KR20230125446A - 항진균 활성을 나타내는 신규 바실러스 벨레젠시스 균주 및 이를 유효성분으로 포함하는 과채류 저장성 증진용 식품 보존제 - Google Patents
항진균 활성을 나타내는 신규 바실러스 벨레젠시스 균주 및 이를 유효성분으로 포함하는 과채류 저장성 증진용 식품 보존제 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 항진균 활성을 나타내는 바실러스 벨레젠시스 균주(Bacillus velezensis KCTC 18962) 및 이를 유효성분으로 포함하는 과채류 저장성 증진용 식품 보존제에 관한 것으로, 된장에서 분리한 신규 바실러스 벨레젠시스 균주(Bacillus velezensis KCTC 18962)가 시들음병균(Fusarium oxysporum)에 대한 항진균 활성을 통해, 과채류의 저장성을 증진시키는 것을 확인함으로써, 과채류 저장성 증진용 식품 보존제로서 유용하게 활용될 수 있다.
Description
본 발명은 항진균 활성을 나타내는 신규 바실러스 벨레젠시스 균주(Bacillus velezensis KCTC 18962) 및 이를 유효성분으로 포함하는 과채류 저장성 증진용 식품 보존제에 관한 것이다.
수확한 과채류를 저장 및 판매를 위해 진열하는 기간 동안 관리를 잘못하게 되면 부패가 발생한다. 과채류에서 발생하는 부패는 일반적으로 곰팡이와 세균에 의해 일어나는 것으로 알려져 있다. 특히 곰팡이는 과채류 부패의 주요한 원인 중 하나이며 이로 인하여 상품의 품질저하, 다른 과채류로의 전염 등 다양한 문제를 야기한다. 곰팡이로 인하여 과채류에서 발생하는 문제를 해결하기 위해 곰팡이의 생육을 억제하는 화학 합성 보존료를 사용한다. ‘화학 합성 보존료’는 각종 미생물의 생육을 억제하여 식품의 보존 기간을 증가시키기 위해 사용하는 것으로 알려져 있다. 하지만, 화학 합성 보존료의 사용은 과채류에 화학 물질의 잔류, 인체에 대한 알러지 반응, 독성 등의 문제점을 가진다. 이러한 문제점은 소비자들에게 상품에 대한 거부감을 증가시켰으며, 화학 합성 보존료의 역할을 대체할 천연 보존제에 대한 관심을 불러일으켰다. 이 관심을 바탕으로 미생물이나 미생물의 대사산물을 이용한 보존제 역할을 할 수 있는 천연 항진균제가 개발되고 있다.
농업에서 사용되며 항진균 물질을 생산하는 대표적인 미생물은 Bacillus 균주이다. Bacillus 균주는 식물성장촉진 뿌리박테리아(PGPR; Plant Growth-Promoting Rhizobacteria)로 알려져 있으며 Iturin, Surfactin, Fengycin 등 다양한 항진균 펩타이드를 생산하는 것으로 알려져 있다. Bacillus subtilis, Bacillus thuringiensis 균주 등과 같은 몇몇 미생물은 병충해나 곰팡이로 인한 농작물 피해를 예방하기 위한 친환경 미생물 농약으로 농작물 재배에 활용되고 있다.
하지만, 수확 후 유통 및 판매 과정에서의 당분이 풍부하여 곰팡이에 상하기 쉬운 과일과 채소의 저장성 증진을 위한 천연 미생물 기반 친환경 식품보존제에 대한 개발은 미흡한 상황이다.
본 발명의 목적은 바실러스 벨레젠시스(Bacillus velezensis KCTC 18962P) 균주 및 이를 유효성분으로 포함하는 과채류 저장성 증진용 식품 보존제를 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 기탁번호 KCTC 18962P로 기탁된 바실러스 벨레젠시스(Bacillus velezensis) 균주를 제공한다.
또한, 본 발명은 기탁번호 KCTC 18962P로 기탁된 바실러스 벨레젠시스(Bacillus velezensis) 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는 과채류 저장성 증진용 식품 보존제를 제공한다.
본 발명에 따르면, 된장에서 분리한 신규 바실러스 벨레젠시스 균주(Bacillus velezensis KCTC 18962)가 시들음병균(Fusarium oxysporum)에 대한 항진균 활성을 통해, 과채류의 저장성을 증진시키는 것을 확인함으로써, 과채류 저장성 증진용 식품 보존제로서 유용하게 활용될 수 있다.
도 1은 PDA 배지에서 Fusarium oxysporum KCTC 16909 균사체에 대한 된장에서 선별된 신규 바실러스 벨레젠시스 균주(Bacillus velezensis KCTC 18962)의 항진균 활성을 분석한 결과이다.
도 2는 된장에서 선별된 신규 바실러스 벨레젠시스 균주(Bacillus velezensis KCTC 18962)를 광학현미경으로 관찰한 결과이다.
도 3은 배양 온도에 따른 신규 바실러스 벨레젠시스 균주(Bacillus velezensis KCTC 18962)의 성장을 비교 및 분석한 결과이다. 결과값은 평균과 표준편차(mean±SD)로 표시하였다(n=3).
도 4는 배양 온도에 따른 신규 바실러스 벨레젠시스 균주(Bacillus velezensis KCTC 18962)의 항진균 활성을 비교 및 분석한 결과이다. 모든 상기 균주 배양액은 무세포 배양상층액(cell-free culture supernatant)으로 제조되었다. 1은 대조군(control; LB medium), 2는 20℃ 조건에서 배양한 배양액, 3은 25℃ 조건에서 배양한 배양액, 4는 30℃ 조건에서 배양한 배양액, 5는 37℃ 조건에서 배양한 배양액이다.
도 5는 초기 배지 pH에 따른 신규 바실러스 벨레젠시스 균주(Bacillus velezensis KCTC 18962)의 성장을 비교 및 분석한 결과이다. 결과값은 평균과 표준편차(mean±SD)로 표시하였다(n=3).
도 6은 초기 배지 pH 조건별 신규 바실러스 벨레젠시스 균주(Bacillus velezensis KCTC 18962) 배양 배지들의 시간에 따른 pH 변화를 분석한 결과이다. 결과값은 평균과 표준편차(mean±SD)로 표시하였다(n=3).
도 7은 초기 배지 pH에 따른 신규 바실러스 벨레젠시스 균주(Bacillus velezensis KCTC 18962)의 항진균 활성을 비교 및 분석한 결과이다. 모든 상기 균주 배양액은 무세포 배양상층액(cell-free culture supernatant)으로 제조되었다. 1은 대조군(control; LB medium), 2는 초기 배지 pH 5 조건에서 배양한 배양액, 3은 초기 배지 pH 7 조건에서 배양한 배양액, 4는 초기 배지 pH 9 조건에서 배양한 배양액이다.
도 8은 최적 조건(배양 온도 37℃, 초기 배지 pH 5)의 배양기간(120시간) 동안 신규 바실러스 벨레젠시스 균주(Bacillus velezensis KCTC 18962)의 Fusarium oxysporum에 대한 inhibition zone을 측정한 결과이다. 모든 상기 균주 배양액은 무세포 배양상층액(cell-free culture supernatant)으로 제조되었다. 결과값은 평균과 표준편차(mean±SD)로 표시하였다(n=3)(p<0.05).
도 9는 신규 바실러스 벨레젠시스 균주(Bacillus velezensis KCTC 18962) 및 바실러스 벨레젠시스(Bacillus velezensis) KACC 19683 균주 배양상층액의 Fusarium oxysporum에 대한 항진균 활성을 비교 및 관찰한 사진(A) 및 inhition zone을 측정한 결과를 나타낸 그래프(B)이다. 1은 대조군(control; LB medium), 2는 20℃ 조건에서 배양한 KACC 19683 균주 배양액, 3은 25℃ 조건에서 배양한 KACC 19683 균주 배양액, 4는 30℃ 조건에서 배양한 KACC 19683 균주 배양액, 5는 37℃ 조건에서 배양한 KACC 19683 균주 배양액, 6은 37℃ 조건에서 배양한 KCTC 18962 균주 배양액이다. 모든 배양액은 무세포 배양상층액(cell-free culture supernatant)으로 제조되었다. 결과값은 평균과 표준편차(mean±SD)로 표시하였다(n=3)(p<0.05).
도 10은 딸기에 신규 바실러스 벨레젠시스 균주(Bacillus velezensis KCTC 18962) 배양상층액을 처리하고, Fusarium oxysporum 억제 활성을 분석한 결과이다. 상기 균주 배양상층액은 무세포 배양상층액(cell-free culture supernatant)으로 제조되었다. A는 LB 배지로 처리된 딸기이고, B는 무세포 배양상층액(Bacillus velezensis KCTC 18962 배양상층액)으로 처리된 딸기이다. 상기 도면은 각 배지 처리 3일 후의 상태를 나타낸다.
도 2는 된장에서 선별된 신규 바실러스 벨레젠시스 균주(Bacillus velezensis KCTC 18962)를 광학현미경으로 관찰한 결과이다.
도 3은 배양 온도에 따른 신규 바실러스 벨레젠시스 균주(Bacillus velezensis KCTC 18962)의 성장을 비교 및 분석한 결과이다. 결과값은 평균과 표준편차(mean±SD)로 표시하였다(n=3).
도 4는 배양 온도에 따른 신규 바실러스 벨레젠시스 균주(Bacillus velezensis KCTC 18962)의 항진균 활성을 비교 및 분석한 결과이다. 모든 상기 균주 배양액은 무세포 배양상층액(cell-free culture supernatant)으로 제조되었다. 1은 대조군(control; LB medium), 2는 20℃ 조건에서 배양한 배양액, 3은 25℃ 조건에서 배양한 배양액, 4는 30℃ 조건에서 배양한 배양액, 5는 37℃ 조건에서 배양한 배양액이다.
도 5는 초기 배지 pH에 따른 신규 바실러스 벨레젠시스 균주(Bacillus velezensis KCTC 18962)의 성장을 비교 및 분석한 결과이다. 결과값은 평균과 표준편차(mean±SD)로 표시하였다(n=3).
도 6은 초기 배지 pH 조건별 신규 바실러스 벨레젠시스 균주(Bacillus velezensis KCTC 18962) 배양 배지들의 시간에 따른 pH 변화를 분석한 결과이다. 결과값은 평균과 표준편차(mean±SD)로 표시하였다(n=3).
도 7은 초기 배지 pH에 따른 신규 바실러스 벨레젠시스 균주(Bacillus velezensis KCTC 18962)의 항진균 활성을 비교 및 분석한 결과이다. 모든 상기 균주 배양액은 무세포 배양상층액(cell-free culture supernatant)으로 제조되었다. 1은 대조군(control; LB medium), 2는 초기 배지 pH 5 조건에서 배양한 배양액, 3은 초기 배지 pH 7 조건에서 배양한 배양액, 4는 초기 배지 pH 9 조건에서 배양한 배양액이다.
도 8은 최적 조건(배양 온도 37℃, 초기 배지 pH 5)의 배양기간(120시간) 동안 신규 바실러스 벨레젠시스 균주(Bacillus velezensis KCTC 18962)의 Fusarium oxysporum에 대한 inhibition zone을 측정한 결과이다. 모든 상기 균주 배양액은 무세포 배양상층액(cell-free culture supernatant)으로 제조되었다. 결과값은 평균과 표준편차(mean±SD)로 표시하였다(n=3)(p<0.05).
도 9는 신규 바실러스 벨레젠시스 균주(Bacillus velezensis KCTC 18962) 및 바실러스 벨레젠시스(Bacillus velezensis) KACC 19683 균주 배양상층액의 Fusarium oxysporum에 대한 항진균 활성을 비교 및 관찰한 사진(A) 및 inhition zone을 측정한 결과를 나타낸 그래프(B)이다. 1은 대조군(control; LB medium), 2는 20℃ 조건에서 배양한 KACC 19683 균주 배양액, 3은 25℃ 조건에서 배양한 KACC 19683 균주 배양액, 4는 30℃ 조건에서 배양한 KACC 19683 균주 배양액, 5는 37℃ 조건에서 배양한 KACC 19683 균주 배양액, 6은 37℃ 조건에서 배양한 KCTC 18962 균주 배양액이다. 모든 배양액은 무세포 배양상층액(cell-free culture supernatant)으로 제조되었다. 결과값은 평균과 표준편차(mean±SD)로 표시하였다(n=3)(p<0.05).
도 10은 딸기에 신규 바실러스 벨레젠시스 균주(Bacillus velezensis KCTC 18962) 배양상층액을 처리하고, Fusarium oxysporum 억제 활성을 분석한 결과이다. 상기 균주 배양상층액은 무세포 배양상층액(cell-free culture supernatant)으로 제조되었다. A는 LB 배지로 처리된 딸기이고, B는 무세포 배양상층액(Bacillus velezensis KCTC 18962 배양상층액)으로 처리된 딸기이다. 상기 도면은 각 배지 처리 3일 후의 상태를 나타낸다.
이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.
본 발명자는 항진균 활성을 나타내는 미생물, 바람직하게는 바실러스(Bacillus) 균주를 탐색하고자 예의 노력한 결과, 된장에서 분리한 신규 바실러스 벨레젠시스(Bacillus velezensis) 균주가 시들음병균(Fusarium oxysporum)에 대해 항진균 활성을 통해, 과채류의 저장성을 증진시키는 것을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
본 발명은 기탁번호 KCTC 18962P로 기탁된 바실러스 벨레젠시스(Bacillus velezensis) 균주를 제공한다.
상기 균주는 시들음병균(Fusarium oxysporum)에 대한 항진균 활성을 나타내는 것을 특징으로 하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명자들은 된장에서 분리한 신규 바실러스 벨레젠시스(Bacillus velezensis) 균주가 시들음병균(Fusarium oxysporum)에 대한 항진균 효과를 확인했고, 한국생명공학연구원에 상기 균주를 기탁하였다(기탁번호 : KCTC 18962P).
또한, 본 발명은 기탁번호 KCTC 18962P로 기탁된 바실러스 벨레젠시스(Bacillus velezensis) 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는 과채류 저장정 증진용 식품 보존제 및 이의 제조방법을 제공한다.
상기 바실러스 벨레젠시스(Bacillus velezensis) 균주 또는 이의 배양액은 식품 보존제 100 중량부에 대하여 10 내지 100 중량부로 포함되는 것을 특징으로 하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 식품 보존제는 시들음병균(Fusarium oxysporum)에 대한 항진균 활성을 나타내는 것을 특징으로 하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 배양액은 기탁번호 KCTC 18962P로 기탁된 바실러스 벨레젠시스(Bacillus velezensis) 균주를 20 내지 37℃ 및 pH 5 내지 9 조건에서 24 내지 60시간 동안 배양하여 수득한 것을 특징으로 하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 과채류는 딸기, 토마토 및 복숭아로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상인 것을 특징으로 하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 식품 보존제는 유해 병원성 미생물 생육억제 및 사멸효과가 있고 식품을 무처리군에 비해 오래 유지하거나 보존하는 활성을 갖는 조성물을 의미한다. 구체적으로는 이에 한정되는 것은 아니나, 식품의 갈변방지제, 산화방지제, 미생물 생장 억제제, 살균제, 향신료, 조미제, 방부제 등으로 사용될 수 있는 물질을 의미한다. 이때 식품보존제는 식품을 침지, 분무 또는 혼합하여 상기 식품에 첨가할 수 있으며, 이러한 보존제의 비율은 10 내지 100 중량 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.
본 발명의 식품 보존제가 적용될 수 있는 식품의 구체적인 예로는 야채, 과일, 야채의 건조제품이나 절단제품, 과일쥬스, 야채쥬스, 야채와 과일의 혼합쥬스, 칩류, 면류, 축산가공식품, 수산가공식품, 유가공식품, 발효유식품, 곡류식품, 미생물발효식품, 제과제빵, 양념류, 육가공류, 산성음료수, 감초류, 허브류 등이 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 식품 보존제는 상기 균주 또는 이의 배양액 외에 본 발명이 목적으로 하는 주 효과를 손상시키지 않는 범위 내에서 바람직하게는 주 효과에 상승 효과를 줄 수 있는 다른 성분 등을 함유할 수 있다. 구체적으로 이에 한정되는 것은 아니나, 식품 위생 목적의 다른 첨가물, 예컨대 젖산 등의 유기산이나 미생물 생육 억제물질 등이 있다.
본 발명의 식품 보존제는 식품 보존 필요성에 맞게 편리하고 적합한 방법으로 액상, 고상, 파우더 형태 등으로 다양하게 제제화될 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
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실험예
1] 항진균 활성을 가지는
바실러스
균주의 분리
된장으로부터 항진균 활성을 가지는 바실러스 균주를 분리하기 위하여, 0.85% NaCl 용액 9mL에 된장 1g을 넣고 희석시켜 혼합 용액을 제조했다. 혼합 용액을 십진희석법을 이용하여 희석한 후 MYP agar 배지(Mannitol egg-yolk-polymyxin agar medium)에 도말하여 37℃에서 24시간 배양하였다. 배양 후 MYP agar 배지에 나타난 노란색 단일 콜로니를 선별하여 액체 LB 배지(Luria-Berani media; 5g yeast extract, 10g tryptone 및 5g NaCl /L)에 배양하였다. LB 배지에서 배양한 후 균 배양액 700μl와 50% glycerol 300μl로 조성하여 cryotube에 보관하였다. tube는 -80℃ 냉동고(DF8520, Ilshin Biobase, Yangju, Korea)에서 보관하였고 동정과 실험에 사용하였다.
분리된 균주 중 항진균 활성을 가지는 균주를 확보하기 위하여, Fusarium oxysporum KCTC 16909 균주와 함께 배양하여, F. oxysporum의 균사체 억제 여부를 확인하였다. 이를 위하여 PDA 배지(Potato Dextrose Agar medium)의 가운데에 직경 8mm 종이 디스크를 놓은 후 그 위에 F. oxysporum 배양액 100μl를 접종한 후 3일 동안 30℃ 인큐베이터에서 배양하였다. 3일 후 직경 8mm 종이 디스크를 PDA 배지 가운데에 존재하는 종이 디스크와 3cm 간격으로 떨어뜨려 위치시킨 후 분리된 균주의 배양액을 접종하여 24시간 동안 배양하였다. 분리 균주를 접종한 종이 디스크에서 F. oxysporum의 균사체를 억제하는 분리 균주를 항진균 활성을 가진 균주로 선별하였다.
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실험예
2] 항진균 활성을 가지는
바실러스
균주의 동정
균주 동정을 위하여, 5mL LB 배지에 -80℃ 냉동고에서 보관한 선별 균주의 glycerol 조성액 1%를 접종하여 37℃에서 밤샘 배양하였다. 밤샘 배양한 균주를 LB agar 배지에 streaking하여 단일 colony를 확인한 후, colony PCR을 이용하여 균주의 16S rRNA를 확인하였다. 16S rRNA를 위한 Primer는 27F(5’ - AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG - 3’)와 1495R(5’- TAC GGY TAC CTT GTT ACG ACT TA - 3’)이며 이를 이용하여 PCR을 하였다. PCR 증폭은 5X polymerase buffer, dNTP mixture, primers 및 polymerase를 사용하였다. PCR은 98℃에서 10초 denaturation, 50℃에서 15초 annealing, 72℃에서 1분 45초 elongation하는 30회 cycle을 MJ Mini Personal Thermal Cycler(PTC-1148, Bio-Rad, CA, USA)를 이용하여 증폭시켰다. 증폭시킨 PCR 결과물은 1% agarose gel 전기영동을 통하여 확인하였다. 확인된 결과물은 DNA Gel Extraction S&V Kit(Bionics, Korea)를 이용하여 정제하였다. 정제한 결과물은 ㈜바이오닉스에 의뢰하여 sequence를 분석하였다. 분석된 sequence는 NCBI Blast search(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)를 통해 상동성을 비교 및 분석하였다.
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실험예
3] 항진균 활성 물질 생산을 위한 배양 조건 탐색
항진균 활성 물질 생산을 위한 배양 조건 탐색을 위해, 온도, 초기 배지 pH 및 배양 시간을 다양하게 설정하여 진행하였다. 최적화를 위한 배양은 LB agar 배지에 -80℃ 냉동고에서 보관한 B. velezensis KCTC 18962(이하 GHK-5라 함) 균주의 glycerol 조성액을 streaking하여 37℃에서 밤새 배양(overnight culture)하였다. 이후 단일 colony를 picking하여 20mL LB 배지에 접종하고 12시간 동안 shaking incubator(VS-8480, Vision Scientific, Bucheon, Korea)에서 37℃ 및 180rpm 조건으로 배양하였다. 이후 20mL LB 배지에 배양한 GHK-5 균주를 OD 0.1이 되도록 100mL 삼각 플라스크에 접종하여 배양하였다.
온도 조건의 탐색을 위하여, 20, 25, 30 및 37℃에서 180rpm으로 24시간 동안 배양하였다. 초기 배지 pH의 탐색은 pH 5, 7 및 9로 조정 후 37℃에서 180rpm으로 24시간 동안 배양하였다. 배양 후 항진균 활성을 확인하기 위하여, PDA 배지 가운데에 직경 8mm 종이 디스크를 놓은 후 그 위에 F. oxysporum 배양액을 100μl를 접종하여 3일 동안 30℃에서 배양하였다. 이후 가운데 놓인 종이 디스크와 3cm 떨어진 곳에 직경 8mm 크기의 구멍을 내어 그곳에 GHK-5 균주 배양 여과액을 100μl 분주하였다. 배양 여과액은 24시간 동안 배양한 배양액을 13,500rpm으로 15분 동안 원심분리한 후 이를 0.22μm 필터로 여과하여 균체를 제거하여 준비하였다. 온도 조건과 초기 배지 pH 조건의 탐색 결과를 바탕으로 최적의 배양 시간의 탐색을 위해서 180rpm으로 120시간 동안 배양하였다. 배양 시간에 따른 항진균 활성의 확인은 배양 12시간마다 추출한 배양액의 여과액을 이용하여 이전에 진행한 항진균 활성의 확인 방법과 같은 방법으로 진행하였다. 배양 여과액으로 인한 F. oxysporum의 균사체 억제거리 측정은 배양액을 분주한 구멍의 가장자리부터 균사체의 억제가 일어난 곳까지의 거리를 측정하였다. 측정은 디지털 켈리퍼를 이용하였다.
또한, 상기 GHK-5 균주의 신규성 및 우수성 증명을 위하여 기존에 알려진 균주인 B. velezensis KACC 19683 균주를 대조군으로 설정하여 배양특성 및 항진균 특성을 비교 및 평가하였다.
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실험예
4] 균주의 분석
균주의 성장율은 배양액을 설정 시간마다 OD600에서 UV-1800 spectrophotometer(SHIMADZU, Japan)를 이용하여 측정하였다. 균주의 pH는 Beckman 390 pH meter(Beckman Coulter Inc., CA, USA)를 이용하여 배양액 1mL를 13,500rpm으로 5분간 원심분리하여 상층액을 이용하여 측정하였다.
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실험예
5]
B.
velezensis
발효물
처리를 통한 딸기 내 항진균 활성 및 방제 효과 분석
항진균 활성 물질의 생산을 위해 결정된 조건을 이용하여 GHK-5 균주를 배양하여 배양 여과액을 준비하였다. 기존에 알려진 균주인 B. velezensis KACC 19683 균주를 대조군으로 설정하여 신규 동정한 균주의 특성을 비교 평가하였다. 딸기는 흐르는 물에 세척하여 준비하였다. 이후 70% ethanol을 분무하여 건조하는 과정을 3회 반복하였다. F. oxysporum 배양액을 세척한 딸기에 도포하여 하루 동안 실온에서 보관하였다. 하루 후 대조군에는 5mL의 LB 배지를 도포하였으며, 실험군에는 5mL의 GHK-5 균주 배양 여과액을 딸기에 도포하였으며 3일 동안 실온에서 보관하였다. 3일 후 딸기에서 F. oxysporum 균사체의 성장을 관찰하였다.
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실험예
6] 통계분석
통계 분석은 SAS 9.4 프로그램(INC, Cary, NC, USA)을 사용하였다. 결과는 평균과 표준편차(mean±SD)로 표시하였으며 일원분산분석(One way ANOVA) 방법으로 유의성을 검증하였으며, 던칸 다중범위검정 방법(Duncan’s multiple range test)을 이용하여 사후검정을 진행하였다. 모든 실험은 3번의 독립적인 실험을 하였다.
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실시예
1] 항진균 활성 물질 생산 균주의 분리 결과
된장으로부터 바실러스 선별 배지인 MYP 배지에 노란색 colony를 선택하여 F. oxysporum을 대상으로 항진균 활성을 확인한 후, 활성이 있는 colony를 선별하였다. 선별된 균주의 항진균 활성모습은 도 1과 같고, 현미경 관찰 모습은 도 2와 같다.
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실시예
2] 항진균 활성 물질 생산 균주의 동정 결과
상기 선별된 균주의 16S rRNA sequence(1033 bp)분석 결과를 이용하여 NCBI BLAST search를 진행한 결과, Bacillus velezensis 균주와 상동성이 99.1%인 것을 확인했고(표 1), 이 균주를 Bacillus velezensis GHK-5로 명명하였다. 균주의 16S rRNA sequence는 표 2와 같다.
| Source | Sequence length blasted(bp) | % identity (Accession no.) |
Identified name of sample | Name of strain |
| 된장 | 1,033 | 99.1 (CP047587.1) |
Bacillus velezensis | 18962P |
| 16S rRNA of Bacillus velezensis GHK-5 |
| CCATGCGCGTGCCTATACATGCAAGTCGAGCGGACAGATGGGAGCTTGCTCCCTGATGTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCTGTAAGACTGGGATAACTCCGGGAAACCGGGGCTAATACCGGATGGTTGTTTGAACCGCATGGTTCAGACATAAAAGGTGGCTTCGGCTACCACTTACAGATGGACCCGCGGCGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCGACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGTTTTCGGATCGTAAAGCTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTGCCGTTCAAATAGGGCGGCACCTTGACGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGGGCTCGCAGGCGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCCCGGCTCAACCGGGGAGGGTCATTGGAAACTGGGGAACTTGAGTGCAGAAGAGGAGAGTGGAATTCCACGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATGTGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTCTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAAGTGTTAGGGGGTTTCCGCCCCTTAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGACTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAACCGGTGGAGCATGTGATTTAATTCTAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACTTCCTCTGACAATCCTAAAGAAAGAACTCCCCTTCGGCGCAAAATGGCCAGTGGCTCATGGAAGCCTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAAGTGTTAGGGGGTTTCCGCCCCTTAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGACTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAACCGGTGGAGCATGTGATTTAATTCTAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACTTCCTCTGACAATCCTAAAGAAAGAACTCCCCTTCGGCGCAAAATGGCCAGTGGCTCATGGAAGCAACGATGAGTGCTAAGTGTTAGGGGGTTTCCGCCCCTTAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGACTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAACCGGTGGAGCATGTGATTTAATTCTAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACTTCCTCTGACAATCCTAAAGAAAGAACTCCCCTTCGGCGCAAAATGGCCAGTGGCTCATGGAAGCG |
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실시예
3] 항진균 활성 물질 생산을 위한 배양 조건 탐색 결과
배양 온도 조건 탐색 결과, 균주의 성장은 37℃에서 가장 빠르고 가장 많이 성장하였고, 온도가 낮아질수록 느리게 성장하는 것을 확인하였다(도 3). 또한, 항진균 활성을 확인한 결과, 37℃에서 배양하여 준비한 배양 여과액이 가장 우수한 항진균 활성을 나타내는 것을 확인하였다(도 4).
초기 배지 pH를 탐색한 결과, 균주의 성장은 초기 배지 pH 7에서 가장 빠르게 성장했고, 초기 배지 pH 9에서 가장 많이 성장했다(도 5). 서로 다른 초기 배지 pH 조건의 배지들이 24시간 배양 동안 pH 7.6으로 수렴하였고(도 6), 초기 배지 pH 5는 균주의 성장이 가장 적었으나 항진균 활성이 초기 배지 pH 조건 중 가장 강한 것을 확인하였다(도 7).
따라서 배양 온도 37℃, 초기 배지 pH 5로 배양 조건을 설정한 후, 120시간 동안 균주를 배양하여 항진균 활성을 관찰한 결과, 24시간부터 60시간까지 항진균 활성은 크게 차이가 없었고, 시간이 지날수록 항진균 활성은 줄어드는 것을 확인하였다(도 8). 따라서 항진균 활성 물질 생산을 위한 배양 조건은 37℃, 초기 배지 pH 5 및 24시간 배양으로 결정하였다.
또한, GHK-5 균주가 기존에 알려진 균주인 B. velezensis KACC 19683 균주와 비교하였을 때, 항진균 효과가 더 우수한지 확인하기 위해, 배양 온도 조건에 따른 항진균 활성을 배양 조건 탐색과 동일한 방법을 이용하여 확인하였다.
그 결과, 37℃ 배양 여과액을 제외한 나머지 20℃, 25℃ 및 30℃ 배양 여과액에서 B. velezensis KACC 19683 균주의 항진균 활성을 확인하였다. 그 중 20℃ 배양 여과액의 항진균 활성이 가장 강하였고, GHK-5 균주의 37℃ 배양 여과액과 비교하였을 때, GHK-5 균주가 B. velezensis KACC 19683 균주보다 항진균 활성이 더 우수함을 확인하였다(도 9).
[
실시예
4] 항진균 활성을 가진
GHK
-5 균주
발효물을
이용한 딸기의 저장성 증진 효과 분석
과채류 중 하나인 딸기를 이용하여 항진균 활성 물질의 진균 방제 효과를 확인한 결과, 대조군으로 LB 배지를 도포한 딸기에서보다 GHK-5 균주 배양 여과액을 도포한 딸기에서 균사체의 성장이 눈에 띄게 적은 것을 확인하였고, 이를 통해 상기 균사체의 성장을 억제하였음을 확인하였다(도 10).
이상으로, 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그것들의 등가물에 의해서 정의된다고 할 것이다.
<110> THE CATHOLIC UNIVERSITY OF KOREA INDUSTRY-ACADEMIC COOPERATION FOUNDATION
<120> Novel Bacillus velegensis for antifungal and food preservatives
for enhancing storage of fruits and vegetables comprising the
same as an active ingredient
<130> ADP-2021-0965
<160> 3
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> Unknown
<220>
<223> DNA primer of 27F
<400> 1
agagtttgat cmtggctcag 20
<210> 2
<211> 23
<212> DNA
<213> Unknown
<220>
<223> DNA primer of 1495R
<400> 2
tacggytacc ttgttacgac tta 23
<210> 3
<211> 1592
<212> RNA
<213> Unknown
<220>
<223> 16S rRNA of Bacillus velezensis GHK-5
<400> 3
ccatgcgcgt gcctatacat gcaagtcgag cggacagatg ggagcttgct ccctgatgtt 60
agcggcggac gggtgagtaa cacgtgggta acctgcctgt aagactggga taactccggg 120
aaaccggggc taataccgga tggttgtttg aaccgcatgg ttcagacata aaaggtggct 180
tcggctacca cttacagatg gacccgcggc gcattagcta gttggtgagg taacggctca 240
ccaaggcgac gatgcgtagc cgacctgaga gggtgatcgg ccacactggg actgagacac 300
ggcccagact cctacgggag gcagcagtag ggaatcttcc gcaatggacg aaagtctgac 360
ggagcaacgc cgcgtgagtg atgaaggttt tcggatcgta aagctctgtt gttagggaag 420
aacaagtgcc gttcaaatag ggcggcacct tgacggtacc taaccagaaa gccacggcta 480
actacgtgcc agcagccgcg gtaatacgta ggtggcaagc gttgtccgga attattgggc 540
gtaaagggct cgcaggcggt ttcttaagtc tgatgtgaaa gcccccggct caaccgggga 600
gggtcattgg aaactgggga acttgagtgc agaagaggag agtggaattc cacgtgtagc 660
ggtgaaatgc gtagagatgt ggaggaacac cagtggcgaa ggcgactctc tggtctgtaa 720
ctgacgctga ggagcgaaag cgtggggagc gaacaggatt agataccctg gtagtccacg 780
ccgtaaacga tgagtgctaa gtgttagggg gtttccgccc cttagtgctg cagctaacgc 840
attaagcact ccgcctgggg agtacggtcg caagactgaa actcaaagga attgacgggg 900
gcccgcacaa ccggtggagc atgtgattta attctaagca acgcgaagaa ccttaccagg 960
tcttgacttc ctctgacaat cctaaagaaa gaactcccct tcggcgcaaa atggccagtg 1020
gctcatggaa gcctgacgct gaggagcgaa agcgtgggga gcgaacagga ttagataccc 1080
tggtagtcca cgccgtaaac gatgagtgct aagtgttagg gggtttccgc cccttagtgc 1140
tgcagctaac gcattaagca ctccgcctgg ggagtacggt cgcaagactg aaactcaaag 1200
gaattgacgg gggcccgcac aaccggtgga gcatgtgatt taattctaag caacgcgaag 1260
aaccttacca ggtcttgact tcctctgaca atcctaaaga aagaactccc cttcggcgca 1320
aaatggccag tggctcatgg aagcaacgat gagtgctaag tgttaggggg tttccgcccc 1380
ttagtgctgc agctaacgca ttaagcactc cgcctgggga gtacggtcgc aagactgaaa 1440
ctcaaaggaa ttgacggggg cccgcacaac cggtggagca tgtgatttaa ttctaagcaa 1500
cgcgaagaac cttaccaggt cttgacttcc tctgacaatc ctaaagaaag aactcccctt 1560
cggcgcaaaa tggccagtgg ctcatggaag cg 1592
Claims (7)
- 기탁번호 KCTC 18962P로 기탁된 바실러스 벨레젠시스(Bacillus velezensis) 균주.
- 청구항 1에 있어서, 상기 균주는 시들음병균(Fusarium oxysporum)에 대한 항진균 활성을 나타내는 것을 특징으로 하는 바실러스 벨레젠시스(Bacillus velezensis) 균주.
- 기탁번호 KCTC 18962P로 기탁된 바실러스 벨레젠시스(Bacillus velezensis) 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는 과채류 저장성 증진용 식품 보존제.
- 청구항 3에 있어서, 상기 바실러스 벨레젠시스(Bacillus velezensis) 균주 또는 이의 배양액은 식품 보존제 100 중량부에 대하여 10 내지 100 중량부로 포함되는 것을 특징으로 하는 과채류 저장성 증진용 식품 보존제.
- 청구항 3에 있어서, 상기 식품 보존제는 시들음병균(Fusarium oxysporum)에 대한 항진균 활성을 나타내는 것을 특징으로 하는 과채류 저장성 증진용 식품 보존제.
- 청구항 3에 있어서, 상기 배양액은 기탁번호 KCTC 18962P로 기탁된 바실러스 벨레젠시스(Bacillus velezensis) 균주를 20 내지 37℃ 및 pH 5 내지 9 조건에서 24 내지 60시간 동안 배양하여 수득한 것을 특징으로 하는 과채류 저장성 증진용 식품 보존제.
- 청구항 3에 있어서, 상기 과채류는 딸기, 토마토 및 복숭아로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상인 것을 특징으로 하는 과채류 저장성 증진용 식품 보존제.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020220022083A KR20230125446A (ko) | 2022-02-21 | 2022-02-21 | 항진균 활성을 나타내는 신규 바실러스 벨레젠시스 균주 및 이를 유효성분으로 포함하는 과채류 저장성 증진용 식품 보존제 |
Applications Claiming Priority (1)
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| KR20230125446A true KR20230125446A (ko) | 2023-08-29 |
Family
ID=87802302
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
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| KR1020220022083A KR20230125446A (ko) | 2022-02-21 | 2022-02-21 | 항진균 활성을 나타내는 신규 바실러스 벨레젠시스 균주 및 이를 유효성분으로 포함하는 과채류 저장성 증진용 식품 보존제 |
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| Country | Link |
|---|---|
| KR (1) | KR20230125446A (ko) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN117660266A (zh) * | 2024-01-29 | 2024-03-08 | 南京农业大学三亚研究院 | 一株贝莱斯芽孢杆菌、抑菌脂肽及其生物防治菌剂与应用 |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR102285666B1 (ko) | 2019-12-13 | 2021-08-06 | 대한민국 | 식물 병원균에 대한 항균 활성을 갖는 바실러스 벨레젠시스 afb2-2 균주 및 이의 용도 |
-
2022
- 2022-02-21 KR KR1020220022083A patent/KR20230125446A/ko unknown
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR102285666B1 (ko) | 2019-12-13 | 2021-08-06 | 대한민국 | 식물 병원균에 대한 항균 활성을 갖는 바실러스 벨레젠시스 afb2-2 균주 및 이의 용도 |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN117660266A (zh) * | 2024-01-29 | 2024-03-08 | 南京农业大学三亚研究院 | 一株贝莱斯芽孢杆菌、抑菌脂肽及其生物防治菌剂与应用 |
| CN117660266B (zh) * | 2024-01-29 | 2024-04-09 | 南京农业大学三亚研究院 | 一株贝莱斯芽孢杆菌、抑菌脂肽及其生物防治菌剂与应用 |
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