RU2694590C2 - Штаммы bacillus safensis вкпм в-12180, bacillus licheniformis вкпм в-1224, bacillus pumilus вкпм в-12182, bacillus endophyticus вкпм в-12181 - продуценты бактериоцинов против бактериальных патогенов, способ получения низина - Google Patents

Штаммы bacillus safensis вкпм в-12180, bacillus licheniformis вкпм в-1224, bacillus pumilus вкпм в-12182, bacillus endophyticus вкпм в-12181 - продуценты бактериоцинов против бактериальных патогенов, способ получения низина Download PDF

Info

Publication number
RU2694590C2
RU2694590C2 RU2017141442A RU2017141442A RU2694590C2 RU 2694590 C2 RU2694590 C2 RU 2694590C2 RU 2017141442 A RU2017141442 A RU 2017141442A RU 2017141442 A RU2017141442 A RU 2017141442A RU 2694590 C2 RU2694590 C2 RU 2694590C2
Authority
RU
Russia
Prior art keywords
vkpm
bacillus
bacteriocin
strains
producers
Prior art date
Application number
RU2017141442A
Other languages
English (en)
Other versions
RU2017141442A (ru
RU2017141442A3 (ru
Inventor
Любовь Сергеевна Дышлюк
Ольга Олеговна Бабич
Вячеслав Федорович Долганюк
Светлана Юрьевна Носкова
Анастасия Игоревна Пискаева
Original Assignee
федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Кемеровский государственный университет" (КемГУ)
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Кемеровский государственный университет" (КемГУ) filed Critical федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Кемеровский государственный университет" (КемГУ)
Priority to RU2017141442A priority Critical patent/RU2694590C2/ru
Publication of RU2017141442A publication Critical patent/RU2017141442A/ru
Publication of RU2017141442A3 publication Critical patent/RU2017141442A3/ru
Application granted granted Critical
Publication of RU2694590C2 publication Critical patent/RU2694590C2/ru

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N63/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing microorganisms, viruses, microbial fungi, animals or substances produced by, or obtained from, microorganisms, viruses, microbial fungi or animals, e.g. enzymes or fermentates
    • A01N63/10—Animals; Substances produced thereby or obtained therefrom
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P1/00—Preparation of compounds or compositions, not provided for in groups C12P3/00 - C12P39/00, by using microorganisms or enzymes
    • C12P1/04—Preparation of compounds or compositions, not provided for in groups C12P3/00 - C12P39/00, by using microorganisms or enzymes by using bacteria

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Dentistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Agronomy & Crop Science (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Pest Control & Pesticides (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

Группа изобретений относится к биотехнологии, к получению бактериоцина микроорганизмов, в частности к получению низина, и включает штаммы – продуценты бактериоцина и способ его получения. В качестве продуцентов бактериоцина используются новые штаммы бактерий Bacillus safensis ВКПМ В-12180, Bacillus licheniformis ВКПМ В-12224, Bacillus pumilus ВКПМ В-12182 и Bacillus endophyticus ВКПМ В-12181. Полученный бактериоцин низин обладает широким спектром антимикробного действия. Способ получения бактериоцина основан на культивировании штаммов - продуцентов на питательной среде, отделении культуральной жидкости, ее концентрировании и выделении бактериоцина с высокой антимикробной активностью. Группа изобретений позволяет получить бактериоцин низин с высокой антимикробной активностью. 5 н.п. ф-лы, 2 табл., 3 пр.

Description

Группа изобретений относится к биотехнологии. Штаммы Bacillus safensis ВКПМ B-12180, Bacillus licheniformis ВКПМ В-12224, Bacillus pumilus ВКПМ B-12182, Bacillus endophyticus ВКПМ В-12181 депонированы во Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов (ВКПМ) ФГУП ГосНИИгенетика и являются продуцентами бактериоцина низина, который обладает антагонистической активностью против бактериальных патогенов и может быть использован в пищевой промышленности для продления сроков годности минимально обработанных овощей. Группа изобретений также включает способ получения низина, основанный на использовании центрифугирования, фильтрации и добавлении сухого хлористого натрия.
Уровень техники
Известно, что на свежих фруктах и овощах содержится большое количество микроорганизмов. Плотность микроорганизмов, в основном, зависит от естественной изменчивости продукта, и составляет в среднем от 103-107 КОЕ/г.
Молочнокислые бактерии (например, Lactobacillus), Pseudomonas, Erwinia, Pantoea, Micrococcus, Flavobacterium и грамположительные спорообразующие бактерии (например, Bacillus, Clostridium), как правило, являются доминирующими бактериями в свежих фруктах и овощах. Кроме того, различные типы бактерий, такие как Alternaria, Penicillium, Aspergillus, Fusarium также могут быть найдены в больших количествах. Наконец, Torulopsis, Saccharomyces и Candida являются частью доминирующих микроорганизмов, особенно в тех фруктах, которые имеют высокое содержание сахара.
В отдельную группу выделяют микроорганизмы, вызывающие порчу свежих фруктов и овощей, к которым относятся грибы и бактерии. К микробной порче фруктов и овощей относится гниль, которая характеризуется изменением цвета (черный или серый), потерей текстуры (мягкая гниль), а зачастую и неприятным запахом. Повреждения, возникающие при хранении продуктов, часто в результате уборки и транспортировки, легко открывают доступ к множеству бактерий и грибов, высокое содержание воды в продукте будет способствовать их развитию. Среди наиболее важных послеуборочных грибковых патогенов, вызывающих порчу фруктов, можно выделить Penicillium expansum, Botrytis cinerea, Monilinia laxa и Rhizopus stolonifer, в связи с тем, что они имеют особую значимость при порче фруктов и овощей.
Бактериоцины - это антибактериальные вещества белковой природы, вырабатываемые бактериями и подавляющие жизнедеятельность других штаммов того же вида или родственных видов.
В настоящее время ученые многих лабораторий мира изучают пути и способы направленного синтеза бактериоцинов для создания биологическим путем различных модификаций уже известных бактериоцинов, но с более ценными свойствами.
Так, известен способ получения низина (СССР, патент 707320, опубл. 30.11.1981) путем выращивания продуцента Streptococcus lactis в питательной среде на основе молочной сыворотки, с последующей экстракцией целевого продукта из микробных клеток, отделением экстракта, его концентрированием, высаливанием, фильтрацией и высушиванием, отличающийся тем, что с целью стабилизации активности низина в процессе хранения продуцент выращивают на среде, содержащей молочную сыворотку и экстракт кормовых дрожжей, выращенных на растительных отходах, очищенную культуральную жидкость концентрируют с сорбиталем С-20, фильтрацию осуществляют через фильтр-перлит, полученную пасту низин-перлит растворяют в 0,02 н. растворе HCl, затем проводят повторную фильтрацию и концентрат высушивают в присутствии хлористого натрия напылением на казеинат натрия при их соотношении 1-2:2,3-1,3.
Недостатками данного способа являются низкая активность и нестабильность полученного препарата при хранении, а также ограниченный спектр его антимикробного действия.
Описана смесь бактериоцинов, штамм Streptococcus thermophilus -продуцент бактериоцинов и способ их получения (РФ, патент 2153505, опубл. 27.07.2000). Бактериоцины получены культивированием штамма-продуцента Streptococcus thermophilus CNCM 1-1351, выделенного из ферментированного молочного продукта из Чехословакии, в среде и условиях, благоприятных для его роста, и до содержания микроорганизмов в среде 107-109 КОЕ/мл с последующим центрифугированием культуры, приготовлением экстракта супернатанта, содержащего целевой продукт. Бактериоцины используют для приготовления пищевых продуктов или косметической продукции.
Недостатком данного способа является низкая продуктивность штамма.
Наиболее близким по технической сущности к заявляемому изобретению - ближайшим аналогом - является штамм Streptococcus lactis - продуцент бактериоцина низина, обеспечивающий стабильный биосинтез целевого продукта в процессе управляемого непрерывного культивирования (продуктивность на уровне 1440-1680 МЕ/см3ч) и характеризующийся повышенной протеолитической активностью (РФ, патент 2061042, опубл. 27.05.1996).
Основной недостаток ближайшего аналога заключается в низкой продуктивности и нестабильности биосинтеза бактериоцина.
Техническая задача, решаемая изобретением, заключается в выделении штаммов-продуцентов бактериоцина, являющихся представителями нормальной микрофлоры поверхности фруктов и овощей и обладающих широким спектром антимикробного действия по отношению к патогенным, условно-патогенным микроорганизмам и микроорганизмам, вызывающим порчу фруктов и овощей.
Раскрытие сущности изобретения
Поставленная задача решается тем, что предложены штаммы Bacillus safensis B-12180, Bacillus licheniformis В-12224, Bacillus pumilus B-12182, Bacillus endophyticus B-12181 - продуценты бактериоцина против бактериальных патогенов.
Для выделения штаммов овощи (репчатый лук, помидор, болгарский перец) тщательно промывают, измельчают в стерильных условиях и вносят в пробирки с жидкой питательной средой, либо небольшой кусочек сырья растирают по поверхности чашки с агаризованной питательной средой. Инкубируют чашки и пробирки в течение 1-5 суток.
Из пробирок с видимым ростом микроорганизмов и с суммарных газонов на чашках проводят истощающие рассевы. Выделенные микроорганизмы культивируют на агаризованных средах, клонируют до чистых культур и проводят анализ выделенных штаммов с последующим отбором наиболее активных штаммов микроорганизмов.
Отобранные штаммы исследуют как продуценты бактериоцина, в частности низина, в процессе управляемого культивирования.
Для получения фракции бактериоцина выделенные и сублимированные штаммы восстанавливают путем переноса содержимого ампул в пробирки с питательной средой МПБ. Посевы инкубируют при температуре 30°С. После восстановления культур их выращивают на питательном агаре МПА. Затем инокуляты вносят в ферментационную среду (MRS-бульон) в количестве 5%. Далее осуществляют процесс ферментации в непрерывных условиях при температуре 30°С в течение 12-24 ч.
По окончании культивирования биомассу отделяют от питательной среды центрифугированием при 8000 об/мин в течение 20 мин.
Затем концентрируют культуральную жидкость на полых волокнах, отсекающих вещества с молекулярной массой более 15 кДа; перемешивают с сухим хлористым натрием (0,5 М); центрифугируют при 10000 об/мин в течение 15 мин. Далее осадок промывают последовательно водой и изопропиловым спиртом.
Полученную массу центрифугируют, выпаривают изопропанол при температуре 60°С. Выдерживают раствор с водой и активированным углем в течение 15 мин, центрифугируют при 10000 об/мин в течение 15 мин; фильтруют через мембрану, отсекающую молекулы с молекулярной массой более 10 кДа. Полученные пептидные фракции объединяют и проводят их лиофилизацию при следующих параметрах: температура сушки 30°С, продолжительность сушки 6 ч, толщина слоя сушки 2 мм. Готовый продукт упаковывают и хранят при температуре -18°С в течение 12 месяцев.
Штаммы Bacillus safensis, Bacillus licheniformis, Bacillus pumilus, Bacillus endophyticus депонированы во Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов (ВКПМ) ФГУП ГосНИИгенетика и имеют коллекционные номера В-12180, В-12224, В-12182, В-12181, соответственно.
Изобретение иллюстрируется следующими примерами.
Пример 1
Для выделения штаммов репчатый лук тщательно промывают от земли и пыли дистиллированной водой, измельчают в стерильных условиях и вносят в количестве приблизительно 5 г в пробирки с 5 мл жидких питательных сред, либо небольшой кусочек сырья растирают по поверхности чашки с агаризованной питательной средой. Инкубируют чашки и пробирки стационарно в трех температурных режимах (30°С, 37°С и 4°С) в течение 1-5 суток.
Для первичного выделения микроорганизмов используют:
- молочную среду (МС) - стерильное обезжиренное молоко;
- бульон MRS по ISO 13721 (Whatman, Германия);
- сердечно-мозговой бульон (Bio-Rad Laboratories SAS, Франция);
- молочный агар, MA (БиоВитрум, Россия);
- рыбопептонный агар, РПА (БиоВитрум, Россия);
- агар MRS, МРСА (Panreac, Испания).
Из пробирок с видимым ростом микроорганизмов (помутнение или наличие молочного сгустка) и с суммарных газонов на чашках проводят истощающие рассевы. Выделенные микроорганизмы культивируют на агаризованных средах (РПА, МРСА и МА), клонируют до чистых культур и проводят микробиологический анализ культурально-морфологических, физиолого-биохимических и генетических свойств выделенных штаммов с последующим отбором наиболее активных штаммов микроорганизмов.
Штаммы Bacillus safensis B-12180, Bacillus pumilus B-12182, наиболее активные из всех отобранных штаммов, исследуют как продуценты бактериоцина в процессе управляемого культивирования.
Штамм Bacillus safensis B-12180 - продуцент бактериоцина -характеризуется следующими признаками.
Морфологические признаки.
Штамм представляет собой грамположительные подвижные за счет наличия перетрихиальных жгутиков палочки размером 0,5-2,5×1,2-10 мкм, образующие споры. Расположение клеток от одиночных до длинных цепочек.
Культуральные признаки.
Штамм образует плоские матовые однородные колонии округлой формы телесного цвета с бахромчатым краем и шероховатой поверхностью. Биохимические признаки.
Штамм растет в аэробных условиях в молоке, в сердечно-мозговом бульоне при температурах 30°С и 37°С, растет на агаризованных средах: рыбопептонном агаре, молочном агаре, MRS-агаре.
Штамм ферментирует глицерол, L-арабинозу, рибозу, D-ксилозу, L-ксилозу, рибит, D-глюкозу, D-фруктозу, рамнозу, галактит, инозитол,
манитол, сорбитол, α-метил-D-манозид, α-метил-D-глюкозид, амигдалин, арбутин, эскулин, салицин, целлобиозу, мальтозу, сахарозу, трегалозу, D-рафинозу, крахмал, гликоген, ксилит, β-генцибиозу.
Антагонистическая активность.
Штамм проявляет in vitro выраженную антагонистическую активность против некоторых грамположительных патогенов: Leuconostoc mesenteroides, Arthrobacter cumminsii.
Штамм Bacillus pumilus B-12182 - продуцент бактериоцина -характеризуется следующими признаками.
Морфологические признаки.
Штамм представляет собой грамположительные подвижные за счет наличия перетрихиальных жгутиков палочки размером 0,5-2,5×1,2-10 мкм, образующие споры. Расположение клеток от одиночных до длинных цепочек.
Культуральные признаки.
Штамм образует выпуклые непрозрачные однородные колонии округлой формы белого цвета с зубчатым краем и гладкой поверхностью. Биохимические признаки.
Штамм растет в аэробных условиях в молоке, в сердечно-мозговом бульоне при температурах 30°С и 37°С, растет на агаризованных средах: рыбопептонном агаре, молочном агаре, MRS-агаре.
Штамм ферментирует L-арабинозу, рибозу, D-глюкозу, D-фруктозу, D-манозу, манитол, арбутин, эскулин, салицин, целлобиозу, сахарозу, трегалозу, β-генцибиозу, D-тагатозу.
Антагонистическая активность.
Штамм проявляет in vitro выраженную антагонистическую активность против некоторых грамположительных патогенов: Leuconostoc mesenteroides, Arthrobacter cumminsii.
В результате проведения генетической идентификации штаммов они депонированы во Всероссийской Коллекции Промышленных
Микроорганизмов (ВКПМ) ФГУП ГосНИИгенетика, находящейся по адресу: 117545, Россия, г. Москва, 1-ый Дорожный проезд, д. 1:
- Bacillus safensis, регистрационный номер ВКПМ В-12180 от 18.04.2015;
- Bacillus pumilus, регистрационный номер ВКПМ В-12182 от 18.04.2015.
Данные культуры микроорганизмов хранятся в сублимационно-высушенном состоянии в ампулах при температуре 4±2°С не менее 24 месяцев.
Для получения фракции бактериоцина выделенные и сублимированные штаммы Bacillus safensis ВКПМ B-12180, Bacillus pumilus ВКПМ В-12182 восстанавливают путем переноса содержимого ампул в пробирки с питательной средой МПБ, г/л: панкреатический гидролизат рыбной муки - 12; хлорид натрия - 6; пептон ферментативный - 12. Посевы инкубируют при температуре 30°С. После восстановления культур, их выращивают на питательном агаре МПА. Затем инокуляты вносят в ферментационную среду (MRS-бульон) в количестве 5%.
Далее осуществляют процесс ферментации в непрерывных условиях при температуре 30°С в течение 12-24 ч до достижения концентраций 1,5⋅108 КОЕ/мл для Bacillus safensis ВКПМ В-12180; 1,5⋅106 КОЕ/мл для Bacillus pumilus ВКПМ В-12182.
Продуктивность непрерывного процесса при указанных параметрах составляет 2500 МЕ/см3ч (у ближайшего аналога известный штамм Streptococcus lactis показал продуктивность 1440-1680 МЕ/см3ч).
По окончании культивирования биомассу отделяют от питательной среды центрифугированием при 8000 об/мин в течение 20 мин.
Затем концентрируют культуральную жидкость на полых волокнах, отсекающих вещества с молекулярной массой более 15 кДа; перемешивают с сухим хлористым натрием (0,5 М) при скорости перемешивания 100 кач/мин в течение 20 мин; центрифугируют при 10000 об/мин в течение 15 мин.
Далее к осадку добавляют воду в объеме 0,1% от начального объема культуральной жидкости, суспендируют; промывают изопропиловым спиртом, взятом в объеме 0,1% от начального объема культуральной жидкости в течение 30 мин при температуре 0°С.
Полученную массу центрифугируют, выпаривают изопропанол на роторном испарителе при температуре 60°С. Далее выдерживают раствор с водой и активированным углем (0,5% w/v) в течение 15 мин, центрифугируют при 10000 об/мин в течение 15 мин; фильтруют через мембрану, отсекающую молекулы с молекулярной массой более 10 кДа. Полученные пептидные фракции объединяют и проводят их лиофилизацию при следующих параметрах: температура сушки 30°С, продолжительность сушки 6 ч, толщина слоя сушки 2 мм. Готовый продукт упаковывают и хранят при температуре -18°С в течение 12 месяцев.
Результаты определения антимикробной активности, физико-химических и биологических свойств полученной фракции представлены в таблицах 1-2.
Пример 2
Для выделения штаммов помидор тщательно промывают от земли и пыли дистиллированной водой, измельчают в стерильных условиях и вносят в количестве приблизительно 5 г в пробирки с 5 мл жидких питательных сред, либо небольшой кусочек сырья растирают по поверхности чашки с агаризованной питательной средой. Инкубируют чашки и пробирки стационарно в трех температурных режимах (30°С, 37°С и 4°С) в течение 1-5 суток.
Для первичного выделения микроорганизмов используют:
- молочную среду (МС) - стерильное обезжиренное молоко;
- бульон MRS по ISO 13721 (Whatman, Германия);
- сердечно-мозговой бульон (Bio-Rad Laboratories SAS, Франция);
- молочный агар, МА (БиоВитрум, Россия);
- рыбопептонный агар, РПА (БиоВитрум, Россия);
- агар MRS, МРСА (Panreac, Испания).
Из пробирок с видимым ростом микроорганизмов (помутнение или наличие молочного сгустка) и с суммарных газонов на чашках проводят истощающие рассевы. Выделенные микроорганизмы культивируют на агаризованных средах (РПА, МРСА и МА), клонируют до чистых культур и проводят микробиологический анализ культурально-морфологических, физиолого-биохимических и генетических свойств выделенных штаммов с последующим отбором наиболее активных штаммов микроорганизмов.
Штамм Bacillus endophyticus В-12181, наиболее активный из всех отобранных штаммов, исследуют как продуцент бактериоцина в процессе управляемого культивирования.
Штамм Bacillus endophyticus В-12181 - продуцент бактериоцина -характеризуется следующими признаками.
Морфологические признаки.
Штамм представляет собой грамположительные подвижные за счет наличия перетрихиальных жгутиков палочки размером 0,5-2,5×1,2-10 мкм, образующие споры. Расположение клеток от одиночных до длинных цепочек.
Культуральные признаки.
Штамм образует плоские матовые мелкозернистые колонии округлой формы белого цвета с ровным краем и гладкой поверхностью. Биохимические признаки.
Штамм растет в аэробных условиях в молоке при температурах 30°С, 37°С и 45°С, в бульоне MRS при температуре 37°С, растет на агаризованных средах: молочном агаре, MRS-агаре.
Антагонистическая активность.
Штамм проявляет in vitro выраженную антагонистическую активность против некоторых грамположительных патогенов: Leuconostoc mesenteroides, Arthrobacter cumminsii.
В результате проведения генетической идентификации штамма он депонирован во Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов (ВКПМ) ФГУП ГосНИИгенетика, находящейся по адресу: 117545, Россия, г. Москва, 1-ый Дорожный проезд, д. 1: Bacillus endophyticus, регистрационный номер ВКПМ В-12181 от 18.04.2015.
Данная культура микроорганизмов хранится в сублимационно-высушенном состоянии в ампулах при температуре 4±2°С не менее 24 месяцев.
Для получения фракции бактериоцина выделенный и сублимированный штамм Bacillus endophyticus ВКПМ В-12181 восстанавливают путем переноса содержимого ампул в пробирки с питательной средой МПБ, г/л: панкреатический гидролизат рыбной муки - 12; хлорид натрия - 6; пептон ферментативный - 12. Посевы инкубируют при температуре 30°С. После восстановления культуры ее выращивают на питательном агаре МПА. Затем инокулят вносят в ферментационную среду (MRS-бульон) в количестве 5%.
Далее осуществляют процесс ферментации в непрерывных условиях при температуре 30°С в течение 12-24 ч до достижения концентраций 1,5⋅107 КОЕ/мл.
Продуктивность непрерывного процесса при указанных параметрах составляет 2500 МЕ/см3ч (у ближайшего аналога известный штамм Streptococcus lactis показал продуктивность 1440-1680 МЕ/см3ч).
По окончании культивирования биомассу отделяют от питательной среды центрифугированием при 8000 об/мин в течение 20 мин.
Затем концентрируют культуральную жидкость на полых волокнах, отсекающих вещества с молекулярной массой более 15 кДа; перемешивают с сухим хлористым натрием (0,5 М) при скорости перемешивания 100 кач/мин в течение 20 мин; центрифугируют при 10000 об/мин в течение 15 мин.
Далее к осадку добавляют воду в объеме 0,1% от начального объема культуральной жидкости, суспендируют; промывают изопропиловым спиртом, взятом в объеме 0,1% от начального объема культуральной жидкости в течение 30 мин при температуре 0°С.
Полученную массу центрифугируют, выпаривают изопропанол на роторном испарителе при температуре 60°С. Далее выдерживают раствор с водой и активированным углем (0,5% w/v) в течение 15 мин, центрифугируют при 10000 об/мин в течение 15 мин; фильтруют через мембрану, отсекающую молекулы с молекулярной массой более 10 кДа. Проводят лиофилизацию полученной пептидной фракции при следующих параметрах: температура сушки 30°С, продолжительность сушки 6 ч, толщина слоя сушки 2 мм. Готовый продукт упаковывают и хранят при температуре -18°С в течение 12 месяцев.
Результаты определения антимикробной активности, физико-химических и биологических свойств полученной фракции представлены в таблицах 1-2.
Пример 3
Для выделения штаммов болгарский перец тщательно промывают от земли и пыли дистиллированной водой, измельчают в стерильных условиях и вносят в количестве приблизительно 5 г в пробирки с 5 мл жидких питательных сред, либо небольшой кусочек сырья растирают по поверхности чашки с агаризованной питательной средой. Инкубируют чашки и пробирки стационарно в трех температурных режимах (30°С, 37°С и 4°С) в течение 1-5 суток.
Для первичного выделения микроорганизмов используют:
- молочную среду (МС) - стерильное обезжиренное молоко;
- бульон MRS по ISO 13721 (Whatman, Германия);
- сердечно-мозговой бульон (Bio-Rad Laboratories SAS, Франция);
- молочный агар, МА (БиоВитрум, Россия);
- рыбопептонный агар, РПА (БиоВитрум, Россия);
- агар MRS, МРСА (Panreac, Испания).
Из пробирок с видимым ростом микроорганизмов (помутнение или наличие молочного сгустка) и с суммарных газонов на чашках проводят истощающие рассевы. Выделенные микроорганизмы культивируют на агаризованных средах (РПА, МРСА и МА), клонируют до чистых культур и проводят микробиологический анализ культурально-морфологических, физиолого-биохимических и генетических свойств выделенных штаммов с последующим отбором наиболее активных штаммов микроорганизмов.
Штамм Bacillus licheniformis В-12224, наиболее активный из всех отобранных штаммов, исследуют как продуцент бактериоцина в процессе управляемого культивирования.
Штамм Bacillus licheniformis В-12224 - продуцент бактериоцина -характеризуется следующими признаками.
Морфологические признаки.
Штамм представляет собой грамположительные подвижные за счет наличия перетрихиальных жгутиков палочки размером 0,5-2,5×1,2-10 мкм, образующие споры. Расположение клеток от одиночных до длинных цепочек.
Культуральные признаки.
Штамм образует плоские матовые однородные колонии округлой формы телесного цвета с волнистым краем и гладкой поверхностью. Биохимические признаки.
Штамм растет в аэробных условиях в молоке, в бульоне MRS, в сердечно-мозговом бульоне при температурах 30°С и 37°С, растет на агаризованных средах: рыбопептонном агаре, молочном агаре, MRS-агаре.
Штамм ферментирует глицерол, L-арабинозу, рибозу, D-ксилозу, галактозу, D-глюкоза, D-фруктозу, D-манозу, рамнозу, манитол, N-ацетил-глюкозоамин, амигдалин, арбутин, эскулин, салицин, целлобиоза, мальтозу, лактозу, сахарозу, трегалозу, β-генцибиозу, глюконат.
Антагонистическая активность.
Штамм проявляет in vitro выраженную антагонистическую активность против некоторых грамположительных патогенов: Leuconostoc mesenteroides, Arthrobacter cumminsii.
В результате проведения генетической идентификации штамма он депонирован во Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов (ВКПМ) ФГУП ГосНИИгенетика, находящейся по адресу: 117545, Россия, г. Москва, 1-ый Дорожный проезд, д. 1: Bacillus licheniformis, регистрационный номер В-12224 от 17.06.2015.
Данная культура микроорганизмов хранится в сублимационно-высушенном состоянии в ампулах при температуре 4±2°С не менее 24 месяцев.
Для получения фракции бактериоцина выделенный и сублимированный штамм Bacillus licheniformis ВКПМ В-12224 восстанавливают путем переноса содержимого ампул в пробирки с питательной средой МПБ, г/л: панкреатический гидролизат рыбной муки - 12; хлорид натрия - 6; пептон ферментативный - 12. Посевы инкубируют при температуре 30°С. После восстановления культуры, ее выращивают на питательном агаре МПА. Затем инокулят вносят в ферментационную среду (MRS-бульон) в количестве 5%.
Далее осуществляют процесс ферментации в непрерывных условиях при температуре 30°С в течение 12-24 ч до достижения концентраций 1,5⋅107 КОЕ/мл.
Продуктивность непрерывного процесса при указанных параметрах составляет 2500 МЕ/см3ч (у ближайшего аналога известный штамм Streptococcus lactis показал продуктивность 1440-1680 МЕ/см3ч).
По окончании культивирования биомассу отделяют от питательной среды центрифугированием при 8000 об/мин в течение 20 мин.
Затем концентрируют культуральную жидкость на полых волокнах, отсекающих вещества с молекулярной массой более 15 кДа; перемешивают с сухим хлористым натрием (0,5 М) при скорости перемешивания 100 кач/мин в течение 20 мин; центрифугируют при 10000 об/мин в течение 15 мин. Далее к осадку добавляют воду в объеме 0,1% от начального объема культуральной жидкости, суспендируют; промывают изопропиловым спиртом, взятом в объеме 0,1% от начального объема культуральной жидкости в течение 30 мин при температуре 0°С.
Полученную массу центрифугируют, выпаривают изопропанол на роторном испарителе при температуре 60°С. Далее выдерживают раствор с водой и активированным углем (0,5% w/v) в течение 15 мин, центрифугируют при 10000 об/мин в течение 15 мин; фильтруют через мембрану, отсекающую молекулы с молекулярной массой более 10 кДа. Проводят лиофилизацию полученной пептидной фракции при следующих параметрах: температура сушки 30°С, продолжительность сушки 6 ч, толщина слоя сушки 2 мм. Готовый продукт упаковывают и хранят при температуре -18°С в течение 12 месяцев.
Результаты определения антимикробной активности, физико-химических и биологических свойств полученной фракции представлены в таблицах 1-2.
Figure 00000001
Из таблицы 1 следует, что метаболиты фракции обладают антимикробными свойствами. Данные таблицы 1 также свидетельствуют о том, что фракция активна только в отношении грамположительных бактерий.
Figure 00000002
Исходя из данных таблицы 2, выделенная фракция представляет собой пептид, состоящий из 33 аминокислот, имеющий молекулярную массу 3353 Да, хорошо растворимый в воде и мало растворимый в этаноле и эфире, проявляющий антимикробное действие только по отношению к грамположительным бактериям. Данная совокупность свойств свидетельствует о принадлежности выделенной фракции к низину.
Таким образом, использование штаммов (Bacillus safensis ВКПМ В-12180, Bacillus licheniformis ВКПМ В-12224, Bacillus pumilus ВКПМ В-12182, Bacillus endophyticus ВКПМ В-12181), выделенных с поверхности овощей, позволяет получать бактериоцины, в частности низин, с высокой продуктивностью и с широким спектром антимикробного действия.

Claims (5)

1. Штамм Bacillus safensis В-12180, депонированный в ВКПМ ФГУП ГосНИИгенетика, - продуцент бактериоцина против бактериальных патогенов.
2. Штамм Bacillus licheniformis В-12224, депонированный в ВКПМ ФГУП ГосНИИгенетика, - продуцент бактериоцина против бактериальных патогенов.
3. Штамм Bacillus pumilus В-12182, депонированный в ВКПМ ФГУП ГосНИИгенетика, - продуцент бактериоцина против бактериальных патогенов.
4. Штамм Bacillus endophyticus В-12181, депонированный в ВКПМ ФГУП ГосНИИгенетика, - продуцент бактериоцина против бактериальных патогенов.
5. Способ получения бактериоцина низина, включающий культивирование штаммов-продуцентов бактериоцина на питательной среде с последующим отделением биомассы и ее концентрированием, центрифугированием и очисткой на мембране, отличающийся тем, что в качестве штаммов-продуцентов бактериоцина используют штаммы Bacillus safensis В-12180, Bacillus licheniformis В-12224, Bacillus pumilus В-12182, Bacillus endophyticus В-12181, выделенные с поверхности овощей.
RU2017141442A 2017-11-28 2017-11-28 Штаммы bacillus safensis вкпм в-12180, bacillus licheniformis вкпм в-1224, bacillus pumilus вкпм в-12182, bacillus endophyticus вкпм в-12181 - продуценты бактериоцинов против бактериальных патогенов, способ получения низина RU2694590C2 (ru)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2017141442A RU2694590C2 (ru) 2017-11-28 2017-11-28 Штаммы bacillus safensis вкпм в-12180, bacillus licheniformis вкпм в-1224, bacillus pumilus вкпм в-12182, bacillus endophyticus вкпм в-12181 - продуценты бактериоцинов против бактериальных патогенов, способ получения низина

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2017141442A RU2694590C2 (ru) 2017-11-28 2017-11-28 Штаммы bacillus safensis вкпм в-12180, bacillus licheniformis вкпм в-1224, bacillus pumilus вкпм в-12182, bacillus endophyticus вкпм в-12181 - продуценты бактериоцинов против бактериальных патогенов, способ получения низина

Publications (3)

Publication Number Publication Date
RU2017141442A RU2017141442A (ru) 2019-05-28
RU2017141442A3 RU2017141442A3 (ru) 2019-05-28
RU2694590C2 true RU2694590C2 (ru) 2019-07-16

Family

ID=66792954

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RU2017141442A RU2694590C2 (ru) 2017-11-28 2017-11-28 Штаммы bacillus safensis вкпм в-12180, bacillus licheniformis вкпм в-1224, bacillus pumilus вкпм в-12182, bacillus endophyticus вкпм в-12181 - продуценты бактериоцинов против бактериальных патогенов, способ получения низина

Country Status (1)

Country Link
RU (1) RU2694590C2 (ru)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2773131C2 (ru) * 2020-03-03 2022-05-30 федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Кемеровский государственный университет" (КемГУ) Способ получения бактериоцинсодержащей композиции

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN116904359B (zh) * 2023-07-13 2024-08-09 江苏香地化学有限公司 一株内生芽孢杆菌及其在降解工业废水cod的应用

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2061042C1 (ru) * 1994-07-08 1996-05-27 Государственный научно-исследовательский институт биосинтеза белковых веществ Штамм streptococcus lactis - продуцент бактериоцина низина
RU2151796C1 (ru) * 1999-02-08 2000-06-27 Государственное унитарное предприятие "Государственный научно-исследовательский институт биосинтеза белковых веществ" Штамм lactococcus lactis-продуцент бактериоцина низина
RU2492231C2 (ru) * 2011-07-28 2013-09-10 Федеральное бюджетное учреждение науки Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии (ФБУН ГНЦ ПМБ) Способ выделения бактериоцинов
RU2585521C1 (ru) * 2015-03-10 2016-05-27 Маргарита Анатольевна Иванова Способ и технологическая линия производства низина

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2061042C1 (ru) * 1994-07-08 1996-05-27 Государственный научно-исследовательский институт биосинтеза белковых веществ Штамм streptococcus lactis - продуцент бактериоцина низина
RU2151796C1 (ru) * 1999-02-08 2000-06-27 Государственное унитарное предприятие "Государственный научно-исследовательский институт биосинтеза белковых веществ" Штамм lactococcus lactis-продуцент бактериоцина низина
RU2492231C2 (ru) * 2011-07-28 2013-09-10 Федеральное бюджетное учреждение науки Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии (ФБУН ГНЦ ПМБ) Способ выделения бактериоцинов
RU2585521C1 (ru) * 2015-03-10 2016-05-27 Маргарита Анатольевна Иванова Способ и технологическая линия производства низина

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ЗИМИНА М.И. "Исследование и разработка технологии получения биоконсерванта для увеличения сроков хранения плодов и овощей". Автореф. дисс. на соискание ученой степени к.т.н., 2016, Кемерово, с.4-15. *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2773131C2 (ru) * 2020-03-03 2022-05-30 федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Кемеровский государственный университет" (КемГУ) Способ получения бактериоцинсодержащей композиции

Also Published As

Publication number Publication date
RU2017141442A (ru) 2019-05-28
RU2017141442A3 (ru) 2019-05-28

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Ogunbanwo et al. Influence of cultural conditions on the production of bacteriocin by Lactobacillus brevis OG1
Abo-Amer Characterization of a bacteriocin-like inhibitory substance produced by Lactobacillus plantarum isolated from Egyptian home-made yogurt
JP6193439B2 (ja) ラクトバチルス属乳酸菌の増殖促進剤及び／又は生残性向上剤
KR102176920B1 (ko) 내염성 감마-글루타밀 트랜스펩티데이즈를 생산하는 신규한 호염성 바실러스 폴리퍼멘티쿠스 균주
Iosca et al. Valorization of wheat bread waste and cheese whey through cultivation of lactic acid bacteria for bio-preservation of bakery products
RU2694590C2 (ru) Штаммы bacillus safensis вкпм в-12180, bacillus licheniformis вкпм в-1224, bacillus pumilus вкпм в-12182, bacillus endophyticus вкпм в-12181 - продуценты бактериоцинов против бактериальных патогенов, способ получения низина
CN109055245A (zh) 一种海洋源锁掷孢酵母及其防控草莓病害的应用
JP2006518208A (ja) 乳酸菌によるグルコシノレートの酵素分解の制御
KR101665888B1 (ko) 동결보호제로서 찹쌀풀을 이용하는 생존율이 증진된 식품 발효용 미생물 첨가제 조성물 및 이의 제조방법
JP6853624B2 (ja) 新規な植物性乳酸菌
KR20150012445A (ko) 마늘 파쇄물 및 유산균이 포집되어 있는 알지네이트 비드를 포함하는, 생존율이 증진된 식품 발효용 미생물 첨가제 조성물 및 이의 제조방법
JPH02117389A (ja) 抗真菌性製品の生産法と真菌の生育阻害法
KR20230125446A (ko) 항진균 활성을 나타내는 신규 바실러스 벨레젠시스 균주 및 이를 유효성분으로 포함하는 과채류 저장성 증진용 식품 보존제
KR20240011581A (ko) 프로바이오틱 균주인 락토바실러스 류테리 sy308 균주 및 이를 포함하는 사료 첨가제
Kitaevskaya et al. Assessment of lactic acid bacteria new consortia proteolytic activity
Ajam et al. The effect of some fermentation conditions on the production of kefiran by kefir grains in fermented milk
KR100273742B1 (ko) 천연 항균물질을 생산하는 락토코커스 락티스 미생물(kfcc 11047)
JP6166105B2 (ja) 漬物の製造に適した乳酸菌、それを用いた漬物の素及び発酵漬物
AU2003246213A1 (en) Milk-coagulating enzyme originating in bacterium and process for producing cheese using the same
KR20150012449A (ko) 동결보호제로서 콩가루를 이용하는 생존율이 증진된 식품 발효용 미생물 첨가제 조성물 및 이의 제조방법
RU2780155C1 (ru) Штамм бактерий lactococcus lactis subsp. cremoris 36 rcam 05396, используемый при производстве кисломолочных диетических продуктов
Srilatha et al. Probiotics: A new approach for post harvest disease management and quality retension in grapes
JP2555255B2 (ja) 氷核形成菌、氷核形成菌の培養方法、氷核形成菌を含む氷核形成物質および該氷核形成物質の使用
JPH04370093A (ja) 血栓溶解性物質の製造方法
KR100464825B1 (ko) 바실러스 스테아로서머필러스 ｄｌ-3 균주, 이를 포함하는 미생물제제 및 이의 생산방법