KR101228552B1 - 마늘 함유 발효 식품소재 및 이의 제조방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 마늘 함유 식품소재 및 이의 제조방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 설탕이 첨가된 두유나 콩가루로 제조된 콩물과 마늘을 포함하는 배지에 마늘에 내성을 갖는 유산균(프로바이오틱스)을 접종하여 마늘의 매운 맛을 제거함으로써 마늘, 유산균 및 콩의 유효성분을 다량 섭취할 수 있는 마늘 함유 발효 식품소재 및 이의 제조방법에 관한 것이다.

Description

마늘 함유 발효 식품소재 및 이의 제조방법{FOOD MATERIAL COMPRISING GARLIC AND MANUFACTURING METHOD THEREOF}

본 발명은 마늘 함유 식품소재 및 이의 제조방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 설탕이 첨가된 두유나 콩가루로 제조된 콩물과 마늘을 포함하는 배지에 마늘에 내성을 갖는 유산균(프로바이오틱스)을 접종하여 마늘의 매운 맛을 제거함으로써 마늘, 유산균 및 콩의 유효성분을 다량 섭취할 수 있는 마늘 함유 발효 식품소재 및 이의 제조방법에 관한 것이다.

마늘은 우리나라 사람들이 가장 많이 섭취하는 대표적 향신 채소의 하나로 단순한 양념뿐만 아니라 다양한 생리적 기능성 성분들이 함유되어 있다. 마늘의 일반성분은 수분 60.4%, 단백질 3%, 지질 0.5%, 당질 34%, 섬유소 0.8%, 무기질 1.3% 이며, 그밖에 미량성분으로 마늘 특유의 냄새와 매운 맛 성분인 알리신, 체내 신진대사를 촉진시키는 스코르디닌(scordinine), 항암 및 혈전의 생성을 예방하는 효과가 있는 아조엔(ajoene) 등이 대표적인 특수성분이다. 마늘의 중요한 생리 활성으로는 항균, 항암, 항바이러스, 항산화, 면역증강, 혈액응고 억제, 간기능 회복, 혈당치 감소 효과, 고지혈증 및 동맥경화증 개선, 뇌기능 향상 등이 알려져 있다. 하지만, 마늘의 유용성에도 불구하고 마늘의 매운 맛 때문에 다량 섭취가 어려운 문제점이 있다.

한편, 프로바이오틱스(probiotics)는 항생물질(antibiotics)에 대비되는 용어로 숙주의 장내 균총의 능력을 개선시킴으로써 숙주의 건강에 유익한 효과를 주는 살아 있는 미생물(젖산균과 다른 박테리아, 또는 건조된 상태 또는 발효제품 내의 효모)이다(Havenaar R 등 1992). 현재 프로바이오틱스로 사용되고 있는 미생물은 Lactobacillus, Bifidobacterium, Lactococcus와 같은 젖산균이 많이 사용되고 있으며, Leuconostoc, Pediococcus, Bacillus, Propionibacterium, 효모 등은 주로 동물에 사용되고 있다(Isolauri E 등 2004).

특히, 프로바이오틱스 젖산균은 정상적인 장관 및 비뇨생식기의 미생물 균총 유지, 유당불내증의 완화, 혈중 콜레스테롤의 감소, 항암작용, 면역 증강작용, 식품의 영양학적 가치의 증진 등의 유익한 효과와 비뇨생식기의 미생물 오염방지, 변비의 완화, 여행자 설사의 예방, 유아 설사의 방지, 항생제 사용에서 유래된 설사의 완화, 혈중 콜레스테롤 상승방지, 장암·방광암의 방지, 간경변의 부작용 방지, 위산과다에의 효과, 골다공증 방지 등의 치료적인 효과를 가진다고 알려져 있다.

한편, 대두는 우리나라에서는 오래전부터 두부, 된장, 콩간장 등 여러 형태의 음식과 영양식으로 사용되어 왔으며, 영양적으로 볼 때 필수이미노산이 고루 함유되어 있는 좋은 단백질원이다. 대두는 양질의 단백질원으로 알려진 우유나 계란과 비교해도 거의 대등한 좋은 단백질원이며, 오히려 열처리 등의 적당한 처리를 함으로써 protease inhibitor나 phytate와 같은 대두에 포함되어 있는 소화방해물질들을 파괴시킬 수 있기 때문에 다른 단백질원에 비해 소화율을 높일 수 있다는 장점이 있다.

또한, 대두에 함유되어 있는 이소플라본(isoflavon)은 유방암이나 전립선암과 같은 호르몬 관련 암에 대해서 강한 항암효과를 가지고 있는 것으로 알려져 있으며, 여성의 갱년기 증상을 완화시켜주는 효과도 있는 것으로 밝혀지고 있다. 대두에 함유되어 있는 레시틴(lecithin)이나 사포닌(saponin) 등은 체내 콜레스테롤 농도를 낮추어 줌으로써 각종 성인병을 예방하는 효과가 있으며, 이밖에도 대두에는 각종 암과 성인병을 예방하여 주는 여러 가지 성분이 함유되어 있는 것으로 밝혀지고 있다. 이러한 대두를 이용한 음료로는 대표적으로 두유와 두유를 발효시킨 두유발효유 등을 들 수 있다.

상기한 바와 같이 마늘, 유산균, 대등 등은 유효성분이 다량함유되어 있어 식품으로서의 유용성이 많음에도 불구하고 이들을 모두 사용한 건강증진 식품에 대한 개발이 거의 이루어지지 않고 있으며, 특히 마늘의 경우 그 매운맛으로 인해 다량 섭취하는데 한계가 있다. 마늘의 매운맛을 제거하기 위하여 열처리 등을 통해 흑마늘을 가공하여 섭취하기도 하지만 이러한 열처리 방법을 사용할 경우 영양소가 일부 파괴될 수도 있는 문제점이 있다.

따라서, 물리적인 방법이 아닌 생물학적 방법을 이용하여 마늘의 유효성분을 다량 함유한 기능성 및 기호성이 우수한 마늘 함유 발효 식품소재를 개발할 필요가 있다.

이에 본 발명자들은 열처리를 하지 않고 생물학적 방법으로 마늘의 매운맛을 제거함으로써 마늘의 유효성분이 다량 함유된 마늘 함유 발효 식품 소재를 개발하게 되었다.

따라서, 본 발명은 프로바이오틱스 유산균을 이용하여 마늘의 매운맛을 제거함으로써 마늘의 유효성분이 다량 함유되고, 나아가 유산균 또한 다량 함유된 기능성 발효 식품 소재 및 그 제조방법을 제공하고자 한다.

또한, 본 발명은 유산균에 의해 마늘이 발효되는 과정에서 유산균의 영양공급원으로 콩이 함유된 배지를 사용함으로써 유산균의 생육안정성을 유지함과 아울러 배지에 함유된 이소플라본이나 항산화활성 물질 등은 유효성분이 다량 함유된 마늘 함유 발효 식품 소재 및 그 제조방법을 제공하고자 한다.

상기 과제를 해결하기 위한 본 발명의 일 실시예인 마늘 함유 발효 식품소재 제조방법은, 설탕과 콩의 함량이 10~30중량%인 배지에 마늘을 첨가한 후, 마늘에 내성을 갖는 유산균을 접종하여 5~7일간 발효시키는 단계를 포함한다.

이때, 배지에 마늘을 첨가하기 전 또는 후에 배지를 50~70℃에서 20~30분간 가열하여 멸균할 수 있다.

상기 마늘 함량은 상기 배지에 대해 5~40중량%이고, 상기 유산균은 상기 배지의 1~10중량% 접종되는 것이 바람직하며, 상기 콩물은 콩 질량의 8~20배의 물을 가하여 팽윤시킨 후 마쇄시킨 것을 사용하거나, 콩가루 함량이 8~22중량% 포함된 것을 사용하며, 설탕의 함량은 상기 배지에 대해 2~10중량%인 것이 바람직하며, 마늘은 껍질을 제거한 미분쇄 톨마늘을 사용하는 것이 바람직하다.

그리고, 상기 유산균은 Lactobacillus acidophilus, Lactococcus lactis subsp. lactis, Lactobacillus plantarum 중 적어도 하나인 것이 바람직하다.

본 발명에 따르면, 발효를 통해 각종 유기산 함량은 증가하면서 마늘의 매운맛이 제거되어 마늘 자체의 유효성분을 다량 섭취할 수 있고, 식물성 에스트로겐인 이소플라본과 항산화활성이 높다고 알려진 콩과 장에 유익한 유산균을 이용하여 기능성과 기호성이 우수한 마늘 함유 발효 식품 소재를 제조할 수 있다.

본 발명의 일실시예에 따른 마늘 함유 식품소재는, 설탕과 콩이 함유된 배지를 준비하는 단계; 껍질을 제거한 마늘을 상기 배지에 첨가하는 단계; 및 마늘이 첨가된 배지에 마늘에 내성을 갖는 프로바이오틱스를 접종하는 단계를 포함하며, 마늘을 배지에 추가하기 전 또는 후에 가열하여 멸균하는 단계를 더 포함할 수 있다.

이하, 각 단계에 대해 보다 상세히 설명한다.

먼저, 설탕과 콩이 함유된 배지를 준비한다.

배지에 함유된 설탕과 콩은 양은 10~30중량%인 것이 바람직하며, 배지는 콩 질량의 8~20배의 물을 가하여 팽윤시킨 후 마쇄시킨 콩물을 사용하거나, 콩가루 함량이 8~20중량% 포함된 것을 사용한다. 그리고, 상기 배지에 함유된 설탕은 2~10중량%인 것이 바람직하다.

일반적으로, 유산균의 생육에는 질소원과 탄소원이 필요한데 배지에 함유된 콩 및 설탕이 이러한 질소원과 탄소원의 역할을 하여 차후 접종된 프로바이오틱스를 생육시키는 영양분이 된다.

이때 배지는 콩을 물에 팽윤시켜 마쇄한 것을 사용할 수도 있으나 대량생산 측면에서는 콩가루를 이용하여 제조하는 것이 바람직하다.

일반적으로 균의 생육주기는 주변의 환경에 적응하는 유도기, 영양성분을 먹고 자라는 대수기, 균체가 최대로 성장하면서 세대별로 사멸 및 세포분열 등을 유지하고 주변 영양분들과 평형을 이루는 정상기, 영양분이 고갈되어 사멸되는 사멸기로 분류된다.

한편, 탄소원과 질소원을 적정량 함유하여야 유도기가 지나치게 길어지는 것을 방지할 수 있다. 일반적인 균주의 배양에 사용되는 한계용량은 탄소원과 질소원이 30% 이상일 시 삼투압 및 적응단계인 유도기가 길어지게 되어 발효에 좋지 않은 영향을 미치게 된다. 따라서, 마늘의 매운맛을 제거할 수 있는 기간 동안 유산균의 생육이 유지되게 하기 위하여 콩과 설탕의 함량이 10~30중량%인 것이 바람직하다.

하지만, 이러한 콩과 설탕의 함량은 유산균의 생육에 따라 조절이 가능하며, 균주 생산을 목적으로 두거나 이를 상업적으로 이용할 시에는 균의 오랜 생육을 위해 처음부터 함량을 높이는 것이 아니라 꾸준하게 3~5% 함량의 배지를 넣어줌으로써, 즉 일정 중량부를 발효물에 첨가함으로써 균을 일정하게 생육시키는 것이 바람직하다.

한편, 콩이 소정량 함유된 배지를 사용하면 프로바이오틱스에 영양원을 제공할 수도 있으며 콩에 함유된 유효성분을 적극 활용할 수 있는 이점 또한 있다. 따라서, 콩이 함유된 배지를 사용함으로써 보다 기능성이 강화된 식품소재를 제조할 수 있다.

다음으로, 껍질을 제거한 미분쇄 마늘 또는 조분쇄한 마늘을 배지에 첨가한다. 첨가되는 마늘의 양은 배지에 대해 5~40중량%인 것이 바람직하며, 더욱 바람직하게는 15~20중량%이다. 차후 접종되는 프로바이오틱스는 간마늘(분쇄한 마늘) 보다는 미분쇄한 톨마늘에서 보다 높은 생육 정도를 나타내는데, 이는 분쇄한 마늘의 경우 표면적이 톨마늘에 비해 넓으므로 프로바이오틱스(유산균)의 생육을 저해하기 때문인 것으로 추정된다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 배지를 제조한 직후 또는 배지에 마늘을 첨가한 후 가열 멸균하는 과정을 더 포함할 수 있다. 가열 멸균 과정은 50~70℃에서 20~30분간 수행하는 것이 바람직하며, 더욱 바람직하게는 60℃에서 30분간 살균할 수 있을 것이다.

마지막으로, 마늘이 첨가된 배지에 프로바이오틱스를 접종하여 소정 기간 동안 발효시킨다. 이때, 접종되는 프로바이오틱스는 배지에 첨가된 마늘에 내성을 갖는 것을 사용하여야 한다.

마늘에 내성을 갖는 프로바이오틱스를 찾기 위하여 마늘 추출물을 함유한 MRS 배지에서 배양한 결과 Lactobacillus salivarius, Enterococcus faecalis, Lactobacillus acidophilus, Lactococcus lactis subsp. lactis, Lactobacillus plantarum 등이 여타 유산균에 비해 생육정도가 높은 것을 확인하였다. 따라서, 이들 유산균 중 적어도 하나를 배지에 접종하는 것이 바람직하다.

상기 유산균은 배지 함량 대비 1~10중량% 접종하는 것이 바람직한데, 접종량을 늘리면 균주의 빠른 생육으로 인해 단시간 내에 마늘의 매운맛을 제거하고 제조 기간을 단축시킬 수 있는 반면, 접종량이 너무 적으면 유도기가 길어져서 발효가 느리게 진행될 수 있다.

한편, 마늘에 내성을 갖는 유산균을 접종하여 발효시키면 마늘의 매운맛을 제거할 수 있는데, 이때 5~7일 동안 발효시키는 것이 바람직하다. 발효기간이 너무 짧을 경우 마늘의 매운맛을 제대로 제거할 수 없으며, 발효기간이 길어질수록 항산화 활성이 증가하기 때문이다. 하지만, 발효기간을 지나치게 길게 하면 유산균이 사멸기에 접어들어 유산균 자체를 함유한 식품 제조가 어려워지는 문제점이 있다.

따라서, 마늘의 매운맛을 제거하면서도 유산균이 사멸하지 않는 기간, 즉 5~7일 동안 발효시키는 것이 바람직하다.

이하, 본 발명의 실험예 및 실시예를 통해 본 발명을 보다 상세히 설명하나, 이러한 실시예나 실험예에 의해 본 발명의 권리범위가 한정되는 것은 아니다.

마늘내성 유산균을 분리하기 위하여 먼저 마늘 첨가량을 달리하여 김치를 제조한 후 김치 속 유산균을 동정하였다. 배추 중량 대비 20% 중량의 마늘이 첨가된 김치에서 유산균을 분리 및 동정을 하였으며, 다양한 유산균주를 찾기 위해 식약청에서 인정한 프로바이오틱스 9개 균주를 이용하여 마늘 추출물이 첨가된 MRS 배지에서 배양하면서 마늘의 항균력에 내성을 가지는 균주를 선발하였다. 선발된 균주를 두유 및 콩분말 발효물에 접종하여 37에서 7일간 배양하면서 발효과정을 살펴보았다.

[실시예 1] 마늘 첨가량을 달리한 김치로부터 유산균 생균수 측정

김치에서 유래한 마늘내성 유산균을 분리하기 위하여 마늘 첨가량을 달리하여 김치를 제조하였다. 하기 표 1은 김치의 재료 및 함량을 나타낸 것이다.

[표 1]

김치 제조에 이용된 고랭지 배추는 4등분하여 7~8%의 소금을 가하여 절인 후 세척하여 최종 배추의 염도가 2.0%가 되도록 조절하여 사용하였다. 마늘, 고춧가루, 생고추, 생강, 양파 및 멸치 액젓은 남해군에서 생산된 것을 산지에서 구입하여 사용하였다. 표 1과 같은 배합비에 따라 절인 배추 무게를 100으로 하였을 때 분쇄 마늘을 5, 10, 15 및 20%씩 첨가한 것을 각각의 실험군으로 하고, 마늘이 첨가되지 않은 것을 대조군으로 하였다.

제조한 각각의 실험군별 김치는 지퍼백에 800 g씩(2쪽 분량)으로 나누어 담아 20℃의 냉장고에서 보관하면서 김치 제조 후 1일에 1차 시료를 취하고 그 이후부터는 7일 간격으로 시료를 취하여 유산균 생균수를 측정하였다.

20℃에서 발효 중인 김치 실험구들을 각각 50 g씩 취한 후 500 mL의 0.1% 펩톤수를 가하여 stomacher (BagMixerR400, Interscience, France)에서 균질화시켰다. 유산균수 측정을 위해 균질화된 시료 1 mL에 0.1% peptone 용액 9 mL을 혼합하여 10배 희석법으로 희석하였다. 시간대별로 회수한 시료를 적절히 희석한 후 각각의 희석액 1 mL를 plate에 접종하고 1% agar가 첨가된 0.04% bromocresol purple(BCP)이 첨가된 MRS broth(Difco, U.S.A.)를 이용한 평판측정법으로 생균수를 측정하였다. 각각의 plate는 37℃ incubator에서 48시간 동안 배양하면서 형성된 colony 수를 계측하고 그 colony에 희석배수를 곱하여 시료 mL당 CFU(Colony Forming Unit)로 나타내었다.

마늘 첨가량을 달리한 김치의 발효기간 동안의 김치속 유산균 생균수를 측정한 결과는 표 2와 같다. 20℃에서 6주간 발효하는 과정에서 유산균 생균수를 측정하였다.

[표 2]

* 상기 표 2에서, 0%, 5%, 10%, 15%, 20%는 김치에 함유된 마늘 함량을 나타낸 것으로, 각각 표 1의 대조군, GK5, GK10, GK15, GK20의 시료코드에 대응된다.

상기 표 2를 통해 알 수 있는 것과 같이, 유산균은 발효기간 및 김치에 함유된 마늘 함량에 따라 그 생육정도가 다르게 나타났다. 마늘의 첨가량이 15%까지 증가할수록 6주간의 발효기간동안 유산균의 생육이 증가하었으나, 20%일 때는 오히려 생육이 저해된 것으로 확인되었다. 즉, 유산균의 생육곡선은 마늘 함량이 15%까지 증가함에 따라 계속 증가하며, 마늘 함량이 20%를 초과하면 감소하는 경향을 나타낸다.

[실시예 2] 김치로부터 분리한 유산균의 동정

유산균은 생육하면서 유산을 생성하여 주위의 pH를 낮춰주게 된다. 배지에 bromocresol purple 같은 지시약을 첨가하면 plate 상에 형성된 단일 colony 주변의 색이 변한 것을 확인함으로써 시료 속 유산균을 계수할 수 있다. 마늘 내성을 가지는 유산균을 분리하기 위하여 6주차에 회수한 시료로부터 생균 유산균수를 측정하고 여러 개의 단일 colony들을 MRS broth에 접종하여 37℃에서 24시간 정치배양한 후 균 동정을 위하여 chromosomal DNA를 회수하였다.

(1) Amplified ribosomal DNA restriction analysis (ARDRA) 방법

ARDRA를 이용하여 유산균주의 유전자종을 1차 선별하였다. MRS agar 평판에 배양된 집락을 증류수로 희석하고 95℃에 5분간 끓여서 PCR의 주형으로 사용하였다. 1.25 U의 Taq polymerase (TaKaRa Shouzo Co., Ltd., Japan), 250 μM의 dNTP, 50 mM의 KCl, 10 mM의 Tris-HCl 및 1.5 mM의 MgCl2로 조성된 PCR 반응액에 0.2 μM의 primer와 5 μL의 주형 DNA를 넣어 최종 50 μL로 만들어 반응을 실시하였다.

PCR 반응은 DNA thermal cycler (TC5000, TECHNE)를 사용하여 94℃에서 5분간 반응시켜 주형 DNA를 변성시키고 다시 95℃에서 45초, 50℃에서 45초, 72℃에서 1분간 32회 반복하고, 72℃에서 10분간 최종적으로 반응시켰다. 사용한 primer의 DNA 염기서열은 5′-AGAGT TTGAT CMTGG CTCAG-3′ (27F), 5′-AGCTA CCTTG TTACG ACTT-3′ (1492R)이다. 반응 후 증폭된 PCR 산물은 1% agarose gel에서 전기영동하여 약 1500 bp의 크기를 확인하고 HhaⅠ및 HaeⅢ의 제한효소를 사용하여 절단하였다. 10 μL의 PCR 산물에 5 U의 제한효소를 첨가하여 최종 20 μL가 되게 한 후 37℃에서 5시간 반응시켜 얻어진 산물을 전기영동하여 나타난 band 양상을 비교하여 1차 선발하였다.

(2) 16S rRNA의 염기서열 분석

유산균의 염기서열 분석을 위하여 ARDRA 방법을 통해 1차 선발된 유산균을 증류수로 희석하고 95℃에 5분간 끓여서 PCR의 주형으로 사용하였다. 1.25 U의 Taq polymerase (TaKaRa Shouzo Co., Ltd., Japan), 250 μM의 dNTP, 50 mM의 KCl, 10 mM의 Tris-HCl 및 1.5 mM의 MgCl2로 조성된 PCR 반응액에 0.2 μM의 primer와 5 μL의 주형 DNA를 넣어 최종 50 μL로 만들어 반응을 실시하였다. PCR 반응은 DNA thermal cycler (TC5000, TECHNE)를 사용하여 94℃에서 5분간 반응시켜 주형 DNA를 변성시키고 다시 95℃에서 45초, 50℃에서 45초, 72℃에서 1분간 32회 반복하고, 72℃에서 10분간 최종적으로 반응시켰다. 사용한 primer의 DNA 염기서열은 5′-AGAGT TTGAT CMTGG CTCAG-3′ (27F), 5′-AGRTA CCTTG TTACG ACTT-3′ (1492R)이다. 반응 후 증폭된 PCR 산물은 1% agarose gel에서 전기영동하여 약 1500 bp의 크기를 확인하여 (주)코스모진텍에 염기서열 분석을 의뢰하였다.

상기와 같이 마늘내성 유산균을 찾기 위하여 마늘이 다량 첨가된 김치의 6주차 시료를 0.04% BCP가 첨가된 MRS agar평판 배지에서 노란색을 나타내는 colony를 무작위로 선별하여 ARDRA 방법을 이용하여 1차 선발하였다. 그리고, 16S rRNA 유전자에 특이적인 primer를 사용하여 PCR을 시행한 결과 모두에서 약 1500 bp 크기의 산물이 증폭되었다. 증폭산물을 HhaⅠ및 HaeⅢ의 제한효소로 처리한 결과 3가지 양상으로 보여졌다.

양상Ⅰ, Ⅱ, Ⅲ을 동정하기 위하여 각각의 colony를 PCR의 주형으로 사용하여 증폭된 산물을 가지고 16S rRNA의 염기서열 분석을 하였다. 각 sequence를 EzTaxon server (http://www.eztaxon.org/)를 통하여 동정 확인한 결과는 표 3과 같다.

[표 3]

양상Ⅰ을 보이는 유산균은 Lactobacillus kunkeei YH-15(T)와 100% 유사성을 나타냈으며, 양상Ⅱ를 보이는 유산균은 Lactobacillus plantarum DSM 10667(T)와 100% 유사성을 나타내었고, 양상Ⅲ을 보이는 유산균은 Fructobacillus pseudoficulneus LC51(T)과 100% 유사하였다. L. plantarum을 제외하고는 산업적으로 크게 활용하지 않는 균주로 동정이 되어 타 균주를 확보하기 위하여 Probiotics로 알려진 균주를 분양받았다.

[ 실시예 3] 분리한 유산균과 프로바이오틱스의 마늘 내성 확인

김치로부터 분리한 유산균과 농촌진흥청 농업유전자원지원센터(KACC)로부터 분양받은 9개의 probiotics를 이용하여 유산균의 마늘내성 실험을 진행하였다. 생마늘을 가정용 믹서기에서 3분간 마쇄였다. 이를 거즈를 이용하여 1차 여과한 후 0.45 μm membrane filter(Sartorius stedim biotech, Germany)를 이용하여 최종 여과하였다. 마늘 마쇄물을 원액으로 하여 각각 MRS broth에 0, 10, 20, 30, 40% 되게 첨가하여 분양받은 9개의 균주를 접종 후 37℃에서 24시간 배양하고 UV/VIS spectrophotometer (Libra S35, biochrom, England)로 600 nm에서 흡광도를 측정하였다. 그 결과는 하기 표 4와 같다.

[표 4]

0, 10, 20, 30, 40% 농도가 되도록 마늘추출물을 MRS broth에 첨가하여 각 균주들을 접종한 후 37℃에서 배양하였으며 대조군으로는 접종하지 않은 배지를 사용하였다.

상기 표 4를 통해 알 수 있는 것과 같이, 24시간 배양한 후 각 시료들의 흡광도를 측정한 결과 마늘 추출물의 농도가 증가할수록 유산균의 생육이 저해되었으며, 10% 마늘추출물 농도에서는 Lactobacillus salivarius, Enterococcus faecalis, Lactobacillus acidophilus, Lactococcus lactis subsp. lactis, Lactobacillus plantarum이 다른 균주에 비해 높은 생육 정도를 나타내었으며, 마늘추출물의 농도가 증가할수록 Lactobacillus acidophilus, Lactococcus lactis subsp. lactis, Lactobacillus plantarum이 다른 균주에 비해 2배 정도 높은 흡광도 값을 나타내었다.

김치에서 분리한 유산균 중 하나인 Lactobacillus plantarum의 마늘 내성이 여타 균주에 비해 우수한 것으로 확인되어 안정성 및 실질적 발효 식품의 적용을 위하여 김치에서 분리한 균주가 아닌 KACC로부터 분양받은 3개의 probiotics를 이용하여 콩과 마늘의 발효 실험을 진행하였다.

[ 실시예 4] 마늘이 첨가된 발효 식품소재 제조

1. Starter

Starter로 사용한 균주는 Lactobacillus acidophilus, Lactococcus lactis subsp. lactis, Lactobacillus plantarum이다. 각 균주를 37℃에서 24시간 MRS broth에서 배양한 후, 10% 탈지분유(서울우유협동조합, 서울)와 3% 흑설탕을 첨가하여 멸균한 용액에 접종하였다. 이를 37℃에서 24시간 배양하여 두유 및 콩분말 용액에 각각 3%(w/w)씩 접종하여 실험을 진행하였다.

2. 마늘이 첨가된 발효 식품 제조

배지는 생콩을 이용하여 제조한 두유와 콩분말을 이용하여 제조한 것으로 나눌 수 있다.

2-1. 두유를 이용한 마늘 첨가 발효 식품 제조

먼저 콩을 이용하여 두유를 제조한다. 실험에 사용한 콩(백태종)은 풍미농산(경남 마산)이 생산한 것을 구매하였으며, 흑설탕은 삼양사(울산)에서 생산한 것을, 마늘은 새남해농협(경남 남해)에서 생산한 것을 사용하였다.

10% 두유를 제조하기 위하여 콩 질량의 10배의 증류수를 가한 후 멸균기를 이용하여 121℃에서 15분간 팽윤을 시켰다. 이를 가정용 믹서기를 이용하여 마쇄시킨 후 100 mesh 체를 이용하여 1차로 불용성 물질을 제거하였으며, 고속원심분리기에서 10000 rpm, 15분간 원심분리한 후 손실된 증류수를 보정하여 10% 두유를 제조하였다.

마늘은 새남해농협에서 판매하는 남해산 깐마늘을 구매하여 증류수에 5분간 침지시키며 3번 세척한 후 물기를 제거하였으며, 실험에 이용할 마늘은 가정용 믹서기를 이용하여 30초간 거칠게 파쇄하여 간마늘로 준비하였다.

3% 흑설탕이 첨가된 두유에 생마늘을 꼭지만 제거하고 분쇄하지 않은 톨마늘과 간마늘을 각각 20% 씩 첨가하여 마늘이 첨가된 두유를 제조하였다. 마늘의 열처리 유무에 따른 유산균의 생육과 발효 특성을 비교하기 위하여 두유에 형태가 다른 마늘을 첨가한 후 121℃에서 15분 조건으로 멸균처리(autoclave)한 실험군(A, C)과 두유를 먼저 autoclave하여 30℃까지 식혀서 마늘을 첨가한 실험군(B, D)으로 나누어 실험을 진행하였다. 실험 조건은 하기 표 5와 같다.

[표 5]

이와 같이 제조된 마늘이 첨가된 배지에 starter를 3%(w/w) 접종하여 실험을 진행하였다.

2-2. 콩분말을 이용한 마늘 첨가 발효 식품 제조

제조공정의 간소화를 위해 두유제조 공정을 대신해 시중에 판매되는 콩가루 제품을 질소원으로 이용하고, 고압멸균공정을 대신하여 일반 살균공정을 이용하여 열의 영향을 최소화하여 배지를 제조할 수 있다.

시판되는 콩가루(백태) 및 검정콩가루(인그린, 경기도 포천)를 구매하여 콩 분말 용액을 제조하였다. 제조된 발효물의 함량은 하기 표 11과 같다. 10% 생콩가루 및 검정콩가루와 10% 흑설탕을 이용하여 80에서 현탁시키면서 콩분말 발효물을 제조하였고, 이를 충분히 식힌 후 20% 생마늘(미분쇄 톨마늘) 및 간마늘을 첨가하여 실험을 진행하였다. 각 콩 발효물들은 60℃에서 30분간 살균하여 실험을 진행하였다. 하기 표 6은 콩분말을 이용한 마늘 첨가 발효 식품의 성분함량을 나타낸 것이다.

[표 6]

이와 같이 제조된 마늘이 첨가된 배지에 starter를 3%(w/w) 접종하여 실험을 진행하였다.

<실험 결과>

1. 생균수 측정

각각의 시료는 37℃에서 배양하면서 0, 1, 3, 5, 7일별로 회수하여 vortex를 이용하여 1분 동안 균질화시킨 후 시료의 일정량을 취해 실험을 진행하였다. 유산균수 측정을 위해 균질화된 시료 1 mL에 0.1% peptone 용액 9 mL을 혼합하여 10배 희석법으로 희석하였다. 시간대별로 회수한 시료를 적절히 희석한 후 각각의 희석액 1 mL를 plate에 접종하고 1% agar가 첨가된 0.04% bromocresol purple (BCP)이 첨가된 MRS broth(Difco, U.S.A.)를 이용한 평판측정법으로 생균수를 측정하였다. 각각의 plate는 37℃ 배양기에서 48시간동안 배양하면서 형성된 균락(colony)수를 계측하고 그 colony에 희석배수를 곱하여 시료 mL당 CFU(Colony Forming Unit)로 나타내었다.

1-1. 두유을 이용한 마늘 첨가 식품에서의 유산균 생균수

두유를 이용하여 제조된 배지에 마늘을 첨가하고 이후 유산균을 접종시킨 후 발효기간별로 생균수를 측정한 결과는 하기 표 7과 같았다.

[표 7]

* 상기 표에서 상첨자가 표기된 대조군, A, B, C, D는 표 5와 동일하다.

상기 표를 통해 알 수 있는 것과 같이, 대조군과 비교시 마늘을 첨가한 실험군 및 열처리를 하지 않은 실험군들의 경우 발효가 진행될수록 생균수가 높은 경향을 보였다. 대조군에 비해 마늘 첨가군의 생육정도가 높은 것은 마늘의 당 성분과 여타 질소원들이 발효기간 동안 추출되면서 유산균의 생육에 영향을 준 것으로 추정된다. 또한, 간마늘(분쇄한 마늘)의 경우 생마늘(껍질을 제거한 톨마늘) 보다 발효가 진행될수록 유산균 생균수가 저조한데, 이는 간마늘이 발효물과 닿는 표면적이 넓어 마늘의 항균물질에 의해 유산균의 생육이 저해된 결과인 것으로 추정된다.

1-2. 콩가루를 이용한 마늘 첨가 식품에서의 유산균 생균수

콩가루를 이용하여 제조된 배지에 마늘을 첨가하고 이후 유산균을 접종시킨 후 발효기간별로 생균수를 측정한 결과는 하기 표 8과 같았다.

[표 8]

* 상기 표에서 위첨자가 표기된 시료코드는 표 6과 동일하다.

상기 표 8을 통해 알 수 있는 것과 같이, 발효 완료시 마늘을 첨가한 실험군들의 생균수가 대조군에 비래 높은 생육 정도를 나타내었는데 이는 두유를 이용한 결과와 동일하다.

검정콩가루 실험군(BS, BSG, BSGG)에서는 간마늘보다 생마늘(톨마늘)에서 높은 생육 정도를 나타내었는데, 이 역시 두유를 이용한 결과와 동일했다. 한편, 생콩가루 실험군(S, SG, SGG)에 비해 검정콩가루 실험군의 유산균 생육이 높은 것으로 나타났다. 따라서, 검정콩가루를 이용하여 마늘이 첨가된 배지에서 유산균 생존에 최적 조건을 가지는 것으로 추정할 수 있다.

2. pH 및 산도 측정

회수한 시료 1 g에 탈이온수를 가하여 50 mL로 정용한 다음 0.45 μm membrane filter로 여과한 여액을 시료로 사용하였다. pH와 산도는 산도계(G20 compact titrator, METTLER TOLEDO, Switzerland)를 사용하여 측정하였으며, 적정산도는 0.1 N NaOH 용액으로 적정하였다. 혼합기 속도와 시간은 각각 30%와 15초간 실시하였으며, 종말점은 pH 8.4로 설정하여 적정에 사용된 0.1 N NaOH 용액 소요량을 젖산계수를 곱하여 표시하였다.

2-1. 두유을 이용한 마늘 첨가 식품

두유를 이용한 마늘 첨가 배지에 유산균을 접종한 경우의 pH를 측정한 결과는 하기 표 9와 같았다.

[표 9]

* 상기 표에서 상첨자가 표기된 시료코드는 표 5와 동일하다.

상기 표 9를 통해 알 수 있는 것과 같이, 발효가 진행되면서 유산균의 생육정도와 pH의 감소는 비슷한 경향을 나타내었다. 이는 유산균이 생육하면서 생성되는 유산에 의해 pH 감소를 유발하지만, 균의 생육정도가 높다고 하여 pH가 가장 낮지는 않았다. 7일째의 결과를 비교하면 대조군에 비해 B 실험군의 유산균 생육정도가 높았으나, pH는 3.86±0.01으로 대조군의 3.77±0.01보다 pH가 높게 나타났다.

한편, 발효기간에 따른 산도 측정 결과는 하기 표 10과 같았다.

[표 10]

* 상기 표에서 상첨자가 표기된 시료코드는 표 5와 동일하다.

상기 표 10을 통해 알 수 있는 것과 같이, 발효기간 동안 산도의 변화는 대조군에 비해 마늘이 첨가된 실험군의 산도가 더욱 높게 나타났다. 신맛을 나타내는 산도는 유산균의 생육 경향과 비슷한 결과를 나타내었는데 유산균의 생육정도가 증가하면 유산의 생성이 많아지므로 산도가 증가를 한 것으로 보인다. 하지만 pH와는 다소 상이한 결과를 나타내었다.

2-2. 콩가루를 이용한 마늘 첨가 식품

콩분말을 이용한 마늘 첨가 배지의 pH 측정 결과는 표 11과 같았다(37℃, 7일).

[표 11]

* 상기 표에서 상첨자를 포함한 시료코드는 표 6과 동일하다.

상기 표 11을 통해 알 수 있는 것과 같이, 콩가루를 이용한 실험군에서도 발효가 진행되면서 유산균의 생육정도와 pH의 감소는 두유발효와 비슷한 경향을 나타내었다. 콩가루 실험군에서도 역시 유산균이 생육하면서 pH가 감소되지만, 균의 생육정도가 높다고 하여 pH가 가장 낮지는 않았다. 7일째의 결과를 비교하면 대조군에 비해 BSG 실험군의 유산균수가 높았으나, BSG 실험군의 pH는 3.80±0.08으로 대조군의 3.54±0.03보다 pH가 높았으며 모든 실험군 중에 가장 높은 pH를 나타내었다.

한편, 발효기간에 따른 산도 측정 결과는 하기 표 12와 같았다.

[표 12]

* 상기 표에서 상첨자를 포함한 시료코드는 표 6과 동일하다.

상기 표 14를 통해 알 수 있는 것과 같이, 발효기간 동안 산도의 변화 역시 두유의 발효와 동일하게 대조군에 비해 마늘이 첨가된 실험군의 산도가 더욱 높게 나타났다. 검정콩가루 실험군은 생콩가루 실험군에 비해 산도가 더욱 높게 확인이 됐으나 마늘이 첨가되지 않은 대조군이 각각 1.60±0.01과 2.01±0.01%로 확인된 것으로 볼 때 콩가루의 영향으로 산도의 차이가 존재하는 것으로 추정된다.

3. 항산화 활성 측정

항산화 활성을 알아보기 위하여 DPPH 및 ABTS 라디칼 소거활성을 측정하였다. 항산화 활성의 평가하기 위하여 각각의 두유 및 콩 발효물 시료를 12000 rpm에서 10분간 원심분리 한 후 0.45 μm membrane filter (Sartorius stedim biotech, Germany)를 이용하여 부유물을 제거하였다. 이를 50 μL/mL의 농도가 되도록 3차 증류수로 희석하여 시료로 사용하였다.

1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) 라디칼에 대한 소거활성 측정 방법은 다음과 같이 진행하였다. 전처리된 시료액 2 mL에 DPPH (Sigma Chemical Co, St Louis, Mo, USA) 용액 2 mL를 가하여 혼합물을 교반한 후 암소에서 30분간 방치한 다음 UV/VIS spectrophotometer로 517 nm에서 흡광도를 측정하여 DPPH 라디칼 소거활성을 백분율로 나타내었다.

2,2-azinobis-3-ethylbenzo-thiazoline-6-sulphonate (ABTS) 라디칼 소거활성 측정은 다음과 같이 진행하였다. 각각 증류수에 용해한 7.0 mM ABTS (Sigma Chemical Co, St Louis, Mo, USA) 용액과 2.6 mM Potassium persulfate 용액을 혼합하고 ABTS 라디칼을 만들기 위해 12~16시간 동안 암소에 반응시켰다. 라디칼이 생성된 용액을 415 nm에서 흡광도 값이 1.50±0.02 되도록 에탄올로 희석하였다. ABTS 용액 3 mL에 희석한 시료 용액 1 mL를 첨가하여 상온에서 4분 반응시킨 후 UV/VIS spectrophotometer로 415 nm에서 흡광도를 측정하여 ABTS 라디칼 소거활성을 백분율로 나타내었다. 자유라디칼 소거활성은 다음과 같이 계산하였다.

Scavenging activity (%) = (1-A1/A0)×100

(A1:시료처리군의 흡광도, A0:시료대조군의 흡광도)

3-1. 두유를 이용한 마늘 첨가 식품

발효기간 동안 두유의 ABTS 라디칼 소거활성을 측정한 결과는 하기 표 13과 같았다.

[표 13]

* 상기 표에서 상첨자가 표기된 시료코드는 표 5와 동일하다.

상기 표를 통해 알 수 있는 것과 같이, ABTS 라디칼 소거활성은 발효가 진행됨과 마늘이 첨가가 되었을 때, 그리고 열의 영향에 의해 차이가 존재하였다. 0일째 대조군에 비해 A, B, C, D 실험군에서 더욱 높은 ABTS 라디칼 소거활성을 나타내었으며, 열의 영향을 받은 A와 C 실험군이 영향을 받지 않은 B와 D 실험군에 비해 높은 활성을 나타내었는데 이는 마늘의 라디칼 소거활성을 가진 물질이 열에 의해 용출되었기 때문으로 추정된다.

발효가 진행됨에 따라 모든 실험군에서 라디칼 소거활성이 증가하는 경향을 나타내었는데 이는 유산균이 발효를 하면서 라디칼 소거활성을 가지는 물질을 합성하거나 두유에 존재하는 활성물질의 용출을 도와 활성이 증가된 것으로 보인다. ABTS 라디칼 소거활성은 생마늘 실험군(A, B)에서 높게 나타났으며 7일째 결과는 열의 영향과는 관계없이 비슷한 결과를 나타내었다.

한편, 안정한 free radical을 함유하는 DPPH 분자는 항산화제의 라디칼 소거활성을 평가하기 위해 가장 많이 사용된다. 생체내의 유해활성 산소, 유리기 등은 생체막의 구성성분인 불포화 지방산을 공격하여 과산화물을 축적시키는데, 이로 인해 생체 기능의 저하나 노화를 유발시킨다고 알려져 있다. 이러한 원인 물질의 생성을 억제하기 위하여 연쇄반응 차단 항산화제로, 산패의 기본물질인 lipid radical과 반응하여 안정한 물질로 전환시키거나 연쇄반응 개시 속도를 연장시킨다.

한편, 발효기간 동안 두유의 DPPH 라디칼 소거활성을 측정한 결과는 하기 표 14와 같았다.

[표 14]

* 상기 표에서 상첨자가 표기된 시료코드는 표 5와 동일하다.

상기 표 10을 통해 알 수 있는 것과 같이, 발효초기 DPPH 라디칼 소거활성은 마늘이 첨가된 실험군 중 열에 영향을 받은 실험군(A, C)의 소거활성이 다른 실험군에 비해 높게 나왔다. 이는 ABTS 라디칼 소거활성과 동일한 경향을 나타내었다. 발효가 진행됨에 따라 소거활성이 증가하였고, 마늘 첨가 실험군의 소거활성이 대조군에 비해 높게 나온 것 역시 ABTS 라디칼 소거활성 실험의 결과와 동일한 경향을 나타내었다. 특히 발효 완료 때는 열처리가 되지 않은 생마늘 실험군(B)이 가장 높은 라디칼 소거활성(55.46±2.09%)을 가지는 것을 확인할 수 있었다.

상기 표 13과 표 14를 비교해보면, ABTS 라디칼 소거활성이 DPPH보다 더 높게 나타나는데, 이는 ABTS 방법은 DPPH 방법보다 수소공여항산화제(hydrogen-donating antioxidant)와 연쇄절단형 항산화제(chain-breaking antioxidant) 모두를 측정할 수 있고, 수용상(aqueous phase)과 유기상(organic phase) 모두에 적용이 가능한 장점이 있기 때문에(Re R 등 1999) ABTS 라디칼 소거활성이 더 sensitive하게 나타난 것으로 판단된다.

마늘 중에 함유되어 있는 플라보노이드, 페놀화합물을 비롯하여 diallyl sulfide, diallyl disulfide, diallyl trisulfide 및 allyl-cystein과 같은 함황화합물은 마늘의 항산화 기능을 나타내는 주체로 보고되어 있다.

라디칼 소거능 결과를 종합해보면, 마늘의 첨가로 인해 라디칼 소거활성이 증가한 것을 미루어 볼 때 마늘이 라디칼 소거활성의 주요 물질로 판단된다.

3-2. 콩가루를 이용한 마늘 첨가 식품

발효 기간 동안 콩가루를 이용한 마늘 첨가 식품의 ABTS 라디칼 소거활성을 측정한 결과는 표 15와 같았다.

[표 15]

* 상기 표에서 상첨자가 표기된 시료코드는 표 6과 동일하다.

상기 표 15를 통해 알 수 있는 것과 같이, ABTS 라디칼 소거활성은 두유 발효와 동일하게 발효가 진행과 마늘이 첨가가 되었을 때 활성이 증가하였다. 0일째 대조군(S, BS)에 비해 실험군(SG, SGG, BSG, BSGG)에서 더욱 높은 ABTS 라디칼 소거활성을 나타내었으며, 생콩가루 실험군보다 검정콩가루 실험군에서 라디칼 소거활성이 더 높게 측정되었다. 이는 생콩보다 검정콩에 라디칼 소거활성을 가지는 물질이 더 많은 것으로 추정되며 이는 마늘과의 상승효과를 가져 소거 활성이 더욱 높게 측정된 것으로 보인다. 발효 완료 후 라디칼 소거활성 역시 대조군에 비해 마늘 첨가군에서 활성이 높게 나타났으며, 검정콩 실험군의 소거활성도 생콩 실험군에 비해 높게 유지되었다. 발효 완료 후 ABTS 라디칼 소거활성은 검정콩가루와 생마늘 실험군(BSG)에서 64.69±2.07%로 가장 높은 활성값을 나타내었다.

한편, 발효기간 동안 콩가루를 이용한 마늘 첨가 식품의 DPPH 라디칼 소거활성을 측정한 결과는 하기 표 16과 같았다.

[표 16]

* 상기 표에서 상첨자가 표기된 시료코드는 표 6과 동일하다.

상기 표 16을 통해 알 수 있는 것과 같이, 발효기간 동안 DPPH 라디칼 소거활성 역시 ABTS 라디칼 소거활성과 동일한 경향을 나타냈다. DPPH 라디칼 소거활성에서도 역시 검정콩가루와 생마늘 실험군(BSG)에서 가장 높은 활성값(62.89±5.94%)을 나타내었다.

따라서, 간마늘에 비해 생마늘이 발효시 이점을 가지며, 두유를 검정콩가루로 대체하여 이용함으로서 높은 항산화 활성을 가진 유산균 제제로서의 기초 발효물로서 가치를 가짐과 동시에 두유 제조 공정을 분말로 대체함으로서 상업적인 이점을 가진다.

4. 콩가루를 이용한 마늘 첨가 식품의 유기산 분석

콩분말을 이용한 마늘 첨가 식품이 발효되는 기간 동안의 유기산 함량을 이온크로마토그래피(ion chromatography, IC)를 이용하여 측정하였다. 측정에 사용한 기기는 ICS-2100 (Dionex, USA)이며, 하기 표 17과 같은 조건에서 분석을 실시하였다.

[표 17]

실험에 사용된 표준 유기산 물질은 총 11종(oxalic, Maleic, Tartaric, Citric, Malic, Glycolic, Formic, Latic, Acetic, Succinic, Fumaric)으로 3차 증류수로 희석하여 5, 10, 30 ppm 제조하여 사용하였다. 실험에 이용된 시료는 3차 증류수로 50배 희석하여 0.45 μm membrane filter를 이용하여 여과한 후 IC에서 분석을 실시하였다.

발효를 통한 유기산 함량 변화를 측정한 결과는 하기 표 18과 같았다.

[표 18]

* 상기 표에서 상첨자가 표기된 시료코드는 표 6과 동일하다.

상기 표를 통해 알 수 있는 것과 같이, 발효가 진행됨에 따라 유산균 수가 급격하게 증가했음을 확인할 수 있다.

본 발명에 따르면, 각종 유기산 및 마늘의 매운맛이 제거된 마늘 자체의 유효성분을 다량 섭취할 수 있고, 식물성 에스트로겐인 이소플라본과 항산화활성이 높다고 알려진 콩과 장에 유익한 유산균을 이용하여 기능성과 기호성이 우수한 마늘 첨가 발효 식품을 제조할 수 있다.

이상 실시예 등을 통해 본 발명을 구체적으로 설명하였지만, 본 발명의 권리범위가 이들 실시에에 한정되는 것은 아니며 특허청구범위에 기재된 사항에 의해 결정되어야 할 것이다.

Claims (8)

1. 설탕과 콩이 10 ~ 30중량% 함유된 배지를 오토클레이브(autoclave)에서 멸균한 후 방냉하는 단계;
   방냉된 상기 배지에 배지 중량의 10~20중량%의 미분쇄 마늘을 첨가하는 단계;
   마늘이 첨가된 상기 배지를 50~70℃에서 20~30분간 가열하여 살균하는 단계; 및
   살균된 상기 배지에 Lactobacillus acidophilus, Lactococcus lactis subsp. lactis, Lactobacillus plantarum 중 적어도 하나의 유산균을 접종한 후 5 ~ 7일간 발효시키는 단계를 포함하는 마늘 함유 발효 식품소재의 제조방법.
2. 제 1항에 있어서,
   상기 유산균은 상기 배지의 1 ~ 10중량% 접종되는 것을 특징으로 하는 마늘 함유 발효 식품소재의 제조방법.
3. 제 1항에 있어서,
   상기 배지는 콩 질량의 8 ~ 20배의 물을 가하여 상기 콩을 팽윤시킨 후 마쇄시킨 것 또는 콩가루 함량이 8 ~ 20중량% 포함된 것 중 적어도 하나를 사용하며,
   상기 배지에 함유된 설탕은 2 ~ 10중량%인 것을 특징으로 하는 마늘 함유 발효 식품소재의 제조방법.
4. 제 1항의 제조방법에 의해 제조된 마늘 함유 발효 식품소재.
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