CN114874948B - 一株高地芽孢杆菌hmqau20091、菌剂及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一株高地芽孢杆菌(Bacillus altitudinis)菌株HMQAU20091，该菌株于2022年4月14日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏登记号：CGMCC No.24677。本发明还提供了一种由高地芽孢杆菌(Bacillus altitudinis)菌株HMQAU20091制备的微生物菌剂，所述微生物菌剂含有菌株HMQAU20091和/或菌株HMQAU20091的代谢产物。本发明还提供了一种微生物菌剂的制备方法。本发明还提供了一种微生物菌剂的应用。本发明还提供了一种植物病害的防治方法。本发明通过室内毒力测定，证明了菌株HMQAU20091对黄瓜霜霉病菌等多种病原菌具有良好的抑制活性。菌株HMQAU20091的发酵滤液作为生防菌剂，具有生活周期短、易于人工培养的优点，是一种选择性强、无污染、对环境友好的生防菌株，病原菌不易产生抗药性。

Description

一株高地芽孢杆菌HMQAU20091、菌剂及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于植物保护技术领域，具体涉及一株高地芽孢杆菌HMQAU20091、菌剂及其制备方法和应用。

背景技术

农业生产上有许多顽固的老病害和一些新出现的病害，严重威胁大田作物、蔬菜、果树以及花卉生产的产前，产中和产后，为了探索农业全产业链中病害防治的新手段，我们选取当地生产和市场中的重要植物病害如百合灰霉病、菜豆灰霉病、大蒜菌核病、芹菜菌核病、大白菜菌核病、番茄灰叶斑病、小麦赤霉病、葡萄白腐病、蓝莓毛色二孢枝枯病、菠菜腐霉根腐病、蓝莓疫霉根腐病、生菜叶斑病、菠菜镰孢菌根腐病、蓝莓叶斑病、山药镰孢菌根腐菌、大豆黑斑病、藜麦枝枯病、胡萝卜软腐病、大蒜干腐病、猕猴桃软腐病、黄瓜褐斑病、黄瓜黑星病、黄瓜霜霉病等病害开展相关研究。常规防治以上植物病害的措施有很多，但是农业防治费时费力，成效慢；采用生态防治，环境条件不易控制；化学农药易产生农药残留，对人类健康造成不良影响并且污染环境，生物防治对环境友好、高效、无污染的特点，成为研究防治植物病害的新方向。

例如黄瓜(Cucumis sativus)，隶属葫芦科黄瓜属，起源于喜马拉雅山南麓的热带雨林地区，为1年蔓生草本植物，在我国已有两千多年的栽培历史(李怀智，2003)，目前已成为全球十大蔬菜栽培作物之一，全世界年栽培面积约为146.67hm²(何晓明等，2002)。黄瓜在中国南、北方均有栽培(熊艳等，2016)，据农业农村部统计2015年黄瓜在全国种植面积为1887万亩，产量达5938万吨，分别占到蔬菜总体的5.8％、7.8％，其市场需求量大，有巨大的经济效益和社会效益。目前黄瓜生产保护地栽培面积迅速扩大，效益显著高于露地栽培(赵国云等，2008)。古巴假霜霉(Pseudoperonospora cubensis)是黄瓜霜霉病的病原菌。黄瓜霜霉病是世界黄瓜产区的叶部重要病害之一(Thomas，1986)，也是保护地黄瓜上的一种毁灭性病害，严重影响黄瓜的产量和品质(傅淑云，1983；石延霞，2002)。

但是，现有技术中缺少对黄瓜霜霉病等以上多种植物病害具有较高防效的生防制剂。如何解决上述问题，是目前微生物领域需要解决的技术问题。

发明内容

本发明旨在针对现有技术的不足，提供一株高地芽孢杆菌HMQAU20091、菌剂及其制备方法和应用。

本发明第一个目的在于提供一种从黄瓜叶面上分离得到的生防细菌——高地芽孢杆菌(Bacillus altitudinis)菌株HMQAU20091，丰富了植物病害生防菌的菌种资源，为研究开发生物菌剂奠定基础。该高地芽孢杆菌(Bacillus altitudinis)菌株HMQAU20091在本发明中或被简称为“菌株HMQAU20091”。

本发明第二个目的在于提供一种利用上述菌株HMQAU20091制备的微生物菌剂。

本发明第三个目的在于提供上述微生物菌剂的制备方法。

本发明第四个目的在于提供上述微生物菌剂的应用，所述微生物菌剂用于黄瓜霜霉病等多种植物病害的防治。

本发明第五个目的在于提供一种植物病害的防治方法。

本发明上述目的通过以下技术方案实现：

一株高地芽孢杆菌(Bacillus altitudinis)菌株HMQAU20091，该菌株于2022年4月14日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏登记号：CGMCC No.24677。该菌株HMQAU20091由山东省聊城市莘县的黄瓜叶面上分离得到，该菌株依据检测菌株产纤维素酶的活性筛选，结合16SrDNA和gyrB基因片段序列测序比对结果，最终将菌株HMQAU20091鉴定为高地芽孢杆菌。

一种由如上所述的高地芽孢杆菌(Bacillus altitudinis)菌株HMQAU20091制备的微生物菌剂，所述微生物菌剂含有菌株HMQAU20091和/或菌株HMQAU20091的代谢产物。

如上所述的微生物菌剂，所述微生物菌剂的有效活性成分为菌株HMQAU20091的发酵液或者发酵滤液。

如上所述的微生物菌剂，所述微生物菌剂的有效活性成分为高地芽孢杆菌HMQAU20091的发酵滤液，其微生物菌剂中的高地芽孢杆菌HMQAU20091的活菌浓度为1×10⁹-10¹⁰CFU/mL。

如上所述的微生物菌剂的制备方法，具体步骤包括：

(1)菌株HMQAU20091种子菌液的培养：将如上所述的菌株HMQAU20091接种到LB培养液中培养，直到种子菌液OD值在0.5-0.8之间时结束培养，获得菌株HMQAU20091种子菌液；

(2)菌株HMQAU20091发酵滤液的制备：采用血球计数板调节步骤(1)获得的种子菌液的浓度为5×10⁸CFU/mL，以体积百分含量1％的比例加入装有发酵培养液的锥形瓶中，振荡培养，然后离心，过滤制备拮抗菌的无菌菌株HMQAU20091发酵滤液；优选的，振荡培养条件是指30℃、200rpm条件下振荡培养48h；优选的，离心条件是指8000rpm离心15min；优选的，过滤采用0.22μm微孔滤膜过滤，即得菌株HMQAU20091发酵滤液。

如上所述的微生物菌剂的制备方法，所述步骤(1)中的培养指在30℃、200rpm条件下振荡培养8-10h。优选的，所述步骤(1)中的培养指在30℃、200rpm条件下振荡培养8h。

如上所述的微生物菌剂的制备方法，所述步骤(2)中的发酵培养液配方为：胰蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，氯化钠10g/L，调节pH值为7.2-7.4。优选的，调节pH值为7.3。

如上所述的微生物菌剂的应用，所述微生物菌剂用于植物病害的防治，所述植物病害包括百合灰霉病、菜豆灰霉病、大蒜菌核病、芹菜菌核病、大白菜菌核病、番茄灰叶斑病、小麦赤霉病、葡萄白腐病、蓝莓毛色二孢枝枯病、菠菜腐霉根腐病、蓝莓疫霉根腐病、生菜叶斑病、菠菜镰孢菌根腐病、蓝莓叶斑病、山药镰孢菌根腐菌、大豆黑斑病、藜麦枝枯病、胡萝卜软腐病、大蒜干腐病、猕猴桃软腐病、黄瓜褐斑病、黄瓜黑星病或者黄瓜霜霉病等病害。优选的，对引起百合灰霉病的灰葡萄孢，引起大蒜菌核病的立枯丝核菌，引起芹菜菌核病的核盘菌，引起菜豆灰霉病的灰葡萄孢，引起大白菜菌核病的核盘菌，引起番茄灰叶斑病的茄葡柄霉，引起小麦赤霉病的禾谷镰孢，引起葡萄白腐病的白腐垫壳孢，引起蓝莓毛色二孢枝枯病的假可可毛色二孢，引起菠菜腐霉根腐病的畸雌腐霉，引起蓝莓疫霉根腐病的樟疫霉，抑制率均为75％以上。更优选的，对引起百合灰霉病的灰葡萄孢，引起大蒜菌核病的立枯丝核菌，引起芹菜菌核病的核盘菌，引起菜豆灰霉病的灰葡萄孢，引起大白菜菌核病的核盘菌，引起番茄灰叶斑病的茄葡柄霉和引起小麦赤霉病的禾谷镰孢有更明显的抑制作用，抑制率分别达到了97.71％，97.56％，93.66％，92.36％，90.16％，88.91％，84.40％。

在本发明的一个实施例中，不同稀释倍数的菌株HMQAU20091发酵滤液对黄瓜霜霉病菌游动孢子释放及休止具有不同程度的抑制作用。优选的，菌株HMQAU20091发酵滤液稀释2倍、10倍或者25倍，在此条件下，游动孢子释放抑制率均在75％以上；更优选的，菌株HMQAU20091发酵滤液稀释2倍或者10倍，在此条件下，游动孢子释放抑制率达100％。

在本发明的另一个实施例中，不同稀释倍数的菌株HMQAU20091发酵滤液对黄瓜霜霉病菌休止孢萌发具有不同程度的抑制作用。优选的，菌株HMQAU20091发酵滤液稀释2倍、10倍或者25倍，在此条件下，萌发抑制率均显著高于吡唑醚菌酯处理，芽管伸长抑制率也均显著高于吡唑醚菌酯处理。更优选的，菌株HMQAU20091发酵滤液稀释2倍或者10倍，在此条件下，可完全抑制休止孢萌发，萌发抑制率和芽管伸长抑制率均为100％。

在本发明的又一个实施例中，采用离体叶片喷雾法测定菌株HMQAU20091发酵滤液对黄瓜霜霉病菌的保护作用。优选的，菌株HMQAU20091发酵滤液稀释5倍，在此条件下，相对防效达77.55％，远远高于吡唑醚菌酯稀释1500倍的处理组，且两者之间的防效差异显著。

在本发明的又一个实施例中，本试验采用离体叶片喷雾法测定菌株HMQAU20091发酵滤液对黄瓜霜霉病菌的治疗作用。优选的，菌株HMQAU20091发酵滤液稀释5倍或者10倍，在此条件下，相对防效均高于稀释1500倍的吡唑醚菌酯处理组的相对防效24.24％；更优选的，菌株HMQAU20091发酵滤液稀释5倍，在此条件下，相对防效达39.39％。

基于同一个发明构思，本发明还提供了一种植物病害的防治方法，所述方法是利用权利要求1所述的高地芽孢杆菌(Bacillus altitudinis)菌株HMQAU20091或者权利要求2所述的微生物菌剂处理。

根据本发明的菌剂对植物和植物部位的处理使用常用的处理方法直接进行或作用于其周围、生长地进行，例如通过浸渍、喷涂、雾化、灌溉、挥发、撒粉、撒播、发泡、涂布、浇灌、滴水灌溉等，并且在繁殖材料的情况下，尤其是种子的情况下，还通过一层或多层涂覆等作为用于干燥种子的处理粉末、处理种子的溶液、用于浆液处理的水溶性粉末。也可通过超低容量的办法施用菌剂，或注射菌剂本身到土壤中。优选的，在防治黄瓜霜霉病等叶部病害时，将如上所述的高地芽孢杆菌(Bacillus altitudinis)菌株HMQAU20091或者如上所述的微生物菌剂对植物的发病部位喷雾使用。

本发明的有益效果是：

1.本发明提供的高地芽孢杆菌菌株HMQAU20091具有广谱拮抗植物病害活性，对百合灰霉病、菜豆灰霉病、大蒜菌核病、芹菜菌核病、大白菜菌核病、番茄灰叶斑病、小麦赤霉病、葡萄白腐病、蓝莓毛色二孢枝枯病、菠菜腐霉根腐病、蓝莓疫霉根腐病、生菜叶斑病、菠菜镰孢菌根腐病、蓝莓叶斑病、山药镰孢菌根腐菌、大豆黑斑病、藜麦枝枯病、胡萝卜软腐病、大蒜干腐病、猕猴桃软腐病、黄瓜褐斑病、黄瓜黑星病或者黄瓜霜霉病等植物病害具有防治效果。

2.本发明提供的高地芽孢杆菌菌株HMQAU20091对30种供试植物病原菌的菌丝生长具有较好的抑制作用，平板抑制率均达到50％以上。实施例的研究表明，菌株HMQAU20091抗菌谱较广，抗菌效果较好，具有较高的生防潜力。差异显著性分析表明，该菌株对灰霉病菌、菌核病菌、番茄灰叶斑病菌、小麦赤霉病菌的抑制作用较高，且与葡萄白腐病菌、蓝莓毛色二孢枝枯病菌、菠菜腐霉根腐病菌、蓝莓疫霉根腐病菌等的抑制作用差异显著。

3.本发明提供的高地芽孢杆菌菌株HMQAU20091发酵滤液对30种供试植物病原菌具有不同的抑菌活性。差异显著性分析表明，该菌株发酵滤液对引起不同植物的同一种病原菌的不同菌株，如引起芹菜和大白菜菌核病的核盘菌菌株HMQAU170216和菌株HMQAU180110的抑制率之间差异显著，由此可见，该菌株HMQAU20091发酵滤液对不同寄主来源的同一种病原菌的不同菌株的抑制效果是不可预期的。

4.本发明提供的高地芽孢杆菌菌株HMQAU20091发酵滤液对黄瓜霜霉病菌具有显著的防治效果，实施例结果表明，菌株HMQAU20091不同稀释倍数的发酵滤液对黄瓜霜霉病菌游动孢子释放及休止具有不同程度的抑制作用；不同稀释倍数的菌株HMQAU20091发酵滤液对黄瓜霜霉病菌休止孢萌发和芽管伸长具有不同程度的抑制作用；该菌株HMQAU20091发酵滤液对离体黄瓜叶片霜霉病的防治效果较好，对黄瓜霜霉病具有较好的保护和治疗作用。

5.本发明提供的高地芽孢杆菌菌株HMQAU20091的发酵滤液作为生防菌剂，具有生活周期短、易于人工培养的优点，适合植物病害防治的要求；作为一种选择性强、无污染、对环境友好的生防菌株，病原菌不易产生抗药性，对非靶标生物及人畜安全，能够保证农产品的高品质，符合可持续发展的要求，其研究和市场应用前景广阔。

附图说明

图1为高地芽孢杆菌菌株HMQAU20091菌落、革兰氏染色、芽孢染色，其中，A、B：菌落形态；C：革兰氏染色；D：芽孢染色；

图2为基于16S rDNA序列构建的高地芽孢杆菌菌株HMQAU20091系统发育树，分支点上的数值为支持率，标尺0.01为进化距离；

图3为基于gyrB基因序列构建的高地芽孢杆菌菌株HMQAU20091系统发育树，分支点上的数值为支持率，标尺0.01为进化距离；

图4为高地芽孢杆菌菌株HMQAU20091对不同病原菌菌丝生长的抑制作用；

图5为高地芽孢杆菌菌株HMQAU20091发酵滤液对不同病原菌的抑制作用；

图6为高地芽孢杆菌菌株HMQAU20091发酵滤液对黄瓜霜霉病菌游动孢子释放及休止的影响(A：无菌水对照；B：发酵滤液原液；C：发酵滤液稀释25倍；D：吡唑醚菌酯稀释1500倍)；

图7为高地芽孢杆菌菌株HMQAU20091发酵滤液对黄瓜霜霉病菌休止孢萌发及芽管伸长的影响(A：无菌水对照；B：发酵滤液原液；C：发酵滤液稀释25倍；D：吡唑醚菌酯稀释1500倍；E：正常休止孢)；

图8为高地芽孢杆菌菌株HMQAU20091发酵滤液对黄瓜霜霉病的保护作用；

图9为高地芽孢杆菌菌株HMQAU20091发酵滤液对黄瓜霜霉病的治疗作用。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的内容，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

除非另有定义，本说明书所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。

实施例1菌株HMQAU20091对不同病原菌菌丝生长的抑制作用

1.供试植物病害及其病原菌：

百合灰霉病：灰葡萄孢Botrytis cinerea HMQAU200037；菜豆灰霉病：灰葡萄孢Botrytis cinerea HMQAU170042；大蒜菌核病：立枯丝核菌Rhizoctonia solaniHMQAU210022；芹菜菌核病：核盘菌Sclerotinia sclerotiorum HMQAU170216；大白菜菌核病：核盘菌Sclerotinia sclerotiorum HMQAU180110；番茄灰叶斑病：茄匍柄霉Stemphylium solani HMQAU170209；小麦赤霉病：禾谷镰孢Fusarium graminearumHMQAU170037；葡萄白腐病：白腐垫壳孢Coniella diplodiella HMQAU170082；蓝莓毛色二孢枝枯病：假可可毛色二胞Lasiodiplodia pseudotheobromae HMQAU140073；菠菜腐霉根腐病：畸雌腐霉Pythium irregulare HMQAU210091,林栖腐霉Pythium sylvaticumHMQAU210092；蓝莓疫霉根腐病：樟疫霉Phytophthora cinnamomi HMQAU180002；生菜叶斑病：纸细基格孢Ulocladium chartarum HMQAU210122，匍柄霉Stemphylium botryosumHMQAU210121；菠菜镰孢菌根腐病：尖镰孢Fusarium oxysporum HMQAU170173，木贼镰孢Fusarium equiseti HMQAU170169；蓝莓叶斑病：拟盘多毛孢Pestalotiopsissp.HMQAU180119，拟茎点霉Phomopsis sp.HMQAU210069；山药镰孢菌根腐菌：腐皮镰孢Fusarium solani HMQAU180201；大豆黑斑病：链格孢Alternaria alternata HMQAU210080；藜麦枝枯病：葡萄座腔菌Botryoshaeria dothidea HMQAU190265，暹罗炭疽菌Colletotrichum siamense HMQAU190267,甜菜茎点霉Phoma betae HMQAU190266；黄瓜褐斑病：山扁豆生棒孢Corynespora cassiicola HMQAU200087，黄瓜黑星病：瓜枝孢Cladosporium cucumerinum HMQAU180016；胡萝卜软腐病：根霉Rhizopussp.HMQAU180037；大蒜干腐病：尖镰孢Fusarium oxysporum HMQAU210030和HMQAU210034，腐皮镰孢Fusarium solani HMQAU210027；猕猴桃软腐病：卷枝毛霉Mucor circinelloidesHMQAU150050；以上均由青岛农业大学真菌学实验室提供。

2.供试生防细菌：

菌株HMQAU20091由山东省聊城市莘县的黄瓜叶面上采用平板稀释法(Krechel etal，2002)分离得到。

3.菌株鉴定方法：

(1)形态学鉴定：

参照《常见细菌系统鉴定手册》(东秀珠和蔡妙英，2001)的方法进行形态学鉴定。

(2)生理生化鉴定：

根据目标菌株的形态特征，选取常见的生理生化指标，参照《常见细菌系统鉴定手册》(东秀珠和蔡妙英，2001)的方法进行生理生化鉴定。

(3)分子鉴定及系统发育分析：

使用细菌基因组DNA提取试剂盒(Bacterial DNA Kit)提取细菌基因组DNA，-20℃冰箱中保存备用。以提取的细菌基因组DNA为模板，采用细菌16S rDNA的通用引物(27F:5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'和1492R:5'-TACGGCT ACCTTGTTACGACTT-3')和GyrB基因序列引物(gyrB-F5'-GAAGTCATCATGACCGTTC TGCAYGCNGGNGGNAARTT YGA-3'和gyrB-F-R(5'-AGCAGGGTACGGATGTGCGAGCCRTC NACRTCNGCRTCNGTCA T-3'))进行PCR扩增。

16S rDNA扩增反应体系反应体系为25μL：10×PCR反应缓冲液2.5μL，dNTPs(10mmol/L)2μL，引物(10mmol/L)各1μL，Taq DNA聚合酶(5U/μl)0.5μl，DNA模板1μl，ddH₂O补足25μl。反应条件：94℃预变性5min；94变性℃30s，63℃退火30s，72℃延伸2min，35个循环；72℃延伸7min。

GyrB基因序列PCR反应总体系(25μL)：10×PCR Buffer 2.5μL，dNTP Mixture 0.5μL(10mM)，gyrB-F/gyrB-R(10μmol/L)各1μL，Pro Taq酶(5U/μL)0.2μL，DNA模板1μL，补ddH₂O至25μL。反应条件：94℃预变性30s；98℃变性10s，67℃退火30s，72℃延伸2min，30个循环；72℃延伸2min。

PCR结束后，取5μL PCR产物与1μL 6×Loading Buffer混匀后，以DNA marker2000为分子量标准，在1％的琼脂凝胶上120V电泳30min，于凝胶成像系统中检测扩增产物的长度及浓度。

利用试剂盒进行普通PCR产物纯化，纯化后用1％琼脂凝胶电泳检测回收纯化的PCR产物，显示单条带后即表示纯化成功。根据pMD^TM18-T Vector使用手册，进行产物连接和转化，单菌落采用pMD^TM18-T通用引物M13-47:5'-CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC-3'和RV-M:5'-GAGCGGATAACAATTTCACACACAGG-3'进行PCR扩增检测。扩增反应体系及反应条件同上述。PCR结束后，取5μL PCR产物在1％的琼脂凝胶上120V电泳30min，于凝胶成像系统中检测扩增产物的长度。若目的片段的长度在1700bp左右，则对应菌落为阳性克隆子，将其菌液送至上海生工生物工程有限公司进行测序。

测序结果在NCBI数据库上进行BLAST比对，下载比对结果中的菌株的标准菌株的16S rDNA序列，并用MEGA5.05软件进行系统发育分析，建立系统发育树并进行聚类分析。

4.菌株鉴定结果：

(1)形态学鉴定结果：

菌株HMQAU20091在LB固体培养基上28℃培养2d，由图1可以看出，菌落凸起呈乳白色、不透明、圆形、边缘不规则、光滑，表面褶皱，菌体革兰氏染色阳性，杆状(0.60±0.03)μm-(2.09±0.17)μm，单个排列，产芽孢，芽孢椭圆形，中生，孢囊不膨大。

(2)生理生化鉴定结果：

生理生化测定结果表明，菌株HMQAU20091为厌氧型，耐盐性较强，在10％NaCl培养液中仍能生长，温度为4℃时不能生长，45℃可以生长。耐酸耐碱，在pH为5.5和9.0时均可生长。可以利用柠檬酸盐，可以利用D-木糖、甘露醇、葡糖糖、D-果糖，不能利用山梨醇，不能氧化发酵葡萄糖。氧化酶、吲哚反应、反硝化、淀粉水解等生理生化试验呈阴性，接触酶、硝酸盐还原、V-P、甲基红等试验生理生化试验呈阳性，如表1所示。根据菌株HMQAU20091的形态特征和生理生化特征，可以初步鉴定菌株为芽孢杆菌属(Bacillus)。

表1高地芽孢杆菌菌株HMQAU20091生理生化试验结果

(3)分子鉴定及系统发育分析结果：

菌株HMQAU20091的16SrDNA和gyrB基因序列的PCR产物长度分别为1513bp和1259bp，详见序列表。在NCBI数据库中BLAST比对结果显示，菌株HMQAU20091与高地芽孢杆菌Bacillus altitudinis(AJ831842)的16SrRNA基因相似性高达99.93％，建立系统发育树分析，结果显示HMQAU20091与高地芽孢杆菌处于同一分支上，见图2。进一步对HMQAU20091的gyrB基因序列进行分析并构建系统发育树，结果显示菌株HMQAU20091与高地芽孢杆菌Bacillus altitudinis(JX680195)的同源性高达99.44％，并与高地芽孢杆菌处于同一分支上，见图3。根据序列比对分析、形态学与生理生化鉴定结果(冯光志，2019；李伟佳，2019；田丹丹，2021)，初步确定菌株HMQAU20091为高地芽孢杆菌(Bacillus altitudinis)。

鉴定结果见表2：

表2测序比对结果

结合菌株的形态学特征、生理生化特性和基因序列比对结果，最终将菌株HMQAU20091鉴定为高地芽孢杆菌(Bacillus altitudinis)。将筛选到的高地芽孢杆菌(Bacillus altitudinis)HMQAU20091于2022年4月14日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏登记号：CGMCC No.24677。请求保藏单位为青岛农业大学。

5.菌株HMQAU20091发酵滤液的制备：

(1)种子菌液的培养：将如上所述的菌环菌株HMQAU20091接种一菌种环到LB培养液中30℃、200rpm振荡培养8h，直到种子菌液OD值均在0.5-0.8之间时结束培养，获得种子液。

(2)发酵滤液制备：采用血球计数板调节步骤(1)获得的种子菌液的浓度为5×10⁸CFU/mL，以体积百分含量1％的比例加入装有50mL发酵培养液的150mL锥形瓶中(本实施例中，取500μL的浓度为5×10⁸CFU/mL的种子菌液加入到50mL发酵培养液中)，30℃、200rpm振荡培养48h，然后8000rpm离心15min，0.22μm微孔滤膜过滤制备拮抗菌的无菌滤液。其中的高地芽孢杆菌HMQAU20091的活菌浓度为1×10¹⁰CFU/mL。

其中所述的发酵培养液配方为：胰蛋白胨10g/L,酵母粉5g/L,氯化钠10g/L调节pH值为7.3。

6.菌株HMQAU20091对不同病原菌菌丝生长的抑制作用试验方法：

采用对峙平板法(黄云，2010)，PDA平板中央划线接种菌株HMQAU20091，距细菌2.5cm的两侧中间接种病原菌菌饼，25℃恒温培养，对照只接种病原菌菌饼。每个处理设3个重复，待对照生长约3/4培养皿时，测量抑菌带宽度。

抑制率(％)＝(对照菌落半径(mm)-处理菌落半径(mm))/对照菌落半径(mm)×100％

7.菌株HMQAU20091对不同病原菌菌丝生长的抑制作用结果：

试验结果如表3和图4所示，高地芽孢杆菌HMQAU20091对30种供试植物病原菌的菌丝生长具有较好的抑制作用，平板抑制率均达到50％以上。其中对引起百合灰霉病的灰葡萄孢，引起大蒜菌核病的立枯丝核菌，引起芹菜菌核病的核盘菌，引起菜豆灰霉病的灰葡萄孢，引起大白菜菌核病的核盘菌，引起番茄灰叶斑病的茄葡柄霉和引起小麦赤霉病的禾谷镰孢有明显的抑制作用，抑制率分别达到了97.71％，97.56％，93.66％，92.36％，90.16％，88.91％，84.40％；其次对引起葡萄白腐病的白腐垫壳孢，引起蓝莓毛色二孢枝枯病的假可可毛色二孢，引起菠菜腐霉根腐病的畸雌腐霉，引起蓝莓疫霉根腐病的樟疫霉，抑制率均为75％以上；对其他19种病原菌的抑制率也在50.15％-71.76％之间。表明菌株HMQAU20091抗菌谱较广，抗菌效果较好，具有较高的生防潜力。差异显著性分析表明，该菌株对灰霉病菌、菌核病菌、番茄灰叶斑病菌、小麦赤霉病菌的抑制作用较高，且与葡萄白腐病菌、蓝莓毛色二孢枝枯病菌、菠菜腐霉根腐病菌、蓝莓疫霉根腐病菌等的抑制作用差异显著。

表3菌株HMQAU20091对不同病原菌菌丝生长的抑制作用

注：同一列数字后面的字母表示在P＜0.05水平差异显著(Duncan氏新复极差法)

实施例2菌株HMQAU20091发酵滤液对不同病原菌的抑制作用

1.试验方法：

供试菌株同实施例1；采用菌丝生长速率法(陈年春，1991)，将发酵液无菌滤液与融化后冷却的PDA培养基(45-50℃)混匀(稀释10倍)，倒平板，以加入等体积LB液体培养基的PDA培养基作为对照，于平板中央接种直径为5mm的病原菌菌饼。待对照长满3/4培养皿时，十字交叉法测量对照组及处理组菌落直径，计算抑菌率，每个处理设3个重复。

抑制率(％)＝(对照菌落半径(mm)-处理菌落半径(mm))/对照菌落半径(mm)×100％

2.菌株HMQAU20091发酵滤液对不同病原菌的抑制作用结果：

选取菌株HMQAU20091的LB发酵滤液于PDA中稀释10倍后进行菌丝生长速率法试验，结果如表4和图5所示，高地芽孢杆菌菌株HMQAU20091发酵滤液对30种供试植物病原菌具有不同的抑菌活性。其中对引起芹菜菌核病的核盘菌、大蒜干腐病的立枯丝核菌、蓝莓疫霉根腐病的樟疫霉、菠菜腐霉根腐病的林栖腐霉、菠菜腐霉根腐病的畸雌腐霉、黄瓜黑星病的瓜枝孢均有明显的抑制作用，抑制率在70.22％-83.59％之间，其次是对灰葡萄孢、葡萄白腐病菌、黄瓜褐斑病的山扁豆生棒孢、藜麦枝枯病菌等的抑制率在40.75％-70.22％之间；对引起生菜叶斑病的葡柄霉和引起镰孢菌根腐病的镰孢菌以及小麦赤霉病菌和根霉等的抑制率相对较差。差异显著性分析表明，该菌株发酵滤液对引起不同植物的同一种病原菌的不同菌株，如引起芹菜和大白菜菌核病的核盘菌菌株HMQAU170216和菌株HMQAU180110的抑制率之间差异显著。

表4菌株HMQAU20091发酵滤液对不同病原菌的抑制作用

注：同一列数字后面的字母表示在P＜0.05水平差异显著(Duncan氏新复极差法)

实施例3菌株HMQAU20091发酵滤液对黄瓜霜霉病菌游动孢子释放及休止的影响

1.试验方法：

采用凹玻片法测定高地芽孢杆菌菌株HMQAU20091发酵滤液对黄瓜霜霉病菌游动孢子释放及休止的影响。

用灭菌自来水制备浓度为2×10⁵个/mL的孢子囊悬浮液。设置7个处理：菌株HMQAU20091发酵滤液原液、5倍、12.5倍、25倍、50倍；吡唑醚菌酯稀释750倍，灭菌自来水为空白对照。将各处理药剂与孢子囊悬浮液等体积混匀，即得菌株HMQAU20091发酵滤液稀释2倍、10倍、25倍、50倍、100倍处理组，吡唑醚菌酯稀释1500倍处理组，后取20μL滴加在凹玻片上，将凹玻片放入铺有湿滤纸的培养皿中，放在4℃,RH>80％的冰箱中黑暗保湿培养1h，再在20℃培养箱中培养1h。待对照中80％以上的孢子囊释放出游动孢子，在显微镜下观察100个孢子囊的空囊率及游动孢子的游动频率(闫磊，2013)，并进行显微拍照。每处理设3个重复，试验重复2次。

游动孢子释放抑制率(％)＝(对照组游动孢子释放率-处理组游动孢子释放率)/对照组游动孢子释放率×100％

游动孢子游动抑制率(％)＝(对照组游动孢子游动率-处理组游动孢子游动率)/对照组游动孢子游动率×100％

2.试验结果：

试验结果如表5和图6所示，不同稀释倍数的高地芽孢杆菌发酵滤液对黄瓜霜霉病菌游动孢子释放及休止具有不同程度的抑制作用，其中发酵滤液稀释2倍、10倍时可完全抑制游动孢子释放，游动孢子释放抑制率达100％；稀释25倍时游动孢子释放抑制率仍可达到75.35％，随着发酵滤液稀释倍数的增加，游动孢子释放抑制率逐渐下降；而稀释1500倍的吡唑醚菌酯的游动孢子释放抑制率为53.60％。显微观察亦可发现，对照中的孢子囊全部释放游动孢子如图6-A所示，而发酵滤液原液处理中的孢子囊不能释放游动孢子如图6-B所示,发酵滤液原液稀释25倍仅部分孢子囊释放游动孢子如图6-C所示，吡唑醚菌酯稀释1500倍仅少数孢子囊释放游动孢子如图6-D所示。当发酵滤液稀释25倍时对游动孢子游动的抑制率仍能达到44.16％。差异显著性分析表明，稀释2倍、10倍与25倍、50倍、100倍的发酵滤液及吡唑醚菌酯处理间的释放抑制率差异显著；稀释25倍、50倍、100倍的发酵滤液及吡唑醚菌酯处理间的游动抑制率差异显著。由不同稀释倍数处理的高地芽孢杆菌发酵滤液对游动孢子释放抑制率得回归曲线y＝-5.7273x+14.114(R²＝0.9739)，有效抑制中浓度EC₅₀＝39.02mg/mL。游动孢子游动抑制率回归曲线y＝-2.0491x+7.7262(R²＝0.9994)，有效抑制中浓度EC₅₀＝21.40mg/mL。

表5菌株HMQAU20091发酵滤液对黄瓜霜霉病菌游动孢子释放及休止的影响

注：同一列数字后面的字母表示在P＜0.05水平差异显著(Duncan氏新复极差法)

实施例4菌株HMQAU20091发酵滤液对黄瓜霜霉病菌休止孢萌发及芽管伸长的影响

1.试验方法：

采用凹玻片法测定高地芽孢杆菌发酵滤液对黄瓜霜霉病菌休止孢萌发及芽管伸长的影响。

用灭菌自来水制备浓度为2×10⁵个/mL的孢子囊悬浮液。将孢子囊悬浮液20μL滴加到凹玻片上，放在13℃、RH＞80％黑暗的培养箱中保湿培养2h，待对照中80％以上的孢子囊释放，分别加入发酵滤液原液、稀释5倍、12.5倍、25倍、50倍的发酵滤液，稀释750倍的吡唑醚菌酯各20μL，以灭菌自来水为对照。放入13℃、RH＞80％黑暗的培养箱中保湿培养4-5h，待大于80％的游动孢子形成休止孢，再继续培养4h后，待对照休止孢萌发率大于45％，进行拍照记录并测量芽管长度。

休止孢萌发抑制率(％)＝[(对照组休止孢萌发率－处理组休止孢萌发率)/对照组休止孢萌发率]×100％

芽管伸长抑制率(％)＝[(对照组芽管伸长量－处理组芽管伸长量)/对照组芽管伸长量]×100％

2.试验结果：

试验结果如表6和图7所示，不同稀释倍数的高地芽孢杆菌发酵滤液对黄瓜霜霉病菌休止孢萌发具有不同程度的抑制作用，当发酵滤液稀释倍数为2倍、10倍时，可完全抑制休止孢萌发，萌发抑制率达100％；随着发酵滤液稀释倍数的增加，抑制率逐渐下降；同时，发酵滤液对黄瓜霜霉病菌的芽管伸长也具有显著的抑制作用。差异显著性分析表明，稀释倍数为2倍、10倍、25倍的萌发抑制率均显著高于吡唑醚菌酯处理，芽管伸长抑制率也均显著高于吡唑醚菌酯处理；显微观察发现，对照组休止孢萌发较好，芽管较长，粗细均匀，如图7-A所示；发酵滤液原液处理组休止孢完全未萌发，且休止孢裂解，如图7-B所示；稀释25倍的休止孢虽能萌发，但芽管较短，如图7-C所示；药剂处理的休止孢虽能萌发，且芽管较长，但芽管部分破裂，如图7-D所示；正常休止孢如图7-E所示。由不同浓度高地芽孢杆菌发酵滤液处理的休止孢萌发抑制率得回归曲线y＝-5.8028x+14.145(R²＝0.9683)，有效抑制中浓度EC₅₀＝37.67mg/mL；由芽管伸长抑制率得回归曲线y＝-2.0032x+7.5213(R²＝0.9831)，有效抑制中浓度EC₅₀＝18.14mg/mL。

表6菌株HMQAU20091发酵滤液对黄瓜霜霉病菌休止孢萌发及芽管伸长的影响

注：同一列数字后面的字母表示在P＜0.05水平差异显著(Duncan氏新复极差法)

实施例5菌株HMQAU20091发酵滤液对黄瓜霜霉病菌的保护作用

1.试验方法：

采用离体叶片喷雾法测定高地芽孢杆菌发酵滤液对黄瓜霜霉病菌的保护作用。

选取大小一致的黄瓜叶片，用自来水冲洗后吸干水分，背面朝上置于垫有湿滤纸的培养皿中，待用。用灭菌自来水制备浓度为1×10⁵个/mL的孢子囊悬浮液。用小喷壶将稀释0倍、5倍、10倍、25倍、50倍、100倍的高地芽孢杆菌HMQAU20091发酵滤液，稀释倍数1500倍的吡唑醚菌酯分别均匀喷施黄瓜叶片下表面至流失，空白对照喷无菌水，待药液稍干燥后接种病原菌。采用离体叶片定点接种法接种，每个叶片5个点，每个点10μL孢子囊悬浮液。在20℃培养箱中黑暗保湿培养24h后，置于白天22℃，夜晚18℃，12h光暗交替的培养箱中培养7d后测量病斑大小，根据病斑大小计算病情指数和防治效果。离体叶片接种分级标准(傅淑云，1984)如下所示。

病情指数＝(∑(代表级值×病斑数))/(调查总病斑数×最高级值)×100

相对防效(％)＝(对照病情指数-处理病情指数)/对照病情指数×100

2.试验结果：

试验结果如表7和图8所示，高地芽孢杆菌发酵滤液对离体黄瓜叶片霜霉病的防治效果较好，其中发酵滤液稀释倍数5倍时，相对防效达77.55％。差异显著性分析表明，稀释5倍的发酵滤液与对照间防效差异显著。根据不同稀释倍数高地芽孢杆菌发酵滤液处理对离体黄瓜叶片霜霉病的抑制率得回归曲线y＝-1.955x+6.8864(R²＝0.9559)，有效抑制中浓度EC₅₀＝9.22mg/mL。

表7菌株HMQAU20091发酵滤液对黄瓜霜霉病菌的保护作用

注：同一列数字后面的字母表示在P＜0.05水平差异显著(Duncan氏新复极差法)

实施例6菌株HMQAU20091发酵滤液对黄瓜霜霉病菌的治疗作用

1.试验方法：

本试验采用离体叶片喷雾法测定高地芽孢杆菌发酵滤液对黄瓜霜霉病菌的治疗作用

选取大小一致的黄瓜叶片，用自来水冲洗后吸干水分，背面朝上置于垫有湿滤纸的培养皿中，待用。用灭菌自来水制备浓度为1×10⁵个/mL的孢子囊悬浮液。将发酵滤液原液稀释0倍、5倍、10倍、25倍、50倍、100倍，稀释倍数1500倍的吡唑醚菌酯。在叶片背面先接种病原菌，采用离体叶片定点接种法接种，每个叶片5个点，每个点滴10μL。在20℃全暗培养箱中培养24h后，分别将不同浓度药剂均匀喷施至叶片背面，对照均匀喷施无菌水，置于白天22℃，夜晚18℃，12h光暗交替的培养箱中培养培养7d后调查病情，防效调查方法同实施例5。

2.试验结果：

试验结果如表8和图9所示，高地芽孢杆菌发酵滤液对离体黄瓜叶片霜霉病有一定防效，各处理与对照间均差异显著，相对防效最高达39.39％，发酵滤液稀释5倍、10倍的相对防效高于稀释1500倍的吡唑醚菌酯处理，说明该滤液对黄瓜霜霉病有较好的治疗作用。根据不同高地芽孢杆菌发酵滤液处理对离体黄瓜叶片霜霉病的抑制率得回归曲线y＝-0.9994x+5.4006(R²＝0.9947)，有效抑制中浓度EC₅₀＝2.5mg/mL。

表8菌株HMQAU20091发酵滤液对黄瓜霜霉病菌的治疗作用

注：同一列数字后面的字母表示在P＜0.05水平差异显著(Duncan氏新复极差法)

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 青岛农业大学

<120> 一株高地芽孢杆菌HMQAU20091、菌剂及其制备方法和应用

<141> 2022-05-31

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1513

<212> DNA

<213> gene 16SrDNA of Bacillus altitudinis HMQAU20091

<400> 1

agagtttgat cctggctcag gacgaacgct ggcggcgtgc ctaatacatg caagtcgagc 60

ggacagaagg gagcttgctc ccggatgtta gcggcggacg ggtgagtaac acgtgggtaa 120

cctgcctgta agactgggat aactccggga aaccggagct aataccggat agttccttga 180

accgcatggt tcaaggatga aagacggttt cggctgtcac ttacagatgg acccgcggcg 240

cattagctag ttggtgaggt aacggctcac caaggcgacg atgcgtagcc gacctgagag 300

ggtgatcggc cacactggga ctgagacacg gcccagactc ctacgggagg cagcagtagg 360

gaatcttccg caatggacga aagtctgacg gagcaacgcc gcgtgagtga tgaaggtttt 420

cggatcgtaa agctctgttg ttagggaaga acaagtgcaa gagtaactgc ttgcaccttg 480

acggtaccta accagaaagc cacggctaac tacgtgccag cagccgcggt aatacgtagg 540

tggcaagcgt tgtccggaat tattgggcgt aaagggctcg caggcggttt cttaagtctg 600

atgtgaaagc ccccggctca accggggagg gtcattggaa actgggaaac ttgagtgcag 660

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gtggcgaagg cgactctctg gtctgtaact gacgctgagg agcgaaagcg tggggagcga 780

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ttccgcccct tagtgctgca gctaacgcat taagcactcc gcctggggag tacggtcgca 900

agactgaaac tcaaaggaat tgacgggggc ccgcacaagc ggtggagcat gtggtttaat 960

tcgaagcaac gcgaagaacc ttaccaggtc ttgacatcct ctgacaaccc tagagatagg 1020

gctttccctt cggggacaga gtgacaggtg gtgcatggtt gtcgtcagct cgtgtcctga 1080

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gggcactcta aggtgactgc cggtgacaaa ccggaggaag gtggggatga cgtcaaatca 1200

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aggtaacctt tatggagcca gccgccgaag gtggggcaga tgattggggt gaagtcgtaa 1500

caaggtagcc gta 1513

<210> 2

<211> 1259

<212> DNA

<213> gene gyrB of Bacillus altitudinis HMQAU20091

<400> 2

gaagtcatca tgaccgttct gcatgctggt gggaaattcg acggcagcgg ttataaagta 60

tctggcggtc tgcacggtgt aggggcatct gttgttaatg cgttatctac gaccttagac 120

gtgaccgtat accgtgatgg aaaaattcat tatcaacaat tcaaacgcgg tgttccagtt 180

ggagatttag agatcattgg tgaaacagat gtaacaggga caaccactca ttttgtgcca 240

gatccagaaa ttttcactga aaccattgaa tttgattacg aaacacttgc taaccgtgta 300

cgtgagttag ctttcttaac aaaaggcgtc aacatcatca ttgaagactt acgtgaaggc 360

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cacaaaattg tgatcatgac cgacgcggac gtggatggct cgcacatccg taccctgct 1259

Claims (10)

1.一株高地芽孢杆菌(Bacillus altitudinis)菌株HMQAU20091，其特征在于，菌株于2022年4月14日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏登记号：CGMCC No.24677。

2.一种由权利要求1所述的高地芽孢杆菌(Bacillus altitudinis)菌株HMQAU20091制备的微生物菌剂，其特征在于，所述微生物菌剂含有菌株HMQAU20091。

3.根据权利要求2所述的微生物菌剂，其特征在于，所述微生物菌剂的有效活性成分为菌株HMQAU20091的发酵液或者发酵滤液。

4.根据权利要求3所述的微生物菌剂，其特征在于，所述微生物菌剂的有效活性成分为高地芽孢杆菌HMQAU20091的发酵滤液，其微生物菌剂中的高地芽孢杆菌HMQAU20091的活菌浓度为1×10⁹-10¹⁰CFU/mL。

5.根据权利要求4所述的微生物菌剂的制备方法，其特征在于，具体步骤包括：

(1)菌株HMQAU20091种子菌液的培养：将权利要求1所述的菌株HMQAU20091接种到LB培养液中培养，直到种子菌液OD值在0.5-0.8之间时结束培养，获得菌株HMQAU20091种子菌液；

(2)发酵滤液的制备：采用血球计数板调节步骤(1)获得的种子菌液的浓度为5×10⁸CFU/mL，以体积百分含量1％的比例加入装有发酵培养液的锥形瓶中，振荡培养，然后离心，过滤制备拮抗菌的无菌菌株HMQAU20091发酵滤液，即得菌株HMQAU20091发酵滤液。

6.根据权利要求5所述的微生物菌剂的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中的培养指在30℃、200rpm条件下振荡培养8-10h。

7.根据权利要求5所述的微生物菌剂的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中的发酵培养液配方为：胰蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，氯化钠10g/L，调节pH值为7.2-7.4。

8.根据权利要求2所述的微生物菌剂的应用，其特征在于，所述微生物菌剂用于植物病害的防治，所述植物病害为百合灰霉病、菜豆灰霉病、大蒜菌核病、芹菜菌核病、大白菜菌核病、番茄灰叶斑病、小麦赤霉病、葡萄白腐病、蓝莓毛色二孢枝枯病、菠菜腐霉根腐病、蓝莓疫霉根腐病、生菜叶斑病、菠菜镰孢菌根腐病、蓝莓叶斑病、山药镰孢菌根腐菌、大豆黑斑病、藜麦枝枯病、胡萝卜软腐病、大蒜干腐病、猕猴桃软腐病、黄瓜褐斑病、黄瓜黑星病和黄瓜霜霉病。

9.一种植物病害的防治方法，其特征在于，所述方法是利用权利要求1所述的高地芽孢杆菌(Bacillus altitudinis)菌株HMQAU20091或者权利要求2所述的微生物菌剂处理。

10.根据权利要求9所述的植物病害的防治方法，其特征在于，在防治植物病害时，将如权利要求1所述的高地芽孢杆菌(Bacillus altitudinis)菌株HMQAU20091或者如权利要求2所述的微生物菌剂对植物的发病部位种球包衣、浸渍、喷涂、灌溉、挥发、撒粉、撒播、发泡、涂布或者喷雾使用。

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