KR20210076260A - 식물 병원균에 대한 항균 활성을 갖는 바실러스 벨레젠시스 afb2-2 균주 및 이의 용도 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 식물 병원균에 대한 항균 활성을 갖는 바실러스 벨레젠시스 AFB2-2 균주에 관한 것으로, 보다 상세하게는 상기 균주를 포함하는 식물병 방제용 조성물, 비료 조성물 및 이를 이용한 식물병 방제 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 바실러스 벨레젠시스 AFB2-2 균주는 식물 병원균에 대해 항균 활성을 나타낸다. 이는 바실러스 벨레젠시스 AFB2-2 균주가 식물병 방제를 위한 미생물 제제로 이용될 수 있음을 의미하는바, 식물병 방제 분야에서 다양하게 활용될 수 있다.
Description
본 발명은 식물 병원균에 대한 항균 활성을 갖는 바실러스 벨레젠시스 AFB2-2 균주에 관한 것으로, 보다 상세하게는 상기 균주를 포함하는 식물병 방제용 조성물, 비료 조성물 및 이를 이용한 식물병 방제 방법에 관한 것이다.
일반적으로 농업에서 생산량을 높이고자 식물에서 유발되는 식물병을 방제하기 위해 유기 화합물을 기초로 한 농약을 제조하여 사용해왔다. 최근에는 환경오염 문제와 함께 농작물 오염문제가 심각하게 대두되면서 화학 비료가 아닌 유기질 비료를 사용하는 농법의 개발이 확산되고 있다. 화학비료의 대안으로서 과량 사용되는 유기질 비료는 재료학적으로만 차이가 있을 뿐 토양의 오염, 연작 장해, 토양 양분의 불균형, 병해충 발생 등의 문제를 야기한다.
상기와 같은 문제를 해소하기 위해, 화학 비료 및 유기질 비료를 대체할 수 있는 수단으로, 생물학적 방법이 활발히 연구되고 있다. 상기 생물학적 방법으로는 유용 미생물을 이용한 병충해 방제 연구가 꾸준하게 이루어지고 있다. 생물학적 방제제로 사용 가능한 미생물은 바실러스 속(Bacillus), 슈도모나스 속(Pseudomonas), 스트렙토마이세스 속(Streptomyces), 엔테로박터 속(Enterobacter) 등의 세균과 암펠로마이세스 속(Ampelomyces), 트라이코더마 속(Trichoderma) 등의 진균이 알려져 있다. 상기 미생물은 환경 및 인체에 무해한 미생물로서, 상기 미생물을 이용한 미생물 비료는 염류 집적 등 토양오염의 환경 문제를 일으키지 않는다는 장점이 있으며, 생태계 안정성 유지에 탁월하며 작물 생산성을 지속적으로 향상시키는 이점이 있다.
그러나, 국내의 미생물 제제의 개발 기술은 선진국에 비해 아직까지도 개발 수준이 상당히 미미하며, 대부분이 미생물의 항생 기작에 의존한 방법으로 적용범위가 매우 협소하다는 한계가 있다.
이에 본 발명자들은 전술한 바와 같은 종래기술의 문제점을 해결하기 위하여, 바실러스 벨레젠시스 AFB2-2 균주를 분리하고, 이의 식물 병원균에 대한 항균 활성을 확인함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서 본 발명의 목적은, 식물 병원균에 대한 항균 활성을 갖는 바실러스 벨레젠시스(Bacillus velezensis) AFB2-2 균주(KACC92281P) 및 이를 포함하는 조성물을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 식물 병원균에 대한 항균 활성을 갖는 바실러스 벨레젠시스 AFB2-2 균주(KACC92281P)를 제공한다.
또한 본 발명은 상기 바실러스 벨레젠시스 AFB2-2 균주를 포함하는 식물병 방제용 조성물을 제공한다.
또한 본 발명은 상기 바실러스 벨레젠시스 AFB2-2 균주를 포함하는 비료 조성물을 제공한다.
또한 본 발명은 상기 바실러스 벨레젠시스 AFB2-2 균주(KACC92281P)를 식물 또는 토양에 처리하는 단계를 포함하는 식물병 방제 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 바실러스 벨레젠시스 AFB2-2 균주는 식물 병원균에 대해 항균 활성을 나타낸다. 이는 바실러스 벨레젠시스 AFB2-2 균주가 식물병 방제를 위한 미생물 제제로 이용될 수 있음을 의미하는바, 식물병 방제 분야에서 다양하게 활용될 수 있다.
도 1은 본 발명에 따른 바실러스 벨레젠시스 AFB2-2 균주의 배양 결과 및 전자현미경 이미지를 나타낸 도이다.
도 2는 본 발명에 따른 바실러스 벨레젠시스 AFB2-2 균주의 생육온도를 조사한 결과를 나타낸 도이다.
도 3은 본 발명에 따른 바실러스 벨레젠시스 AFB2-2 균주의 최적 NaCl 농도를 조사한 결과를 나타낸 도이다.
도 4는 API 50CH 키트를 이용하여, 본 발명에 따른 바실러스 벨레젠시스 AFB2-2 균주의 탄소 이용 능력을 평가한 결과를 나타낸 도이다.
도 5는 API 20E 키트를 이용하여, 본 발명에 따른 바실러스 벨레젠시스 AFB2-2 균주의 탄소 이용 능력을 평가한 결과를 나타낸 도이다.
도 6은 본 발명에 따른 바실러스 벨레젠시스 AFB2-2 균주의 2차 대사 산물 생합성 유전자를 분석한 결과를 나타낸 도이다.
도 7은 본 발명에 따른 바실러스 벨레젠시스 AFB2-2 균주가 가지고 있는 bmyA 유전자의 유전적 연관관계를 분석한 결과를 나타낸 도이다.
도 8은 본 발명에 따른 바실러스 벨레젠시스 AFB2-2 균주가 가지고 있는 ituA 유전자의 유전적 연관관계를 분석한 결과를 나타낸 도이다.
도 9는 본 발명에 따른 바실러스 벨레젠시스 AFB2-2 균주가 가지고 있는 srfA 유전자의 유전적 연관관계를 분석한 결과를 나타낸 도이다.
도 2는 본 발명에 따른 바실러스 벨레젠시스 AFB2-2 균주의 생육온도를 조사한 결과를 나타낸 도이다.
도 3은 본 발명에 따른 바실러스 벨레젠시스 AFB2-2 균주의 최적 NaCl 농도를 조사한 결과를 나타낸 도이다.
도 4는 API 50CH 키트를 이용하여, 본 발명에 따른 바실러스 벨레젠시스 AFB2-2 균주의 탄소 이용 능력을 평가한 결과를 나타낸 도이다.
도 5는 API 20E 키트를 이용하여, 본 발명에 따른 바실러스 벨레젠시스 AFB2-2 균주의 탄소 이용 능력을 평가한 결과를 나타낸 도이다.
도 6은 본 발명에 따른 바실러스 벨레젠시스 AFB2-2 균주의 2차 대사 산물 생합성 유전자를 분석한 결과를 나타낸 도이다.
도 7은 본 발명에 따른 바실러스 벨레젠시스 AFB2-2 균주가 가지고 있는 bmyA 유전자의 유전적 연관관계를 분석한 결과를 나타낸 도이다.
도 8은 본 발명에 따른 바실러스 벨레젠시스 AFB2-2 균주가 가지고 있는 ituA 유전자의 유전적 연관관계를 분석한 결과를 나타낸 도이다.
도 9는 본 발명에 따른 바실러스 벨레젠시스 AFB2-2 균주가 가지고 있는 srfA 유전자의 유전적 연관관계를 분석한 결과를 나타낸 도이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명의 양태에 따르면, 본 발명은 식물 병원균에 대한 항균 활성을 갖는 바실러스 벨레젠시스 AFB2-2 균주(KACC92281P)를 제공한다.
본 발명에 있어서, “바실러스(Bacillus)”는 자연계에 널리 분포하는 호기성, 또는 통성혐기성 간균으로서 탈질, 철환원, 망간산화 등에 관여하는 세균으로, 바실러스 속에 속하는 미생물에는 고초균(Bacillus subtilis), 탄저병균(Bacillus anthracis), 세레우스균(Bacillus cereus) 등이 있다.
본 발명자들은 바실러스 속 균주 중에서도 토양 전염성 병원균에 항균활성을 나타내는 바실러스 벨레젠시스 AFB2-2 균주를 분리하였으며, 이를 하기와 같이 규명하였다.
상기 바실러스 벨레젠시스 AFB2-2 균주는 감자 더뎅이병이 발생한 유기농 감자재배지의 무발병 감자의 근권토양으로부터 선별되었다. 상기 분리된 균주를 선별하여 동정한 결과 바실러스 벨레젠시스인 것으로 동정되었다. 또한 상기 바실러스 벨레젠시스 균주는 서열번호 1의 염기서열로 표시되는 16S rRNA를 포함하는 것을 확인하였다. 또한 2차 대사 산물 생합성 유전자인 Bacillomycin D(bmyA), Iturin A(ituA) 및 Surfactin(srfA)의 유전적 연관관계를 분석한 결과, 상기 바실러스 벨레젠시스 균주의 유전자와 완전히 일치하는 균주는 없는 것을 확인하였다.동정된 균주를 바실러스 벨레젠시스 AFB2-2로 명명하고, 농업유전자원센터(2019년 11월 06일)에 기탁하여 수탁번호 KACC92281P를 부여받았다.
본 발명의 구체예에서는, 신규하게 분리된 바실러스 벨레젠시스 AFB2-2 균주가 식물병 원인균, 즉, 토양 오염성 병원균에 대해 현저한 항균 활성을 가진다는 것을 구체적으로 확인하였다.
본 발명에 있어서, “식물 병원균”은 식물에 기생생활을 하는 균류(기생균), 식물에 살생생활을 하는 균(살생균), 특정한 식물에 기생하는 조건적 기생균 등 식물의 병을 유발하는 균류를 의미한다.
본 발명의 구체예에서, 상기 식물 병원균은 푸사리움 옥시스포럼(Fusarium oxysporum), 보트라이티스 시네레아(Botrytis cinerea), 라히족토니아 솔라니(Rhizoctonia solani), 스크레로티니아 스크레로티오럼(Sclerotinia sclerotiorum), 피시움 울티멈(Pythium ultimum), 파이토프소라 캡사이시(Phytophthora capsici) 및 콜레토트리쿰 글로에오스포리오이더스(Colletotrichum gloeosporioides)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것이 바람직하나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 바실러스 벨레젠시스 AFB2-2 균주(KACC92281P)를 포함하는 식물병 방제용 조성물을 제공한다.
본 발명의 구체예에서, 상기 식물병은 세균성 병 또는 바이러스 병일 수 있으며, 바람직하게는 세균성 병으로, 푸사리움 옥시스포럼(Fusarium oxysporum), 보트라이티스 시네레아(Botrytis cinerea), 라히족토니아 솔라니(Rhizoctonia solani), 스크레로티니아 스크레로티오럼(Sclerotinia sclerotiorum), 피시움 울티멈(Pythium ultimum), 파이토프소라 캡사이시(Phytophthora capsici) 및 콜레토트리쿰 글로에오스포리오이데스(Colletotrichum gloeosporioides)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 균주에 의한 병일 수 있다.
또한 상기 식물병은 역병, 더뎅이병, 무름병, 시들음병, 잿빛곰팡이병, 마름병, 흰곰팡이병, 뿌리 썩음병, 고추역병 및 탄저병으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 구체예에서, 본 발명의 식물병 방제용 조성물은 유효성분 이외에 당업계에 공지된 식물병 방제 활성을 갖는 물질을 1종 이상 더 포함할 수 있다.
본 발명의 식물병 방제용 조성물은 농약분야에 공지된 다양한 형태로 제형화될 수 있으며, 제형화를 위해서는 농약분야에서 통상적으로 사용되는 제형화 방법을 어느 것이나 사용할 수 있다. 상기 조성물은 예를 들어, 액제, 입제, 분제, 유제, 오일제, 수화제 또는 도포제의 형태로 제형화될 수 있으며, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 식물병 방제용 조성물은 제형화를 위해 다양한 성분을 포함할 수 있으며, 예를 들어, 액체 담체, 고체 담체, 계면활성제 또는 보조제 등이 포함될 수 있다.
상기 액체 담체로는 물(water), 식물유(vegetable oil), 에탄올(ethanol) 등이 사용될 수 있으며, 상기 식물유에는 대두유, 유채씨기름, 야자유, 팜핵유, 미강유, 옥수수유, 팜유, 올리브유 등이 포함되고, 이에 제한되지 않는다.
상기 고체 담체로는 광물 분말, 젤라틴, 알긴산 등이 사용될 수 있으며, 이에 제한되지 않는다.
상기 광물 분말로는 양이온 점토(cation clay), 벤토나이트(bentonite), 카올린(kaolin), 탈크(Talc), 규조토(diatomaceous earth) 등이 사용될 수 있으며, 이에 제한되지 않는다.
상기 계면활성제로는 에틸렌옥사이드(Ethyleneoxide)계, 다이에탄올아민(Diethanolamine)계, 솔비톨(Sorbitol)계, 글리세린(Glycerine)계 등이 사용될 수 있으며, 이에 제한되지 않는다.
상기 보조제로는 증량제, 부동액, 용제, 증점제, 전착제 등이 사용될 수 있으며, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 식물병 방제용 조성물에 포함되는 유효성분의 농도는 식물체의 생육 정도, 경작지 환경, 식물병의 발병 정도 등을 고려하여 당업자에 의해 적절하게 조절할 수 있다.
본 발명의 식물병 방제용 조성물은 관주용, 침지용, 엽면 살포용, 종자 소독용 또는 농기구 소독용으로 사용될 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 바실러스 벨레젠시스 AFB2-2 균주(KACC92281P)를 포함하는 비료 조성물을 제공한다.
본 발명의 구체예에서, 상기 비료 조성물은 첨가제로서 질소, 인, 칼륨, 규산소다, 키토산, 목초액, 칼슘, 마그네슘, 철, 망간, 붕소, 황, 아연, 구리, 몰리브덴 및 염소를 첨가할 수 있으며, 작물의 종류, 비료성분의 길항작용 및 상조작용을 참고로 첨가할 수 있다.
상기 첨가제 중 질소, 인산 및 칼륨은 작물에 필수적인 비료의 3요소이다.
상기 인은 식물의 세포핵 분열조직 및 포스폴리라제와 같은 식물의 생리상 중요한 요소의 구성요소이며 뿌리의 발육을 촉진하는 역할을 한다.
상기 규산소다는 작물의 생산량 및 품질을 향상시키고, 스트레스 저항성을 높여 주며, 각종 유해 성분을 중화하는 역할을 한다. 토양 중에 존재하는 규산은 가용성 규산 형태로 작물의 뿌리에 흡수되면 잎이나 줄기의 표피세포 중에 침적되어 식물체의 병충해 등에 대한 저항성을 향상시킨다. 또한, 규산은 냉해에 대한 저항성 증가, 이로 인한 시비효율 증진, 토양 비옥도 증진 및 병충해 경감 등의 작용으로 인해 생산비를 절감하는 효과가 있다.
상기 키토산은 게, 새우 등의 갑각류 껍데기에 있는 키틴을 탈아세틸화하여 얻어낸 물질로서, 작물의 생산량을 증대시키고, 우수한 항균 활성을 나타내 작물의 내병성을 증진시키는 역할을 한다. 사용될 수 있는 키토산의 예로는 수용성 키토산 또는 이들의 유도체를 들 수 있으며, 구체적으로 키토산 유도체로서 카르복시메틸 키토산(carboxymethyl chitosan) 또는 설페이티드 키토산(sulfated chitosan), 바람직하게는 카르복시메틸 키토산이 이용될 수 있다.
상기 목초액은 다량의 초산을 함유하고 있어 해충에 대한 기피 작용을 하며 몇몇 병원성 세균에 대해서 높은 저항성을 부여한다.
상기 칼슘은 세포막의 구성요소이며, 단백질의 합성에 관여하고 질소의 흡수 및 이용을 돕는다. 또한, 체내의 유해한 유기산을 중화하고 알루미늄의 과잉흡수를 억제하며 그 독성을 줄여준다. 또한, 상기 마그네슘은 광합성 작용과 인산대사에 관여하는 효소의 활성을 높이고 종자내의 지방질의 집적을 돕는다.
상기 철은 호흡효소의 구성성분이다. 또한, 상기 망간은 각종 효소의 활성을 높이고 동화물질의 합성분해, 호흡작용, 광합성 등에 관여한다. 상기 붕소는 촉매 또는 반응조절물질로 작용하며, 석회결핍의 영향을 줄여준다. 상기 황은 결핍되면 전체적인 생장이 저해된다.
상기 아연은 결핍되면 황화작용이 일어나고 잎이 작아진다. 상기 구리는 결핍되면 새잎의 선단부터 황백화되고 작물이 시들게 된다. 상기 몰리브덴은 결핍되면 질산염의 환원장애를 유발한다. 상기 염소는 결핍되면 새싹 또는 새눈이 황화되고 작물의 품질이 나빠진다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 바실러스 벨레젠시스 AFB2-2 균주(KACC92281P)를 식물 또는 토양에 처리하는 단계를 포함하는 식물병 방제 방법을 제공한다.
상기 처리 방법에는 경엽처리, 토양처리, 침지처리, 가지절단 또는 농기구소독에 적용하는 처리 방법 등이 포함될 수 있으며, 이에 제한되지 않는다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1. 바실러스 벨레젠시스(
Bacillus velezensis
) AFB2-2 균주의 분리
식물 병원균에 대한 항균 활성을 갖는 균주를 감자 더뎅이병이 발생한 유기농 감자재배지의 무발병 감자의 근권 토양으로부터 분리하였다. 2018년 강원도 원주지역의 유기농 감자 재배포장에 감자 더뎅이병이 발생하였으나 일부 감자 더뎅이병이 발생하지 않은 무발병 감자가 있어 근권토양 100 g을 채취하여 실험실에서 풍건한 다음, 건조토양 5 g을 채취하여 멸균증류수 45 ml에 현탁하여 희석평판도말법으로 TSA(Triptic Soy Agar)배지에 도말하여 30℃ 저온배양기에서 7일간 배양하여 250개의 균주를 선발하였다. 250개의 균주 중에서 라히족토니아 솔라니(Rhizoctonia solani)균과 대치배양하여 항균을 가지는 균주만을 1차 선발하였으며 선발한 25개의 균주 중에서 가장 항균력이 우수한 AFB2-2균주를 우수균주로 선발하여 분자생물학적으로 동정과정을 거쳐 바실러스 벨레젠시스(Bacillus velezensis) AFB2-2로 명명하고, 농업유전자원센터에 기탁하여 수탁번호 KACC92281P를 부여받았다.
실시예 2. 바실러스 벨레젠시스AFB2-2 균주의 생물학적 특성 및 생육 조건 조사
2-1. 생물학적 특성 평가
바실러스 벨레젠시스 AFB2-2 균주의 생물학적 특성을 다음과 같이 평가하였다.
그람염색법
그람염색법은 세균의 세포벽에 펩티도 글리칸이 많은지(양성), 적은지(음성)를 검사하는 방법으로 바실러스 벨레젠시스 AFB2-2 균주를 TSA배지에 삼분도말하여 3일간 배양한 후, Gram Stain Kit (Becton Dickinson, BBL, USA) 다음과 같은 순서에 의해 세포벽을 염색하고 광학현미경으로 그람염색을 판별하였다.
(가) 슬라이드 글라스에 증류수를 한방을 떨어뜨린다.
(나) 신선하게 배양된 바실러스 벨레젠시스 AFB2-2 균을 백금이로 소량만 떼어서 슬라이드 글라스의 증류수와 같이 얇게 도말한다.
(다) 균을 도말한 슬라이드 글라스를 가스램프를 아주 약하게 켠 다음 불꽃 위에서 4~5회 통과시켜 세포를 슬라이드 글라스에 고정시킨다.
(라) 세포가 고정된 슬라이스 글라스 위에 1차 염색제인 크리스탈 바이올렛(Crystal Violet)으로 약 1분 동안 염색한다.
(마) 세균이 염색된 면을 뒤로하고 흐르는 물에 세척한 후, 물기를 제거한다.
(바) 매염제인 요오드(Iodine) 용액을 1분간 염색한다.
(사) 세균이 염색된 면을 뒤로하여 흐르는 물에 세척한 후, 물기를 제거한다.
(아) 에탄올로 약 15~60초간 도말면의 색이 보이지 않을 때 가지 탈색한 후, 흐르는 물에 세척하여 물기를 제거한다.
(자) 대조염색제인 샤프라닌(Safranin)으로 약 40초 간 염색 하고 흐르는 물에 세척한 후. 물기를 제거하고 공기 중에 건조시킨다.
(차) 커버 글라스를 덮고 광학현미경으로 검경한다.
포자형성 정도
바실러스 벨레젠시스 AFB2-2 균주를 TSB배지에 삼분도말하여 30℃ 저온배양기에 암조건에서 7일간 배양한 후, 슬라이드 글라스에 증류수를 한방을 떨어뜨리고 바실러스 벨레젠시스 AFB2-2 균총을 백금이로 소량만 떼어서 슬라이드 글라스의 증류수와 같이 얇게 도말한 후, 커버 글라스를 덮고 광학현미경으로 관찰하여 포자형성 정도를 검경하였다.
운동성 및 세포형태
바실러스 벨레젠시스 AFB2-2 균주를 TSA배지에 삼분도말하여 30℃ 저온배양기에 암조건에서 2일간 배양한 후, 슬라이드 글라스에 증류수를 한방을 떨어뜨리고 바실러스 벨레젠시스 AFB2-2 균총을 백금이로 소량만 떼어서 슬라이드 글라스의 증류수와 같이 얇게 도말한 후, 커버 글라스를 덮고 광학현미경으로 관찰하여 운동성과 세포형태를 검경하였다.
편모와 세포크기
바실러스 벨레젠시스 AFB2-2 균주의 편모 형성과 세포의 크기는 바실러스 벨레젠시스 AFB2-2 균주를 TSB배지에 삼분도말하여 30℃ 저온배양기에 암조건에서 2일간 배양하였다. 파라필름에 멸균 증류수를 한 방울 떨어뜨린 후, 균총을 백금이로 소량만 떼어서 멸균 증류수에 현탁하고 투과전자 현미경용 그리드에 올린다. 물기를 제거한 후, 텅스텐으로 1~2분간 염색하고 필터 페이퍼 조각으로 물기를 제거한다. 공기 중에 3분간 건조한 후 투과전자현미경(TEM)으로 관찰하였다.
상기 균주의 생물학적 특성을 평가한 결과는 표 1 및 도1에 나타내었다.
| 특징 | |
| 그람 염색(Gram staining) | 양성 |
| 포자(Spore) | 양성 |
| 모탈리티(Mortality) | 양성 |
| 편모(Flagella) | 양성, 주모성(Peritrichous) |
| 세포 크기(μm) | 1.56±0.13X0.58±0.05 |
표 1 및 도 1에 나타낸 바와 같이, 바실러스 벨레젠시스 AFB2-2 균주는 그람 양성 세균으로, 포자를 형성하는 것을 확인하였다. 도한 편모는 주모성으로 운동성을 가지며, 세포의 크기는 1.56±0.13X0.58±0.05 μm임을 확인하였다.
2-2. 생육 온도
바실러스 벨레젠시스 AFB2-2 균주의 최적 생육 온도를 조사하였다. 구체적으로, 바실러스 벨레젠시스 AFB2-2 균주를 TSA(Trytic Soy Agar)배지에 삼분도말하여 3일간 배양하여 신선한 균주를 준비하였다. 3일간 신선하게 배양된 균주의 단일 균총을 가스램프 불꽃으로 살균한 백금이로 떼어 TSA 배지에 삼분도말한 후, 온도를 10~60℃로 각각 설정한 멀티저온배양기에 넣어 5일간 배양하여 적정 배양온도와 생육 가능 온도를 조사하였다. 바실러스 벨레젠시스 AFB2-2 균주의 최적 생육 온도를 조사한 결과는 표 2 및 도 2에 나타내었다.
| 온도 (℃) | |||||||||||
| 10 | 15 | 20 | 25 | 30 | 35 | 40 | 45 | 50 | 55 | 60 | |
| 성장 | - | + | + | ++ | +++ | ++++ | ++++ | ++++ | +++ | + | - |
표 2 및 도 2에 나타낸 바와 같이, 바실러스 벨레젠시스 AFB2-2 균주는 15 내지 55℃에서 성장하는 것을 확인하였다. 특히, 바실러스 벨레젠시스 AFB2-2 균주의 최적 배양 온도는 35 내지 45℃인 것을 확인하였다.
2-3. NaCl 농도
바실러스 벨레젠시스 AFB2-2 균주의 배양 시 최적의 NaCl의 농도를 조사하였다. 구체적으로, TSA(Trytic Soy Agar) 배지에 NaCl을 0 내지 20% 가량 첨가하여 고압멸균한 후 각각을 페트리디쉬에 분주라여 NaCl이 첨가된 TSA 배양 배지를 제조하였다. 바실러스 벨레젠시스 AFB2-2 균주를 제조된 NaCl이 포함된 TSA배지에 삼분도말하여 3일간 배양하여 신선한 균주를 준비하였다. 3일간 신선하게 배양된 균주의 단일 균총을 가스램프 불꽃으로 살균한 백금이로 떼어 NaCl이 0~20% 첨가된 TSA 배지에 삼분도말한 후, 온도를 30℃로 설정한 저온배양기에 넣고 5일간 배양하여 최적 NaCl 농도를 조사하였다. 바실러스 벨레젠시스 AFB2-2 균주의 최적 NaCl 농도를 조사한 결과는 표 3 및 도 3에 나타내었다.
| NaCl(%, w/v) | ||||||||
| 0 | 1 | 2 | 2.5 | 3 | 5.5 | 6 | 7.5 | |
| 성장 | +++++ | +++++ | +++++ | +++++ | +++++ | +++ | +++ | +++ |
표 3 및 도 3에 나타낸 바와 같이, 바실러스 벨레젠시스 AFB2-2 균주는 NaCl의 농도가 7.5% 이상에서도 성장하는 것을 확인하였다. 특히, 상기 균주는 NaCl의 농도가 0 내지 3%에서 균주가 빠르게 성장하는 것을 확인하였다. 상기 결과는 바실러스 벨레젠시스 AFB2-2 균주는 염도가 높은 토양 등에서도 생존할 수 있음을 의미한다.
실시예 3. 바실러스 벨레젠시스 AFB2-2 균주의 분자생물학적 동정
순수 분리한 바실러스 벨레젠시스 AFB2-2 균주를 AFB2-2 균주를 TSB(Trytic Soy Broth, Difco)에 접종하여 30℃에서 24시간 배양 후 6000rpm에서 원심 분리하여 균을 수확하였다. 수확된 균을 28℃에서 24시간 동안 배양 후 Bead beater Phenol 법을 통해 분리 및 정제하였다. 정제된 genomic DNA 중 16S rDNA 유전자 부위만을 PCR로 증폭하여 1.5 kbp의 DNA 산물을 수득하였다. 수득된 DNA 산물 중 1492 bp를 Direct DNA sequencing 법을 통해 분석하였다. 바실러스 벨레젠시스 AFB2-2 균주의 16S rRNA 서열은 서열번호 1로 표시된다.
(a) Bacillus velezensis strain FZB42 16S ribosomal RNA, complete sequence (NR_075005.2)
(b) Bacillus subtilis subsp. subtilis strain 168 16S ribosomal RNA(NR_102783.2)
(c) Bacillus amyloliquefaciens strain MPA 1034 16S ribosomal RNA gene(NR_117946.1)
BLAST 결과, 바실러스 벨레젠시스 AFB2-2 균주의 16S rRNA 서열과 상기 서열 (a) 내지 (c)는 유사성이 99%인 것을 확인하였다.
실시예 4. 바실러스 벨레젠시스 AFB2-2 균주의 탄소 이용 능력 평가
4-1. API 50CH 키트를 이용한 탄소원 이용 능력 평가
바실러스 벨레젠시스 AFB2-2 균주의 탄소원 이용 능력 평가는 API 50CH 키트를 이용하였으며, 제조사의 매뉴얼에 따라 실험하였다. 구체적으로, 바실러스 벨레젠시스 AFB2-2 균주 배양 시 49종의 탄소원을 각각 첨가하였으며, 배양온도 28℃ 및 35℃ 조건에서 평가하였다. 바실러스 벨레젠시스 AFB2-2 균주의 탄소원 이용 능력을 평가한 결과는 표 4 및 도 4에 나타내었다.
| No. | 탄소원 | 반응온도(℃) | No. | 탄소원 | 반응온도(℃) | ||
| 28 | 35 | 28 | 35 | ||||
| 0 | 대조군 | - | - | 25 | 에스쿨린 구연산 철 | ++++ | ++++ |
| 1 | 글리세롤 | +++ | +++ | 26 | 살리신 | - | + |
| 2 | 에리스리톨 | - | - | 27 | D-셀로보스 | + | ++ |
| 3 | D-아라비노스 | - | - | 28 | D-말토스 | - | +++ |
| 4 | L-아라비노스 | - | + | 29 | D-락토스 | - | + |
| 5 | D-리보스 | - | + | 30 | D-멜리비오스 | - | - |
| 6 | D-자일로스 | - | - | 31 | S-사카로스(수크로스) | + | + |
| 7 | L-자일로스 | - | - | 32 | D-트레할로스 | ++ | +++ |
| 8 | D-아도니톨 | - | - | 33 | 이눌린 | - | - |
| 9 | 메틸-βD-자일로피라노사이드 | - | - | 34 | D-멜레치토스 | - | - |
| 10 | D-갈락토스 | - | - | 35 | D-라피노스 | - | + |
| 11 | D-글루코스 | ++ | ++ | 36 | 아미돈(전분) | - | + |
| 12 | D-프룩토스 | + | + | 37 | 글리코겐 | - | + |
| 13 | D-만노스 | ++ | ++ | 38 | 자일리톨 | - | - |
| 14 | L-소르보스 | - | - | 39 | 젠티오비오스 | + | + |
| 15 | L-람노스 | - | - | 40 | D-투라노스 | - | - |
| 16 | 둘시톨 | - | - | 41 | D-릭소스 | - | - |
| 17 | 이노시톨 | - | +++ | 42 | D-타가토스 | - | - |
| 18 | D-만니톨 | ++ | ++ | 43 | D-푸코스 | - | - |
| 19 | D-소르비톨 | +++ | +++ | 44 | L-푸코스 | - | - |
| 20 | 메틸-αD-만노피라노시드 | - | - | 45 | D-아라비톨 | - | - |
| 21 | 메틸-αD-글루코피라노시드 | - | + | 46 | L-아라비톨 | - | - |
| 22 | N-아세틸글루코사민 | - | - | 47 | 글루콘산칼륨 | - | - |
| 23 | 아미그달린 | - | + | 48 | 포타슘 2-케토글루콘산 | - | - |
| 24 | 알부틴 | - | + | 49 | 포타슘 5-케토글루콘산 | - | - |
표 4 및 도 4에 나타낸 바와 같이, 바실러스 벨레젠시스 AFB2-2 균주는 28 ℃에서 Glycerol, D-글루코스, D-프룩토스, D-만노스, D-만니톨, D-소르비톨, 에스쿨린 구연산 철, D-셀로보스, S-사카로스, D-트레할로스, 젠티오비오스 등 11종의 탄소원을 이용하였으나, 35 ℃에서는 글리세롤, L-아라비노스, D-리보스, D-글루코스, D-프룩토스, D-만노스, 이노시톨, D-만니톨, D-소르비톨, 에스쿨린 구연산 철, 살리신, D-셀로보스, D-말토스, D-락토스, S-사카로스, D-트레할로스, D-라피노스, 아미돈(전분), 글리코겐, 젠티오비오스 등 20종의 탄소원을 이용하였다. 바실러스 벨레젠시스 AFB2-2 균주는 일반적인 세균의 적정배양 온도인 28℃보다 고온인 35℃의 배양조건에서 더 많은 탄소원을 이용하는 것으로 나타났다.
4-2. API 20E 키트를 이용한 탄소원 이용 능력 평가
바실러스 벨레젠시스 AFB2-2 균주의 탄소원 이용 능력 평가는 API 20E 키트를 이용하였으며, 제조사의 매뉴얼에 따라 실험하였다. 구체적으로, 바실러스 벨레젠시스 AFB2-2 균주 배양 시 20종의 탄소원을 각각 첨가하였으며, 배양온도 35℃ 및 37℃ 조건에서 평가하였다. 바실러스 벨레젠시스 AFB2-2 균주의 탄소원 이용 능력을 평가한 결과는 표 5 및 도 5에 나타내었다.
| No. | 탄소원 | 반응온도(℃) | No. | 탄소원 | 반응온도(℃) | ||
| 35 | 37 | 35 | 37 | ||||
| 1 | 질산칼륨 | - | - | 11 | D-만노스 | + | + |
| 2 | L-트립토판 | - | - | 12 | D-만니톨 | + | + |
| 3 | D-글루코스 | - | - | 13 | N-아세틸글루코사민 | + | + |
| 4 | L-아르지닌 | - | - | 14 | D-말토스 | - | - |
| 5 | 우레아 | - | - | 15 | 글루콘산칼륨 | ± | ± |
| 6 | 에스쿨린 구연산 철 | - | - | 16 | 카프릭산 | - | - |
| 7 | 젤라틴 | - | - | 17 | 아디프산 | + | + |
| 8 | 4-니트로페닐 β D-갈락트로피라노사이드 | - | - | 18 | 말산 | - | - |
| 9 | D-글루코스 | - | - | 19 | 시트르산삼나트륨 | - | - |
| 10 | L-아라비노스 | + | + | 20 | 페닐아세트산 | - | - |
표 5 및 도 5에 나타낸 바와 같이, 바실러스 벨레젠시스 AFB2-2 균주는 두 가지 온도 모두에서 L-아라비노스, D-만노스, D-만니톨, N-아세틸글루코사민, 글루콘산칼륨 및 아디프산을 이용하는 것을 확인하였다.
실시예 5. 바실러스 벨레젠시스 AFB2-2 균주의 식물 병원균에 대한 항균력 검정
바실러스 벨레젠시스 AFB2-2 균주의 식물 병원균에 대한 항균력을 검정하였다. 구체적으로, 바실러스 벨레젠시스 AFB2-2 균주를 TSA 배지에 삼분도말하여 3일간 배양한 후 식물병원균과 대치할 PDA 배양에 사용하였다. 주요 식물병원균인 푸사리움 옥시스포럼(Fusarium oxysporum), 보트라이티스 시네레아(Botrytis cinerea), 라히족토니아 솔라니(Rhizoctonia solani), 스크레로티니아 스크레로티오럼(Sclerotinia sclerotiorum), 피시움 울티멈(Pythium ultimum), 파이토프소라 캡사이시(Phytophthora capsici) 및 콜레토트리쿰 글로에오스포리오이데스(Colletotrichum gloeosporioides)는 PDA(Potato Dextrose Agar)배지에서 대치배양 8일 전 25℃ 저온배양기에서 균사가 충분히 자라도록 배양하여 준비하였다. 바실러스 벨레젠시스 AFB2-2 균주를 PDA배지 중앙에 한줄로 도말하고 멸균된 지름 5mm Corker borer로 평가하고자 하는 식물병원균 7종의 균사를 뚫은 후, 도말한 바실러스 벨레젠시스 AFB2-2 균주와 2cm 간격으로 배치하여 25℃ 저온배양기에 7일 간 배양하여 균사생육 억제 정도를 조사하였다. 바실러스 벨레젠시스 AFB2-2 균주의 식물병원균에 대한 항균력을 검정한 결과는 표 6에 나타내었다.
| 식물 병원균의 균사 성장 (mm) | |||||||
| FO | BC | RS | SS | PU | PC | CC | |
| AFB 2-2 | 15.1 | 18.1 | 27.1 | 25.3 | 20.3 | 12.4 | 10.2 |
| 무처리 | 41.5 | 45.0 | 45.4 | 45.2 | 45.5 | 46.0 | 41.5 |
| 억제율(%) | 63.6 | 59.8 | 40.3 | 44.0 | 55.4 | 73.0 | 75.4 |
| FO, Fusarium oxysporum; BC, Botrytis cinerea; RS, Rhizoctonia solani; SS, Sclrotinia sclreotiorum; PU, Pythium ultimum; PC, Phytophthora capsici, CG: Collectotrichum gloeosporioiedes | |||||||
표 6에 나타낸 바와 같이, 바실러스 벨레젠시스 AFB2-2 균주는 식물병원균인 푸사리움 옥시스포럼(Fusarium oxysporum), 보트라이티스 시네레아(Botrytis cinerea), 라히족토니아 솔라니(Rhizoctonia solani), 스크레로티니아 스크레로티오럼(Sclerotinia sclerotiorum), 피시움 울티멈(Pythium ultimum), 파이토프소라 캡사이시(Phytophthora capsici) 및 콜레토트리쿰 글로에오스포리오이더스(Colletotrichum gloeosporioides)에 대하여 균사 생육 억제효과가 40.3% 이상인 것을 확인하였다.
실시예 6. 바실러스 벨레젠시스 AFB2-2 균주의 2차 대사 산물 생합성 유전자 검출
6-1. 2차 대사 산물 생합성 유전자 분석
바실러스 벨레젠시스 AFB2-2 균주의 2차 대사 산물 생합성 유전자를 분석하였다. 구체적으로, 순수 분리한 바실러스 벨레젠시스 AFB2-2 균주를 동정하기 위해서 16S rRNA 유전자를 분석하였다. AFB2-2 균주를 TSB(Trytic Soy Broth, Difco) 배지에 접종하여 30℃에서 24시간 배양 후 6000 rpm에서 원심 분리하여 균체를 수확하였다. Q-spin Genomic DNA Extraction Kit(Qiagen, USA)를 사용하여 수확한 균체에서 DNA를 분리하였다. 2차 대사 산물 생합성 유전자를 증폭하기 위해서 표 7의 프라이머를 사용하여, Kim et al. (2012)의 방법대로 PCR 반응을 수행하였다. 증폭된 PCR 산물은 QIAquick PCR Purification kit(QIAGEN)를 사용하여 정제하였다.
| 항생제 | 프라이머 명 | 프라이머 서열 (5’-3’) |
| Bacillomycin D | BACC1F | GAA GGA CAC GGC AGA GAG TC |
| BACC1R | CGC TGA TGA CTG TTC ATG CT | |
| Fengycin | FEND1F | TTT GGC AGC AGG AGA AGT TT |
| FEND1R | GCT GTC CGT TCT GCT TTT TC | |
| Iturin A | ITUD1F | GAT GCG ATC TCC TTG GAT GT |
| ITUD1R | ATC GTC ATG TGC TGC TTG AG | |
| Surfactin | SUR3F | ACA GTA TGG AGG CAT GGT C |
| SUR3R | TTC CGC CAC TTT TTC AGT TT | |
| Zwittermicin A | ZWITF2 | TTG GGA GAA TAT ACA GCT CT |
| ZWITR1 | GAC CTT TTG AAA TGG GCG TA |
생합성 유전자 PCR 산물을 확인하고자 1.2% Agarose gel에 5 μl 분주하여 1X TAE buffer에서 100 V로 30분간 전기영동하여 생합성 유전자 존재 유무를 확인하였으며, 그 결과는 도 6에 나타내었다.
도 6에 나타낸 바와 같이, 바실러스 벨레젠시스 AFB2-2 균주는 생합성 유전자 5개 중 Bacillomycin D(bmyA), Iturin A(ituA) 및 Surfactin(srfA)의 3개의 유전자를 가지고 있는 것을 확인하였다.
6-2. Bacillomycin D(bmyA) 생합성 유전자의 염기서열 및 유전적 연관관계 분석
바실러스 벨레젠시스 AFB2-2 균주가 가지고 있는 bmyA 유전자의 염기서열 및 유전적 연관관계를 분석하였다. 구체적으로, 순수 분리한 바실러스 벨레젠시스 AFB2-2 균주를 TSB(Trytic Soy Broth, Difco)에 접종하여 30℃에서 24시간 동안 배양한 후 6000rpm에서 원심 분리하여 균체를 수확하였다. Q-spin Genomic DNA Extraction Kit(Qiagen, USA)를 사용하여 수확한 균체에서 DNA를 분리하였다. 2차 대사 산물 생합성 유전자를 증폭하기 위해서 표 8의 프라이머를 사용하여, Kim et al. (2012)의 방법대로 PCR반응을 수행하였다. 증폭된 PCR 산물은 QIAquick PCR Purification kit(QIAGEN)를 사용하여 정제하였다.
| 항생제 | 프라이머 명 | 프라이머 서열 (5’-3’) |
| Bacillomycin D | BACC1F | GAA GGA CAC GGC AGA GAG TC |
| BACC1R | CGC TGA TGA CTG TTC ATG CT |
NCBI(http://www.ncbi.blm.nih.gov)의 BLAST를 이용하여, 바실러스 벨레젠시스 AFB2-2 균주의 서열과 비교하였다. bmyA 유전자의 염기서열 및 유전적 연관관계를 분석한 결과는 도 7에 나타내었다.
도 7에 나타낸 바와 같이, 바실러스 벨레젠시스 AFB2-2 균주의 bmyA 유전자는 다음의 염기서열과 유사성이 98.32%인 것을 확인하였다.
-Bacillus velezensis strain WRN014 chromosome, complete genome(CP041361.1)
-Bacillus velezensis strain Hx05 chromosome, complete genome(CP029473.2)
-Bacillus velezensis strain CMT-6 chromosome, complete genome(CP025341.1)
6-3. Iturin A(ituA) 생합성 유전자의 염기서열 및 유전적 연관관계 분석
바실러스 벨레젠시스 AFB2-2 균주가 가지고 있는 ituA 유전자의 염기서열 및 유전적 연관관계를 분석하였다. 상기 분석은 상기 실시예 6-2와 동일한 방법으로 수행하였으며, PCR에 사용한 프라이머는 하기 표 9에 나타내었다.
| 항생제 | 프라이머 명 | 프라이머 서열 (5’-3’) |
| Iturin A | ITUD1F | GAT GCG ATC TCC TTG GAT GT |
| ITUD1R | ATC GTC ATG TGC TGC TTG AG |
ituA 유전자의 염기서열 및 유전적 연관관계를 분석한 결과는 도 8에 나타내었다.
도 8에 나타낸 바와 같이, 바실러스 벨레젠시스 AFB2-2 균주의 ituA 유전자는 다음의 염기서열과 유사성이 99.66%인 것을 확인하였다.
- Bacillus velezensis strain WRN014 chromosome, complete genome (CP041361.1)
-Bacillus velezensis strain J01 chromosome(CP023133.1)
-Bacillus velezensis strain GFP-2 chromosome, complete genome(CP021011.1)
6-4. Surfactin(srfA) 생합성 유전자의 염기서열 및 유전적 연관관계 분석
바실러스 벨레젠시스 AFB2-2 균주가 가지고 있는 srfA 유전자의 염기서열 및 유전적 연관관계를 분석하였다. 상기 분석은 상기 실시예 6-2와 동일한 방법으로 수행하였으며, PCR에 사용한 프라이머는 하기 표 10에 나타내었다.
| 항생제 | 프라이머 명 | 프라이머 서열 (5’-3’) |
| Surfactin | SUR3F | ACA GTA TGG AGG CAT GGT C |
| SUR3R | TTC CGC CAC TTT TTC AGT TT |
srfA 유전자의 염기서열 및 유전적 연관관계를 분석한 결과는 도 9에 나타내었다.
도 9에 나타낸 바와 같이, 바실러스 벨레젠시스 AFB2-2 균주의 srfA 유전자는 다음의 염기서열과 유사성이 99.21%인 것을 확인하였다.
-Bacillus amyloliquefaciens strain DH8030 chromosome, complete genome(CP041770.1)
-Bacillus velezensis strain WRN014 chromosome, complete genome(CP041361.1)
-Bacillus velezensis strain LB002 chromosome, complete genome(CP037417.1)
종합적으로 본 발명자들은 바실러스 벨레젠시스 AFB2-2 균주를 분리하고, 상기 균주가 식물 병원균에 대해 항균력을 가진다는 것을 확인하였다. 따라서 본 발명의 바실러스 벨레젠시스 AFB2-2 균주는 식물병 방제 분야에서 다양하게 활용될 수 있다.
이상, 본 발명내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의해 정의된다고 할 것이다.
<110> REPUBLIC OF KOREA(MANAGEMENT : RURAL DEVELOPMENT ADMINISTRATION)
<120> Bacillus Velzensis AFB2-2 with antibacterial activity against
plant pathogen and uses thereof
<130> 1-98P
<160> 4
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 1425
<212> RNA
<213> Unknown
<220>
<223> Bacillus Velzensis AFP2-2 16S rRNA
<400> 1
tatacatgca gtcgagcgga cagatgggag cttgctccct gatgttagcg gcggacgggt 60
gagtaacacg tgggtaacct gcctgtaaga ctgggataac tccgggaaac cggggctaat 120
accggatggt tgtctgaacc gcatggttca gacataaaag gtggcttcgg ctaccactta 180
cagatggacc cgcggcgcat tagctagttg gtgaggtaac ggctcaccaa ggcgacgatg 240
cgtagccgac ctgagagggt gatcggccac actgggactg agacacggcc cagactccta 300
cgggaggcag cagtagggaa tcttccgcaa tggacgaaag tctgacggag caacgccgcg 360
tgagtgatga aggttttcgg atcgtaaagc tctgttgtta gggaagaaca agtgccgttc 420
aaatagggcg gcaccttgac ggtacctaac cagaaagcca cggctaacta cgtgccagca 480
gccgcggtaa tacgtaggtg gcaagcgttg tccggaatta ttgggcgtaa agggctcgca 540
ggcggtttct taagtctgat gtgaaagccc ccggctcaac cggggagggt cattggaaac 600
tggggaactt gagtgcagaa gaggagagtg gaattccacg tgtagcggtg aaatgcgtag 660
agatgtggag gaacaccagt ggcgaaggcg actctctggt ctgtaactga cgctgaggag 720
cgaaagcgtg gggagcgaac aggattagat accctggtag tccacgccgt aaacgatgag 780
tgctaagtgt tagggggttt ccgcccctta gtgctgcagc taacgcatta agcactccgc 840
ctggggagta cggtcgcaag actgaaactc aaaggaattg acgggggccc gcacaagcgg 900
tggagcatgt ggtttaattc gaagcaacgc gaagaacctt accaggtctt gacatcctct 960
gacaatccta gagataggac gtccccttcg ggggcagagt gacaggtggt gcatggttgt 1020
cgtcagctcg tgtcgtgaga tgttgggtta agtcccgcaa cgagcgcaac ccttgatctt 1080
agttgccagc attcagttgg gcactctaag gtgactgccg gtgacaaacc ggaggaaggt 1140
ggggatgacg tcaaatcatc atgcccctta tgacctgggc tacacacgtg ctacaatgga 1200
cagaacaaag ggcagcgaaa ccgcgaggtt aagccaatcc cacaaatctg ttctcagttc 1260
ggatcgcagt ctgcaactcg actgcgtgaa gctggaatcg ctagtaatcg cggatcagca 1320
tgccgcggtg aatacgttcc cgggccttgt acacaccgcc cgtcacacca cgagagtttg 1380
taacacccga agtcggtgag gtaaccttta tggagccagc cgccg 1425
<210> 2
<211> 313
<212> DNA
<213> Unknown
<220>
<223> Bacillus Velzensis AFP2-2 Bacillomycin D
<400> 2
cagcttctcg ccatcncccg tctcctttct ctgtcaatnt attccggttt canttgaaat 60
atgatagaga aaaacagatt ttctttttta ctgattttta ctaaaagtaa ccaanaatag 120
ttattgaaaa cgcattacta atatatgata atatcatttt aacaataacc nggtcatttc 180
tgtttagtaa atatttagta aaaaggagat acgaaatggt ccgtctcaaa gatattgcct 240
tacaggcatc tgtatccngc gcgacngtat cgagaatttt gaataaggat gactctctcg 300
ggnggtcctt caa 313
<210> 3
<211> 611
<212> DNA
<213> Unknown
<220>
<223> Bacillus Velzensis AFP2-2 Iturin A
<400> 3
antttaggag attgaatgaa ttgacaagac aatgaacgcg cagcccgcta ttttaacggt 60
cagtgttatt gcttttcaag tgtatatgca ggaaataggg gtgaagcccc gcttcctggc 120
aggtcatagc ttaggcgaat attcagcgct tgtctgtgcc ggcgcccttt cttttcagga 180
tgccgttaca cttgtaaggc agcggggaat tcttatgcaa aatgcggatc ctcagcagca 240
ggggacgatg gccgccgtga ctcacctctc tcttcaaacg ttgcaggaaa tatgttcgaa 300
agtgtcgacg gaagactttc cggcaggagt agcctgcatg aattcagaac agcagcatgt 360
gatttccgga caccggcaag ctgtggaacg tgtcatcaag atggcggagg aaaagggagc 420
ggcatacact tatttgaatg tcagtgcgcc ttttcacagt tcgctgatac gatcagcatc 480
tgaacaattc cagactgtat tacaccggta ttccttccgg gatgccgcat ggccgatcat 540
ttcaaatgtc accgcacgcc cttacagcag cggaaattcg atcagcgaac atctcaagca 600
ccnttgggaa c 611
<210> 4
<211> 398
<212> DNA
<213> Unknown
<220>
<223> Bacillus Velzensis AFP2-2 Surfactin A
<400> 4
tgncagctga gcggganggg atttcccgca ggccgtgatc atctcagcca ttcagccgcc 60
gcatgttgaa aggaaaaaag tgtctcatct tgatgatgaa aaatttctcg cccatattat 120
cgagctgggc ggaatgccgc aggagttagt ggagaataag gaggtcatgt catttttcct 180
gccttctttc aggtccgact accgcgcgct tgaaagcttc cgtccgtctg attctcacat 240
gattcaatca cccgtccata tttttaacgg gcggaaagat aaaaaatgta tcaaagatgc 300
ggacggatgg aaaaaatggg ccgacaatcc cgtatttcat gagttttcgg acggccacat 360
gttcatatta agtgaaactg aaagttgggn cggaaaaa 398
Claims (8)
- 식물 병원균에 대한 항균 활성을 갖는, 바실러스 벨레젠시스(Bacillus velezensis) AFB2-2 균주(KACC92281P).
- 제1항에 있어서,
상기 균주는 서열번호 1의 염기서열로 표시되는 16S rRNA를 포함하는 것인, 바실러스 벨레젠시스 AFB2-2 균주(KACC92281P). - 제1항에 있어서,
상기 식물 병원균은 푸사리움 옥시스포럼(Fusarium oxysporum), 보트라이티스 시네레아(Botrytis cinerea), 라히족토니아 솔라니(Rhizoctonia solani), 스크레로티니아 스크레로티오럼(Sclerotinia sclerotiorum), 피시움 울티멈(Pythium ultimum), 파이토프소라 캡사이시(Phytophthora capsici) 및 콜레토트리쿰 글로에오스포리오이더스(Colletotrichum gloeosporioides)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인, 바실러스 벨레젠시스 AFB2-2 균주(KACC92281P). - 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 따른 바실러스 벨레젠시스(Bacillus velezensis) AFB2-2 균주(KACC92281P)를 포함하는, 식물병 방제용 조성물.
- 제4항에 있어서,
상기 식물병은 푸사리움 옥시스포럼(Fusarium oxysporum), 보트라이티스 시네레아(Botrytis cinerea), 라히족토니아 솔라니(Rhizoctonia solani), 스크레로티니아 스크레로티오럼(Sclerotinia sclerotiorum), 피시움 울티멈(Pythium ultimum), 파이토프소라 캡사이시(Phytophthora capsici) 및 콜레토트리쿰 글로에오스포리오이더스(Colletotrichum gloeosporioides)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 균주에 의해 발병되는 것인, 식물병 방제용 조성물. - 제4항에 있어서,
상기 식물병은 역병, 더뎅이병, 무름병, 시들음병, 잿빛곰팡이병, 마름병, 흰곰팡이병, 뿌리 썩음병, 고추역병 및 탄저병으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인, 식물병 방제용 조성물. - 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 따른 바실러스 벨레젠시스(Bacillus velezensis) AFB2-2 균주(KACC92281P)를 포함하는, 비료 조성물.
- 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 따른 바실러스 벨레젠시스(Bacillus velezensis) AFB2-2 균주(KACC92281P)를 식물 또는 토양에 처리하는 단계를 포함하는, 식물병 방제 방법.
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