 있었다.
표 3
Figure PCTKR2015005342-appb-T000003
[주]
* Summed features는 가스크로마토그라피로 분석되지 않는 C17:1 ISO I/ANTEI 을 포함하고 있음.
- 1: YC7007
- 2: YC7010T
- 3: B. amyloliquefaciens subsp. plantarum KACC 17177T
- 4: B. methylotrophicus KACC13105T
- 5: B. siamensis KACC 15859T
- -: 발견 안됨
도 3에서는 YC7007 균주의 유전자 분석(BOX-PCR)을 이용한 근연종 균주 대비 유전자 비교 분석 결과를 나타내고 있다. 유전자 분석(BOX-PCR)을 위한 폴리머라제(polymerase)는 Platinum Taq DNA polymerase High Fidelity(Invitrogen), 프라이머(primer)는 BOXAR1(5'-CATCGGCAAGGCGACGCTGACG-3')을 사용하였다. PCR 조건은 초기 변성(initial denaturation)은 95℃에서 7분, 35회 반복되는 과정인 변성(denaturation), 어닐링(annealing), 연장(extension)은 각각 90℃에서 30초, 40℃에서 1분, 72℃에서 3분, 마지막으로 final extension은 72℃에서 10분간 반응시켜 증폭시켰다. 이러한 과정을 거쳐 얻은 PCR 산물에 대해 1% LE agarose gel(Seakem)을 이용하여 증폭유무를 확인하였다. 도 3에서 M은 1kb 마커(marker), 1은 YC7007 균주, 2는 바실러스 메칠로트로피쿠스(Bacillus methylotrophicus) KACC13105 균주, 3은 바실러스 시아멘시스(Bacillus siamensis) PD-A10T 균주를 나타낸다.
도 3에 나타낸 바와 같이, YC7007 균주와 학명이 같은 표준균주와 보다 세부적인 비교를 위해 유전자 분석(BOX-PCR)을 수행한 결과, YC7007 균주는 근연종 균주들과는 다른 것으로 판명되었다.
따라서, 본 발명의 미생물은 위에서 얻어진 생리·생화학적, 분자생물학적 결과를 바탕으로 볼 때 새로운 균주로 확인되었으며, 그 명칭을 바실러스 오리지콜라(Bacillus oryzicola) YC7007 균주로 명명하고 2012년 04월 18일자로 한국미생물보존센터(KCCM: Korean Culture Center of Microorganisms)로부터 수탁번호 KCCM11275P를 부여받았다.
신규 바실러스 오리지콜라(Bacillus oryzicola) 에 대한 분류학적 기술은 다음과 같다.
그람 양성균이며 내생포자를 형성할 수 있는 호기성, 간균(0.6~1.0×2.5~2.8㎛)으로 세포는 단독 또는 짝을 이루어 있다. 1/10 TSA 배지에 24시간 배양했을 때 균총은 크림흰색(creamy white), 중앙이 볼록(convex), 정상적인 가장자리(regular edge)의 형태를 가진다. 온도 20~60℃, pH 4.5~12, 염화나트륨(NaCl) 농도 0~13%에서 생장한다. 항생제 저항성 테스트 결과, 30㎍/㎖ 농도의 클로람페니콜(chloramphenicol)에 저항성을 가지고 있지만, 10㎍/㎖의 암피실린(ampicillin), 겐타미신(gentamicin), 페니실린(penicillin)과 30㎍/㎖의 테트라사이클린(tetracyclin), 스트렙토마이신(streptomycin), 반코신(vancomycin), 카나마이신(kanamycin)에는 저항성이 없었다. 주요 지방산은 anteiso-C15:0과 iso-C15:0이었다.
YC7007 균주의 병원 진균 및 세균에 대한 배양기내 억제효능 검정
YC7007 균주를 포함한 분리 내생세균 10종의 병원 진균 및 세균에 대한 억제효능을 검정하기 위하여, 하기와 같이 항균활성을 조사하였다.
내생세균 YC7007의 항균 활성은 중요한 식물병원 진균 4종(Gibberella fujikuroi(벼키다리병), Pythium ultimum(모잘록병), Bipolaris oryzae(벼깨씨무늬병), Magnaporthe grisea(벼도열병) 및 병원 세균 3종(Burkholderia glumae(벼알마름병), Xanthomonas oryzae pv. oryzae, Xanthomonas oryzae pv. oryzae(벼흰잎마름병)에 대한 대면 생물검정(confrontation bioassay) 방법으로 생장의 억제 조사로 확인하였다.
상기 병원 진균과 YC7007 균주는 감자한천설탕배지(PDB, Difco) 5g을 포함한 생육배지(16g 한천 / 증류수 1ℓ) 1/5PDA와 1/10TSA에서 평판디스크 측정법(paper disc method)을 이용하여 생장 억제효과를 조사하였다. 종이 디스크(직경 5㎜)를 배양기 가장자리로부터 1㎝ 똑같은 거리에 놓았고, 균주 배양액 100㎕를 종이 디스크에 충분히 스며들게 한 후 가운데에 PDA 배지에서 4일 동안 자란 병원 진균 균사 디스크(6㎜)를 놓고 병균에 따라 24~28℃에서 4~6일간 배양하였다.
병원 세균 억제 조사는 28℃에서 하룻밤 동안 배양한 병원 세균을 살균 증류수에 현탁하여(O.D600=0.1) 현탁액 0.1㎖를 배지에 도말 한 후 YC7007 균주의 병균 생장 억제 정도를 측정하였다. YC7007 균주가 생산하는 배양여액의 병균 억제효과는 균주를 한천을 제외한 위 배양 액체 배지에서 28℃, 72시간까지 진탕배양(120rpm)하고, 배양액을 원심분리 후 밀리포어 필터(millipore filter)로 걸러낸 여액을 이용하였다. 배양여액의 온도에 대한 반응을 보기 위하여 각 처리 온도로 유지된 온수에 10분간 처리 후 억제효과를 조사하였다.
하기 표 4에 YC7007 균주의 주요 식물병원 진균 및 주요 식물병원 세균에 대한 항균활성 조사 결과를 나타내었다.
표 4
Figure PCTKR2015005342-appb-T000004
[주]
- 억제 거리: +, < 3㎜; ++, 4~5㎜; +++, 6~8㎜; ++++, >8㎜.
표 4를 참조하면, 내생세균 YC7007 균주의 식물병원 진균에 대한 항균활성은 배지에 따라 약간 다르지만 3~10㎜ 균사 생장 억제효과를 나타낸 것을 확인할 수 있다.
또한 하기 표 5를 참조하면, 내생세균 YC7007 균주의 식물병원 세균에 대한 항균활성도 1/10TSA에서 배양액은 4~10㎜, 배양여액은 3~8㎜ 생장 억제효과를 나타낸 것을 확인할 수 있다.
표 5
Figure PCTKR2015005342-appb-T000005
[주]
- 억제거리: +, <3㎜; ++, 4~5㎜; +++, 6~8㎜; ++++, 8~10㎜.
이러한 결과로부터 현재까지 알려진 다른 어느 길항 세균보다 더 광범위한 병원균 억제효과가 있는 것으로 파악할 수 있다.
YC7007 균주의 병원 진균에 대한 포트 실험 방제효능 검정
상기 실시예 2에 따른 실험실 배양기내 시험의 억제 효과를 바탕으로 YC7007 균주의 7종의 주요 식물병에 대하여 하기와 같이 직접 식물에 처리하여 방제효과를 조사하였다. 방제효능 검정은 한국화학연구원에 의뢰하여 시행하였으며, 대상 식물병은 벼 도열병, 벼 잎집무늬마름병, 토마토 잿빛곰팡이병 , 토마토 역병(병원균: Phytophthora infestans), 밀 붉은녹병(병원균: Puccinia recondita), 보리 흰가루병(병원균: Blumeria graminis f. sp. hordei) 및 고추 탄저병(병원균: Colletotrichum coccodes)이었다.
약제 처리는 YC7007 균주 현탁액을 접종 1일 전에 식물병 당 식물 2포트씩을 회전원판 위에 놓고 회전시키면서 분무총(1㎏/㎠)으로 식물체 전체에 골고루 충분히 부착되도록 살포하여 수행되었다. YC7007 균주 현탁액의 관주 처리에 의한 병 저항성 유도 효과 조사는 균주를 병원균 접종 7일 전에 각 기주 식물 3포트 당 5㎖씩 관주하고 온실에서 1주일 간 재배 후 병 발생 정도를 조사하여 수행되었다. 균주 현탁액 준비는 1/10TSB 배지에서 28℃로 하루 밤 동안 진탕배양 후 원심분리하여 세균 세포를 10mM MgSO4 용액에 현탁시켜 2x106cfu/㎖ 농도로 조절하여 사용하였다. 병원균 접종 및 발병 조사는 균주를 처리한 식물에 7종 병원균의 포자 및 균체를 각 기주 식물에 접종하여 수행하였다. 각 식물병에 대한 구체적인 실험방법은 다음과 같다.
벼 도열병(RCB)은 병원균인 마그나포스 그리시어(M. grisea) KJ201 균주를 쌀겨 한천배지에 접종하여 25℃ 배양기에서 2주간 배양하여 형성된 포자를 살균 증류수로 수확하여 일정 농도의 포자현탁액(3x105 spores/㎖)을 준비하였다. 이를 약제 처리된 낙동 벼(본엽 3~4엽기)에 흘러내릴 정도로 충분히 분무하였다. 접종된 벼는 습실상에서 암상태로 24시간 배양한 뒤에 상대습도 80% 이상이며 온도가 26℃인 항온항습실에서 4일간 발병시킨 후 병반면적율을 조사하였다.
벼 잎집무늬마름병(RSB)은 적당한 양의 밀기울을 1ℓ 배양병에 넣고 멸균한 후 병원균인 리족토니아 솔라니(R. solani)AG1 균주를 접종한 후 25℃ 배양기에서 7일간 배양하였다. 병 접종은 배양된 균사덩어리를 적당하게 잘게 마쇄하여 약제 처리된 4~5엽기의 낙동 벼가 자란 포트에 고르게 접종하여 습실상(25℃)에서 7일간 배양하여 발병을 시킨 후 병 조사는 잎집(sheath)에 형성된 병반면적율을 조사하였다.
토마토 잿빛곰팡이병(TGM)은 병원균인 보트리티스 시네레아(B. cinerea)를 감자한천배지에 접종하여 25℃ 항온기에서 배양하여 형성된 포자를 접종원으로 사용하였다. 병 접종은 포자를 수확하여 혈구계를 사용하여 포자농도를 3x105 포자/㎖로 만든 후 약제가 처리된 토마토 유묘(2~3엽기)에 분무접종 하였다. 접종된 토마토 유묘는 20℃ 습실상(상대습도 95% 이상)에 넣어 3일간 발병을 유도시킨 후 병반면적율을 조사하였다.
토마토 역병(TLB)은 병원균인 파이토프쏘라 인페스탄스(P. infestans) 균주를 오트밀 배지에 접종하여 20℃ 배양기에서 배양하여 유주자낭을 형성시켰다. 병원균 접종은 형성된 유주자낭을 살균 증류수를 첨가하여 수확하고 포자농도가 3x104 포자낭/㎖인 포자현탁액을 만들었다. 이들을 냉장고에 넣어 저온 처리하여 유주자를 유출시켜 유주자 현탁액을 준비하였다. 이를 약제 처리된 토마토 유묘(2~3엽기)에 분무접종 하였다. 병원균을 접종한 토마토 유묘는 20℃ 습실상에서 2일간 습실처리하고 항온항습실에서 발병시켜 접종 3일 후에 잎에 발생한 병반면적율을 조사하였다.
밀 붉은녹병(WLR)은 병원균인 푸치니아 레콘디타(P. recondita)는 활물기생균이므로, 실험실에서 식물체에 직접 계대배양하면서 밀 유묘에 형성된 하포자를 접종원으로 사용하였다. 균주의 약효조사를 위하여 일회용 포트(직경: 4.5㎝)에 5립씩 밀 종자(품종: 은파)를 파종하여 온실에서 8일간 재배한 1엽기 유묘에 약제를 처리하고 1일 후에 접종원(포자 0.11g/ℓ)을 분무접종하였다. 접종된 밀 유묘는 20℃의 습실상에서 1일간 습실처리한 후에 상대습도가 70%인 20℃의 항온항습실로 옮겨서 발병을 유도하고 접종 7일 후에 병반면적율을 조사하였다.
보리 흰가루병(BPM)은 병원균인 블루메리아 그라미니스(B. graminis f. sp. hordei)는 활물기생균이므로 실험실에서 보리 유묘로 계대배양하면서 보리에 형성된 포자를 접종원으로 사용하였다. 약효조사는 일회용 포트(직경: 4.5㎝)에 5립씩의 보리 종자(품종: 동보리)를 파종하여 온실에서 8일간 재배한 1엽기 유묘에 약제를 살포하고 온실에서 풍건시킨 후 약제 처리된 보리에 흰가루병 포자를 털어 접종하였다. 접종된 보리 유묘는 20~23℃, 상대습도 60% 정도의 항온항습실에 두어 7일간 발병시킨 후 병반면적율을 조사하였다.
고추 탄저병(RPA)은 병원균인 콜레토트리쿰 코코데스(C. coccodes)를 오트밀 배지에 접종하고 25℃에서 10일 동안 배양하여 형성된 포자를 수확하고, 포자 농도를 ㎖당 2x105 spores가 되도록 조정하여 포자현탁액을 준비하였다. 약제를 처리한 고추 유묘(3~4엽기)에 준비한 포자현탁액을 분무접종하고 이를 습실상(25℃)에 넣고 2일 동안 습실처리한 후에 항온항습실(25℃, 75% RH)에서 발병시켰다. 접종 3일 후에 고추 잎에 형성된 병반면적율을 조사하였다.
방제가는 병 조사로부터 얻은 병반면적율로부터 하기 수학식 1에 따라 계산하여 산출하였다.
수학식 1
Figure PCTKR2015005342-appb-M000001
하기 표 6에 YC7007 균주의 주요 식물병에 대한 방제효과 조사 결과를 나타내었다.
표 6
Figure PCTKR2015005342-appb-T000006
표 6을 참조하면, 7종의 주요 식물병에 대한 방제효과는 벼 도열병, 밀 붉은녹병, 보리 흰가루병 및 고추 탄저병의 경우 70~83% 정도의 방제가를 보였으나, 벼 잎집무늬마름병, 토마토 잿빛곰팡이병 및 토마토 역병의 경우에는 36% 이하의 낮은 방제가를 나타낸 것을 알 수 있다. 특히, 토양에 관주 후 병 저항성 유도에 의한 방제효과는 벼의 경우에만 35%로 나타나 YC7007 균주가 벼에 대한 기주 특이성이 있음을 확인할 수 있다.
YC7007 균주의 병 저항성 유도에 의한 벼 알마름병 방제효능 검정
YC7007 균주의 병 저항성 유도에 의한 벼 알마름병 방제효능을 검정하기 위하여, 하기와 같이 방제효과를 조사하였다.
식물 생육상(28~30℃, 상대습도 80% 이상)에서 5주 동안 재배한 벼(동진1) 유묘를 멸균 또는 비멸균 벼 재배용 상토에 옮겨 심은 뒤 바로 균주 현탁액(2x107cfu/㎖) 10ml를 상토(120g)에 분주 처리하였다. YC7007 균주 현탁액 준비는 1/10TSB 배지에서 28℃로 하루 밤 동안 진탕배양 후 원심분리하여 세균 세포를 10mM MgSO4 용액에 현탁시키고 농도를 적절하게 조절하여 수행하였다. 처리 5일 후에 벼 알마름병균(B. glumae) 현탁액 (5x107cfu/ml, OD600=0.1)을 접종 침에 묻혀 각 잎에 3반복으로 20개 잎에 접종하였다. 병원균 현탁액은 R2A 배지에서 24시간 배양 후 원심분리하여 세균 세포를 10mM MgSO4 용액에 현탁시키고 농도를 적절하게 조절하여 사용하였다. 병원균 접종 후 5일 동안 생육상에 둔 후에 병반 괴사 정도를 조사하였다. 발병도는 0~3(0: 병징 없음, 1: 소형 괴사반점, 2: 몇 개 괴사반점이 합쳐져 대형 갈반, 3: 전체 괴사)으로 구분하였고, 방제가는 대조구에 대한 병 억제 정도를 계산하여 산출하였다. 벼의 병 저항성 유도 대조약제로는 벤조티아디아졸(benzothiadiazole(BTH), 1mM 용액)을 사용하였다.
하기 표 7에 YC7007 균주의 토양처리에 의한 벼 알마름병 방제효과 조사 결과를 나타내었으며, 도 4에서 벼 알마름병 방제효과를 설명하는 처리구별 비교 사진을 나타내었다.
표 7
Figure PCTKR2015005342-appb-T000007
표 7 및 도 4를 참조하면, YC7007 균주 현탁액을 토양에 처리한 5일 후에 병균을 접종하여 방제 효과를 조사한 결과, 균주 처리구는 잎병반길이 2.0㎜, 발병도 1.1로 병균만 처리한 대조구의 잎병반길이 17.4㎜, 발병도 2.4에 비하여 훨씬 적게 나타났으며, 방제가는 54%로 대조약제인 BTH의 57%와 동일한 정도의 기주 병 저항성 유도 효과가 확인되었다.
YC7007 균주의 병 저항성 유도에 의한 벼 흰잎마름병 방제효능 검정
YC7007 균주의 병 저항성 유도에 의한 벼 흰잎마름병 방제효능을 검정하기 위하여, 하기와 같이 방제효과를 조사하였다.
식물 생육상(28~30℃, 상대습도 80% 이상)에서 5주 동안 재배한 벼(동진1) 유묘를 멸균 또는 비멸균 벼 재배용 상토에 옮겨 심은 뒤 바로 균주 현탁액(2x107cfu/㎖) 10㎖를 상토(120g)에 분주 처리하였다. 처리 5일 후에 벼 흰잎마름병균(X. oryzae pv. oryzae) 현탁액(1x107cfu/㎖, OD600=0.1)을 접종 침에 묻혀 각 잎에 3반복으로 20개 잎에 접종하였다. 벼 흰잎마름병균 현탁액은 상기 벼 알마름병균과 같은 방법으로 준비하였다. 병균 접종 후 5일간 생육상에 둔 후에 병반 괴사 정도를 조사하였다. 발병도는 0~9(0: 병징 없음, 1: 소형 괴사반점, 2~4: 몇 개 괴사반점이 합쳐져 중형 갈반, 5~8: 몇 개 괴사반점이 합쳐져 대형 갈반, 9: 전체 괴사)으로 구분하였고, 방제가는 대조구에 대한 병 억제 정도를 계산하여 산출하였다.
하기 표 8에 YC7007 균주의 토양처리에 의한 벼 흰잎마름병 방제효과 조사 결과를 나타내었으며, 도 5에서 벼 흰잎마름병 방제효과를 설명하는 처리구별 비교 사진을 나타내었다.
표 8
Figure PCTKR2015005342-appb-T000008
표 8 및 도 5를 참조하면, YC7007 균주 현탁액을 토양에 처리한 5일 후에 병균을 접종하여 방제 효과를 조사한 결과, 병원균의 바늘 접종(pin prick)과 크리핑(clipping) 접종 방법에 따라 약간 차이가 있으나, 병원균만 처리한 잎의 발병도가 각각 7.4 및 5.67인 것에 반해, YC7007 균주 처리구는 2.3 및 2.2로 각각 69% 및 61%(평균 65%)의 방제가를 나타내어, 우수한 기주 병 저항성 유도 효과가 확인되었다.
YC7007 균주의 병 저항성 유도에 의한 벼 키다리병 방제효능 검정
YC7007 균주의 병 저항성 유도에 의한 벼 키다리병 방제효능을 검정하기 위하여, 하기와 같이 방제효과를 조사하였다.
식물 생육상(28~30℃, 상대습도 80% 이상)에서 2주 동안 재배한 벼(동진1) 유묘를 멸균 또는 비멸균 벼 재배용 상토에 옮겨 심은 뒤 바로 균주 현탁액(105 ~107cfu/㎖) 15㎖를 상토(150g)에 분주 처리하였다. 처리 3일 후에 벼 키다리병균(G. fujikuroi)(5x105cfu/g)을 3반복으로 반복 당 10개씩의 유묘에 1.5g/pot 씩 접종하였다. 접종 후 10~30일 동안 생육상에 둔 후에 병 발생 정도를 조사하였다. 발병도는 0~5 (0: 병징 없음, 1: 잎 약간 황화 및 줄기 왜화, 2~3: 잎 황화 및 줄기 키 커짐, 5: 전체 괴사)으로 구분하였고, 방제가는 대조구에 대한 병 억제 정도를 계산하여 산출하였다.
하기 표 9에 YC7007 균주의 토양처리에 의한 벼 키다리병 방제효과 조사 결과를 나타내었다.
표 9
Figure PCTKR2015005342-appb-T000009
표 9를 참조하면, YC7007 균주 현탁액을 토양에 처리한 3일 후에 병균을 접종하여 방제 효과를 조사한 결과, 병원균만 처리한 곳에서는 발병도가 3.4이었으나 균주 처리구는 1.4로 58.8%의 방제가를 나타내어, 우수한 기주 병 저항성 유도 효과가 확인되었다.
YC7007 균주 처리에 의한 벼의 생육 촉진 효능 검정
YC7007 균주 처리에 의한 벼의 생육 촉진 효능을 검정하기 위하여, 하기와 같이 식물생육 촉진 효능을 조사하였다.
벼 재배용 상토 1㎏을 균주 현탁액(2x107cfu/㎖) 200㎖와 골고루 혼합 후에 발아된 벼 종자를 파종하였다. 파종 후 식물 생육상(28~30℃, 상대습도 80% 이상)에서 재배하면서 10일(유묘기), 30일(분얼기), 75일(출수기) 후에 각각 줄기와 뿌리 생장 정도를 조사하였다. 대조구는 같은 양의 10mM MgSO4 완충 용액만으로 혼합한 토양을 사용하였다. 접종 30일 후 분얼기에 세균 밀도의 유지를 위하여 YC7007 균주 현탁액 5㎖를 벼 뿌리 부분 토양에 다시 관주 처리하였다. 각 처리는 3반복으로 반복 당 10주의 식물을 사용하였다.
하기 표 10에 YC7007 균주의 벼 생육 촉진 효능 조사 결과를 나타내었다.
표 10
Figure PCTKR2015005342-appb-T000010
표 10을 참조하면, YC7007 균주를 벼 재배용 상토에 처리하여 포트에 재배하면서 생육기 별로 생장 촉진 효과를 조사한 결과, YC7007 균주 처리구는 유묘기에서 줄기와 뿌리의 길이가 모두 무처리구의 11.7㎝ 및 2.7㎝에 비하여 19.3㎝ 및 7.7㎝로 훨씬 길었고, 분얼기에서도 줄기 길이가 27.4% 더 증가되었고 분얼된 숫자도 52% 정도 더 많았다. 출수기에서도 YC7007 균주 처리구는 줄기 길이가 10.8% 더 증가되었고 분얼된 숫자도 32% 정도 더 많은 것으로 나타나, YC7007 균주 처리에 의한 벼의 생육 촉진 효능이 확인되었다.
병원균 억제 항균물질의 생산 및 효과 조사
YC7007 균주에 의한 병원균의 억제가 항균물질 생산에 의한 것인지를 확인하기 위하여 1/10TSB 액체배지에서 항균물질 생산 여부를 조사하였다. 항균물질의 억제 효과 정도는 전술한 디스크 확산법(disc diffusion method)으로 실시하여 종이 디스크 주위에 형성된 곰팡이 균사 또는 세균 세포 생장 억제 거리를 측정하여 확인하였다. YC7007 균주를 액체배지에서 28℃로 72시간 동안 진탕(180rpm) 배양하여 9000g으로 10분간 원심분리 후 배양여액을 밀리포어 필터(millipore filter, 0.2㎛)로 여과 후에 배양 시간별로 항균활성을 측정하였다.
도 6은 YC7007 균주 배양여액의 배양기간별 항균 효과를 나타낸 그래프(a) 및 사진(b)이고, 도 7은 YC7007 균주 배양여액의 온도 처리별 항균 효과를 나타낸 그래프이다.
먼저, 도 6을 참조하면, YC7007 균주 배양여액의 배양기간별 항균 효과는 벼 병원세균(B. glume, X. oryzae) 및 키다리병균(G. fujikuroi)은 균주 배양시간이 증가할수록 억제 효과가 높아지다가 60시간 배양여액에서 억제 효과가 가장 좋았으며, 72시간 배양여액은 효과가 급속히 감소하는 것으로 나타났다.
또한, 도 7을 참조하면, 배양여액의 열에 대한 안정성을 조사한 결과 90℃ 처리 시까지는 항균활성이 유지되었으나 100℃를 넘어서면 억제효과가 다소 감소하는 것으로 나타났다. 이 결과로 보아 YC7007 균주에 의하여 생산되는 항균물질은 상대적으로 열에는 안정한 물질인 것으로 볼 수 있다.
YC7007 균주의 제제화
YC7007 균주의 활성과 보관 중 밀도 유지를 위하여, 하기와 같이 분말과 액제 형태로 제제화하였다.
균주를 대형 발효기(1톤 이상)에서 배양하여 얻은 세균 배양액 또는 원심분리 후 얻은 균체를 카올린(kaolin), 벤토나이트(bentonite), 이탄(peat) 등의 점토 광물과 1:100으로 혼합하여 저온에서 말린 후 균일하게 분쇄하여 분말 형태의 고상제로 제조하였다. 동시에 균 배양체를 상기 점토 광물과 1:100으로 혼합하여 액제 현탁액 형태로도 제조하였다.
상기와 같이 제제화한 시료의 밀도를 조사한 한 결과 대부분의 제제에서 108 cfu/g 이상을 포함하고 있었으며, 점토 광물과 혼합하여 제제한 액제 현탁액도 108 cfu/㎖ 이상의 밀도를 함유한 것으로 확인되었다.
실시예 2
쌀은 전세계 인구의 절반 이상의 주식으로 2013년에는 약 7.45억톤이 생산된 것으로 추산된다. 아시아 지역에서 가장 많이 생산되고 있으나, 주요 제한 요인인 병으로 해마다 24~41%의 손실이 발생한다(Annonymous 2014. Rice market monitor. In: Monthly report, Food and Agriculture Organization of the United Nations, vol. 17, iss. 1, pp 1-4(http://www.fao.org/3/a-i3735e.pdf).; Savary, S., Willocquet, L., Elazegui, F. A., Castilla, N. P. and Teng, P. S. 2000. Rice pest constrainsts in tropical Asia: Quantification of yield losses due to rice pests in a range of production situations. Plant Dis. 84:357-369.). 벼에서 곰팡이, 박테리아, 바이러스 및 선충류(nematodes)에 의한 병이 70여 가지 이상 기록되었다. 특히 도열병(rice blast), 세균성 잎마름병(bacterial leaf blight), 벼알마름병(grain rot) 및 벼키다리병(bakanae)은 수확량을 감소시키는 가장 심각한 종자 전염병이다(Ou, S. H. 1985. Rice disease. 2nd ed. Commonwealth Mycol. Inst., 361 pp. Key, England.). 잔토모나스 오리재(Xanthomonas oryzae pv. oryzae)에 의한 흰잎마름병(bacterial blight)은 상황에 따라서 전체 쌀 생산량의 10~50%를 감소시켜 큰 영향을 미친다(Mew, T. W. 1992. Foliar disease, bacterial blight. In: Compendium of Rice Diseases, eds. by R. K. Webster and P. S. Gunnell, pp. 10-11.). 벌크홀데리아 글루메(Burkholderia glumae)에 의한 모마름 및 썩음병(seedling blight and rot), 잎집썩음병(leaf sheath rot), 잎갈변병(leaf browning), 이삭마름병(panicle blight), 세균성 시들음병(bacterial wilt) 및 벼알마름병(grain rot)을 포함하는 다른 세균성 질병은 어떠한 경우에는 수확량의 75%까지 감소시킨다(Croplife 2015. Bacterial panicle blight, the disease with the greatest impact on rice crops. (http://www.croplifela.org/en/disease-of-the-month.html?id=182).; Kim, J., Kang, Y., Kim, J. G., Choi, O. and Hwang, I. 2010. Occurrence of Burkholderia glumae on rice and field crops in Korea. Plant Pathol. J. 26:271-272.; Ura, H., Furuya, N., Iiyama, K., Hidaka, M., Tsuchiya, K. and Matsuyama, N. 2006. Burkholderia gladioli associated with symptoms of bacterial grain rot and leaf-sheath browning of rice plants. J. Gen. Plant Pathol. 72:98-103.). 푸사리움 푸지쿠로이(Fusarium fujikuroi)에 의한 벼키다리병(bakanae)으로 인한 수확량 감소는 아시아에서의 벼 재배 지역에서 약 10~50%로 추산된다(Bonman, J. M. 1992. Root and crown disease, bakanae. In: Compendium of Rice Diseases, eds. by R. K. Webster and P. S. Gunnell, p. 27.). 이러한 질병 방제를 위해 화학 살균제가 지난 수십 년간 대부분의 아시아 국가에서 광범위하게 사용되었으나, 최근에는 내성으로 인해 살균제 약효가 감소하고 있다(Yang, Y. R., Kim, Y. C., Lee, S. W., Lee, S. W., An, G. G. and Kim, I. S. 2012. Involvement of an efflux transporter in prochloraz resistance of Fusarium fujikuroi CF245 causing rice bakanae disease. J. Korean Soc. Appl. Biol. Chem. 55:571-574.). 또한 화학 살균제의 오용은 농업 환경과 작업자에게 부작용을 유발한다. 따라서 이를 대체할 수 있는 방제 수단의 개발, 특히 길항 세균을 이용한 생물학적 방제가 많은 아시안 국가에서 시도되고 있다(Gnanamanickam, S. S. 2009. An overview of progress in biological control. In: Biological control of rice diseases, Progress in biological control, ed. by S. S. Gnanamanckam, vol. 8, pp. 43-51. Springer, Netherlands.).
길항 세균을 이용한 생물학적 방제는 환경적으로 안전하고, 집약된 병 관리 수단으로 구현될 수 있다. 바실러스(Bacillus), 벌크홀데리아(Burkholderia), 라이소박터(Lysobacter), 판토에아(Pantoea), 슈도모나스(Pseudomonas) 및 스트렙토마이세스(Streptomyces)와 같은 다양한 미생물 속이 많은 농작물 병의 방제를 위한 생물학적 방제제로 사용되고 있으나, 벼 질병의 생물학적 방제에 대해서는 몇몇 연구만이 보고되고 있다(Bouizgarne, B. 2013. Bacteria for plant growth promotion and disease management. In: Bacteria in agrobiology, Disease mangement, ed. by D. K. Maheshwari, pp. 15-34. Springer-Verlag, Berlin, Heidelberg.; McSpadden Gardener, B. 2010. Biocontrol of plant pathogens and plant growth promotion by　Bacillus. In: Recent developments in management of plant diseases, Plant pathology in the 21st Century. eds. by U. Gisi, I. Chet and M. L. Gullino, chapt. 6, pp. 71-79. Springer-Amsterdam.). 길항 세균 스트렙토마이세스(Streptomyces) 및 바실러스(Bacillus)의 다중 이용이 벼잎집무늬마름병(rice sheath blight) 방제를 위해 시도되었다(Sung, K. C. and Chung, Y. R. 1997. Enhanced suppression of rice sheath blight using combination of bacteria which produce chitinases or antibiotics. In: Proceedings of the 4th international workshop on plant growth promoting rhizobacteria present status and future prospects, eds. by A. Ogoshi, K. Kobayashi, Y. Homma, F. Kodama, N. Konodo and S. Akino, pp. 370-373. OECD, Paris.). 도열병(rice blast) 및 잎집무늬마름병(sheath blight)은 바실러스 발리스모르티스(Bacillus vallismortis) EXTN-1 및 두 길항 세균 균주 슈도모나스 플루오레센스(Pseudomonas fluorescens) mc75 및 pc78에 의해 효과적으로 방제되었다(Choi, G. J., Kim, J. C., Park, E. J., Choi, Y. H., Jang, K. S., Lim, H. K., Cho, K. Y. and Lee, S. W. 2006. Biological control activity of two isolates of Pseudomonas fluorescens against rice sheath blight. Plant Pathol. J. 22:289-294.; Park, K. S., Paul, D. and Yeh, W. H. 2006. Bacillus vallismortis EXTN-1 mediated growth promotion and disease suppression in rice. Plant Pathol. J. 22:278-282.). 푸사리움 모닐리포르메(Fusarium moniliforme) 및 푸사리움 푸지쿠로이(F. fujikuroi)에 의한 벼키다리병(bakanae) 및 벼모썩음병(seedling rot of rice) 또한 길항 세균 슈도모나스 플루오레센스(P. fluorescens) 및 바실러스 세레우스(Bacillus cereus)에 의해 방제되었다(Kazempour, M. N. and Elahinia, S. A. 2007. Biological control of Fusarium fujikuroi, the causal agent of bakanae disease by rice associated antagonistic bacteria. Bulg. J. Agric. Sci. 13:393-408.; Rosales, A. M. and Mew, T. W. 1997. Suppression of Fusarium moniliforme in rice by rice-associated antagonistic bacteria. Plant Dis. 81:49-52.). 다양한 길항 세균 중에서도 여러 바실러스 종이 상업적 생물 농약으로 개발되었다. 바실러스 종은 내생포자를 생산하고 처리 후 장기간 동안 자연환경에서 지속하기 때문이다(Hu, X., Roberts, D. P., Maul, J. E., Emche, S. E., Liao, X., Guo, X., Liu, Y., McKenna, L. F., Buyer, J. S. and Liu, S. 2011. Formulations of the endophytic bacterium Bacillus subtilis Tu-100 suppress Sclerotinia sclerotiorum on oilseed rape and improve plant vigor in field trials conducted at separate locations. Can. J. Microbiol. 57:539-546.).
다른 숙주에서 많은 식물병의 생물학적 방제에 폭 넓게 사용되는 바실러스 종으로 바실러스 아밀로리퀘페이션스(Bacillus amyloliquefaciens), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 바실러스 파스테리(Bacillus pasteurii), 바실러스 세레우스(B. cereus), 바실러스 푸밀루스(Bacillus pumilus), 바실러스 마이코이데스(Bacillus mycoides) 및 바실러스 스파에리쿠스(Bacillus sphaericus)가 있다(Kloepper, J. W., Ryu, C. M. and Zhang, S. 2004. Induced systemic resistance and promotion of plant growth by Bacillus spp. Phytopathology 94:1259-1266.; McSpadden Gardener, B. 2010. Biocontrol of plant pathogens and plant growth promotion by　Bacillus. In: Recent developments in management of plant diseases, Plant pathology in the 21st Century. eds. by U. Gisi, I. Chet and M. L. Gullino, chapt. 6, pp. 71-79. Springer-Amsterdam.). 바실러스 서브틸리스(B. subtilis) GB03 및 바실러스 아밀로리퀘페이션스(B. amyloliquefaciens) IN937는 애기장대(Arabidopsis)에서 세균성 병원균인 어위니아 카로토보라(Erwinia carotovora subsp. carotovora)를 방제하는 것으로 입증되었다(Ryu et al., 2004). 또한 바실러스 세레우스(B. cereus) AR156 및 바실러스 서브틸리스(B. subtilis)는 애기장대(Arabidopsis)에서 내성을 유도하여 슈도모나스 시린재(Pseudomonas syringae pv. tomato) DC3000를 방제하는 것으로 입증되었다(Niu, D. D., Liu, H. X., Jiang, C. H., Wang, Y. P., Wang, Q. Y., Jin, H. L. and Guo, J. H. 2011. The plant growth promoting rhizobacterium Bacillus cereus AR156 induces systemic resistance in Arabidopsis thaliana by simultaneously activating salicylate-and jasmonate/ethylene dependent signaling pathways. Mol. Plant-Microbe Interact. 24:533-542.). 이러한 바실러스 종의 몇몇은 숙주 식물에서 항진균성, 항세균성, 식물 성장 촉진 및 내성 유도 활성 면에서 특징이 있다(Park, K. S., Paul, D., Kim, J. S. and Park, J. W. 2009. L-alanine augments Rhizobacteria induced systemic resistance in cucumber. Folia Microbiol. 54:322-326.; Ryu, C, M. 2013. Promoting plant protection by root-associated microbes. Plant Pathol. J. 29:123-124.). 다양한 바실러스 종이 다양한 육상 및 염생 식물로부터 분리되었고, 이들 중 일부는 내생성을 보인다(비특허문헌 7 참조). 바실러스 속은 현재 299종이 있고, 16S rRNA 유전자 서열, DNA-DNA 혼성화 분석, 지방산 프로파일, 물리학적 및 생화학적 실험을 포함하는 다상 연구에 기초하여 30종 이상이 지난 5년간 새롭게 보고되었다(LPSN. 2015. List of prokaryotic names with standing in nomenclature. (http://www.bacterio.net/bacillus.html)).
본 실시예에서는 벼의 뿌리에서 분리된 두 가지 바실러스 균주 YC7007 및 YC7010에 대하여 다기능 활성을 가지는 새로운 생물학적 방제제 개발을 검토하였고, 다상 접근으로 분류를 특징화하였다. 또한 벼의 생장 촉진 뿐만 아니라 흰잎마름병(bacterial blight) 및 이삭마름병(panicle blight)에 대한 내성 유도를 통해 새로운 YC7007 및 YC7010 균주의 방제 효능을 조사하였다.
재료 및 방법
(1) 내생 세균의 분리 및 배양
경상대학교 농장(진주, 한국)의 논 토양에서 수집된 벼의 뿌리로부터 내생 세균 균주를 분리하였다. 분리를 위해 샘플 조각을 흐르는 물로 수회 세척하고 70% 에탄올로 5분간, 1.2% 차아염소산나트륨(NaOCl) 용액으로 10분간 표면 멸균을 수행하고, 마지막으로 멸균 증류수로 수회 세척하였다. 멸균 확인을 위해 세척된 절편을 1/10 TSA(one-tenth strength tryptic soy broth agar)에 28℃에서 3일간 두고 세균 성장을 관찰하였다. 세균 콜로니가 없는 것을 확인 후 샘플 절편을 다시 70% 에탄올로 수초간 멸균하고, 고압멸균기에 멸균 증류수를 넣어 살균된 주발과 절구로 마쇄하였다(비특허문헌 7 참조). 마쇄액 일부를 고압 멸균수에서 10배씩 순차적으로 희석시킨 후 이 중 일부(0.1ml)를 시클로헥시미드(cycloheximide)로 보충된 1/10　TSA 배지에 놓고 플레이트를 30℃에서 3일간 배양시켰다. 배지상에 성장한 세균 콜로니를 뚜렷한 콜로니 형태에 기초하여 선별하였다. 순수하게 분리된 세균 균주를 1/10　TSA 배지에서 계대배양하고 후속 사용을 위해 -70℃에서 보관하였다. 세균 균주 배양을 위해 증류수 리터 당 프로테아제 펩톤(protease peptone) 10g, 효모 추출물 10g, 염화암모늄 4g, 황산마그네슘 4g, 글루코오스 10g 및 한천 15g을 함유한 배지를 준비하였다.
(2) 진균 및 세균 병원체에 대한 길항 활성
내생 세균에 대하여 알터나리아 파낙스(Alternaria panax) KACC 42461, 푸사리움 푸지쿠로이(F. fujikuroi)KACC 44022, 푸사리움 옥시스포룸(F. oxysporum) KCTC 16909, 스클레로티니아 스클레로티오룸(Sclerotinia sclerotiorum) GSCC 50501, 파이티움 울티뭄(Pythium ultimum) GSCC 50651, 비폴라리스 오리재(Bipolaris oryzae) KACC 40853, 보트리티스 시네레아(Botrytis cinerea) KCTC 6973, 마그나포르테 그리세아(Magnaporthe grisea) KACC 40415, 보트리오스파에리아 도티데아(Botryosphaeria dothidea) GSCC 50201 및 리족토니아 솔라니(Rhizoctonia solani) KCTC 40101와 같은 주요 식물 진균 병원체에 대한 실험을 수행하였다. 세균 균주의 길항 활성은 in　vitro 대조 생물 시험법을 이용하여 PDA(potato dextrose agar) 배지에서 진균 병원체의 균사 생장 억제 영역을 측정함으로써 평가되었다(비특허문헌 7 참조). 항균 실험을 위해 벌크홀데리아 글루메(B. glumae) KACC10359 및 잔토모나스 오리재(X. oryzae pv. oryzae)KACC 10208을 R2A(one-half strength R2A) 및 YGC 배지(10 g glucose, 30 g CaCO3, 5 g yeast extract 및 15 g agar per liter distilled water)에서 각각 성장시키고, 확산 ㅈ종이 디스크법(diffusion paper disc method)을 이용하여 억제 활성을 실험하였다. 세균 균주 YC7007의 배양여액은 배양액으로부터 원심분리(5,000 g, 10 min) 및 밀리포어 필터(0.2㎛)를 통한 여과에 의해 다른 배양 시간으로 준비되었다.
(3) 세균 병원체에 대한 유도 저항성 검정
잔토모나스 오리재(X. oryzae pv. oryzae) KACC 10208 및 벌크홀데리아 글루메(B. glumae) KACC10359 각각에 의한 흰잎마름병(bacterial blight) 및 이삭마름병(panicle blight)에 대한 YC7007 종에 의한 저항성 유도를 실험(pot test)하였다. 벼 종자(Oryza sativa L. cultivar Dongjin)를 1.2% 차아염소산나트륨 용액으로 10분간 및 70% 에탄올로 5분간 표면 멸균 후 멸균 증류수로 3회 헹구고, 발아를 위해 30℃의 암실에서 3일간 보관하였고 물은 매일 교체하였다. 발아된 종자를 상용 상토(nursery soil, Dasuran Sangto, Youngnong Sun Up, Korea)에 파종하고, 재배를 위해 온실에 두었다. 이후 2주된 모를 2일 동안 하루에 20분씩 121℃에서 고압멸균 처리된 상토 약 150g을 포함하는 플라스틱 포트(9.5×8×7㎤)에 옮겨 심었다. YC7007의 세균 현탁액 준비를 위해 세균 세포를 회전식 진동기(160 rpm, 28℃) 상의 배지(liquid mass culture medium)에서 2일간 배양하고 원심분리(5,000 g, 10 min)하여 현탁액을 취하고 완충액(10 mM MgSO4)에서 다양한 농도(5.6×105, 3.6×106, 2×107 CFU/ml)로 맞추었다. 2주된 모를 옮겨 심는 동안 동시에 YC7007의 세포 현탁액(15ml)을 고압멸균된 흙(150g)을 포함한 플라스틱 포트에 관주하였다. 최적 농도(2×107 CFU/ml)의 YC7007를 흰잎마름병(bacterial blight) 및 이삭마름병(panicle blight)에 대한 추가 저항성 유도 실험에 사용하였다. 10mM 황산마그네슘으로 10배 희석된 60h 배양액으로부터 준비된 YC7007 균주의 배양여액을 방제 효과 확인을 위해 방울이 맺힐 때까지 잎에 분사시켰다. 이후 YC7007로 처리 5일 후에 세균 병원체를 접종하였다. 완충액을 대조군으로 사용하였고, 모든 실험은 각 처리당 3회 반복하여 10개의 식물을 이용하여 수행되었다.
(4) 세균 병원체의 접종원 준비
2개의 세균 병원체의 접종원으로, 회전식 진동기(160 rpm, 28℃)상의 R2A 및 YGC 배지에서 각각 배양 후 세포 현탁액을 이용하여 벌크홀데리아 글루메(B. glumae) KACC10359 및 잔토모나스 오리재(X. oryzae pv. oryzae) KACC 10208을 준비하였다. 벌크홀데리아 글루메(B.　glumae)의 배양액을 원심분리(5,000 g, 10 min)하고 6×107CFU/ml 농도로 조정된 완충액(10mM MgSO4)에서 세포 펠렛을 현탁시켰다. 벌크홀데리아 글루메(B. glumae) 현탁액의 접종을 위해 생물 시험법(pin-prick bioassay)을 실시하였다. 3-4 pins/needles 다발을 현탁액에 집어 넣고 다발의 니들로 잎을 뽑았다. 5주된 모에 병원체 접종 후 5일째 발병도를 평가하되, 0=증상 없음, 1=약간의 감염, 병변 거의 없음, 2=전체적으로 갈변된 응집 병변, 3=no description available 로 평가하였다(Cottyn, B., Cerez, M. T., Van Outryve, M. F., Barroga, J., Swings, J. and Mew, T. W. 1996. Bacterial diseases of rice. I. Pathogenic bacteria associated with sheath rot complex and grain discoloration of rice in the Philippines. Plant Dis. 80:429-437.). 흰잎마름병(bacterial blight)의 경우 잔토모나스 오리재(X. oryzae pv. oryzae) 현탁액은 벌크홀데리아 글루메(B. glumae)의 경우와 동일한 과정을 거쳐 준비되었고, 1.2×107 CFU/ml 농도로 조정되었다. 흰잎마름병(bacterial blight)에 대한 생물 시험법(clipping bioassay)은 현탁액에 넣은 가위를 이용하여 상부 잎을 자르는 방법으로 수행되었다. 접종 7일 후에 1-9점법에 따라 발병도를 평가하였다(Misra, J. K., Mew, T. W. and Merca, S. D. 1994. Field inspection. In: A manual of rice seed health testing, eds. by T. W. Mew and J. K. Misra, pp. 52-55. International Rice Research Institute, Philippines.). 병 감소율은 하기 수학식 2에 따라 계산되었다.
수학식 2
Figure PCTKR2015005342-appb-M000002
(5) 생장 촉진 측정
YC7007 균주의 세균 현탁액(2×107　CFU/ml) 처리에 따른 벼의 생장촉진을 재배 기간에 걸쳐 조사하였다. 배지(10ml 1/2 MS media with 0.8% agar)를 함유한 테스트 튜브(18cm length)에서 YC7007의 세균 현탁액(1ml)을 5일된 모의 근권에 관주하였다. 세균 처리 7일 후에 생장 정도를 기록하였다(12일째). 포트 실험의 경우 2주된 모를 약 150g의 고압멸균된 상토 및 세균 현탁액(15ml)을 포함한 플라스틱 포트에 옮겨 심고 이식 7일째에 관주하였다. 세균 처리 9일 후에 생장 정도를 기록하였다(30일째). 다시 세균 현탁액(15ml)을 분얼기(tillering stage)(30일째)에 관주하고 분얼기로부터 세균 처리 40일 후 출수기(booting stage)에 생장 정도를 기록하였다(70일째). 테스트 튜브 및 포트 실험에서 각 처리당 3회 반복하여 10개의 식물을 이용하여 생장촉진 활성 실험을 수행하였고, 완충액을 대조군으로 사용하였다.
(6) 16S rRNA 유전자 서열 및 DNA-DNA 혼성화에 기초한 계통분류학적 분석
16S rRNA 유전자를 상용 추출 키트(Intron Biotech, Seoul, Korea)로 추출된 유전체 DNA로부터 프라이머(bacterial universal primers 27F 및 1492R)를 이용하여 증폭시키고, 정제된 PCR 산물에 대해 시퀀싱(GenoTech Inc., Daejeon, Korea)을 수행하였다(Lane, D. J. 1991. 16S/23S rRNA sequencing. In: Nucleic acid techniques in bacterial systematics, eds. by E. Stackebrandt and M. Goodfellow, pp. 115-175. Chichester: Wiley.). 새로운 내생 세균과 다른 근연종과의 계통분류학적 위치를 확인하기 위해 균주의 16S rRNA 유전자 서열을 데이터베이스(NCBI and the EzTaxon-e database server)로부터 얻은 서열과 비교하였다(Kim, O. S., Cho, Y. J., Lee, K., Yoon, S. H., Kim, M., Na, H., Park, S. C., Jeon, Y. S., Lee, J. H., Yi, H., Won, S. and Chun, J. 2012. Introducing EzTaxon-e: a prokaryotic 16S rRNA gene sequence database with phylotypes that represent uncultured species. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 62:716-721.). CLUSTAL_X 소프트웨어를 이용하여 서열의 다중 정렬을 수행하였고(Thompson, J. D., Gibson, T. J., Plewniak, F., Jeanmougin, F. and Higgins, D. G. 1997. The CLUSTAL_X windows interface: flexible strategies for multiple sequence alignment aided by quality analysis tools. Nucleic Acids Res. 25:4876-4882.), BioEdit 프로그램을 이용하여 갭을 편집하였다(Hall, T. A. 1999. BioEdit: a user friendly biological sequence aligned editor and analysis program for Windows 95/98/NT. Nucleic Acids Symp. Ser. 41:95-98.). 1000 반복에서 나온 부트스트랩 값(bootstrap value)으로 계통수 수행을 위해 인접 결합 방법(neighbor-joining method; Saitou, N. and Nei, M. 1987. The neighbor-joining method: a new method for reconstructing phylogenetic trees. Mol. Biol. Evol. 4:406-425.), 최대 단순성 원리(maximum-parsimony; Fitch, W. M. 1972. Toward defining the course of evolution: minimum change for a specific tree topology. Syst. Biol. 20:406-416.), MEGA 5.10 소프트웨어에서 최대 가능성 알고리즘(maximum-likelihood algorithms; Tamura, K., Peterson, D., Peterson, N., Stecher, G., Nei, M. and Kumar, S. 2011. MEGA5: molecular evolutionary genetics analysis using maximum likelihood, evolutionary distance, and maximum parsimony methods. Mol. Biol. Evol. 28:2731-2739.)이 사용되었다(Felsenstein, J. 1985. Confidence limits on phylogenies: an approach using the bootstrap. Evolution 39:783-791.). 균주 사이에 DNA-DNA 연관 값 결정을 위해 제조사의 지시와 전술한 방법(Lee, S. H., Shim, J. K., Kim, J. M., Choi, H. K. and Jeon, C. O. 2011. Henriciella litoralis sp. nov., isolated from a tidal flat, transfer of Maribaculam marinum Lai et al. to the genus Henriciella as Henriciella aquimarina nom. nov. and emended description of genus Henriciella. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 61:722-727.)에 따라 키트(DIG DNA labeling and detection kit, Roche Applied Science)를 이용한 DNA-DNA 혼성화를 수행하였다.
(7) 형태학, 표현형 및 화학분류적 특성
광학 현미경(Nikon, ×1000)을 이용하여 세포 형태를 관찰하였고, 28℃ R2A 배지에서 24시간 동안 성장된 세포 배양액을 이용하여 투과 전자 현미경(Hitachi, model H-600)으로 편모의 존재를 관찰하였다. 키트(bioMerieux Gram stain kit)를 이용하여 제조사의 지시에 따라 그람 반응을 조사하였다. 균주의 가수분해 실험은 표준 프로토콜에 따라 카제인, 에스쿨린(esculin), 젤라틴, 녹말, L-티로신(L-tyrosine), 요소(urea), Tween 20 및 Tween 80를 이용하여 수행되었다(Smibert, R. M. and Krieg, N. R. 1994. Phenotypic characterization. In: Methods for general and molecular bacteriology, eds. by P. Gerhardt, R. G. E. Murray, W. A. Wood and N. R. Krieg, pp. 607-654. American Society for Microbiology, Washington, DC.; Reichenbach, H. 1992. The order Cytophagales. In: The Prokaryotes, eds. by A. Balows, H. G. Truper, M. Dworkin, W. Harder and K. H. Schleifer, 2nd ed., vol. 4, pp. 3631-3675. Springer, New York.). 효소 활성, 다양한 탄수화물로부터의 산 생성, 다양한 기질의 흡수 및 탄수화물에서의 성장에 대하여 상용 시스템(각각 API ZYM, API 20E, API 20NE 및 API 50CH kits)을 이용하여 28℃에서 제조사의 지시에 따라 조사하었다(BioMerieux). 다양한 온도 및 pH(pH 4.0-14.0 at intervals of 0.5 pH units)에서의 성장에 대해서는 적절한 완충액을 이용하여 R2A 배양액에서 5일간 배양 후 조사하였다(Xu, P., Li, W. J., Tang, S. K., Zhang, Y. Q., Chen, G. Z., Chen, H. H., Xu, L. H. and Jiang, C. 2005. Naxibacter alkalitolerans gen. nov., sp. nov., a novel member of the family 'Oxalobacteraceae' isolated from China. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 55:1149-1153.). 또한 28℃에서 배양 5일 후 1-14%(w/v, at 1% intervals) 염화나트륨으로 보충된 R2A 배양액으로 내염성을 평가하였다. 복제 항생제-감수성(Duplicate antibiotic-sensitivity) 실험은 다양한 항생물질(10㎍ ampicillin, 30㎍ chloramphenicol, 10㎍ penicillin, 10㎍ gentamycin, 3㎍ kanamycin, 30㎍ vancomycin, 30㎍ streptomycin 및 30㎍ tetracycline)로 디스크 확산법(filter-paper disc diffusion assays)을 이용하여 수행되었다(Yasir, M., Aslam, Z., Song, G. C., Jeon, C. O. and Chung, Y. R. 2010. Sphingosinicella vermicomposti sp. nov., isolated from vermicompost, and emended description of the genus Sphingosinicella. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 60:580-584.). 세포벽의 준비 및 펩티도글리칸 분석은 Schleifer의 방법(Schleifer, K. H. 1985. Analysis of the chemical composition and primary structure of murein. Methods Microbiol. 18:123-156.)에서 TLC를 종이 크로마토그래피 대신 셀룰로오스 시트를 이용하는 수정된 방법으로 수행되었다. 세포 지방산 분석을 위해 세균 균주를 28℃ R2A 배양액에서 배양하고 미생물 세포를 중간-지수 성장 단계(mid-exponential growth phase)(OD600 = 0.4-0.5)에서 취하였다. 지방산 메틸 에스터(fatty acid methyl esters) 분석은 미생물 식별 시스템(microbial identification system, MIDI; Microbial ID, Inc.)의 지시에 따라 수행되었다. GC로 추출물을 분석하였고(Agilent 6890), Sherlock 소프트웨어(ver. 4.0)에서 제공하는 TSBA 40 데이터베이스로 지방산 프로파일을 비교하여 식별하였다. 세균 균주의 전세포 가수분해물의 아미노산을 추출하여 Staneck 및 Roberts 방법(Stanek, J. L. and Roberts, G. D. 1974. Simplified approach to identification of aerobic actinomycetes by thin-layer chromatography. Appl. Microbiol. 28:226-231.)에 따라 분석하였다. 이소프레노이드 퀴논(Isoprenoid quinones)을 추출하고 Komagata 및 Suzuki의 방법(Komagata, K. and Suzuki, K. 1987. Lipid and cell-wall analysis in bacterial systematics. Methods Microbiol. 19:161-207.)에 따라 역-상(reverse-phase) HPLC를 이용하여 분석하였다. 염색체 DNA의 G+C 함량 측정을 위해 YC7010 균주의 유전체 DNA를 추출하고 Ausubel 등의 방법(Ausubel, F. W., Brent, R., Kingston, R. E., Moore, D. D., Seidman, J. G., Smith, J. A. and Struhl, K. 1995. Current Protocols in Molecular Biology, New York: Wiley.)에 따라 정제하고, 효소적으로 분해된 뉴클레오사이드 및 G+C 함량을 컬럼(reverse-phase C18 column)으로 측정하였다(Mesbah, M., Premachandran, U. and Whitman, W. B. 1989. Precise measurement of the G+C content of deoxyribonucleic acid by high-performance liquid chromatography. Int. J. Syst. Bacteriol. 39:159-167.). Minnikin 등(1984)의 방법을 변형하여 극성 지질을 추출하고, Merck Kieselgel 60-HPTLC에서 TLC로 분리하였다. 또한 플레이트에 닌히드린 용액(0.2% (w/v) solution of ninhydrin in butanol saturated with water)으로 스프레이한 후 105℃에서 10분간 가열하여 아미노지질을 검출하였다(Ross, H. N. M., Grant, W. D. and Harris, J. E. 1985. Lipids in archaebacterial taxonomy. In: Chemical Methods in Bacterial Systematics, eds. by M. Goodfellow and D. E. Minnikin, pp. 289-300. Academic Press, London.). 또한 Dittmer 및 Lester(Dittmer, J. C. and Lester, R. L. 1964. A simple, specific spray for the detection of phospholipids on thin-layer chromatograms. J. Lipid Res. 15:126-127.)의 Zinzadze 시약으로 플레이트를 스프레이하여 인지질을 검출하였다. 또한 1-나프톨 스프레이 시약으로 3-5분간 가열하여 당지질을 검출하였다(Jacin, H. and Mishkin, A. R. 1965. Separation of carbohydrates on borate impregnated silica gel G plates. J. Chromatogr. 18:170-173.). 포스파티틸콜린(phosphatidylcholine) 검출에는 Dragendorff 시약(Sigma-Aldrich; St. Louis, Mo)을 이용하였다. 또한 인몰리브덴산 용액(phosphomolybdic acid solution, Sigma-Aldrich; St. Louis, Mo)으로 스프레이 후 150℃에서 10분간 가열하여 총 지질 프로파일을 검출하였다.
(8) 통계분석
in vitro에 있어서는 완전 무작위적 단일 요소로 분산 디자인된 분석을 이용하여 데이터를 분석하였고, in vivo에 있어서는 완전 무작위적 블록 디자인된 분석을 이용하였다. 또한 던칸의 방법(Duncan's multiple range test (DMRT))을 이용하여 평균차(mean differences)를 비교하였다. 모든 분석에서 SPSS 소프트웨어(ver. 17; SPSS Inc. in Chicago)가 사용되었다.
실험 결과
(1) 분리된 균주의 길항 활성
벼 근권에서 분리된 250개의 세균 균주 중에서 15개의 내생 세균이 푸사리움 푸지쿠로이(F. fujikuroi)의 균사 성장에 대해 2-20mm 이상의 범위에서 억제 활성을 보였다. 이러한 세균은 16S rRNA 유전자 서열에 기초할 때 패니바실러스 폴리믹사(Paenibacillus polymyxa), 바실러스 시아멘시스(Bacillus siamensis), 패니바실러스 자밀레(Paenibacillus jamilae), 바실러스 메칠로트로피쿠스(Bacillus methylotrophicus), 바실러스 터린지엔시스(Bacillus thuringiensis), 바실러스 세레우스(B. cereus), 바실러스 심플렉스(Bacillus simplex) 및 바실러스 달리엔시스(Bacillus daliensis)와 관련성이 있는 것으로 확인되었다. 이들 분리된 세균들은 실험적으로 식별되었고 그 유사성이 99.27-100%로서 근연속에 속한다. 분리된 세균들 중 특히 두 균주, YC7007 및 YC7010는 바실러스 시아멘시스(B. siamensis)와 가장 높은 유사성을 갖는 균주로 푸사리움 푸지쿠로이(F. fujikuroi)에 대하여 강한 길항 활성(>　20　mm inhibition zone)을 보였다(하기 표 11 참조). YC7007는 또한 다른 벼 병원균인 B. oryzae, M. grisea, F. fukikuroi 와 다른 주요 식물 병원균에 대하여 PDA에서 10-29mm의 억제 범위로 강한 길항 활성을 보였다(하기 표 12 참조). 다른 배양 시간(different cultivation times)으로부터 준비된 YC7007 균주의 배양여액 또한 푸사리움 푸지쿠로이(F. fujikuroi) 및 두 개의 주요 종자 유래 세균 병원균인 벌크홀데리아 글루메(B. glumae) 및 잔토모나스 오리재(X. oryzae pv. oryzae)에 대한 좋은 성장 억제능을 보였다(도 8 참조). 60　h-old 배양액의 배양여액은 각각의 배양 배지에서 푸사리움 푸지쿠로이(F. fujikuroi), 잔토모나스 오리재(X. oryzae pv. oryzae) 및 벌크홀데리아 글루메(B. glumae) 각각에 대하여 30mm, 24mm 및 19.7mm의 억제 범위로서 가장 강력한 활성을 나타냈다.
표 11
Figure PCTKR2015005342-appb-T000011
표 12
Figure PCTKR2015005342-appb-T000012
(2) 이삭마름병(panicle blight) 및 흰잎마름병(bacterial blight)에 대한 전신 저항성 유도
YC7007 균주에 대하여 벼의 흰잎마름병(bacterial blight) 및 이삭마름병(panicle blight)에 대한 전신 저항성 유도 활성을 조사하였다. 세 가지의 다른 농도(5.6×105, 3.6×106 및 2×107 CFU/ml)의 YC7007 균주를 토양에 관주한 결과 잎 부패(leaf rot)의 발병도를 대조군(2.5)에 비해 1.4, 0.9 및 0.8로서 상당히 낮추는(p <0.05) 것으로 나타났다(도 9 참조). 그러나 106 및 107 농도 사이에서 유의적인 차이는 보이지 않았다. 2×107CFU/ml 농도의 YC7007 균주가 근권 토양에 관주될 경우 이삭마름병(panicle blight) 및 흰잎마름병(bacterial blight)에 대한 방제 효과가 각각 65.2% 및 61.2%로서 우수한 것으로 나타났다. 배양여액을 엽면분사할 경우에도 대조군에 비해 이삭마름병(panicle blight) 및 흰잎마름병(bacterial blight) 발병도를 각각 70.8% 및 70.5% 정도 상당히 감소시키는 것으로 나타났다(하기 표 13 참조). YC7007 균주는 대조군에 비해 이삭마름병(panicle blight) 및 흰잎마름병(bacterial blight) 발병도를 상당히 감소(p <0.01)시키는 것으로 나타났다.
표 13
Figure PCTKR2015005342-appb-T000013
(3) YC7007에 의한 생장 촉진
YC7007 균주는 벼의 유묘기, 분얼기 및 출수기와 같은 모든 실험 단계에서 대조군에 비해 상당한 생장 촉진 활성(p <0.05)을 갖는 것으로 나타났다. 벼 근권에 세균 현탁액(2×107 CFU/ml)의 처리로 테스트 튜브에서의 싹의 길이가 유묘기에서는 11.67cm에서 19.33cm로, 분얼기에서는 36.45cm에서 46.33cm로, 출수기에서는 55.33cm에서 61.0cm로 각각 증가되었다. 주근의 길이는 유묘기에서는 2.67cm에서 7.67cm로 증가되었고, 분얼수(numbers of tillers) 또한 분얼기에서는 1.9에서 2.9로, 출수기에서는 5.3에서 7.0으로 증가되었다(하기 표 14 참조).
표 14
Figure PCTKR2015005342-appb-T000014
(4) YC7007 및 YC7010 길항 세균의 동정
15개의 길항 세균 중 가장 강력한 길항 활성을 가진 두 내생 세균 YC7007 및 YC7010에 대해 다상 접근법으로 동정하였다. 두 균주의 16S rRNA 유전자 서열은 1,513bp가 연속적으로 뻗어있는 것으로, 두 개의 뉴클레오타이드를 제외하고는 동일하게 정렬되어 있다(database accession numbers KP203893 (YC7007) and KP201498 (YC7010T) in GenBank/EMBL/DDBJ)(도 1 참조). 16S rRNA 유전자 서열 분석을 통해 두 균주는 계통수에서 동일한 가지 길이를 갖는 동일한 분기군(clade)에 있는 것으로, 바실러스 시아멘시스(B. siamensis) KACC 15859T (99.67%), 바실러스 메칠로트로피쿠스(B.　methylotrophicus) KACC 13105T (99.65%), 바실러스 아밀로리퀘페이션스(B. amyloliquefaciens subsp. plantarum) KACC 17177T (99.60%) 및 바실러스 트레퀼렌시스(B. tequilensis) KACC 15944T (99.45%)와 가장 높은 유사성을 보인 것으로 나타났다(상기 표 11 및 도 2 참조). YC7010 균주 및 이와 가장 근연 균주인 바실러스 시아멘시스(B.　siamensis) KACC 15859T와의 DNA-DNA 연관 값은 50.4±3.5였으나, YC7007 및 YC7010 사이에서는 91.5±11.0%였다(상기 표 2 참조). 두 균주는 그람-양성으로, 운동성이 있고, 막대형이고, 13-60℃(최적 28-30℃) 및 pH 4-12(최적 pH 7)에서 좋은 성장을 보인다. 이들 균주는 1-13%(w/v) 염화나트륨을 함유한 0.1 TSA 배지에서 성장 가능하나 성장을 위해 염화나트륨이 요구되지는 않았다. 이들 균주는 30㎍/㎖ 농도의 클로람페니콜(chloramphenicol)에 저항성을 가지고 있다. 또한 이들 균주는 세포벽 펩티도글리칸에서의 길항 디아미노산으로 메조-디아미노피멜릭산(meso-diaminopimelic acid) 및 주요 호흡 퀴논 시스템(major respiratory quinone system)으로 MK-7을 함유하였다. YC7007 및 YC7010 균주의 다른 생리학적 및 생화학적 특징을 상기 표 1에 요약하였다. YC7007 및 YC7010 균주의 주요 지방산은 각각 anteiso-C15:0(38.4 and 32.0%) 및 iso C15:0(28.1 and 27.7%)로 나타났다. YC7010의 다른 세포 지방산 프로파일은 C16:0 (7.7%), iso C17:0 (6.4%), anteiso-C17:0 (5.3%), iso C16:0 (5.2%), C18:0 (5.1%), C16:1 ω7c alcohol (3.4%), iso C14:0 (2.9%), iso-C17:1 ω10c (1.7%), C16:1 ω11c (1.4%), C14:0 (1.1%), and C20:1 ω7c (0.2%)로 구성되었다(상기 표 3 참조). YC7007 및 YC7010 균주 유전체 DNA의 G+C 함량은 각각 50.5mol% 및 51.2mol% 이었다. 이들 균주는 PE(phosphatidylethanolamine), PG(phosphatidylglycerol), DPG(diphosphatidylglycerol), GL(unknown glycolipid) 및 AL1-2(unknown aminolipids)로 구성된 극성 지질 프로파일을 나타내었다. 16S rRNA 유전자 서열 분석, DNA-DNA 연관 값, 지방산 조성, 생화학적 및 생리학적 특성 분석 결과, YC7007 및 YC7010 균주는 바실러스(Bacillus) 속의 새로운 종으로 확인되어 바실러스 오리지콜라(Bacillus oryzicola sp. nov.)로 제안하였다.
(5) 바실러스 오리지콜라 YC7010(Bacillus oryzicola YC7010T sp. nov.)의 상세
세포는 그람-양성, 막대형(0.8-0.9×2.0-3.0㎛)이다. 28℃ R2A 한천 배지에서 2일간 성장한 콜로니는 크림 흰색(white-cream), 원형, 전체 가장자리에서 평평하게 높아지는(flat elevation with an entire margin) 형태이다. 세포는 단일 극성 편모로 운동성이 있다. 세포벽은 길항 디아미노산으로 메조-디아미노피멜릭산을 함유한다. 세포는 보통 카탈라아제-양성 및 옥시다아제-음성으로 단일 또는 짝을 이루어 나타나고, 13-60℃ 및 pH 4-12.0에서 성장한다. 카제인 및 젤라틴 가수분해는 양성이나, 녹말, Tween 20, Tween 80, 티로신(tyrosine) 및 카복시메틸 셀룰로오스(carboxymethyl cellulose)에 대해서는 음성이다. 또한 D-글루코오스(D-glucose), D-프룩토오스(D-fructose), D-만노오스(D-mannose), D-만니톨(D-mannitol), 메틸-α-D-글루코피라노사이드(methyl-α-D-glucopyranoside), N-아세틸-글루코사민(N-acetyl-glucosamine), 아미그달린(amygdalin), 알부틴(arbutin), 에스쿨린 페릭 시트레이트(esculin ferric citrate), 살리신(salicin), D-셀리오비오스(D-celiobiose), D-말토오스(D-maltose), D-락토오스(D-lactose), D-사카로오스(D-saccharose), D-트레할로오스(D-trehalose), D-라피노오스(D-raffinose), 녹말, 글리코겐(glycogen), 젠티오비오스(gentiobiose), 트리소디움(trisodium), 시트레이트(citrate) 및 Kohn's 젤라틴을 소비한다. 또한 API ZYM kit 결과, 에스터라아제(esterase)(C4), 에스터라이제 리파아제(esterase lipase)(C8), 나프톨-AS-Bl-포스포하이드롤라아제(naphthol-AS-Bl-phosphohydrolase) 및 N-아세틸-β-글루토사미니다아제(N-acetyl-β-glucosaminidase)의 효소적 활성을 보이나, 리파아제(lipase)(C-14), 류신 아릴아미다아제(leucine arylamidase), 발린 아릴아미다아제(valine arylamidase), 시스틴 아릴아미다아제(cystine arylamidase), 트립신(trypsin), α-키모트립신(α-chymotrypsin), α-갈락토시다아제(α-galactosidase), β-갈락토시다아제(β-galactosidase), β-글루코시다아제(β-glucosidase), α-만노시다아제(α-mannosidase) 및 α-푸코시다아제(α-fucosidase)에 대해서는 활성을 보이지 않는다. 또한 30㎍/㎖ 농도의 클로람페니콜 및 스트렙토마이신에 저항성을 가지고 있으나, 10㎍/㎖ 농도의 암피실린(ampicillin), 페니실린(penicillin), 젠타마이신(gentamycin) 및 30㎍/㎖ 농도의 카나마이신(kanamycin), 반코마이신(vancomycin), 테트라사이클린(tetracycline)은 허용한다. 13%(w/v) 염화나트륨을 함유한 R2A 배양액에서는 성장이 관찰되나, 14%(w/v)에서는 그렇지 않다. 주요 퀴논은 MK-7이다. 극성 지질은 PE(phosphatidylethanolamine), PG(phosphatidylglycerol), DPG(diphosphatidylglycerol), GL(unknown glycolipid) 및 AL1-2(unknown aminolipids)이다. 기준주(type strain)의 DNA G+C 함량은 51.2mol%이다. 기준주 YC7010T (= KACC18228T)는 벼(Jinju, Korea)의 뿌리에서 분리되었다.
이상과 같이 본 실시예에서는 벼의 뿌리에서 분리된 많은 내생 세균 균주 중에서 바실러스(Bacillus) 속의 6%가 길항성이고 식물 병원체의 균사 성장을 억제하는 것으로 나타났다. 이전 연구에 따르면 갯벌 식물로부터 분리된 여러 바실러스(Bacillus) 속 및 다른 그람-음성 세균을 포함하는 내생 세균의 약 9%는 난균류 식물 병원체(oomycetous phytopathogens)에 대해 길항성이 있는 것으로 보고되었다(비특허문헌 7 참조). 16S rRNA 유전자 서열에 따라 바실러스(Bacillus) 속에 속하는 본 발명에 따른 균주들은 in vitro 및 in vivo 실험에서 주요 벼 진균성 및 세균성 병원균에 대한 길항 활성이 있는 것으로 확인되었다. 이들 분리된 균주 중에서 바실러스 시아멘시스(B. siamensis)와 가장 유사성이 높은 YC7007 및 YC7010 균주는 벼키다리병 병원균(bakanae pathogen)으로서 가장 중요한 벼 종자 유래 병원균인 푸사리움 푸지쿠로이(F.　fujikuroi)의 균사 성장을 억제하는 강력한 길항 활성을 보였다. YC7007의 배양여액 또한 벼키다리병(bakanae), 흰잎마름병(bacterial blight) 및 벼알마름병(grain rot)에 대한 강력한 억제 활성을 가지고 있으며, 따라서 항진균 물질을 생산하는 균주라고 볼 수 있다. 몇몇 바실러스 속은 펜기신(fengycin), 이투린(iturin) 및 서팩틴(surfactin)과 같은 약간의 펩티드 및 리포펩티드를 생산하고, 식물 병원체에 좋은 억제 효능이 있는 것으로 보고되었다(Bais, H. P., Fall, R. and Vivanco, J. M. 2004. Biocontrol of Bacillus subtilis against infection of Arabidopsis roots by Pseudomonas syringae is facilitated by biofilm formation and surfactin production. Plant Physiol. 134:307-319.; Crane, J. M., Gibson, D. M., Vaughan, R. H. and Bergstrom, G. C. 2013. Iturin levels on wheat spikes linked to biological control of Fusarium head blight by Bacillus amyloliquefaciens. Phytopathology 103:146-155.; Dimkic, I., Zivkovic, S., Beric, T., Ivanovic, Z., Gavrilovic, V., Stankovic, S. and Fira, D. 2013. Characterization and evaluation of two Bacillus strains, SS-12.6 and SS-13.1, as potential agents for the control of phytopathogenic bacteria and fungi. Biol. Control 65:312-321.). YC7007 균주의 세포 현탁액을 관주함으로써 이삭마름병(panicle blight) 및 흰잎마름병(bacterial blight)의 발병을 억제할 수 있음을 포트 실험으로부터 확인하였고, 이는 전신 저항성 유도를 의미한다. 이삭마름병(panicle blight)의 발병도는 105 (CFU/ml) 농도의 YC7007 균주 처리로 감소되었고, 106 에서 107 CFU/ml의 더 높은 농도에서 62% 이상 발병을 억제하였다. YC7007이 배양여액 또한 대조군과 비교하여 이삭마름병(panicle blight) 및 흰잎마름병(bacterial blight)의 발병을 70% 이상 감소시켰다. 바실러스 서브틸리스(B. subtilis)(2.5×108 CFU/ml) 및 바실러스 세레우스(B. cereus) AR156 (5×108 CFU/ml)의 세포 현탁액 처리로 각각 애기장대(Arabidopsis)의 뿌리 및 잎 점무늬병(speck diseases)을 방제하는 것이 밝혀진 바 있다(Bais et al., 2004; Niu, D. D., Liu, H. X., Jiang, C. H., Wang, Y. P., Wang, Q. Y., Jin, H. L. and Guo, J. H. 2011. The plant growth promoting rhizobacterium Bacillus cereus AR156 induces systemic resistance in Arabidopsis thaliana by simultaneously activating salicylate-and jasmonate/ethylene dependent signaling pathways. Mol. Plant-Microbe Interact. 24:533-542.). 바실러스 서브틸리스(B. subtilis) 및 B. 바실러스 세레우스(B. cereus) AR156는 세균 농도(108 CFU/ml)가 YC7007(106 CFU/ml)보다 100배 이상으로, 생산 농가에서 실용적으로 사용하기에는 현실적이지 않다. 생물 농약으로서 길항 세균을 개발하기 위해서는 세균의 최적 농도가 사용자의 최종 사용 시 희석 인자를 고려할 때 107　CFU/ml 수준 이하이어야 한다(Chen, X. H., Scholz, R., Borriss, M., Junge, H., Mogel, G., Kunz, S. and Borriss, R. 2009. Difficidin and bacilysin produced by plant associated Bacillus amyloliquefaciens are efficient in controlling fire blight disease. J. Biotechnol. 140:38-44.). 병원균에 대한 길항 활성을 갖는 세균 현탁액을 벼의 근권에 관주하고 배양여액을 엽면 분사함에 따라 YC7007 균주가 병원균 사이에서 직접 및/또는 간접적인 상호작용을 하는 것으로 예상된다. 이삭마름병(panicle blight) 및 흰잎마름병(bacterial blight)은 관주 또는 분사 처리에 의해 방제되는데, YC7007 균주가 병 억제에 있어 유도 전신 저항성(induced systemic resistance; ISR)이나 전신 획득 저항성(systemic acquired resistance; SAR)을 통해 작용하여 방제되는 것으로 보인다(Ahn, I. P., Lee, S. W. and Suh, S. C. 2007. Rhizobacteria induced priming in Arabidopsis is dependent on ethylene, jasmonic acid, and NPR1. Mol. Plant-Microbe Interact. 20:759-768.; Niu et al., 2011). 반응 메커니즘은 SAR 또는 ISR에 있어 살리실릭(salicylic), 자자스모닉(jasmonic) 또는 에틸렌(ethylene) 경로를 통한 호르몬 신호 측면에서 결정할 필요가 있다.
여러 바실러스 종이 장기간에 걸쳐 불리한 환경에서 오랜 지속성이 있어 생물 농약으로 상용화되고 있다. 몇몇은 전신 저항성을 유도함으로써 많은 식물에서 기능을 발휘하였다(Hu et al., 2011; Kloepper et al., 2004). 바실러스 발리스모르티스(B. vallismortis) EXTN-1 및 바실러스 세레우스(B. cereus)는 도열병(rice blast), 벼잎집무늬마름병(rice sheath blight) 및 벼키다리병(bakanae) 방제에 사용되었다(Kazempour and Elahinia, 2007; Park et al., 2006). 바실러스 균주 YC7007가 이삭마름병(panicle blight) 및 흰잎마름병(bacterial blight)의 주요 세균성 병에 대한 벼에서의 저항성 유도에 장기 지속 활성을 갖는다는 것은 본 연구에서 처음 보고하는 것으로 생각된다. 더욱이, YC7007 균주는 발아 직후 유묘기에 세균 현탁액을 1회 적용함으로써 벼의 생장을 촉진시키는데 효과적인 것으로 나타났다. YC7007 균주는 대조군에 비해 유묘기, 분얼기 및 출수기에서 싹 및 뿌리 길이를 1.1-2.9배 증가시키고, 분얼기 및 출수기에서 분얼수를 1.3배 증가시켰다. 이는 프로바이오틱 박테리움 YC7007에 의한 저항성 유도 및 생장 촉진 활성이 유묘기로부터 출수기까지 오래 지속된다는 것을 의미한다(Picard, C., Baruffa, E. and Bosco, M. 2008. Enrichment and diversity of plant probiotic microorganisms in the rhizosphere of hybrid maize during four growth cycles. Soil Biol. Biochem. 40:106-115.). 숙주 저항성의 유도는 지베렐린산 및 옥신의 식물 호르몬과 관련된 성장을 억제하는 점에서 숙주 식물에 부정적인 영향을 미치는 것으로 알려져 있다. 면역 체계는 각각 벼 및 애기장대(Arabidopsis)에서 적어도 부분적으로 호르몬과의 상호작용(negative cross talk)을 통하여 지베렐린산 및 옥신을 억제하는 브라시노스테로이드(brassinosteroids) 및 살리실릭산(salicylic acid)에 의해 조절된다(De Vleesschauwer, D., Van Buyten, E., Satoh, K., Balidion, J., Mauleon, R., Choi, I. R., Vera Cruz, C., Kikuchi, S. and Hofte, M. 2012. Brassinosteroids antagonize gibberellin and salicylate mediated root immunity in rice. Plant Physiol. 158:1833-1846.; Wang, D, Mukhtar, K. P., Culler, A. H. and Dong, X. 2007. Salicylic acid inhibits pathogen growth in plants through repression of the auxin signaling pathway. Curr.Biol. 17:1784-1790.). 살리실릭산, BTH(benzothiadiazole)의 화학적 유도체는 벼, 오이, 애기장대 및 후추에서 기생영양 병원균에 대하여 살리실릭산 신호망을 통해 전신 저항성을 유도하나, 옥신 반응을 저해하여 식물 생장을 지연시킨다. 반면, 바실러스 종을 포함하는 몇몇 근권 세균은 식물 생장에 부작용 없이 저항성 유도를 증대시킨다(Ahn et al., 2005; Ryu et al., 2004; Yang, J. W., Yu, S. H. and Ryu, C. M. 2009. Priming of defense-related genes confers root-colonizing Bacilli-elicited induced systemic resistance in pepper. Plant Pathol. J. 25:389-399.). 이러한 점에서 YC7007 균주는 부작용 없이 벼에서의 저항성 유도 및 생장 촉진의 다기능성을 갖는 생물 방제제 개발을 위한 좋은 후보라 할 수 있다. 또한 YC7007 균주는 항생물질 생산을 통해 항진균성 및 항세균성 활성을 갖는 것으로 사료된다.
본 발명에서 YC7007 및 YC7010로 명명된 두 내생 균주는 16S rRNA 유전자 서열, DNA-DNA 혼성화, 지방산 분석 및 다른 물리적 및 생화학적 실험을 포함하는 다상 연구를 토대로 더욱 특징화되었다. 두 균주는 계통수에서 동일한 가지 길이를 갖는 동일한 분기군(clade)에 있는 바실러스 속의 새로운 종으로 동정되었다. 두 균주의 총 서열 분기 비율은 동일하였으나, 계통수 분기군에서 다른 근연종과는 상이하였다. YC7007 및 YC7010 균주는 100% 유사성을 보였고, 91.5%의 매우 높은 DNA-DNA 연관 값을 보여, 두 균주가 동일한 바실러스 종인 것으로 나타났다. YC7010 기준주와 비교할 때 바실러스 시아멘시스(B.　siamensis), 바실러스 메칠로트로피쿠스(B. methylotrophicus), 바실러스 서브틸리스(B. subtilis subsp. inaquosorum), 바실러스 아밀로리퀘페이션스(B. amyloliquefaciens subsp. plantarum) 및 바실러스 터퀼렌시스(B. tequilensis)등 다른 연관 균주의 DNA-DNA 혼성화 값은 70% 미만으로, YC7010 균주가 신종임을 알 수 있다(Goris, J., Konstantinidis, K. T., Klappenbach, J. A., Coenye, T., Vandamme, P. and Tiedje, J. M. 2007. DNA-DNA hybridization values and their relationship to whole genome sequence similarities. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 57:81-91.; Stackebrandt, E. and Goebel, B. M. 1994. Taxonomic Note: A place for DNA-DNA reassociation and 16s rRNA sequence analysis in the present species definition in bacteriology. Int. J. Syst. Bacteriol. 44:846-849.). 또한 두 균주는 API kits를 이용한 물리적 및 생화학적 실험에서 거의 동일한 반응을 보였으나, 다른 참고 기준주에 대해서는 다른 반응을 보여, 두 균주가 다른 연관 바실러스 균주와는 구별되는 것을 알 수 있다. 염화나트륨에 대한 내성에 있어, 두 균주는 13% 염화나트륨까지 생존하였으나, 바실러스 메칠로트로피쿠스(B. methylotrophicus)는 10% 염화나트륨에서 성장하지 못하였다(비특허문헌 1 참조). YC7007 및 YC7010의 주요 세포 지방산은 anteiso-C15:0 및 iso C15:0 으로, 바실러스 속의 다른 연관 종과 동일하였다. 두 균주의 소량의 다른 지방산은 근연종의 바실러스 균주의 것과는 다르게 나타났다. 각 세균은 특유의 지방산 프로파일을 가지고 있으며, 세균 분류에서 효과적인 수단으로 지방산 분석이 사용된다(Kampfer, P. 1994. Limits and possibilities of total fatty acid analysis for classification and identification of Bacillus species. Syst. Appl. Microbiol. 17:86-98.). YC7007 및 YC7010 균주의 주요 이소프레노이드 퀴논은 바실러스 속의 기준주와 마찬가지로 MK-7(menaquinone-7)이었다(Chen, J. H., Tian, X. R., Ruan, Y., He, Z. Q., Tang, S. K., Li, W. J., Shi, H. and Chen, Y. G. 2015. Bacillus crassostreae sp., nov., isolated from an oyster in the South China Sea. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. Doi:10.1099/ijs. 0.000139.; Kang, H., Weerawongwiwat, V., Kim, J. H., Sukhoom, A. and Kim, W. 2013. Bacillus songkensis sp. nov., isolated from soil. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 63:4189-4195.). 두 균주의 DNA G+C 함량은 50.5-51.2mol%로 유사하나, 다른 바실러스 종에 비해 약간 높았다(비특허문헌 1 및 비특허문헌 17 참조). 두 균주의 주요 극성 지질은 PE, PG, and DPG로 바실러스 시아멘시스(B. siamensis) 및 바실러스 송클렌시스(B. songklensis)와 상응하였다(Kang et al., 2013; 비특허문헌 17).
다상 연구로부터의 모든 데이터에 기초할 때 두 균주 YC7007 및 YC7010는 바실러스 속에 속하였고, 따라서 YC7007 및 YC7010 균주를 새로운 종으로 제안하였고, 기준주로서 바실러스 오리지콜라(Bacillus oryzicola YC7010T sp. nov.)로 명명하였다. 결론적으로, 내생 균주 바실러스 오리지콜라(B. oryzicola) YC7007는 벼에서 다기능성 활성을 갖는 균주로서, 진균성 및 세균성 병원균의 직접적인 억제, 전신 저항성 유도 및 식물 생장 촉진 효능을 발휘하여, 생산 농가에 미생물 접종제로서 실용적으로 사용될 수 있다.
이상에서 설명한 본 발명의 바람직한 실시예들은 기술적 과제를 해결하기 위해 개시된 것으로, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 본 발명의 사상 및 범위 안에서 다양한 수정, 변경, 부가 등이 가능할 것이며, 이러한 수정 변경 등은 이하의 특허청구범위에 속하는 것으로 보아야 할 것이다.
(1) 서열목록 1은 본 발명에 다른 바실러스 오리지콜라(Bacillus oryzicola) YC7007 균주의 16S rRNA 유전자의 염기서열이다.
(2) 서열목록 2는 본 발명에 다른 바실러스 오리지콜라(Bacillus oryzicola) YC7010 균주의 16S rRNA 유전자의 염기서열이다.
[기탁증-YC7007]
Figure PCTKR2015005342-appb-I000001
[기탁증-YC7007_번역문]
Figure PCTKR2015005342-appb-I000002
[기탁증-YC7010]
Figure PCTKR2015005342-appb-I000003
[기탁증-YC7010_번역문]
Figure PCTKR2015005342-appb-I000004

Claims (8)

  1. 신규 미생물 바실러스 오리지콜라(Bacillus oryzicola) 또는 상기 바실러스 오리지콜라(Bacillus oryzicola)와 70% 이상의 디엔에이-디엔에이 연관 값(DNA-DNA relatedness value)을 보유한 바실러스 오리지콜라(Bacillus oryzicola).
  2. 제1항에 있어서,
    상기 바실러스 오리지콜라(Bacillus oryzicola)는 서열번호 1 또는 서열번호 2로 기재되는 염기서열을 갖는 16S rRNA를 포함하는 것을 특징으로 하는 바실러스 오리지콜라(Bacillus oryzicola).
  3. 제1항에 있어서,
    상기 바실러스 오리지콜라(Bacillus oryzicola)는 바실러스 오리지콜라(Bacillus oryzicola) YC7007(수탁번호: KCCM11275P) 또는 바실러스 오리지콜라(Bacillus oryzicola) YC7010(수탁번호: KACC 18228)인 것을 특징으로 하는 바실러스 오리지콜라(Bacillus oryzicola).
  4. 제1항에 있어서,
    상기 바실러스 오리지콜라(Bacillus oryzicola)는 식물병 저항성 유도 효능을 갖는 것을 특징으로 하는 바실러스 오리지콜라(Bacillus oryzicola).
  5. 제4항에 있어서,
    상기 식물병은 벼 알마름병, 벼 흰잎마름병, 벼 이삭마름병 및 벼 키다리병으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는 바실러스 오리지콜라(Bacillus oryzicola).이삭마름병(panicle blight) 및 흰잎마름병(bacterial blight)
  6. 제4항에 있어서,
    상기 바실러스 오리지콜라(Bacillus oryzicola)는 식물병원균 억제 효능, 식물생육 촉진 효능 및 식물 강화 효능을 더 갖는 것을 특징으로 하는 바실러스 오리지콜라(Bacillus oryzicola).
  7. 제6항에 있어서,
    상기 식물생육 촉진 효능은 벼에 대한 식물생육 촉진 효능인 것을 특징으로 하는 바실러스 오리지콜라(Bacillus oryzicola).
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 미생물, 이의 배양액 또는 배양여액을 유효성분으로 함유하는 비료용, 식물 보호용 및 식물 강화용 미생물 제제.
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