KR20120051284A

KR20120051284A - 바실러스 벨레젠시스 ｋｒｉｃｔ934 균주를 이용한 유기질 비료의 질소무기화 촉진 및 식물병 방제방법

Info

Publication number: KR20120051284A
Application number: KR1020100112650A
Authority: KR
Inventors: 김진철; 최경자; 최용호; 장경수; 박명수
Original assignee: 한국화학연구원
Priority date: 2010-11-12
Filing date: 2010-11-12
Publication date: 2012-05-22
Also published as: KR101199931B1

Abstract

본 발명은 바실러스 벨레젠시스 KRICT934 균주 및 이의 배양액을 함유하는 미생물 제제와 이를 이용한 식물병 방제방법에 관한 것으로, 본 발명에 따른 바실러스 벨레젠시스 KRICT934 균주는 다양한 식물병에 대하여 탁월한 항균 활성을 갖고 있으며, 동시에 유박의 질소 무기화를 촉진하는 활성이 매우 우수하여 기존 미생물에 대한 경제적인 대체효과가 크고 고성능을 가지고 있어, 작물의 상품성 및 생산성을 증대시킬 수 있는 효과가 있다.

Description

바실러스 벨레젠시스 ＫＲＩＣＴ934 균주를 이용한 유기질 비료의 질소무기화 촉진 및 식물병 방제방법{Promotion of nitrogen mineralization of organic fertilizers and control of plant diseases using bacillus velezensis KRICT934}

본 발명은 바실러스 벨레젠시스 KRICT934 균주를 이용한 유기질 비료의 질소무기화 촉진 및 식물병 방제방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 신규한 바실러스 벨레젠시스 KRICT934 균주 및 이의 배양물을 함유하는 미생물 제제와 이를 이용한 식물병 방제방법에 관한 것이다.

그동안 농업생산성은 합성 농약과 화학 비료의 사용과 재배방법의 기술력 향상으로 꾸준히 증가해왔으나, 합성농약과 화학비료의 사용으로 인한 토양, 수질 및 농산물 오염, 독성, 생태계 교란, 저항성 균주들의 출현 등 여러 가지 문제점이 제기되고, 또한 소비자의 고품질 농산물 선호에 따라 이들의 사용량을 줄이고자 하는 정책을 우리나라를 포함한 각국에서 펼치고 있다. 이들 화학비료와 합성농약의 대안 기술로서 제시되고 있는 것이 유기질 비료와 생물농약이다.

유기질 비료는 토양에 유기물을 공급하여 토양의 물리화학성과 생물상을 개선하여 양분 및 수분 보유능과 토양 완층능을 증가시키며(임수길 등, 1992. 한토비지 25(1):52-56; 장기운 등, 1992. 한국유기성폐자원학회지 7(1):23-30), 유기질 비료 자체가 양분공급원이 되므로 토양 미생물의 배지가 되어 작물의 생육안정과 토양생산성을 증가시킨다(이경자 등, 2004. 한토비지 29(2):145-149).

또한 유기물로부터 생산된 humic acid과 pyruvic acid는 때때로 식물생육을 촉진하는 효과를 나타낸다(유성준 등, 1996. 한토비지 29(3):297-302). 현재 유기질 비료 중에서 유박(oil cake)이 가장 많이 사용되고 있다. 유박은 녹말 및 단백질의 함량이 높아서 가축사료로 사용될 뿐만 아니라 유기물, 질소 함량이 높고 또한 인산, 칼륨을 포함하고 있어 비료로 널리 이용되고 있다. 우리나라의 경우 참깨묵, 채종박, 면실박, 피마자박, 탈지강 등 10여종의 유박이 등록되어 있다.

그러나 유기질 비료는 퇴비와는 달리 부숙과정을 거치지 않아 토양에 시용시 일시적인 분해로 가스피해를 유발할 수가 있어 반드시 수분공급과 아울러 약 2주 이상의 안정화 기간이 지난 다음에 작물을 재배하도록 하고 있다. 그러나 농민의 경우 전작과 후작 사이의 기간이 짧고, 사용상의 인식 부족으로 인하여 가스 피해가 자주 일어나고 있는 실정이다. 또한 기존 제품의 경우 작물정식 후 유묘의 생장기에 필요한 질소원을 신속히 공급하지 못해 초기 생육부진 현상을 보이고 있으며, 특히 수도의 경우 퇴비 등 기타 발효 유기질비료에 비해 현저하게 생육이 저조한 특성을 보이고 있다.

따라서 2주 동안의 부숙기간을 줄이고 양질의 유기질 비료를 공급하기 위해서는 토양에 사용 시 초기 빠른 분해로 무기화를 촉진시켜 유기태 질소(암모니아 질소= NH₄-N, 질산태 질소 = NO₃-N)로의 전환으로 양분을 가용화할 필요가 크다. 이러한 단백질 분해 및 질소 무기화과정(Nitrogen mineralization)은 주로 미생물에 의하여 진행된다. 서로 다른 여러 종류의 미생물, 즉 세균, 사상균 및 방선균 등이 유기질소화합물로부터 암모늄을 유리시킨다.

한편, 유기질 비료를 사용하는 토지에서는 주로 유기농산물을 생산할 목적으로 이 비료를 사용하기 때문에 각종 식물병을 방제하기 위하여 합성농약을 사용할 수가 없는 실정이다. 이들 식물병을 방제하기 위해서는 생물농약(Biopesticide)을 사용해야 한다. 생물농약은 크게 식물, 미생물, 천적, 천연 생리활성물질 및 유전자 조작 생명체(GMO) 등으로 나누어진다. 생물농약 중 특히 미생물 살균제 개발에 대한 연구는 지난 70여 년간 식물병리학의 주요 분야로서 꾸준히 진행되어 왔으며, 지난 10년간 40여개 이상의 제품들이 개발된 바 있다.

그람양성 세균인 바실러스 속 세균은 슈도모나스(Pseudomonas)속 다음으로 널리 연구되고 상용화된 세균으로서 토양 내에 많은 수로 존재하고 생물학적 활성이 있는 다양한 2차 대사산물을 생산하며, 열에 안정하고 열악한 환경에 저항성인 내생포자(endospore)를 형성하는 특징을 가진다. 이러한 특징을 갖는 바실러스 벨레젠시스 균주는 1994년 구스타프손(Gustafson)사가 코디악(Kodiak)이라는 상품명으로 목화와 땅콩의 종자 및 밭고랑 처리제로서 개발된 바 있다(Backman 등, Improving Plant Productivity with Rhizosphere Bacteria, pp. 3-8).

또한, 2001년에는 바실러스 벨레젠시스균과 바실러스 아밀로리퀴페시언스(Bacillus amyloliquefaciens) 균을 섞어 바이오일드(BioYield)라는 미생물 살균제를 출시하였다. 중국에서는 바실러스 속의 많은 균들을 수확량 증진을 위한 세균이라 하여 널리 사용하고 있으며, 독일 바이엘(Bayer)사에서는 바실러스 FZB 24균을 사용하는 토양전염병 방제제를 개발한 바 있다. 또한 미국 탠사(Taensa)에서는 동일한 균을 이용한 미생물 살균제를 출시하였다. 미국 아그라퀘스트(AgraQuest)사는 세레나데(Serenade)라는 바실러스 벨레젠시스 QST713 균주를 이용한 미생물 살균제를 개발하였다.

국내에서는 1970년대 초반부터 인삼 뿌리썩음병의 생물학적 방제 연구를 시작으로 고추 역병, 오이 및 딸기 시들음병, 참깨 모잘록병과 잿빛곰팡이병의 생물학적 방제에 관한 연구를 하고 있으나, 효과의 불안정성, 제제화의 미흡, 비경제성 등으로 인해 큰 진전은 없는 상황이다.

지금까지 바실러스 속의 미생물을 이용한 미생물 살균제로서 ‘테라스’, ‘홀인원’, ‘그린올’, ‘씰러스’, ‘슈팅스타’, ‘재노탄’ 등의 제품이 등록되어 있는데, 이들의 경우 제품에 따라 흰가루병과 잿빛곰팡이병, 잔디 갈색잎마름병 또는 잔디 피시움마름병 등에 효과가 있는 것으로 나타나 그 사용에 있어 많은 제한이 따른다.

하지만 유기질 비료를 무기질소화하는 과정을 촉진하는 미생물(김진호와 주길재, 2008. 대한민국 특허 출원번호 2008-0008928)이나 식물병에 대하여 효과가 있는 바실러스속 미생물에 대한 보고는 많이 있으나 상기 두 가지 효과를 동시에 소유하고 있는 미생물에 대한 보고는 전무한 실정이다.

이에 본 발명자들은 유기질 비료의 사용시 초기 단백질 분해를 촉진하여 무기질소의 생산량을 증가시킴으로써 유기질 비료의 안정화기간을 단축시킬 뿐만 아니라 다양한 식물병을 저감시키는 미생물을 선발하고자 노력한 결과, 상기 두 가지 기능을 동시에 소유하고 있는 미생물을 선별 후 다양한 식물병에 대한 방제효과 및 우수한 유기물의 무기질소화 촉진 활성능을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 유기질 비료의 사용시 초기 단백질 분해를 촉진하여 무기질소의 생산량을 증가시킴으로써 유기질 비료의 안정화기간을 단축시킬 뿐만 아니라 다양한 식물병을 저감시키는 미생물 및 이의 배양물을 함유하는 미생물 제제와 이를 이용한 식물병 방제방법을 제공하는 것이다.

본 발명은 상기 목적을 달성하기 위하여, 신규한 바실러스 벨레젠시스 KRICT934 균주 및 이의 배양물을 함유하는 미생물 제제와 이를 이용한 식물병 방제방법을 제공한다.

본 발명의 신규한 바실러스 벨레젠시스 KRICT934 균주는 배추의 뿌리로부터 분리되고, 유기물의 무기질소화 촉진 활성 및 식물 병원균에 대한 항균 활성을 동시에 갖는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 바실러스 벨레젠시스(Bacillus velezensis) KRICT934(기탁번호: KCTC 11774BP) 균주 및 바실러스 벨레젠시스(Bacillus velezensis) KRICT934(기탁번호: KCTC 11774BP) 균주의 배양물은 벼 도열병, 벼 잎집무늬마름병, 토마토 잿빛곰팡이병, 토마토 역병, 밀 붉은녹병, 보리 흰가루병, 고추 탄저병, 무 시들음병 및 고추 역병으로부터 선택되는 1종 이상의 식물병에 대하여 강한 길항작용을 가지는 것을 특징으로 한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 배추의 뿌리로부터 분리되고, 유기물의 무기질소화 촉진 활성 및 식물 병원균에 대한 항균 활성을 동시에 갖는, 바실러스 벨레젠시스(Bacillus velezensis) KRICT934(기탁번호: KCTC 11774BP) 균주 및 이의 배양물을 제공한다.

보다 구체적으로 본 발명에 따른 바실러스 벨레젠시스(Bacillus velezensis) KRICT934 균주는 배추의 뿌리로부터 분리하였으며, 균주의 형태적 특성 및 생화학적 특성은 하기와 같았다.

트립틱 소이 한천 배지(Tryptic soy agar) 상에서 얇게 퍼져 자라며, 단일 콜로니의 경우 작은 눈꽃 모양을 띠며, 간상형으로 내생포자를 형성하며 그람 염색반응에서 양성을 나타내는 것을 확인할 수 있었다. 또한, 덱스트린(dextrin), L-아라비노스(L-arabinose), 셀로바이오스(cellobiose), D-프럭토스(D-fructose), 젠토바이오스(gentobiose), α-D-글르코스(α-D-glucose), D-만노스(D-mannose), D-리보스(D-ribose), D-자일로스(D-xylose), 글리코겐(glycogen), 메틸 α-D-글리코사이드(Methyl α-D-glycoside), D-라피노스(D-raffinose), D-트라노스(D-Turanose) 등을 이용하여 산을 생성하며, 트윈 40(tween 40)과 트윈 80(tween 80)을 가수분해하는 특징을 확인할 수 있었다. 도 5를 참조한다.

또한, 바실러스 벨레젠시스 KRICT934 균주의 16S rRNA 유전자의 염기서열(서열번호 1) 및 gyrA 유전자의 염기서열(서열번호 2)을 확인한 결과, 바실러스 벨레젠시스(Bacillus velezensis)인 것을 확인할 수 있었고, 이를 바실러스 벨레젠시스(Bacillus velezensis) KRICT934로 명명하고, 한국생명공학연구원 미생물자원센터에 2010년 10월 4일자로 기탁하여 기탁번호 KCTC 11774BP를 부여받았다. 도 1 내지 4를 참조한다.

뿐만 아니라 본 발명의 바실러스 벨레젠시스 KRICT934 균주 또는 바실러스 벨레젠시스 KRICT934 균주의 배양물은 혼합유박의 질소무기화 촉진능을 가지는 것을 확인할 수 있었다.

보다 상세하게는 탈지강과 질석의 비율에 따른 바실러스 벨레젠시스 KRICT934 균주에 대한 혼합 유박에서의 질소무기화 촉진 활성을 조사한 결과, 바실러스 벨레젠시스 KRICT934 균주를 처리하지 않은 대조구에 비하여 유박의 질소무기화 활성이 우수한 것을 확인할 수 있었다. 도 6 내지 8을 참조한다.

본 발명은 상기 특성을 갖는 바실러스 벨레젠시스(Bacillus velezensis) KRICT934(기탁번호: KCTC 11774BP) 균주 또는 바실러스 벨레젠시스(Bacillus velezensis) KRICT934(기탁번호: KCTC 11774BP) 균주의 배양물을 함유하는, 유기물의 질소무기화 촉진 활성 및 식물 병원균에 대한 항균 활성을 동시에 갖는 미생물 제제를 제공한다.

상기 미생물 제제는 벼 도열병, 벼 잎집무늬마름병, 토마토 잿빛곰팡이병, 토마토 역병, 밀 붉은녹병, 보리 흰가루병, 고추 탄저병, 무 시들음병 및 고추 역병으로부터 선택되는 1종 이상의 식물병에 대하여 강한 길항작용을 가지는 것을 특징으로 한다.

본 발명은 상기 바실러스 벨레젠시스(Bacillus velezensis) KRICT934(기탁번호: KCTC 11774BP) 균주 또는 상기 바실러스 벨레젠시스(Bacillus velezensis) KRICT934(기탁번호: KCTC 11774BP) 균주의 배양물을 함유하는, 유기물의 질소무기화 촉진 활성 및 식물 병원균에 대한 항균 활성을 동시에 갖는 미생물 제제를 작물의 지상부 또는 재배지에 처리하는 것을 특징으로 하는 식물병의 방제방법을 제공한다.

상기 식물병은 벼 도열병, 벼 잎집무늬마름병, 토마토 잿빛곰팡이병, 토마토 역병, 밀 붉은녹병, 보리 흰가루병, 고추 탄저병, 무 시들음병 및 고추 역병으로부터 선택되는 1종 이상인 것으로, 작물에 통상의 방법으로 적용한다.

구체적인 방법으로 본 발명에 따른 상기 미생물 제제는 토양, 작물의 잎, 줄기, 꽃 또는 열매에 살포하는 것으로, 물에 상기 미생물 제제를 희석하여 사용할 수 있으며, 본 발명의 미생물 균주의 항균 활성을 더하기 위하여 엽면살포제 또는 관주살포제 등을 더 포함할 수 있다. 또한, 살포시기는 각 식물 병원균이 발병ㆍ증식하기 전 예방적으로 미리 처리하는 것이 방제효과를 더욱 상승시킬 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 바실러스 벨레젠시스(Bacillus velezensis) KRICT934(기탁번호: KCTC 11774BP) 균주 또는 상기 바실러스 벨레젠시스(Bacillus velezensis) KRICT934(기탁번호: KCTC 11774BP) 균주의 배양물을 함유하는, 유기질 비료를 제공할 수 있다.

본 발명에 따른 바실러스 벨레젠시스 KRICT934 균주는 다양한 식물병에 대하여 탁월한 항균 활성을 갖고 있으며, 동시에 유박의 질소 무기화를 촉진하는 활성이 매우 우수하여 기존 미생물에 대한 경제적인 대체효과가 크고 고성능을 가지고 있어, 작물의 상품성 및 생산성을 증대시킬 수 있는 효과가 있다.

도 1은 본 발명에 따른 KRICT934 균주의 16S rRNA 유전자 염기서열을 나타낸 것이고,
도 2는 본 발명에 따른 KRICT934 균주의 gyr A 유전자 염기서열을 나타낸 것이며,
도 3은 본 발명에 따른 KRICT934 균주의 16S rRNA 유전자 염기서열에 의한 계통수를 나타낸 것이고,
도 4는 본 발명에 따른 KRICT934 균주의 gyr A 유전자 염기서열에 의한 계통수를 나타낸 것이며,
도 5는 본 발명에 따른 KRICT934 균주의 고체배양 추출물에 대한 효소 생성능을 조사한 결과이고,
(A: 프로테아제, B: 키티나아제, C: 셀룰라아제)
도 6은 탈지강과 질석의 비율(탈지강:질석=2:8, v/v)에 따른 본 발명의 KRICT934 균주에 대한 혼합 유박에서의 질소무기화 촉진 활성을 조사한 결과이며,
도 7은 탈지강과 질석의 비율(탈지강:질석=1:1, v/v)에 따른 본 발명의 KRICT934 균주에 대한 혼합 유박에서의 질소무기화 촉진 활성을 조사한 결과이며,
도 8은 탈지강과 질석(탈지강:질석=1:1, v/v)으로부터 배양된 본 발명의 KRICT934 균주의 배양체에 대한 토양에서의 유박 질소무기화 촉진 활성을 조사한 결과이며,
도 9는 다양한 식물병원균에 대한 본 발명에 따른 KRICT934 균주의 균사생육 저해활성을 조사한 결과이고,
도 10은 다양한 식물병에 대한 접종 하루 전 본 발명에 따른 KRICT934 균주의 배양물의 처리에 따른 예방효과를 조사한 결과이며,
(RCB: 벼 도열병, RSB: 벼 잎집무늬마름병, TGM: 토마토 잿빛곰팡이병, TLB: 토마토 역병, WLR: 밀 붉은녹병, BPM: 보리 흰가루병, RPA: 고추 탄저병)
도 11은 무 시들음병에 대한 본 발명에 따른 KRICT934 균주 고체배양체의 방제효과를 조사한 결과이고,
(왼쪽 포트: 무처리구, 오른쪽 포트: KRICT934 처리구)
도 12는 고추 역병에 대한 본 발명에 따른 KRICT934 균주 고체배양체의 방제효과를 조사한 결과이다.
(왼쪽 포트: KRICT934 처리구, 오른쪽 포트: 무처리구)

이하, 하기 실시예에 의하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하고자 한다. 하지만, 본 발명은 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니며, 본 발명의 사상과 범위 내에서 여러 가지 변형 또는 수정할 수 있음은 이 분야에서 당업자에게는 명백한 것이다.

이때, 사용되는 기술 용어 및 과학 용어에 있어서 다른 정의가 없다면, 이 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 통상적으로 이해하고 있는 의미를 가지며, 하기의 설명 및 첨부 도면에서 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있는 공지 기능 및 구성에 대한 설명은 생략한다.

[ 실시예 1] 바실러스 벨레젠시스 KRICT934 균주의 분리

배추, 토마토, 무 등 다양한 종류의 건전한 작물 뿌리를 작은 조각으로 나눈 어 1% NaOCl에 1분간 침지한 다음, 멸균수에 1분간 세척하였다. 뿌리 조직에 0.1M MgSO₄ 용액을 가하여 마쇄한 다음 감자 덱스트로스 한천 배지(potato dextrose agar: PDA; Difco사, 미국)에 도말하였다. 30℃에서 배양한 후 세균 콜로니가 나타나면 영양 한천 배지(Nutrient agar)에서 3 내지 4회 계대배양하여 단일 콜로니를 분리하였다.

상기 분리된 단일 콜로니로부터 총 504개의 균주를 분리할 수 있었고, 하기 실시예 3 및 4와 동일한 방법으로 단백질 분해효소 생성능과 유박의 질소무기화 촉진활성 정도를 조사하여 최종적으로 배추 뿌리로부터 가장 활성이 우수한 균주를 선별하였고, KRICT934라고 명명하였다.

[ 실시예 2] 바실러스 벨레젠시스 KRICT934 균주의 동정

상기 실시예 1에서 선별된 바실러스 벨레젠시스 KRICT934 균주의 동정은 균주의 형태학적/생화학적 특성과 16S rRNA 유전자와 gyr A 유전자 염기서열 분석을 이용하여 수행하였다.

(1) 형태적 및 생화학적 특성

상기 실시예 1에서 선별된 바실러스 벨레젠시스 KRICT934 균주는 트립틱 소이 한천배지(Tryptic soy broth) 상에서 얇게 퍼져 자라며, 단일 콜로니의 경우 작은 눈꽃 모양을 띠는 것을 확인할 수 있었고, 선별 균주는 간상이며, 그람 염색반응에서 양성을 나타내었다. 내생포자를 형성하며, 덱스트린(dextrin), L-아라비노스(L-arabinose), 셀로바이오스(cellobiose), D-프럭토스(D-fructose), 젠토바이오스(gentobiose), α-D-글르코스(α-D-glucose), D-만노스(D-mannose), D-리보스(D-ribose), D-자일로스(D-xylose), 글리코겐(glycogen), 메틸 α-D-글리코사이드(Methyl α-D-glycoside), D-라피노스(D-raffinose), D-트라노스(D-Turanose) 등을 이용하여 산을 생성하며, 트윈 40(tween 40)과 트윈 80(tween 80)을 가수분해하는 것으로 나타났다. 이와 같은 특징들을 표준 균주(type strain)인 LMG22478과 비교할 때 하기 표 1과 같이 여러 가지 차이가 있는 것으로 나타났다.

(2) 유전자의 염기서열 분석

상기 실시예 1에서 선별된 바실러스 벨레젠시스 KRICT934 균주의 16S rRNA 유전자의 염기서열(서열번호: 1)을 분석한 결과, 도 3에서도 확인할 수 있듯이 바실러스 서브틸리스 콤플렉스(Bacillus subtilis complex)에 속하는 것을 확인할 수 있었다.

보다 정확한 동정을 위하여 gyr A 유전자의 염기서열 분석을 실시하였다. 그 결과 gyr A 유전자의 염기서열(서열번호: 2)을 분석한 결과, 도 4에서도 확인할 수 있듯이 상기 실시예 1에서 선별된 균주는 바실러스 벨레젠시스 LMG22478T와 98.5% 정도의 상동성을 나타냄을 확인할 수 있었다.

상기의 결과로부터 본 발명에서 수득된 균주는 바실러스 벨레젠시스 균주로서 동정되었으며, 상기 균주를 바실러스 벨레젠시스 KRICT934로 명명하고 한국생명공학연구원 미생물자원센터에 2010년 10월 4일자로 기탁번호 제 KCTC 11774BP를 부여받았다.

[ 실시예 3] 바실러스 벨레젠시스 KRICT934 균주의 효소 생성능 조사

상기 선별된 KRICT934균주에 대하여 단백질 분해능과 기타 다른 효소의 생산여부를 조사하기 위하여 프로테아제(protease), 셀룰라아제(cellulase), 그리고 키티나아제(chitinase)에 대한 생물검정을 실시하였다.

프로테아제의 생성 유무를 알아보기 위해 1%(w/v) skim milk(구입처: Difco사, 미국)가 포함된 1/10 루리아-버타니한천(Luria-Bertani agar, 구입처: Difco사, 미국) 평판배지 중앙에 루프(loop)를 이용하여 KRICT934 균주를 획선으로 접종하고, 30℃에서 24시간 배양 후 콜로니 주위에 clear zone의 반경을 측정하였다.

키티나아제의 생성 유무를 알아보기 위해 키틴한천배지(Colloidal chitin 7 g, KH₂PO₄ 3 g, K₂HPO₄ 2 g, NH₄Cl 1 g, MgSO₄?7H₂O 0.2 g, CaCl₂?2H₂O 0.01 g, yeast extract 0.1 g, Bacto agar 15 g, 증류수 1 L)를 만들고, 배지 중앙에 KRICT934 균주를 획선으로 접종하여 30℃에서 3일간 배양 후 콜로니 주위에 clear zone의 반경을 조사하였다.

또한, 셀룰라아제의 생성 유무를 알아보기 위해 셀룰로오스한천배지(MgSO₄?7H₂O 0.1 g, CaCl₂?2H₂O 0.2 g, KH₂PO₄ 0.3 g, K₂HPO₄ 0.5 g, carboxymethylcellulose 5 g, yeast extract 0.1 g, Bacto agar 15 g, 증류수 1 L)를 만들고, 배지 중앙에 KRICT934 균주를 획선으로 접종하여 30℃에서 3일간 배양 후, 1 mg/ml의 콩고레드(congo red)를 배지 위에 부어 10분간 잘 흔들어준 후 버리고 1 M NaCl로 3번 행군 후 콜로니 주위에 형성된 clear zone의 크기를 조사하였다.

그 결과, 상기 표 2와 같이, KRICT934 균주는 프로테아제와 셀룰라아제를 생산하였지만, 키티나아제는 생산하지 않는 것을 확인할 수 있었다.

한편, 바실러스 벨레젠시스 KRICT934 균주의 고체배양체에서의 이들 효소의 생성유무를 조사하기 위하여, 페트리디쉬 내의 멸균한 탈지강:질석(Vermiculite)(2:8, v/v) 배지(50 g; 물 17.5 ml)에 트립틱소이액체배지에서 30℃, 150 rpm으로 1일간 배양한 배양액 5 ml을 취하여 접종하였다. 접종 후 30℃에서 3일간 배양하였으며, 매일 배지가 잘 석이도록 흔들어주었다. 이렇게 배양한 고체 배양체 5 g을 위하여 10 ml을 증류수를 첨가한 다음 10분간 초음파 처리하였다.

0.2 ㎛의 막을 이용하여 여과하여 제균한 다음 획득한 추출액 35 ㎕를 멸균한 paper disc에 처리한 다음 세 가지 효소검정용 배지에 치상하였다. 프로테아제는 하루 후에, 그리고 셀룰라아제와 키티나아제는 3일 후에 clear zone의 생성여부를 조사하였다.

그 결과, 도 5와 같이 바실러스 벨레젠시스 KRICT934균주는 고체배양체에서도 프로테아제와 셀룰라아제를 많이 생산하는 것을 확인할 수 있었다.

[ 실시예 4] 바실러스 벨레젠시스 KRICT934 균주의 유박 질소무기화 촉진 활성

상기 선별된 바실러스 벨레젠시스 KRICT934 균주의 유박의 질소무기화 활성을 조사하기 위하여, 삼각플라스크 내의 멸균한 탈지강:질석(Vermiculite)(2:8, v/v)이 함유된 혼합물(50 g; 물 17.5 ml)에 트립틱 소이 액체배지(Tryptic soy broth)에서 30℃, 150 rpm으로 1일간 배양한 선별된 바실러스 벨레젠시스 KRICT934 균주의 배양액 5 ml를 취하여 접종하였다.

접종 후, 30℃에서 3일간 배양하였으며 매일 배지가 잘 석이도록 흔들어주었다. 이렇게 제조한 배양체(1.5 g)에 혼합유박(질소함량=4.2%)(1.5 g)을 혼합한 다음 물을 1 ml 가하였다. 30℃에서 배양하면서 5일, 7일, 9일 및 11일 차에 2M KCl로 시료를 채취한 후에 킬달 증류장치(Kjeldahl distillation)을 이용하여 무기태질소의 양을 측정하였다. 이 때 대조구로는 유박(1.5 g)+증류수(1 ml)를 혼합한 대조구 1과 배양체(1.5 g)를 단독 처리한 대조구 2를 조사하였다.

또한 고체배지의 탈지강과 질석의 비율을 달리하였을 때 유박의 질소무기화 활성 정도를 측정하기 위하여 바실러스 벨레젠시스 KRICT934 균주를 탈지강:질석(1:1, v/v)에 3일간 배양한 후, 유박에 배양체를 처리하였을 때 실험실에서의 질소무기화 정도를 조사하였으며, 기타 모든 방법은 상술한 바와 같이 실시하였다.

그 결과, 도 6 및 도 7에서도 확인할 수 있듯이 본 발명의 선별된 바실러스 벨레젠시스 KRICT934 균주는 유박의 질소무기화를 매우 촉진하는 것을 확인할 수 있었다.

한편, 탈지강:질석(1;1, v/v) 배지에서 배양한 배양체에 대한 토양에서의 유박 질소무기화 활성 정도를 측정하였다. 토양 10 g에 혼합 유박 1 g과 배양체 1 g을 혼합한 후 증류수를 2 ml 가하였다. 대조구로는 토양(10 g)+유박(1 g)+증류수(3 ml)를 혼합한 대조구 1과 토양(10 g)+배양체(1 g)+증류수(3 ml)를 혼합한 대조구 2를 조사하였다.

그 결과, 도 8에도 확인할 수 있듯이, 본 발명의 선별된 바실러스 벨레젠시스 KRICT934 균주는 토양 중에서도 유박의 유기질소를 무기질소화하는 활성이 매우 강한 것을 확인할 수 있었다.

[ 실시예 5] 바실러스 벨레젠시스 KRICT934 균주의 식물병원균 생장 저해 활성

상기 선별된 바실러스 벨레젠시스 KRICT934 균주가 다양한 식물병원균의 생장에 미치는 영향 조사하기 위하여 9가지 식물병원균을 이용하였다.

PDA 배지의 한가운데에 왕성하게 자라고 있는 식물병원균의 배양체로부터 얻은 균사조각을 접종하였다. 약 2.5 cm 정도 떨어진 부위에 선별된 KRICT934균주를 직선으로 스트리킹(streaking)한 다음 25℃에서 배양한 후, 식물병원균이 가장자리까지 생장할 때 KRICT934 균주에 의한 식물병원균의 생장저해 정도를 측정하였다.

그 결과 상기 표 3 및 도 9에서도 확인할 수 있듯이 대부분의 식물병원균에 대한 생장을 강하게 저해하는 것을 확인할 수 있었다.

[ 실시예 6] 접종 1일전 엽면분무살포에 의한 7가지 식물병에 대한 예방효과

다양한 식물병에 대한 접종 하루 전 본 발명에 따른 KRICT934 균주의 배양물의 처리에 따른 예방효과를 조사하였다.

상기 다양한 식물병은 벼 도열병, 벼 잎집무늬마름병, 토마토 잿빛곰팡이병, 토마토 역병, 밀 붉은녹병, 보리 흰가루병, 고추 탄저병을 포함한 7가지 식물병을 대항으로 실험하였다.

우선, 바실러스 벨레젠시스 KRICT934 균주를 멸균한 50 ㎖의 트립틱 소이 액체배지(Tryptic soy broth, 구입처: Becton and Dickinson사)에 접종한 다음 30℃에서 3일간 150 rpm으로 진탕배양하였다. 배양액을 증류수로 3배로 희석한 40 ㎖의 희석액에 트윈 20(Tween 20)을 250 ㎍/㎖의 농도로 첨가한 후, 대상 식물인 벼와 토마토, 밀 그리고 보리에 각각 처리하고 풍건한 다음 실온에서 1일 동안 방치하였다.

벼의 경우 전착력을 증진하기 위하여 배양액을 살포하기 4시간 전에 트윈 20을 250 ㎍/㎖의 용액을 미리 살포한 다음 상온에 건조하였다. 실험에 사용한 벼와 토마토, 밀 그리고 보리는 지름 4.5 ㎝의 플라스틱 포트에 수도용 상토 또는 원예용 상토를 70% 정도 채운 후, 종자를 파종하여 25±5℃의 온실에서 1주 내지 4주간 재배하였다.

벼 도열병의 경우 3 내지 4엽기의 유묘에 도열병의 원인균인 마그나포르테 오리자(Magnaporthe oryzae, 한국화학연구원)의 포자 현탁액(5×10⁵ spores/㎖)을 분무 접종하고, 25℃의 습실상에서 하루 동안 습실 처리한 후, 25℃의 항온실에서 5일간 배양하여 발병을 유도하였다.

벼 잎집무늬마름병의 경우는 원인균인 리족토니아 솔라니(Rhizoctonia solani, 한국화학연구원)를 배지(밀기울 90 g, 왕겨 15 g 및 증류수 100 ㎖)에서 7일간 배양하여 얻은 배양물을 5엽기 유묘에 접종하고 25℃의 습실상에서 4일간 습실처리한 후, 25℃의 항온실에서 4일간 배양하여 발병을 유도하였다.

토마토 역병의 경우는 3 내지 4엽기 토마토 유묘에 역병의 원인균인 파이토프토라 인페스탄스(Phytophthora infestans, 강릉대학교)의 유주자낭(5×10⁴ sporangia/㎖)에서 나출된 유주자 현탁액을 분무 접종한 후 25℃의 습실상에서 2일간 습실 처리하고 25℃의 항온항습실에서 1일간 배양하여 발병을 유도하였다.

토마토 잿빛곰팡이병의 경우 토마토 3 내지 4엽기 유묘에 잿빛곰팡이병의 원인균인 보트라이티스 시네리아(Botrytis cinerea, 한국화학연구원)의 포자 현탁액(5×10⁵ spores/㎖)을 처리한 후, 20℃의 습실상에서 3일간 배양하여 발병을 유도하였다.

밀 붉은녹병의 경우는 1엽기 유묘에 활물기생균으로 알려진 녹병의 원인균인 퍽시니아 리콘디타(Puccinia recondita, 인천대학교)의 포자를 250 ㎍/㎖의 트윈 20 용액에 0.67 g spores/ℓ의 양으로 현탁하여 분무 처리하고 20℃의 습실상에서 하루 동안 습실처리한 후, 20℃의 항온실로 옮겨 6일간 배양하여 발병을 유도하였다.

보리 흰가루병의 경우는 보리의 1엽기 유묘에 숙주 식물에서 계대배양된 흰가루병의 원인균인 에리시페 그래미니스 폼 스피시스 호르데이(Erysiphe graminis f. sp. hordei, 한국화학연구원)의 포자를 털어서 접종하고 20℃의 항온실에서 7일간 배양하여 발병을 유도하였다. 벼 도열병, 밀 붉은녹병, 보리 흰가루병은 접종 7일 후, 벼 잎집무늬마름병은 접종 8일 후, 그리고 토마토 잿빛곰팡이병과 토마토 역병은 접종 3일 후에 병반 면적율을 조사하였다.

한편, 고추 탄저병에 대한 방제활성 실험을 위해서는, 지름 7.0 ㎝의 플라스틱 포트에 원예용 상토를 70% 정도 채운 후 최아된 고추 종자를 파종하고, 이를 온실에서 3 내지 4엽기까지 키운 다음 상기에서 준비된 바실러스 벨레젠시스 KRICT934 균주의 배양액을 엽면 살포하였다. 시료 살포 후 24시간 동안 상온에서 건조시킨 다음 고추 탄저병원균인 콜레토트리쿰 코코데스(Colletotrichum coccodes, 고려대학교)의 포자 현탁액(4×10⁵ 포자/㎖)을 분무 접종하였다. 습실상에서 2일간 발병시킨 후 25℃의 항온실에 1일간 방치하였고, 접종 3일 후에 병반 면적율을 조사하였다.

상기로부터 얻은 병반 면적율을 이용하여 하기 수학식 1에 따라 방제가를 계산하였다.

그 결과 도 10에서 확인할 수 있듯이, 본 발명의 바실러스 벨레젠시스 KRICT934 균주는 시험한 7가지 식물병 모두에 대하여 높은 항균 활성을 보이는 것을 확인할 수 있었고 특히, 벼 잎집무늬마름병과 토마토 역병에 대해서는 우수한 항균 활성을 가짐을 확인하였다.

[ 실시예 7] 바실러스 벨레젠시스 KRICT934 균주의 무 시들음병에 대한 효과

바실러스 벨레젠시스 KRICT934 균주의 고체 배양체를 토양에 처리하였을 때 식물병에 대한 방제효과를 조사하기 위하여 토양전염병인 무 시들음병에 대한 방제 효과를 조사하였다.

상기 실시예 3에서와 동일한 방법으로 탈지강:질석(Vermiculite)(2:8, v/v) 고체 배지(50 g; 물 17.5 ml)에 균주를 접종한 후, 30℃에서 3일간 배양한 고체배양체를 시료로 사용하였다.

원예용 상토와 버미큐라이트(Vermiculite)를 1:1(v/v)로 혼합한 토양에 청수궁중무 종자를 파종하고 온실에서 14일간 재배하였다. 뿌리를 뽑아 물로 세척한 다음 뿌리를 푸자리움 옥시스포룸 폼 스페셜리스 라파니(Fusarium oxysporum f. sp . raphani)의 포자현탁액(1.0×10⁷ 포자/㎖)에 30분간 침지하였다. 포자현탁액의 경우 맥아추출물 액체배지(Malt extract broth, MEB)에 접종하여 25℃ 배양기에서 7일 동안 배양한 후, 4겹 가제로 걸러 균사체를 제거하고 수확한 포자 현탁액을 원심분리(4℃) 한 후 멸균수로 희석하여 농도를 맞췄다. 침지한 유묘의 뿌리에 고체배양체를 묻힌 다음, 50 ㎖ 부피의 포트에 고체배양체를 5% 첨가한 원예용 상토를 사용하여 이식하였다. 25℃ 습실상에서 하루 동안 보관한 다음 온실로 옮겨 3주 후 발병도를 조사하였다.

발병도는 하기와 같은 인덱스(index)를 이용하여 측정하였다.

0: 건전, 1: 지하부는 갈변되나 지상부는 시들지 않고 병징이 없는 것, 2: 지하부는 갈변되고 지상부는 시드는 것, 3: 지하부는 갈변되고 지상부는 시들며 황화하는 것, 4: 지하부는 갈변되고 지상부는 심하게 황변하여 시들고 낙엽된 것, 5: 고사.

그 결과, 도 11에서도 확인할 수 있듯이, 본 발명의 바실러스 벨레젠시스 KRICT934 균주의 고체배양체는 무 시들음병에 대하여 27%의 방제활성을 보였다.

[ 실시예 8] 바실러스 벨레젠시스 KRICT934 균주의 고추 역병에 대한 효과

상기 실시예 7에서서 사용한 본 발명의 균주 고체배양체를 이용하여 고추 역병에 대한 효과를 조사하였다.

4엽기의 부강 고추 유묘를 200 ㎖ 부피의 포트에 옮겨 심고, 고체 배양체를 포트 부피비 10%에 해당하는 양을 포트 표면에 처리하고 온실에서 일주일간 키웠다. 고추 역병균(Phytophthora capsici)은 귀리한천배지(Oatmeal agar, OMA) 배지에 접종하여 25℃에서 일주일간 배양하였다. 일주일 후, 고추 역병균이 자란 배지 표면을 붓으로 긁어 균사를 제거하고, 25℃, 명조건의 습실에서 24시간 배양하였다. 4℃의 차가운 멸균수를 고추 역병균 배지에 조금 부은 후, 붓으로 긁어 유주자낭을 회수한 후 회수한 유주자낭을 3×10³ 유주자낭/ml로 맞추고 냉장고에 넣은 후, 한 시간 후에 꺼내어 20분간 상온에 두었다.

고체 배양체를 처리한 1주일 후에 고추 유묘를 트레이에 옮기고, 상기에서 준비한 고추 역병균의 유주자낭 현탁액을 고추 유묘에 10 ml씩 관주하였다. 트레이에 물을 0.5 cm 정도로 채우고 습실 챔버(95% RH, 25℃)에서 24시간 동안 습실처리한 후, 온실에서 저면관수로 9일간 발병시키며 발병도를 조사하였다.

발병도는 하기와 같은 인덱스(index)를 이용하여 측정하였다.

0: 건전, 1: 지제부가 무르고 갈변하기 시작하는 것, 2: 30-50% 정도의 병발생으로 잎이 아래로 쳐진 것, 3: 50 내지 70% 정도의 병발생으로 잎이 쳐진 후에 말린 것, 4: 70 내지 90% 정도의 병발생으로 상위 옆을 제외한 모든 잎과 줄기가 마른 것, 5: 고사.

그 결과, 도 12에서도 확인할 수 있듯이,본 발명의 바실러스 벨레젠시스 KRICT934 균주의 고체배양체는 고추 역병에 대하여 55%의 높은 방제활성을 보이는 것을 확인할 수 있었다.

한국생명공학연구원

KCTC11774BP

20101004

<110> KOREA RESEARCH INSTITUTE OF CHEMICAL TECHNOLOGY <120> Promotion of nitrogen mineralization of organic fertilizers and control of plant diseases using bacillus velezensis KRICT934 <160> 2 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 1456 <212> DNA <213> Bacillus velezensis <220> <221> gene <222> (1)..(1456) <223> 16S rRNA <400> 1 ctcaggacga acgctggcgg cgtgcctaat acatgcaagt cgagcggaca gatgggagct 60 tgctccctga tgttagcggc ggacgggtga gtaacacgtg ggtaacctgc ctgtaagact 120 gggataactc cgggaaaccg gggctaatac cggatggttg tttgaaccgc atggttcaga 180 cataaaaggt ggcttcggct accacttaca gatggacccg cggcgcatta gctagttggt 240 gaggtaacgg ctcaccaagg cgacgatgcg tagccgacct gagagggtga tcggccacac 300 tgggactgag acacggccca gactcctacg ggaggcagca gtagggaatc ttccgcaatg 360 gacgaaagtc tgacggagca acgccgcgtg agtgatgaag gttttcggat cgtaaagctc 420 tgttgttagg gaagaacaag tgccgttcaa atagggcggc accttgacgg tacctaacca 480 gaaagccacg gctaactacg tgccagcagc cgcggtaata cgtaggtggc aagcgttgtc 540 cggaattatt gggcgtaaag ggctcgcagg cggtttctta agtctgatgt gaaagccccc 600 ggctcaaccg gggagggtca ttggaaactg gggaacttga gtgcagaaga ggagagtgga 660 attccacgtg tagcggtgaa atgcgtagag atgtggagga acaccagtgg cgaaggcgac 720 tctctggtct gtaactgacg ctgaggagcg aaagcgtggg gagcgaacag gattagatac 780 cctggtagtc cacgccgtaa acgatgagtg ctaagtgtta gggggtttcc gccccttagt 840 gctgcagcta acgcattaag cactccgcct ggggagtacg gtcgcaagac tgaaactcaa 900 aggaattgac gggggcccgc acaagcggtg gagcatgtgg tttaattcga agcaacgcga 960 agaaccttac caggtcttga catcctctga caatcctaga gataggacgt ccccttcggg 1020 ggcagagtga caggtggtgc atggttgtcg tcagctcgtg tcgtgagatg ttgggttaag 1080 tcccgcaacg agcgcaaccc ttgatcttag ttgccagcat tcagttgggc actctaaggt 1140 gactgccggt gacaaaccgg aggaaggtgg ggatgacgtc aaatcatcat gccccttatg 1200 acctgggcta cacacgtgct acaatggaca gaacaaaggg cagcgaaacc gcgaggttaa 1260 gccaatccca caaatctgtt ctcagttcgg atcgcagtct gcaactcgac tgcgtgaagc 1320 tggaatcgct agtaatcgcg gatcagcatg ccgcggtgaa tacgttcccg ggccttgtac 1380 acaccgcccg tcacaccacg agagtttgta acacccgaag tcggtgaggt aacctttatg 1440 gagccagccg ccgaag 1456 <210> 2 <211> 924 <212> DNA <213> Bacillus velezensis <220> <221> gene <222> (1)..(924) <223> gyr A <400> 2 cgtatcccgg gcgcttccgg atgtgcgtga cggtctgaag ccggttcaca gacggatttt 60 gtacgcaatg aatgatttag gcatgaccag tgacaaacca tataaaaaat ctgcccgtat 120 cgtcggtgaa gttatcggta agtaccaccc gcacggtgac tcagcggttt acgaatcaat 180 ggtcagaatg gcgcaggatt ttaactaccg ctacatgctt gttgacggac acggcaactt 240 cggttcggtt gacggcgact cagcggccgc gatgcgttac acagaagcga gaatgtcaaa 300 aatcgcaatg gaaattctgc gtgacattac gaaagacacg attgactatc aagataacta 360 tgacggttca gaaagagaac ctgccgtcat gccttcgaga tttccgaatc tgctcgtaaa 420 cggagctgcc ggtattgcgg tcggaatggc gacaaatatt cctccgcatc agcttgggga 480 agtcattgaa ggcgtgcttg ccgtaagtga gaatcctgag attacaaacc aggagctgat 540 ggaatacatc ccgggcccgg attttccgac tgcaggtcag attttgggcc ggagcggcat 600 ccgcaaggca tatgaatccg gacggggatc aatcacaatc cgggctaagg ctgaaatcga 660 agagacatca tcgggaaaag aaagaattat tgtcacagaa cttccttatc aggtgaacaa 720 agcgagatta attgaaaaaa tcgcagatct tgtccgggac aaaaaaatcg aaggaattac 780 cgatctgcgt gacgaatccg accgtaacgg aatgagaatc gtcattgaga tccgccgtga 840 cgccaatgct cacgtcattt tgaataacct ttacaaacaa acggccctgc agacgtcttt 900 cggaatcaac ctgctggcgc tcgt 924

Claims

배추의 뿌리로부터 분리되고, 유기물의 무기질소화 촉진 활성 및 식물 병원균에 대한 항균 활성을 동시에 갖는, 바실러스 벨레젠시스(Bacillus velezensis) KRICT934(기탁번호: KCTC 11774BP) 균주.
제 1항에 있어서,
상기 식물 병원균은 벼 도열병, 벼 잎집무늬마름병, 토마토 잿빛곰팡이병, 토마토 역병, 밀 붉은녹병, 보리 흰가루병, 고추 탄저병, 무 시들음병 및 고추 역병으로부터 선택되는 1종 이상의 원인균인 것을 특징으로 바실러스 벨레젠시스(Bacillus velezensis) KRICT934(기탁번호: KCTC 11774BP) 균주.
제 1항에 따른 바실러스 벨레젠시스(Bacillus velezensis) KRICT934(기탁번호: KCTC 11774BP) 균주의 배양물.
제 1항에 따른 바실러스 벨레젠시스(Bacillus velezensis) KRICT934(기탁번호: KCTC 11774BP) 균주 또는 제 3항에 따른 바실러스 벨레젠시스(Bacillus velezensis) KRICT934(기탁번호: KCTC 11774BP) 균주의 배양물을 함유하는, 유기물의 질소무기화 촉진 활성 및 식물 병원균에 대한 항균 활성을 동시에 갖는 미생물 제제.
제 4항에 있어서,
상기 식물 병원균은 벼 도열병, 벼 잎집무늬마름병, 토마토 잿빛곰팡이병, 토마토 역병, 밀 붉은녹병, 보리 흰가루병, 고추 탄저병, 무 시들음병 및 고추 역병으로부터 선택되는 1종 이상의 원인균인 것을 특징으로 미생물 제제.
제 4항 또는 제 5항에서 선택되는 어느 한 항에 따른 미생물 제제를 작물의 열매 또는 재배지에 처리하는 것을 특징으로 하는 식물병의 방제방법.
제 6항에 있어서,
상기 식물병은 벼 도열병, 벼 잎집무늬마름병, 토마토 잿빛곰팡이병, 토마토 역병, 밀 붉은녹병, 보리 흰가루병, 고추 탄저병, 무 시들음병 및 고추 역병으로부터 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 하는 식물병의 방제방법.