JP6853624B2 - 新規な植物性乳酸菌 - Google Patents
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Description
本発明は、植物性乳酸菌に関する。より詳しくは、夕張メロンから単離した新規な植物性乳酸菌であるラクトバチルス プランタラム（lactobacillus plantarum）ＨＯＫＵ−１株（受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−０１７７９）に関する。また、当該乳酸菌または培養物を含む飲食品、ヨーグルト及び当該乳酸菌または培養物を有効成分とする抗菌剤に関する。
乳酸菌と乳酸菌発酵食品との関係は、ヨーグルトや漬物に見られるように、乳酸菌の生産する乳酸によってｐＨが低下して雑菌の繁殖を防止し、食品に独特の風味を付与するとともに食品の保存性を高めることが知られている。
しかし、乳酸菌発酵食品を長期間にわたり保存すると、乳酸菌によって産生される乳酸によって、風味や組織の劣化が生じ、食品の価値が減ずるという問題点もある。また、乳酸菌は乳酸のほかにペプチド系の抗生物質を生産して抗菌性を発揮するものもある。
このように、乳酸菌を利用して食品の長期保存安定性を追及する場合、ｐＨの低下は雑菌の繁殖防止には有効であるが、風味や組織の劣化を招き、食品の品質低下をもたらす。
また、抗生物質を食品として常時摂取することは推奨されることではない。
ところで、植物性乳酸菌の代表的な菌株としてラクトバチルス・プランタラムＨＯＫＫＡＩＤＯ株等が知られている（特許文献１）。本文献によれば、当該乳酸菌株は漬物から分離され、豆乳などに高い発酵能を有し、官能的に優れた乳酸発酵豆乳を製造できる乳酸菌であることが記載されている。
しかし、後述する本願実施例中の比較試験に示すように、本ＨＯＫＫＡＩＤＯ株によって製造した豆乳ヨーグルトも長期間保存した場合には、ｐＨの低下が起こり、食品としての安定的な保存には向かないことがわかった。
しかし、乳酸菌発酵食品を長期間にわたり保存すると、乳酸菌によって産生される乳酸によって、風味や組織の劣化が生じ、食品の価値が減ずるという問題点もある。また、乳酸菌は乳酸のほかにペプチド系の抗生物質を生産して抗菌性を発揮するものもある。
このように、乳酸菌を利用して食品の長期保存安定性を追及する場合、ｐＨの低下は雑菌の繁殖防止には有効であるが、風味や組織の劣化を招き、食品の品質低下をもたらす。
また、抗生物質を食品として常時摂取することは推奨されることではない。
ところで、植物性乳酸菌の代表的な菌株としてラクトバチルス・プランタラムＨＯＫＫＡＩＤＯ株等が知られている（特許文献１）。本文献によれば、当該乳酸菌株は漬物から分離され、豆乳などに高い発酵能を有し、官能的に優れた乳酸発酵豆乳を製造できる乳酸菌であることが記載されている。
しかし、後述する本願実施例中の比較試験に示すように、本ＨＯＫＫＡＩＤＯ株によって製造した豆乳ヨーグルトも長期間保存した場合には、ｐＨの低下が起こり、食品としての安定的な保存には向かないことがわかった。
このように、従来知られている植物性乳酸菌は、もっぱら漬物などを分離源とすることもあり、当該菌を用いた発酵食品は保存により、序々にｐＨが低下し、酸味も強くなり、食品としての風味や組織の劣化が生じ、長期間の保存に適するようなものは存在しなかった。
本発明は、上記問題点を解決するためのもので、乳酸菌を利用した食品を長期間保存した場合であっても、ｐＨの低下が非常に穏やかで、風味や組織の劣化が起こらず、かつ、雑菌の繁殖が見られないような植物性乳酸菌の探索を課題とする。
本発明は、上記問題点を解決するためのもので、乳酸菌を利用した食品を長期間保存した場合であっても、ｐＨの低下が非常に穏やかで、風味や組織の劣化が起こらず、かつ、雑菌の繁殖が見られないような植物性乳酸菌の探索を課題とする。
本発明者らは、植物性乳酸菌の分離源として夕張メロンを選択し、乳酸菌の分離を試み、分離した各種乳酸菌でヨーグルトを試作し、ｐＨ、離水、風味を観察し、もっとも優れた乳酸菌をスクリーニングした。本乳酸菌により１年以上経過しても風味が維持され離水も生成していないヨーグルトを得ることができた。このヨーグルトに利用した植物性乳酸菌は、新規なラクトバチルス・プランタラム（lactobacillus plantarum）であることがわかり、ＨＯＫＵ−１株と命名し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は以下の構成を有する。
（１）ラクトバチルス プランタラム（lactobacillus plantarum）ＨＯＫＵ−１株（受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−０１７７９）。
（２）ラクトバチルス プランタラム（lactobacillus plantarum）ＨＯＫＵ−１株（受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−０１７７９）の菌体または培養物を含む飲食品。
（３）ラクトバチルス プランタラム（lactobacillus plantarum）ＨＯＫＵ−１株（受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−０１７７９）の菌体または培養物を含むヨーグルト。
（４）ラクトバチルス プランタラム（lactobacillus plantarum）ＨＯＫＵ−１株（受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−０１７７９）の菌体または培養物を有効成分とする抗菌剤。
（５）医薬品である（４）に記載の抗菌剤。
（６）ラクトバチルス プランタラム（lactobacillus plantarum）ＨＯＫＵ−１株（受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−０１７７９）の菌体または培養物を有効成分とする飲食品用保存料。
（７）原料にラクトバチルス プランタラム（lactobacillus plantarum）ＨＯＫＵ−１株（受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−０１７７９）を添加して発酵する工程を含む発酵食品の製造方法。
（８）一般式（Ｉ）に示される化合物を有効成分とする抗菌剤。
（９）医薬品である（８）に記載の抗菌剤。
（１０）一般式（Ｉ）に示される化合物を有効成分とする飲食品用保存料。
すなわち、本発明は以下の構成を有する。
（１）ラクトバチルス プランタラム（lactobacillus plantarum）ＨＯＫＵ−１株（受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−０１７７９）。
（２）ラクトバチルス プランタラム（lactobacillus plantarum）ＨＯＫＵ−１株（受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−０１７７９）の菌体または培養物を含む飲食品。
（３）ラクトバチルス プランタラム（lactobacillus plantarum）ＨＯＫＵ−１株（受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−０１７７９）の菌体または培養物を含むヨーグルト。
（４）ラクトバチルス プランタラム（lactobacillus plantarum）ＨＯＫＵ−１株（受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−０１７７９）の菌体または培養物を有効成分とする抗菌剤。
（５）医薬品である（４）に記載の抗菌剤。
（６）ラクトバチルス プランタラム（lactobacillus plantarum）ＨＯＫＵ−１株（受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−０１７７９）の菌体または培養物を有効成分とする飲食品用保存料。
（７）原料にラクトバチルス プランタラム（lactobacillus plantarum）ＨＯＫＵ−１株（受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−０１７７９）を添加して発酵する工程を含む発酵食品の製造方法。
（８）一般式（Ｉ）に示される化合物を有効成分とする抗菌剤。
（１０）一般式（Ｉ）に示される化合物を有効成分とする飲食品用保存料。
本発明の夕張メロンから分離した新規な植物性乳酸ラクトバチルス・プランタラムＨＯＫＵ−１株によれば、長期間にわたって酸の生成が少なく風味が良く、雑菌の繁殖も少ない発酵飲食品を提供することができる。
また、本ＨＯＫＵ−１株の菌体及び培養物には、抗菌作用があることから、これらを飲食品に添加することで、食品の長期保存安定性を実現することができる。
また、さらに本発明の一般式（Ｉ）の化合物にも抗菌作用があることから、同様に飲食品に添加することで、食品の長期保存安定性を実現することができる。
また、本ＨＯＫＵ−１株の菌体及び培養物には、抗菌作用があることから、これらを飲食品に添加することで、食品の長期保存安定性を実現することができる。
また、さらに本発明の一般式（Ｉ）の化合物にも抗菌作用があることから、同様に飲食品に添加することで、食品の長期保存安定性を実現することができる。
本発明のラクトバチルス・プランタラム（lactobacillus plantarum）ＨＯＫＵ−１株は、完熟した夕張メロンより単離され、独立行政法人製品評価技術基盤機構・特許微生物寄託センターに、２０１３年１２月５日付けで寄託されており、受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−０１７７９を付与された。本菌株の菌学的特性は後述する実施例に記載されたとおりである。
本菌株の培養は、ラクトバチルス・プランタラムの培養に通常用いられる培地であればよく、ＭＲＳ培地などが挙げられる。培養条件は、３７℃付近、数時間〜数日が挙げられる。
本菌株の培養は、ラクトバチルス・プランタラムの培養に通常用いられる培地であればよく、ＭＲＳ培地などが挙げられる。培養条件は、３７℃付近、数時間〜数日が挙げられる。
本発明のラクトバチルス・プランタラムＨＯＫＵ−１株は、菌体自体または菌体培養液を各種の飲食品に添加することにより、食品の保存安定性を高めることができる。飲食品としては、パン類、パスタ類、食用粉類、ごはん類、寿司、惣菜、ふりかけ、スープのもと、たれ、調味料、香辛料、茶、菓子、飲料等が挙げられる。
また、豆乳、牛乳、ヨーグルト中間製品などの発酵対象となる食品に添加し、発酵させることにより、菌体または培養液を添加することもできる。
また、豆乳、牛乳、ヨーグルト中間製品などの発酵対象となる食品に添加し、発酵させることにより、菌体または培養液を添加することもできる。
本発明における抗菌剤の有効成分としては、ラクトバチルス・プランタラムHOKU-1株菌体または菌体培養物を使用することができる。菌体は、乳酸菌生菌体調製に用いられる定法によって得ることができ、発酵物、凍結物、凍結乾燥物などの形態が例示される。
培養物としては、当該菌株を培養したもの利用することができ、培養物から生菌体を除去したものであってもよい。また、菌体除去培養液を濃縮したもの、乾燥したもの、あるいは抗菌活性の強い画分を分画したものも利用できる。
培養物としては、当該菌株を培養したもの利用することができ、培養物から生菌体を除去したものであってもよい。また、菌体除去培養液を濃縮したもの、乾燥したもの、あるいは抗菌活性の強い画分を分画したものも利用できる。
また、本発明における抗菌剤の有効成分としては、式（Ｉ）に示す化合物を使用することができる。本化合物は、ラクトバチルス・プランタラムＨＯＫＵ−１株の菌体培養物より分離精製することにより単離されたものであるが、他の植物を由来とするものでも、化学合成により製造されたものであってもよい。また、本化合物を多く含む物質として、ラクトバチルス・プランタラムＨＯＫＵ−１株の菌体培養物を濃縮、抽出、分画して、本化合物を多く含む画分を利用することもできる。
上記抗菌剤は、サプリメント、特定健康保健用食品、機能表示食品、健康食品のほか医薬品としても利用できる。
本発明の抗菌剤の有効成分は、例えば通常の飲食品や飼料に添加することができる。また、直接経口摂取することもできる。経口摂取する場合の形態としては飲食品以外に、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、シロッブ剤などをあげることができる。
本発明の抗菌剤の有効成分は、例えば通常の飲食品や飼料に添加することができる。また、直接経口摂取することもできる。経口摂取する場合の形態としては飲食品以外に、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、シロッブ剤などをあげることができる。
本発明の抗菌剤の食品への添加量は特に制限はないが、添加する飲食品や飼料の風味を損なわない範囲で、保存期間に応じて選択することができる。
本発明を以下、実施例をもとに説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
本発明を以下、実施例をもとに説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
〔試験例１〕本発明菌株の分離・同定・特性
１．夕張メロンからの植物乳酸菌の分離
分離源として北海道産の夕張産メロン（完熟）を用いた。メロンをストマッカ―で粉砕後生理食塩水に懸濁、ＢＣＰ加プレート寒天培地に塗抹して30℃、2〜4日間恒温器に入れて培養した。菌が酸を生成するとＢＣＰ培地は黄色に変色することから、この培地の性質を利用して乳酸菌候補菌株の選抜と純化を繰り返した。コロニーの単一性を確認できるまで純化を繰り返し行い、単一に純化された乳酸菌株を取得した。純化の終了した菌株はBCP加プレート寒天培地（斜面）に接種、斜面生育を確認（斜面の黄色化を確認）後、４℃の冷蔵庫に保存した。
１．夕張メロンからの植物乳酸菌の分離
分離源として北海道産の夕張産メロン（完熟）を用いた。メロンをストマッカ―で粉砕後生理食塩水に懸濁、ＢＣＰ加プレート寒天培地に塗抹して30℃、2〜4日間恒温器に入れて培養した。菌が酸を生成するとＢＣＰ培地は黄色に変色することから、この培地の性質を利用して乳酸菌候補菌株の選抜と純化を繰り返した。コロニーの単一性を確認できるまで純化を繰り返し行い、単一に純化された乳酸菌株を取得した。純化の終了した菌株はBCP加プレート寒天培地（斜面）に接種、斜面生育を確認（斜面の黄色化を確認）後、４℃の冷蔵庫に保存した。
２．乳酸菌候補菌株の牛乳・豆乳の凝固試験
夕張メロンから分離した上記植物乳酸菌候補菌株について、牛乳と豆乳に対する凝固能を検討した。保存培地から植物乳酸菌候補菌株を直接牛乳および豆乳に接種し、牛乳および豆乳に対する凝固能、酸度測定、食味試験を行った。
３０℃でインキュベート後、２４時間、４８時間、７２時間後の牛乳および豆乳の凝固状態の観察、酸度測定、官能テストを行なった。もっとも風味の優れた株を選抜し、下記同定を行った。
夕張メロンから分離した上記植物乳酸菌候補菌株について、牛乳と豆乳に対する凝固能を検討した。保存培地から植物乳酸菌候補菌株を直接牛乳および豆乳に接種し、牛乳および豆乳に対する凝固能、酸度測定、食味試験を行った。
３０℃でインキュベート後、２４時間、４８時間、７２時間後の牛乳および豆乳の凝固状態の観察、酸度測定、官能テストを行なった。もっとも風味の優れた株を選抜し、下記同定を行った。
３．菌株の同定
上記で選抜された株は、顕微鏡観察では桿菌、大きさは約１μｍであった。また、細胞はグラム陽性、カタラーゼは陰性、生育温度は２０〜４５℃（３０〜４０℃が至適）、糖の資化性はブドウ糖を資化して乳酸などを生成するという性質を有する。
ＤＮＡ分析による菌株の分析では、ラクトバチルス・プランタラムと９９％という高い相同性を示したことから、ラクトバチルス・プランタラムに属する植物乳酸菌と同定し、ＨＯＫＵ−１株と命名した。
ＨＯＫＵ−１株は、豆乳を２４時間で完全に凝固するが牛乳に対する凝固力は非常に弱く、また酸生産能力はあまり高くないという特性を有する。特に、豆乳に対する凝固能と風味の優れたカードを生成する。また、他の植物乳酸菌と比べ、ヨーグルトカードの安定性、酸生成能と風味及び長期保存性に優れている点で大きく異なっていることから新菌株であると判断し、独立行政法人製品評価技術基盤機構、特許微生物寄託センターに寄託し、受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−０１７７９を付与された。
上記で選抜された株は、顕微鏡観察では桿菌、大きさは約１μｍであった。また、細胞はグラム陽性、カタラーゼは陰性、生育温度は２０〜４５℃（３０〜４０℃が至適）、糖の資化性はブドウ糖を資化して乳酸などを生成するという性質を有する。
ＤＮＡ分析による菌株の分析では、ラクトバチルス・プランタラムと９９％という高い相同性を示したことから、ラクトバチルス・プランタラムに属する植物乳酸菌と同定し、ＨＯＫＵ−１株と命名した。
ＨＯＫＵ−１株は、豆乳を２４時間で完全に凝固するが牛乳に対する凝固力は非常に弱く、また酸生産能力はあまり高くないという特性を有する。特に、豆乳に対する凝固能と風味の優れたカードを生成する。また、他の植物乳酸菌と比べ、ヨーグルトカードの安定性、酸生成能と風味及び長期保存性に優れている点で大きく異なっていることから新菌株であると判断し、独立行政法人製品評価技術基盤機構、特許微生物寄託センターに寄託し、受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−０１７７９を付与された。
４．ＨＯＫＵ−１株の特性
ＨＯＫＵ−１株について人口消化液耐性試験を行った。
（１）人工胃液耐性試験
ＭＲＳ培地で２４時間培養したＨＯＫＵ−１株培養液に４％ペプシンを加え、塩酸でＰＨを３．０に調整し３７℃で３時間インキュベート後その生存率を測定した。
その結果、８０％以上の高い生存率を確認した。
（２）人工腸液耐性試験
人工胃液処理（ＰＨ３．０で４時間）したＨＯＫＵ−１株懸濁液にパンクレアチン（１％）と胆汁末（０．３％）を加えて３７℃で２４時間インキュベートした。その結果、人工腸液による生育阻害は受けなかった。
（３）上記試験結果より、ＨＯＫＵ−１株はヒトが摂取すると生菌のまま大半は腸内に達し生存し、腸内環境の改善に効果があると考えられる。
ＨＯＫＵ−１株について人口消化液耐性試験を行った。
（１）人工胃液耐性試験
ＭＲＳ培地で２４時間培養したＨＯＫＵ−１株培養液に４％ペプシンを加え、塩酸でＰＨを３．０に調整し３７℃で３時間インキュベート後その生存率を測定した。
その結果、８０％以上の高い生存率を確認した。
（２）人工腸液耐性試験
人工胃液処理（ＰＨ３．０で４時間）したＨＯＫＵ−１株懸濁液にパンクレアチン（１％）と胆汁末（０．３％）を加えて３７℃で２４時間インキュベートした。その結果、人工腸液による生育阻害は受けなかった。
（３）上記試験結果より、ＨＯＫＵ−１株はヒトが摂取すると生菌のまま大半は腸内に達し生存し、腸内環境の改善に効果があると考えられる。
〔実施例１〕ＨＯＫＵ−１株による豆乳ヨーグルトの製造
市販無調整豆乳を用いて豆乳ヨーグルトを調製した。ＨＯＫＵ−１株を接種後発酵は１４日間行った。発酵過程での培養物の生菌数、ＰＨ、乳酸生成量、風味について評価した。
なお、比較例として、北海道食品加工研究センターが分離、実用化を図っている植物乳酸菌ＨＯＫＫＡＩＤＯ株（ＦＥＲＭ Ｐ−１９６４５）についても同様に試験を行った。
市販無調整豆乳を用いて豆乳ヨーグルトを調製した。ＨＯＫＵ−１株を接種後発酵は１４日間行った。発酵過程での培養物の生菌数、ＰＨ、乳酸生成量、風味について評価した。
なお、比較例として、北海道食品加工研究センターが分離、実用化を図っている植物乳酸菌ＨＯＫＫＡＩＤＯ株（ＦＥＲＭ Ｐ−１９６４５）についても同様に試験を行った。
１．生菌数
各菌株を豆乳に接種後２４時間以内に凝固しゲル状になった。また、２４時間以内に急速な乳酸菌の増殖が見られた。培養２週間の各培養物の菌数を表１に示す。
徐々に菌数の減少は見られたが、一定数の菌数が保持され。ＨＯＫＫＡＩＤＯ株と比較して菌の増殖については大差がなかった。
各菌株を豆乳に接種後２４時間以内に凝固しゲル状になった。また、２４時間以内に急速な乳酸菌の増殖が見られた。培養２週間の各培養物の菌数を表１に示す。
徐々に菌数の減少は見られたが、一定数の菌数が保持され。ＨＯＫＫＡＩＤＯ株と比較して菌の増殖については大差がなかった。
２．ＰＨの変化
各菌株接種後培養2週間の各培養物のｐＨを表２に、培養１４日目の官能評価を表３に示す。
ＨＯＫＵ−１株は、接種２４時間後から徐々にｐＨが下がり始めて、７日後はｐＨ４．１４、１４日後は４．１４であり、その後、表には記載していないが、３ヵ月後、６ヶ月経過後してもｐＨ４．１とほとんど変動しなかった。また、酸味も非常にマイルドで３ケ月後、６ケ月後でも食味に変化は見られなかった。
一方、ＨＯＫＫＡＩＤＯ株は、接種後１４日でｐＨ３．８９に低下し、強い酸味が感じられた。
これまで報告されている植物乳酸菌の分離源としては漬物由来が多く、豆乳などに接種した場合３、４日で強い酸味が感じられるようになるものが多い。本発明のＨＯＫＵ−１株は、これらの報告されているような植物性乳酸菌とは異なる特有の性質を有していることがわかった。
各菌株接種後培養2週間の各培養物のｐＨを表２に、培養１４日目の官能評価を表３に示す。
ＨＯＫＵ−１株は、接種２４時間後から徐々にｐＨが下がり始めて、７日後はｐＨ４．１４、１４日後は４．１４であり、その後、表には記載していないが、３ヵ月後、６ヶ月経過後してもｐＨ４．１とほとんど変動しなかった。また、酸味も非常にマイルドで３ケ月後、６ケ月後でも食味に変化は見られなかった。
一方、ＨＯＫＫＡＩＤＯ株は、接種後１４日でｐＨ３．８９に低下し、強い酸味が感じられた。
これまで報告されている植物乳酸菌の分離源としては漬物由来が多く、豆乳などに接種した場合３、４日で強い酸味が感じられるようになるものが多い。本発明のＨＯＫＵ−１株は、これらの報告されているような植物性乳酸菌とは異なる特有の性質を有していることがわかった。
３．酸の生成
本発明のＨＯＫＵ−１株を使用して製造した豆乳ヨーグルトは、一般の豆乳ヨーグルトに比較してコハク酸、乳酸とリン酸の生成が少ない事、リンゴ酸を生成する事を特徴とする。そこで、代表的な有機酸である乳酸の生成量について測定した。
（１）試験方法
有機酸分析システムProminence（島津製作所社製）を使用し、説明書に従って測定した。
（２）試験結果
結果を表４に示す。ＨＯＫＵ−１株の乳酸の生成量は、ＨＯＫＫＡＩＤＯ株の生成量の約２／３であった。
本発明のＨＯＫＵ−１株を使用して製造した豆乳ヨーグルトは、一般の豆乳ヨーグルトに比較してコハク酸、乳酸とリン酸の生成が少ない事、リンゴ酸を生成する事を特徴とする。そこで、代表的な有機酸である乳酸の生成量について測定した。
（１）試験方法
有機酸分析システムProminence（島津製作所社製）を使用し、説明書に従って測定した。
（２）試験結果
結果を表４に示す。ＨＯＫＵ−１株の乳酸の生成量は、ＨＯＫＫＡＩＤＯ株の生成量の約２／３であった。
〔試験例２〕ＨＯＫＵ−１株の抗菌活性
１．毒性試験
ＨＯＫＵ−１株の凍結乾燥菌体について、ラットを用いた急性毒性試験（雌雄とも２０００ｍｇ/ｋｇ以上）、細菌を用いる復帰突然変異試験を行ったところ、いずれも陰性であった。
１．毒性試験
ＨＯＫＵ−１株の凍結乾燥菌体について、ラットを用いた急性毒性試験（雌雄とも２０００ｍｇ/ｋｇ以上）、細菌を用いる復帰突然変異試験を行ったところ、いずれも陰性であった。
２．抗菌活性
（１）Bucillus subtilis を用いた抗菌テスト
ＨＯＫＵ−１株をＭＲＳ液体培地で培養し、培養液を遠心分離（７，０００ｒｐｍ、１５分）し上清と菌体部に分け、上清の酢酸エチル抽出物と菌体のアセトン抽出物について、Bucillus subtilisを用いた抗菌テスト（ペーパーディスク法.バイオ薄層クロマトグラフィー）を行った。
その結果、ＨＯＫＵ−１株の上清及び菌体部の画分いずれにも般の有機酸以外の抗菌物質の存在が示された。特に培養液である上清部分に多く存在が認められた。
（１）Bucillus subtilis を用いた抗菌テスト
ＨＯＫＵ−１株をＭＲＳ液体培地で培養し、培養液を遠心分離（７，０００ｒｐｍ、１５分）し上清と菌体部に分け、上清の酢酸エチル抽出物と菌体のアセトン抽出物について、Bucillus subtilisを用いた抗菌テスト（ペーパーディスク法.バイオ薄層クロマトグラフィー）を行った。
その結果、ＨＯＫＵ−１株の上清及び菌体部の画分いずれにも般の有機酸以外の抗菌物質の存在が示された。特に培養液である上清部分に多く存在が認められた。
（２）バクテリオシン検定菌を用いたテスト
バクテリオシン抗菌活性試験Ｄｉｒｅｃｔ法（善藤ら、九州大) にて検定菌に対して、バクテリオシンよう抗菌活性を示すかどうかを試験した。検定菌には以下の6種類の菌株を使用した。
Lactococcas lactis subsp.lactis
Lactobacillus sake subsp. Sakei
Pediococcus pentosaceus
Listeria innocua
Bacillus coagulans
Kocuria rhizophila
その結果、ＨＯＫＵ−１株は、バクテリオシン検定菌に対して全く抗菌性を示さなかった。このことは、ＨＯＫＵ−１株の産生する抗菌物質はバクテリオシンなどのペプチド系の抗菌物質ではないことを意味する。また、グリセリンからのロイテリン誘導はできなかったことから、これら既知の抗菌物質以外の比較的低分子の化合物と推定した。
バクテリオシン抗菌活性試験Ｄｉｒｅｃｔ法（善藤ら、九州大) にて検定菌に対して、バクテリオシンよう抗菌活性を示すかどうかを試験した。検定菌には以下の6種類の菌株を使用した。
Lactococcas lactis subsp.lactis
Lactobacillus sake subsp. Sakei
Pediococcus pentosaceus
Listeria innocua
Bacillus coagulans
Kocuria rhizophila
その結果、ＨＯＫＵ−１株は、バクテリオシン検定菌に対して全く抗菌性を示さなかった。このことは、ＨＯＫＵ−１株の産生する抗菌物質はバクテリオシンなどのペプチド系の抗菌物質ではないことを意味する。また、グリセリンからのロイテリン誘導はできなかったことから、これら既知の抗菌物質以外の比較的低分子の化合物と推定した。
〔試験例３〕ＨＯＫＵ−１株の産生する抗菌物質の同定
１．抗菌物質の分離・精製
（１）ＨＯＫＵ−１培養液をＴＬＣ−バイオオートグラフィー（Bacillus subtilis,展開溶媒 CH2Cl2:EtOH７：３Ｖ/Ｖ）に供した結果、少なくともRf値０．７，０．６、および０．３の領域に抗菌ゾーンが認められその内Rf値０．７がメインの抗菌物質と推定した。
（２）ＨＯＫＵ−１株をＭＲＳ培地で、３０℃、３〜７日間培養後遠心分離で（７，０００ｒｐｍ、１５分間）上清部と菌体部に分けた。培養液上清部に対して活性炭を加え良く攪拌後吸引濾別し、活性炭通過部と吸着部に分け、活性炭吸着部はエタノール溶出した。抗菌性物質は活性炭吸着部に存在した。
前記エタノール溶出液を濃縮後、活性区分のシリカゲルによる分画クロマトを行った。
バイオオートグラフィーの結果から抗菌性物質の本体の存在をチェックしながらリクロマト、調整用薄層クロマトグラフィーを行って抗菌活性物質の精製に成功した。
１．抗菌物質の分離・精製
（１）ＨＯＫＵ−１培養液をＴＬＣ−バイオオートグラフィー（Bacillus subtilis,展開溶媒 CH2Cl2:EtOH７：３Ｖ/Ｖ）に供した結果、少なくともRf値０．７，０．６、および０．３の領域に抗菌ゾーンが認められその内Rf値０．７がメインの抗菌物質と推定した。
（２）ＨＯＫＵ−１株をＭＲＳ培地で、３０℃、３〜７日間培養後遠心分離で（７，０００ｒｐｍ、１５分間）上清部と菌体部に分けた。培養液上清部に対して活性炭を加え良く攪拌後吸引濾別し、活性炭通過部と吸着部に分け、活性炭吸着部はエタノール溶出した。抗菌性物質は活性炭吸着部に存在した。
前記エタノール溶出液を濃縮後、活性区分のシリカゲルによる分画クロマトを行った。
バイオオートグラフィーの結果から抗菌性物質の本体の存在をチェックしながらリクロマト、調整用薄層クロマトグラフィーを行って抗菌活性物質の精製に成功した。
２．化学構造の同定
上記１．で得られた精製品について、分子量、Ｈ1−ＮＭＲ、Ｃ13−ＣＭＲによる分析を行ったところ、下記結果が得られた。これより本発明の抗菌活性物質は、式（Ｉ）に示す化学構造を有するジラクティックアシッド（Dilactic acid）であることがわかった。
[ M + H ] １６３．０９
Ｈ1−ＮＭＲ δ１．４１ ｄ ３Ｈ Ｊ＝６．６
δ４．１９ ｑ １Ｈ Ｊ＝６．６
Ｃ13−ＣＭＲ δ ２１．０ one methyl
δ ６９．０． one methine
δ１８１．５ quaternary carbon
上記１．で得られた精製品について、分子量、Ｈ1−ＮＭＲ、Ｃ13−ＣＭＲによる分析を行ったところ、下記結果が得られた。これより本発明の抗菌活性物質は、式（Ｉ）に示す化学構造を有するジラクティックアシッド（Dilactic acid）であることがわかった。
[ M + H ] １６３．０９
Ｈ1−ＮＭＲ δ１．４１ ｄ ３Ｈ Ｊ＝６．６
δ４．１９ ｑ １Ｈ Ｊ＝６．６
Ｃ13−ＣＭＲ δ ２１．０ one methyl
δ ６９．０． one methine
δ１８１．５ quaternary carbon
式（Ｉ）の化合物は、下記文献１において報告されているが、本発明の抗菌活性については記載されておらず、当該活性は本発明により初めて明らかにされた特性である。本発明のDilactic acidは食品から得られた安全な化合物であるから、これを飲食品の添加剤、保存料として利用することができる。
文献１：
A new tyrosinase inhibitor from Crinum yemense as potential treatment for hyperpigmentation,O.B. Abdel-Halim,A.M.Marzouk,R.Mothana,N. Awaoh,
Pharmazie 63 (2008) 5
文献１：
A new tyrosinase inhibitor from Crinum yemense as potential treatment for hyperpigmentation,O.B. Abdel-Halim,A.M.Marzouk,R.Mothana,N. Awaoh,
Pharmazie 63 (2008) 5
〔実施例２〕本発明のＨＯＫＵ−１株培養液を添加した食品の保存安定性確認試験
１．製造例
下記組成のうち、ＨＯＫＵ−１株培養液以外の原料を混合してよく攪拌して殺菌した後、ＨＯＫＵ−１株培養液を添加し３５℃で２４時間発酵させて豆乳ヨーグルトを製造した。豆乳ヨーグルトを５℃の冷蔵庫で６か月間保存し、製造後、７日後、１か月後、３か月後、６か月後のヨーグルトの保存状態を観察した。
ＨＯＫＵ−１株培養液は、ＨＯＫＵ−１株をＭＲＳ培地で３０℃で４日間培養後、遠心分離して集めた菌体を生理食塩水で洗浄したものを用いた。
原料；
豆乳 ４０％
牛乳 ３５％
夕張メロン果汁 １０％
砂糖 ７％
メロンエキスなど ５％
ＨＯＫＵ−１培養液 ３％
１．製造例
下記組成のうち、ＨＯＫＵ−１株培養液以外の原料を混合してよく攪拌して殺菌した後、ＨＯＫＵ−１株培養液を添加し３５℃で２４時間発酵させて豆乳ヨーグルトを製造した。豆乳ヨーグルトを５℃の冷蔵庫で６か月間保存し、製造後、７日後、１か月後、３か月後、６か月後のヨーグルトの保存状態を観察した。
ＨＯＫＵ−１株培養液は、ＨＯＫＵ−１株をＭＲＳ培地で３０℃で４日間培養後、遠心分離して集めた菌体を生理食塩水で洗浄したものを用いた。
原料；
豆乳 ４０％
牛乳 ３５％
夕張メロン果汁 １０％
砂糖 ７％
メロンエキスなど ５％
ＨＯＫＵ−１培養液 ３％
２．結果
結果を表４に示す。本発明のＨＯＫＵ−１株により発酵させた豆乳ヨーグルトは、６か月経過してもｐＨの低下が起こらず、離水もなく、食味も変化なく、生産時の性状を保持していた。
結果を表４に示す。本発明のＨＯＫＵ−１株により発酵させた豆乳ヨーグルトは、６か月経過してもｐＨの低下が起こらず、離水もなく、食味も変化なく、生産時の性状を保持していた。
〔実施例３〕本発明の化合物（Ｉ）を添加した生パスタの保存安定性確認試験
１．製造例
試験例３により得られた式（Ｉ）の化合物を配合した本発明生パスタを製造した。原料組成を以下に示す。比較のために、式（Ｉ）の化合物を含まないこと以外は同様の組成で比較例生パスタを製造した。
原料；
デユラムセモリナ粉 ２５０ｇ
強力粉 ２５０ｇ
卵 ５個
オリーブオイル ２５ｍｌ
食塩 ３ｇ
式（Ｉ）の化合物 １０ｍｇ
上記組成の原料をよく攪拌後、生地の圧搾と伸展を繰り返したのち、市販の家庭用パスタマシンで所定の厚さに引き延ばした後カッター（巾４ｍｍ）で切った。湯煎後３０℃の恒温機に入れて７２時間加温し、保存状態を調べた。
１．製造例
試験例３により得られた式（Ｉ）の化合物を配合した本発明生パスタを製造した。原料組成を以下に示す。比較のために、式（Ｉ）の化合物を含まないこと以外は同様の組成で比較例生パスタを製造した。
原料；
デユラムセモリナ粉 ２５０ｇ
強力粉 ２５０ｇ
卵 ５個
オリーブオイル ２５ｍｌ
食塩 ３ｇ
式（Ｉ）の化合物 １０ｍｇ
上記組成の原料をよく攪拌後、生地の圧搾と伸展を繰り返したのち、市販の家庭用パスタマシンで所定の厚さに引き延ばした後カッター（巾４ｍｍ）で切った。湯煎後３０℃の恒温機に入れて７２時間加温し、保存状態を調べた。
２．結果
比較例生パスタには枯草菌などの細菌の生育が見られ、表面にぬめりが見られた。一方、式（Ｉ）の化合物を添加した本発明生パスタは、微生物の生育も見られず食用に耐えた。
比較例生パスタには枯草菌などの細菌の生育が見られ、表面にぬめりが見られた。一方、式（Ｉ）の化合物を添加した本発明生パスタは、微生物の生育も見られず食用に耐えた。
上記以外に、豆腐、パンおよびプリンの製造時にＨＯＫＵ−１株培養液を添加してこれらの食品を製造し、製造後約1か月間冷蔵保存した。また、同様に、本発明（Ｉ）の化合物（dilactic acid）を添加してこれらの食品を製造し、製造後約1か月間冷蔵保存した。その結果、これらの食品は製造時と同様の性状を示し、本発明の食品添加剤の保存安定性効果を確認することができた。
[寄託生物材料への言及]
（１）ＨＯＫＵ−１
イ 当該生物材料を寄託した寄託機関の名称及び住所
独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センター
〒２９２−０８１８ 千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８ １２２号室
ロ イの寄託機関に生物材料を寄託した日付
２０１３年１２月５日
ハ イの寄託機関が寄託について付した受託番号
ＮＩＴＥ Ｐ−０１７７９
（１）ＨＯＫＵ−１
イ 当該生物材料を寄託した寄託機関の名称及び住所
独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センター
〒２９２−０８１８ 千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８ １２２号室
ロ イの寄託機関に生物材料を寄託した日付
２０１３年１２月５日
ハ イの寄託機関が寄託について付した受託番号
ＮＩＴＥ Ｐ−０１７７９
夕張メロンより単離したラクトバチルス・プランタラムＨＯＫＵ−１株の菌体若しくはその培養液ならびに培養液から単離された式（Ｉ）の化合物が抗菌性を有すると共に食品の風味と組織の劣化を防止できることがわかった。したがって、本発明により、長期保存安定性を大幅に改善した飲食品を提供することができ、このことは、従来の食品保存の概念を変えることにつながると考えられる。
Claims (10)
- ラクトバチルス プランタラム（lactobacillus plantarum）ＨＯＫＵ−１株（受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−０１７７９）。
- ラクトバチルス プランタラム（lactobacillus plantarum）ＨＯＫＵ−１株（受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−０１７７９）の菌体または培養物を含む飲食品。
- ラクトバチルス プランタラム（lactobacillus plantarum）ＨＯＫＵ−１株（受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−０１７７９）の菌体または培養物を含むヨーグルト。
- ラクトバチルス プランタラム（lactobacillus plantarum）ＨＯＫＵ−１株（受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−０１７７９）の菌体または培養物を有効成分とする抗菌剤。
- 医薬品である請求項４に記載の抗菌剤。
- ラクトバチルス プランタラム（lactobacillus plantarum）ＨＯＫＵ−１株（受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−０１７７９）の菌体または培養物を有効成分とする飲食品用保存料。
- 原料にラクトバチルス プランタラム（lactobacillus plantarum）ＨＯＫＵ−１株（受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−０１７７９）を添加して発酵する工程を含む発酵食品の製造方法。
- 一般式（Ｉ）に示される化合物を有効成分とする抗菌剤。
- 医薬品である請求項８に記載の抗菌剤。
- 一般式（Ｉ）に示される化合物を有効成分とする飲食品用保存料。
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