KR101871904B1 - 류코노스톡 메센테로이데스 ｙｓｍ１２１９ 균주 및 이의 용도 - Google Patents
류코노스톡 메센테로이데스 ｙｓｍ１２１９ 균주 및 이의 용도 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 류코노스톡 메센테로이데스 서브스피시스 메센테로이데스(Leuconostoc mesenteroides subsp. mesenteroides) YSM1219 [기탁번호: KFCC11613P] 또는 그 배양물을 포함하는 생균제 조성물, 사료용 조성물, 식품첨가용 조성물, 발효식품 또는 그 제조방법에 관한 것이다. 상기 본 발명의 균주는 김치 제조에 스타터로 첨가되어 적숙기에 도달하는 시간은 단축하면서도 잘익은 상태의 적숙기의 지속시간이 오래 유지될 수 있도록 한다.
Description
본 발명은 류코노스톡 메센테로이데스 균주 및 이의 용도에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 생체 위해성이 없는 안전한 균주로서, 김치 제조에 스타터로 첨가되어 김치 제조에서 적숙기에 도달하는 시간은 단축하면서도 잘익은 상태의 적숙기의 지속시간이 오래 유지될 수 있도록 하는 류코노스톡 메센테로이데스 YSM1219 균주 및 이의 용도에 관한 것이다.
유산균은 인간의 건강에 매우 유익한 영향을 미치는 미생물로써 그 유용성이 날로 증가하고 있다. 최근에는 유산균에 대한 연구가 활발히 진행되어 일반 식품뿐만 아니라 건강식품 및 약품으로도 개발되는 등 그 응용범위가 점점 넓어지고 있다. 유산균에 속하는 미생물로는 스트렙토코커스(Streptococcus) 속, 페디오코커스(Pediococcus) 속, 류코노스톡(Leuconostoc) 속, 락토바실러스(Lactobacillus) 속, 스포로락토바실러스(Sporolactobacillus) 속 및 비피도박테리움(Bifidobacterium) 속의 미생물 등이 있다.
이러한 유산균들은 동물의 장내에 서식하면서 동물이 섭취한 영양분 및 섬유소 등을 분해하여 에너지원으로 사용하고, 젖산 및 항생물질 등을 생산하여 장내 유해균의 발육을 억제함으로써 장내 건강유지에 중요한 역할을 한다. 또한, 유산균은 동물의 성장촉진 및 사료 이용률 개선, 병에 대한 저항력 증가, 유해세균의 증식억제, 폐사율 감소, 부패 독성물질의 생성 억제 및 각종 비타민 생성에도 이용되고 있다.
한국 전통 발효식품 중 하나인 김치에도 다양한 유산균이 포함되어 있으며, 이들의 조합이나 지배균주의 종류에 따라 김치의 발효 과정과 김치 맛이 달라지는 것으로 알려져 있다. 그 중 류코노스톡 속 균주는 김치의 맛이 가장 이상적일 때까지 발효를 이끄는 균주로 알려져 있을 뿐만 아니라, 다른 유산균과 달리 발효 과정에서 변비 예방 등에 효과가 있는 불용성 식이섬유인 덱스트란을 생성하는 것으로 알려져 있다.
따라서 김치의 제조에 스타터 균주로 류코노스톡 속 균주를 첨가하여 김치 숙성과정에서 지배균으로 점유되어 김치의 미생물 조성과 이화학적 성질이 조절되어 품질과 맛이 균일한 김치를 안정적으로 할 수 있도록, 저온성 락토바실러스와 류코노스톡을 사용하거나(소명환 등, 1996. 한국식품과학회지, 28(5): 806-813), 류코노스톡과 페디오코커스를 사용하거나(조영 등, 1991. 한국조리과학회지, 7(1): 15-25, 7(2):89-95), 내산성 변이주 류코노스톡과 사카로미세스(Saccharomyces)를 사용하는(Kim YC, et al., 1999. J. Microbial. Biotechnol. 9(1):22-31) 시도가 있었고, 한국특허 제0519083호에서도 류코노스톡 메센터로이데스 K8P4[기탁번호: KCTC 10527BP]를 사용한 예가 있었다.
그러나 이들 선행기술에서는 스타터의 사용으로 적숙기에서 맛이 우수하고 품질이 균일한 김치를 제조하는 것은 가능했으나 발효 단계에서 적숙기에 도달하는 시간을 단축하지 못하는 경우가 많았고, 적숙기에 도달하는 시간을 단축하는 경우에는 전반적인 발효 과정이 촉진되어 적숙기의 지속기간은 단축되는 문제가 있었다.
이에 본 발명자들은 한국 전통 김치에서 분리한 류코노스톡 메센테로이데스 YSM1219 균주가 김치의 제조에 스타터로 첨가되었을 때 발효 초기에 김치의 지배균주로 작용하여 김치가 적숙기에 도달하는 시간을 단축하면서도, 적숙기에 도달한 후에는 적숙기의 지속시간이 오래 연장되도록 함을 알게 되어 본 발명을 완성하였다.
따라서 본 발명의 목적은 생체 위해성이 없는 안전한 균주로서, 김치 제조에 스타터로 첨가되어 김치 제조에서 적숙기에 도달하는 시간은 단축하면서도 잘익은 상태의 적숙기의 지속시간이 오래 유지될 수 있도록 하는 류코노스톡 메센테로이데스 YSM1219 균주와, 이를 이용한 생균제 조성물, 사료용 조성물, 식품첨가용 조성물, 발효식품으로의 용도를 제공하기 위한 것이다
상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 류코노스톡 메센테로이데스 서브스피시스 메센테로이데스(Leuconostoc mesenteroides subsp. mesenteroides) YSM1219 [기탁번호: KFCC11613P]를 제공한다.
또한 본 발명은 류코노스톡 메센테로이데스 서브스피시스 메센테로이데스(Leuconostoc mesenteroides subsp. mesenteroides) YSM1219 [기탁번호: KFCC11613P] 또는 그 배양물을 함유하는 생균제 조성물을 제공한다.
또한 본 발명은 류코노스톡 메센테로이데스 서브스피시스 메센테로이데스(Leuconostoc mesenteroides subsp. mesenteroides) YSM1219 [기탁번호: KFCC11613P] 또는 그 배양물을 함유하는 사료용 조성물을 제공한다.
또한 본 발명은 류코노스톡 메센테로이데스 서브스피시스 메센테로이데스(Leuconostoc mesenteroides subsp. mesenteroides) YSM1219 [기탁번호: KFCC11613P] 또는 그 배양물을 함유하는 식품첨가용 조성물을 제공한다.
또한 본 발명은 류코노스톡 메센테로이데스 서브스피시스 메센테로이데스(Leuconostoc mesenteroides subsp. mesenteroides) YSM1219 [기탁번호: KFCC11613P] 또는 그 배양물을 함유하는 발효식품을 제공한다.
또한 본 발명은 류코노스톡 메센테로이데스 서브스피시스 메센테로이데스(Leuconostoc mesenteroides subsp. mesenteroides) YSM1219 [기탁번호: KFCC11613P] 또는 그 배양물을 함유하는 스타터(starter)를 첨가하여 발효시키는 발효식품의 제조방법을 제공한다.
또한 본 발명은 류코노스톡 메센테로이데스 서브스피시스 메센테로이데스(Leuconostoc mesenteroides subsp. mesenteroides) YSM1219 [기탁번호: KFCC11613P] 또는 그 배양물을 함유하는 스타터(starter)를 첨가하여 발효시키는 김치의 제조방법을 제공한다.
상기 김치의 제조방법에서, 상기 스타터(starter)를 소금에 절인 김치용 채소 및 양념과 혼합하여 김치를 제조하는 단계; 및 상기 김치를 발효시키는 단계;를 포함하는 것이 바람직하다.
상기 김치의 제조방법에서, 상기 김치를 발효시키는 단계는, 15 내지 30 ℃에서 18 내지 30 시간 발효하는 스타터 활성화 과정; 및 1 내지 10 ℃에서 3 내지 10일 발효하는 적숙화 과정;을 포함하는 것이 바람직하다. 상기 스타터 활성화 과정의 온도 및 시간이 상기 하한치 미만일 경우 스타터로 첨가되는 본 발명의 균주의 활성화가 이루어지지 않아 적숙기 도달시간을 100 시간 이내, 바람직하게는 80 시간 이내, 더욱 바람직하게는 70 내지 50 시간으로 단축할 수 없고, 상기 스타터 활성화 과정의 온도 및 시간이 상기 상한치를 초과할 경우, 적숙기 도달시간이 상기 범위로 단축되는 경우에도 적숙기 유지기간이 스타터를 사용하지 않은 김치에 비해 20% 이상 연장되지 못할 수 있다. 또한 상기 적숙화 과정에서 발효 온도가 상기 하한치 미만일 경우에는 김치가 얼면서 조직이 손상되고 식감이 저하될 수 있고, 상기 상한치를 초과할 경우 적숙기 유지기간이 단축될 수 있고, 상기 적숙화 과정에서 3 내지 10일 발효하여 적숙기에 도달하게 된다. 상기 적숙기에 도달한 김치는 1 내지 10 ℃, 바람직하게는 2 내지 5 ℃에서 장기간 저장되면서 적숙기가 60일 이상, 바람직하게는 70 내지 100 일 동안 유지된다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명의 류코노스톡 메센테로이데스 서브스피시스 메센테로이데스(Leuconostoc mesenteroides subsp. mesenteroides) YSM1219 [기탁번호: KFCC11613P]은 김장철 제조한 배추김치에서 분리된 것으로 16S rRNA 염기서열 분석 결과 류코노스톡 메센터로이데스 표준균주(Leuconostoc mesenteroides subsp.)와 GenBank 데이터베이스 검색시 상동성 99%를 나타내었다(도 1 참조).
따라서 본 발명의 균주는 류코노스톡 메센테로이데스(Leuconostoc mesenteroides)로 동정하고, 류코노스톡 메센테로이데스 서브스피시스 메센테로이데스(Leuconostoc mesenteroides subsp. mesenteroides) YSM1219로 명명하였으며 한국미생물보존센터에 2015년 4월 28일자로 기탁하여 기탁번호 KFCC11613P를 부여받았다.
본 발명의 류코노스톡 메센테로이데스 서브스피시스 메센테로이데스 YSM1219균주는 그람양성균이며 호기적 조건과 혐기적 조건에서 모두 성장이 가능한 통성 혐기성(facultive anaerobe)이다. 포자를 형성하지 않는다. 세포의 형태는 구균 혹은 쌍구균의 사슬모양이며 운동성은 없다(도 2 참조).
또한 본 발명의 류코노스톡 메센테로이데스 서브스피시스 메센테로이데스 YSM1219 균주는 사람에게는 위해가 없는 GRAS(Generally recognized as safe)균주로 분류되고, API-ZYM kit(Biomerieux사 제품 France)를 이용한 효소활성 측정결과 20 종의 효소가 모두 비활성인 안전한 균주이다.
따라서 본 발명의 류코노스톡 메센테로이데스는 인간 및 동물의 건강증진을 위한 용도, 즉 생균제 조성물, 사료용 조성물 또는 식품 첨가용 조성물로 사용될 수 있다. 상기 조성물은 본 발명의 균주의 생균, 건조균 또는 배양물을 유효성분으로 포함할 수 있으며, 부형제 또는 담체를 추가로 포함할 수 있다. 상기 배양물은 액체배지에서 배양한 배양액 자체, 상기 배양액을 여과 또는 원심분리하여 균주를 제거한 여액(원심분리한 상등액)등을 포함한다. 조성물 내 류코노스톡 메센테로이데스의 함량은 조성물의 용도 및 제형에 따라 달라질 수 있다.
상기 조성물은 다양한 제형과 방법으로 제조 및 투여될 수 있다. 예를 들어, 류코노스톡 메센테로이데스 또는 이의 배양물을 약제학적 분야에서 통상적으로 사용하는 담체 및 향료와 혼합하여 정제(tablet), 트로키(troche), 캡슐(caps㎕e), 엘릭실(elixir), 시럽(syrup), 산제(powder), 현탁제(suspension) 또는 과립제(gran㎕e) 등의 형태로 제조 및 투여될 수 있다. 상기 담체로는 결합제, 활탁제, 붕해제, 부형제, 가용화제, 분산제, 안정화제, 현탁화제 등을 사용할 수 있다. 투여방식은 경구, 비경구 또는 도포법을 사용할 수 있으나, 바람직하게는 경구 투여하는 것이 바람직하다. 또한, 투여용량은 체내에서 활성성분의 흡수도, 불활성율 및 배설속도, 피투여자의 연령, 성별, 상태 등에 따라 적절히 선택할 수 있다.
본 발명의 류코노스톡 메센테로이데스 또는 이의 배양물은 김치, 음료, 이유식, 유제품 등의 식품에 대한 식품첨가제로 사용될 수 있다. 아울러, 본 발명의 류코노스톡 메센테로이데스는 발효식품의 제조를 위한 스타터(starter)로 사용될 수 있다. 상기 발효식품은 치즈, 김치, 발효생식제품 등을 포함한다. 본 발명의 류코노스톡 메센테로이데스를 이용한 발효식품은 당업계에 공지된 통상의 방법에 따라 제조될 수 있다.
본 발명의 류코노스톡 메센테로이데스는 김치를 제조하는데 사용할 수 있다. 바람직하게는 소금으로 절인 배추에 고춧가루, 마늘, 생강, 대파, 무채, 설탕과 같은 일반적인 김치 양념들을 혼합한 후, 본 발명의 류코노스톡 메센테로이데스 또는 그의 배양물을 첨가하여 김치를 제조할 수 있다. 상기 본 발명의 류코노스톡 메센테로이데스를 첨가하는 경우 습중량으로 김치 전체 중량에 대하여 0.0005 내지 0.05의 중량%, 바람직하게는 0.001 내지 0.005 중량% 첨가하고, 배양물로 첨가할 경우 김치 전체 중량에 대하여 0.01 내지 1 중량% 로 첨가하는 것이 바람직하며, 0.02 내지 0.5 중량%로 첨가하는 것이 가장 바람직하다.
본 발명의 류코토스톡 메센테로이데스는 통상적인 류코노스톡 속 미생물의 배양방법에 의해 대량으로 배양할 수 있다. 배양배지로는 탄소원, 질소원, 비타민 및 미네랄로 구성된 배지를 사용할 수 있으며, 예컨대, MRS(Man-Rogosa-Sharp)배지 또는 배추즙 배지를 사용할 수 있다. 상기 배추즙 배지는 절임배추를 분쇄하고 착즙한 후, 멸균하여 사용할 수 있다. 미생물의 배양은 통상의 류코노스톡속 미생물의 배양 조건상에서 가능하며, 예컨대 25 ℃ 내지 37 ℃에서 18 시간 내지 48 시간 정도 배양할 수 있으며, 보다 바람직하게는 37 ℃에서 20시간 정도 배양할 수 있다. 배양액 중의 배양 배지를 제거하고 농축된 균체만을 회수하기 위해 원심분리 또는 여과 과정을 거칠 수 있으며, 이러한 단계는 당업자가 필요에 따라 수행할 수 있다. 농축된 균체는 통상적인 방법에 따라 냉동(frozen)하거나 또는 냉동건조(lyophilized)하여 그 활성을 잃지 않도록 보존할 수 있다.
본 발명의 신규한 김치 유산균인 류코노스톡 메센테로이데스 서브스피시스 메센테로이데스(Leuconostoc mesenteroides subsp. mesenteroides) YSM1219은 생균제 조성물, 사료용 조성물, 식품첨가용 조성물 및 발효식품의 제조에 다양하게 이용될 수 있다.
도 1은 본 발명의 류코노스톡 메센테로이데스 서브스피시스 메센테로이데스(Leuconostoc mesenteroides subsp. mesenteroides) YSM1219 균주의 계통도를 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명의 류코노스톡 메센테로이데스 서브스피시스 메센테로이데스 YSM1219 균주의 그램염색 사진이다.
도 2는 본 발명의 류코노스톡 메센테로이데스 서브스피시스 메센테로이데스 YSM1219 균주의 그램염색 사진이다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1: 유산균의 분리 및 동정>
적숙기에 도달한 김장김치를 시료를 0.85 % 식염수로 10 배 희석하였고, 0.1 ㎖씩 MRS 아가 배지(MRS 아가, 디프코(Difco.); 박토 펩톤 10 g, 소고기추출물 10 g, 효모추출물 5 g, 글루코스 20 g, 트윈 801 g, 구연산 2 g, 제2 인산칼륨 2 g, 초산나트륨 5 g, 황산망간 0.1 g, 황산마그네슘 0.05 g, 아가 15 g/증류수 1 ℓ)플레이트에 접종한 후, 유리막대로 도말하였다. 이후, 플레이트를 25 ℃의 항온 배양기에서 2일 동안 배양하였다. 생성된 각각의 콜로니를 MRS 아가 플레이트에 획선 접종하였고, 25 ℃에서 2일 동안 배양하여 유산균 콜로니를 분리하였다.
상기 선발된 유산균을 단일 콜로니로 분리한 후, API 시스템(API system; La Balme-les-Grottes, France)으로 동정하였다. 우선, 멸균 백금이로 균 콜로니를 각각 취한 후 멸균 증류수 2 ㎖에 부유시켰다. 다시 상기 균액을 멸균 증류수 5 ㎖에 API 50CH 키트(BioMerieux, France)에서 제공되는 맥팔란드 표준 용액 No.2(MccFaland Standard Solution No.2)의 농도로 균액을 부유시켰다. 상기 부유액을 API 50CH 키트의 액체배지에 첨가하여 균질화시킨 후, API 50CH 키트의 50개 각 튜브에 200 ㎕씩 접종하였다. 미네랄 오일로 튜브 위를 엎어준 후, 30 ℃에서 48 시간 동안 배양시켰다. 상기 배양액을 API 시스템으로 분석하여 49종의 탄수화물 발효패턴을 확인한 후, 이 결과를 ATB 동정 컴퓨터 시스템에 입력하여 동정하였다. 그 결과, 상기 선발된 유산균은 류코노스톡 속에 속하는 균주인 것으로 판명되었다.
또한 당업계에 공지된 통상적인 방법에 따라 상기 선별된 유산균의 16S rDNA의 염기서열을 분석하였다. 그 결과, 상기 유산균의 16S rDNA 염기서열(서열번호 1)은 류코노스톡 메센터로이데스 표준균주(Leuconostoc mesenteroides subsp.)의 16S rDNA 염기서열과 99 % 동일함을 알 수 있었다.
따라서, 본 발명자들은 상기 유산균을을 "류코노스톡 메센테로이데스 서브스피시스 메센테로이데스(Leuconostoc mesenteroides subsp. mesenteroides) YSM1219" 로 명명하고 이를 한국미생물보존센터(Korean Culture Center of Microorganisms)에 2015년 4월 28일자로 기탁하였다[기탁번호: KFCC11613P].
<실험예 1: 안전성 관련 효소 활성 측정>
본 발명의 균주를 MRS배지에 37℃로 배양하면서, 분광광도계(spectrophotometer)를 사용하여 OD 550nm에서 1.0까지 도달한 후 원심분리하고, 생리식염수(0.85% NaCl)로 균수를 106 CFU/ml 수준으로 희석하여, API-ZYM kit(Biomerieux사 제품 France)를 이용하여 조사하였다. 균을 37℃에 8시간 배양한 후, ZYM-A 용액과 ZYM-B용액을 1방울 떨어뜨린 후 10분간 실온에서 방치한 다음 효소활성을 측정하였다. 효소활성은 API-ZYM 메뉴얼의 표준색상도에 색깔별로 제시되어 있는 단계(0-5, nanomole)와 비교하여 일치되는 색깔에 해당되는 수치로 표시하였다.
예를 들어 베타-글루크로니다아제(β-glucuronidase)는 벤조피렌을 발암성 물질로 전환시키는 작용을 하는 발암효소로 알려져 있는데, 상기 효소 활성이 3 미만으로 비활성이었고, 기타 유해효소들로 알려진 효소들에서도 모두 비활성으로 나타났다.
따라서 본 발명의 류코노스톡 메센테로이데스 서브스피시스 메센테로이데스 YSM1219균주는 안전성 관련 효소 활성이 모두 비활성인 안전한 균주임을 확인할 수 있었다.
<제조예 1: 식품첨가용 조성물의 제조>
본 발명의 류코노스톡 메센테로이데스 서브스피시스 메센테로이데스 YSM1219 균주를 대량 배양한 다음 원심분리를 통하여 균체를 분리하여 제조하였다. 배지는 MRS 액체배지를 제조한 다음 멸균기에서 멸균(121℃ 15분)하여 사용하였고, 배지 전체량에 0.5%(V/V)의 균주(3±×10-11 CFU/ml)를 접종하여 37℃에서 12시간 배양하였다. 상세한 배양조건은 아래 표 2에 나타내었다.
| 구분 | 내용 |
| 배지(액체) | MRS Broth |
| pH | 6.1±0.2 |
| 배양온도 | 37℃±1 |
| 통기조건(VVM) | 0.5 |
| 교반(RPM) | 300±10 |
| 배양시간(Hour) | 12 |
상기 배양액 자체 또는 그 배양액에서 균체를 분리하여 식품첨가용 조성물로 활용할 수도 있고, 또는 아래와 같이 동결건조한 분말을 식품첨가용 조성물로 활용할 수 있다. 예를 들어 분유 또는 탈지유(skim milk) 및 전분 또는 유당을 1:1 중량비로 혼합한 혼합물에 상기 배양액을 60 중량%로 첨가한 후, 이를 -70℃ 이하에서 급속 냉동시킨 후, -60 ℃에서 36 시간 동안 동결 건조시켜 식품첨가용 조성물을 제조하였다. 이때, 동결건조시 수분 증발 효율을 높이기 위한 열판의 온도는 30 ℃로 하였으며, 이때 제조된 식품첨가용 조성물은 본 발명의 균주가 1×108 cfu/g 이상으로 포함되도록 하였다.
<제조예 2: 김치의 제조>
김치 제조방법은 전통 배추김치 표준화 방법에 따라 수행하였다. 보다 상세하게 설명하면 원료는 배추 100g을 기준으로 무우 13±5.0g, 파 2.0±0.5g, 마늘 1.5±0.5g, 생강 1±0.2g, 멸치액젖 2.0±1.5g, 설탕 1.0±0.2g, 최종염도 3.0±0.5g, 고춧가루 4.0±0.5g의 비율로 구성하였다. 배추는 작은 것은 이등분, 큰 것은 네 등분하여 13% 소금물(신안 천일염)에 10시간 절여서 물기를 뺀 다음 사용하였다. 양념은 믹스기로 갈은 무우에 고추가루를 갠 다음 채 썰은 무우와 파를 넣고 다음으로 마늘, 생강, 설탕을 넣었다. 마지막으로 멸치액젖을 넣고 버무렸다.
상기 제조예 1의 배양액을 원심분리하여 균체를 얻고, 원심분리 하여 0.85% 식염으로 세척한 다음, 김치 전체 중량에 대해서 0.002 중량%가 되도록 상기 양념에 본 발명의 균주를 스타터로 첨가하여 김치를 제조하였다(제조예 2-1). 대조군으로 본 발명의 균주가 첨가되지 않은 양념을 사용하여 동일한 방법으로 김치를 제조하였다(제조예 2-0).
<실험예 2: 발효온도에 따른 적숙기 도달시간과 적숙기 유지시간>
상기 제조예 2-0의 스타터 무첨가 김치와 제조예 2-1의 본 발명의 균주를 스타터로 첨가한 김치를 발효 온도를 3, 12 및 20 ℃로 달리하여 저장하면서 적숙기 도달시간과 적숙기 유지시간을 측정하여 표 3에 나타내었다.
김치 발효에서 적숙기는 김치가 발효되어 너무 시지 않게 맛있게 익은 상태로서 본 발명에서는 김치의 pH가 4.3±0.3일 때를 적숙기라 하고, 김치가 발효되면서 최초로 상기 범위, 즉 pH 4.0 내지 4.6 사이로 pH가 낮아질 때까지 소요된 시간을 적숙기 도달시간이라 하며, 상기 pH 4.0 내지 4.6 사이를 유지하는 시간을 적숙기 유지기간이라 한다. 김치의 pH는 김치를 믹서기로 분쇄한 후 증류수 5 중량% 혼합하여 교반하면서 20 ℃에서 측정하였다.
| 발효 온도(℃) | 구분 | 적숙기 도달시간(hr) | 적숙기 유지기간(day) |
| 3 | 제조예 2-0 | 162 | 47 |
| 3 | 제조예 2-1 | 126 | 55 |
| 12 | 제조예 2-0 | 114 | 33 |
| 12 | 제조예 2-1 | 90 | 46 |
| 20 | 제조예 2-0 | 66 | 15 |
| 20 | 제조예 2-1 | 42 | 28 |
상기 적숙기 도달시간은 6 시간마다 1회 측정하였고, 적숙기 유지기간은 1일 1회 측정하였다. 발효 온도가 높아질수록 적숙기 도달시간 및 적숙기 유지기간은 짧게 나타났고, 본 발명의 균주를 스타터로 첨가한 제조예 2-1과 스타터를 첨가하지 않은 제조예 2-0을 동일 온도 조건에서 비교했을 때 적숙기 도달시간은 23 내지 33 % 짧고, 적숙기 유지시간은 17 내지 86 % 길어졌다.
따라서 본 발명의 균주를 스타터로 첨가한 경우가 발효 온도에 관계없이 실험한 모든 발효 온도에서 적숙기 도달시간을 단축하면서 적숙기 유지시간을 연장하는 효과를 확인할 수 있었다.
<실험예 3: 초기 스타터 활성화 온도에 따른 적숙기 도달시간과 적숙기 유지시간>
상기 제조예 2-1의 본 발명의 균주를 스타터로 첨가한 김치를 제조 직후, 12, 20, 28, 36 ℃에서 각각 24 시간 유지시켜 스타터를 활성화시킨 후, 그 활성화 종료 시점의 pH를 측정하고 이후 3 ℃에서 저장하면서 적숙기 도달시간과 적숙기 유지시간을 측정하여 표 4에 나타내었다.
| 활성화온도(℃) | 활성화종료시점 pH | 적숙기 도달시간(hr) | 적숙기 유지기간(day) |
| 12 | 5.20 | 102 | 58 |
| 20 | 4.95 | 66 | 74 |
| 28 | 4.80 | 54 | 68 |
| 36 | 4.45 | 36 | 47 |
실험예 2에서 제조예 2-1의 본 발명의 균주를 스타터로 첨가한 김치를 처음부터 3 ℃로 유지했을 때는 적숙기 도달시간이 126 시간이고, 적숙기 유지기간이 55일이었다.
이와 비교하여 스타터로 첨가한 본 발명의 균주가 지배균주가 될 수 있도록 스타터 균주 활성화를 위해 초기 발효 온도를 높였을 때, 적숙기 도달시간은 발효 온도에 비례하여 증가하였으나, 적숙기 유지시간은 활성화 온도가 12 ℃일 때에는 활성화로 인한 적숙기 유지기간의 증가가 3일로 미미하였고, 활성화 온도가 36 ℃인 경우에는 적숙기 유지기간이 오히려 8일 단축되었으며, 활성화 온도가 15 내지 30 ℃에서는 적숙기 유지기간이 13 내지 19일 증가하였다.
<실험예 4: 초기 스타터 활성화 시간에 따른 적숙기 도달시간과 적숙기 유지시간>
상기 제조예 2-1의 본 발명의 균주를 스타터로 첨가한 김치를 제조 직후, 20 ℃에서 각각 12, 24, 36 시간 유지시켜 스타터를 활성화시킨 후, 그 활성화 완료 시점의 pH를 측정하고 이후 3 ℃에서 저장하면서 적숙기 도달시간과 적숙기 유지시간을 측정하여 표 5에 나타내었다.
| 활성화시간(hr) | 활성화종료시점 pH | 적숙기 도달시간(hr) | 적숙기 유지기간(day) |
| 12 | 5.30 | 108 | 56 |
| 24 | 4.95 | 66 | 74 |
| 36 | 4.70 | 48 | 53 |
20 ℃에서 초기 스타터 활성화 시간이 18 내지 30 시간이었을 때에는 실험예 2에서 제조예 2-1의 본 발명의 균주를 스타터로 첨가한 김치를 처음부터 3 ℃로 유지했을 때와 비교하여 적숙기 유지기간이 증가하였으나, 상기 범위를 벗어난 경우에는 적숙기 유지기간의 연장 효과가 나타나지 않았다.
<실험예 5: 스타터의 종류에 따른 적숙기 도달시간과 적숙기 유지시간>
상기 제조예 2-1과 동일하게 김치를 제조하되, 대조군으로 스타터를 첨가하지 않거나, 스타터 미생물을 달리하여 각각 김치를 제조하고, 20 ℃에서 24 시간 유지시킨 후, 3 ℃에서 저장하면서 적숙기 도달시간과 적숙기 유지시간을 측정하여 표 6에 나타내었다.
| 구분 | 적숙기 도달시간(hr) | 적숙기 유지기간(day) |
| 제조예 2-0 (스타터 무첨가) | 132 | 50 |
| 제조예 2-1 (YSM1219) | 66 | 74 |
| 류코노스톡 메센테로이데스 K8P4 (KCTC 10527BP) |
72 | 58 |
| 류코노스톡 메센테로이데스 KFRI819 (KFCC 11209) |
84 | 63 |
본 발명의 균주를 스타터로 사용한 경우, 스타터 무첨가와 비교하여 적숙기 도달시간은 50% 정도로 단축되었고, 적숙기 유지기간은 24일 연장되었다. 류코노스톡 메센테로이데스 K8P4 균주를 스타터로 사용한 경우, 본 발명의 균주를 스타터로 사용한 제조예 2-1과 적숙기 도달시간은 6 시간차로 크게 차이가 없었으나, 적숙기 유지시간은 16일이나 짧아 발효 단계를 촉진하는 효과는 있으나 적숙기 유지기간의 증진 효과는 나타내지 않았고, 류코노스톡 메센테로이데스 KFRI819 균주를 스타터로 사용한 경우, 적숙기 도달시간도 단축하지 못하고 또한 적숙기 유지기간도 본 발명에 비해 11일 정도 짧게 나타났다.
<실험예 6: 스타터의 종류에 따른 적숙기 김치의 관능 평가 및 경도>
상기 실험예 5에서 제조된 김치가 모두 적숙기에 도달한 제조 후 40일째의 김치를 이용하여, 관능 검사와 경도 측정을 실시하여 그 결과를 표 7에 나타내었다.
관능검사는 20명의 훈련된 패널을 대상으로 5점 평점법으로 향미 기호도, 물성(식감) 기호도 및 전체 기호도를 평가하였다.
경도측정은 texture analyzer(TA.XT2, Stable Micro Systems, Ltd., Godalming, England)를 사용하였다. 측정은 김치 포기 중 겉잎에서 4번째 배추잎을 잘라내어 사용하였고, 배추 한 잎에서 가장 두꺼운 부분이며 제일 나중에 숙성되는 부분이라고 알려져 있는 '뿌리에서 4-5cm 정도에 위치한 줄기 흰부분'에 puncture test(뚫어질 때까지 힘을 가하는 시험법)를 시행하였다. 이때 측정 조건은 probe 3 mm, pretest speed 5 mm/s, test speed 0.5 mm/s, posttest speed 10 mm/s였다. 김치 표면의 중앙부분에서부터 100% 관통하면서 받는 최대 강도(hardness)와 probe가 배추 표면에 닿은 후부터 배추 조직의 겉면이 뚫릴 때까지의 시간 등을 배추 두께로 경도 측정 시 화면의 그래프에 나타나는 peak 수를 참고 하였다. 김치 시료 측정 횟수는 실험군 대조군 모두 15회 반복하여 평균값을 구하였다
| 구분 | 기호도 | 경도 | ||
| 향미 | 물성 | 전체 | ||
| 제조예 2-0 (스타터 무첨가) | 3.8±0.3 | 3.1±0.3 | 3.4±0.3 | 10.2±0.11 |
| 제조예 2-1 (YSM1219) | 4.0±0.2 | 4.3±0.3 | 4.2±0.3 | 13.2±0.23 |
| 류코노스톡 메센테로이데스 K8P4 (KCTC 10527BP) |
3.9±0.2 | 3.6±0.3 | 3.7±0.3 | 12.5±0.31 |
| 류코노스톡 메센테로이데스 KFRI819 (KFCC 11209) |
3.8±0.2 | 3.5±0.2 | 3.6±0.2 | 12.1±0.15 |
본 발명의 균주를 스타터로 사용한 경우, 스타터 무첨가와 비교하여 모두 적숙기의 김치 시료이었음에도, 물성 기호도의 차이가 크게 나타났고 이는 경도 측정값에서도 현저한 차이로 나타났다.
류코노스톡 메센테로이데스 K8P4 균주 및 KFRI819 균주를 스타터로 사용한 경우, 본 발명의 균주를 스타터로 사용한 제조예 2-1과 경도 값에서는 큰 차이가 없었으나, 관능적으로 느끼는 물성(식감)의 차이로 인하여 물성 기호도 및 전체 기호도에서 특히 제조예 2-1보다 떨어지는 결과가 나타났다.
<제조예 3: 생균제 조성물의 제조>
본 발명의 류코노스톡 메센테로이데스 서브스피시스 메센테로이데스 YSM1219 균주를 2.0 % 글루코스, 1.0 % 펩톤, 1.0 % 효모추출물, 0.2 % 제이인산, 0.05 % 황산마그네슘 및 0.05 % 시스테인이 함유된 배지에 접종하여 37 ℃에서 2 일 동안 호기적으로 배양하였다. 탈지강, 대두분말, 옥분 및 당밀이 각각 3:1:1:1의 중량비로 혼합되어 들어 있는 고체 배양기에 상기 각 균주의 배양액을 10 중량%로 접종한 후, 여기에 물을 45 내지 60 중량%로 첨가하였다. 이를 40 ℃에서 3 일 동안 교반시키면서 혐기적으로 고체발효를 수행하여 생균제 조성물을 제조하였으며, 이때 제조된 생균제 조성물은 본 발명의 균주가 1×108 cfu/g 이상으로 포함되도록 하였다.
<제조예 4: 사료용 조성물의 제조>
본 발명의 류코노스톡 메센테로이데스 서브스피시스 메센테로이데스 YSM1219 균주를 2.0 % 글루코스, 1.0 % 펩톤, 1.0 % 효모추출물, 0.2 % 제이인산, 0.05 % 황산마그네슘 및 0.05 % 시스테인이 함유된 배지에 접종하여 37 ℃에서 2일 동안 호기적으로 배양하였다. 각 균주의 배양액과 부형제인 탈지강, 대두분말을 1:1:1의 중량비로 단순 혼합한 후 영하 40 ℃ 이하에서 건조시켰으며, 건조된 혼합물을 분쇄하여 사료용 조성물을 제조하였다. 이때 제조된 사료용 조성물은 본 발명의 균주가 1×108 cfu/g 이상으로 포함되도록 하였다.
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<160> 1
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<210> 1
<211> 1442
<212> DNA
<213> Leuconostoc mesenteroides
<400> 1
atgcaagtcg aacgcacagc gaaaggtgct tgcacctttc aagtgagtgg cgaacgggtg 60
agtaacacgt ggacaacctg cctcaaggct ggggataaca tttggaaaca gatgctaata 120
ccgaataaaa cttagtgtcg catgacaaaa agttaaaagg cgcttcggcg tcacctagag 180
atggatccgc ggtgcattag ttagttggtg gggtaaaggc ctaccaagac aatgatgcat 240
agccgagttg agagactgat cggccacatt gggactgaga cacggcccaa actcctacgg 300
gaggctgcag tagggaatct tccacaatgg gcgaaagcct gatggagcaa cgccgcgtgt 360
gtgatgaagg ctttcgggtc gtaaagcact gttgtatggg aagaacagct agaataggaa 420
atgattttag tttgacggta ccataccaga aagggacggc taaatacgtg ccagcagccg 480
cggtaatacg tatgtcccga gcgttatccg gatttattgg gcgtaaagcg agcgcagacg 540
gtttattaag tctgatgtga aagcccggag ctcaactccg gaatggcatt ggaaactggt 600
taacttgagt gcagtagagg taagtggaac tccatgtgta gcggtggaat gcgtagatat 660
atggaagaac accagtggcg aaggcggctt actggactgc aactgacgtt gaggctcgaa 720
agtgtgggta gcaaacagga ttagataccc tggtagtcca caccgtaaac gatgaacact 780
aggtgttagg aggtttccgc ctcttagtgc cgaagctaac gcattaagtg ttccgcctgg 840
ggagtacgac cgcaaggttg aaactcaaag gaattgacgg ggacccgcac aagcggtgga 900
gcatgtggtt taattcgaag caacgcgaag aaccttacca ggtcttgaca tcctttgaag 960
cttttagaga tagaagtgtt ctcttcggag acaaagtgac aggtggtgca tggtcgtcgt 1020
cagctcgtgt cgtgagatgt tgggttaagt cccgcaacga gcgcaaccct tattgttagt 1080
tgccagcatt cagatgggca ctctagcgag actgccggtg acaaaccgga ggaaggcggg 1140
gacgacgtca gatcatcatg ccccttatga cctgggctac acacgtgcta caatggcgta 1200
tacaacgagt tgccaacccg cgagggtgag ctaatctctt aaagtacgtc tcagttcgga 1260
ttgtagtctg caactcgact acatgaagtc ggaatcgcta gtaatcgcgg atcagcacgc 1320
cgcggtgaat acgttcccgg gtcttgtaca caccgcccgt cacaccatgg gagtttgtaa 1380
tgcccaaagc cggtggccta accttttagg aaggagccgt ctaaggccgg accagatagg 1440
gg 1442
Claims (9)
- (ⅰ) 적숙기 도달시간이 50 내지 80 시간이고, (ⅱ) 적숙기 유지시간이 균주를 투입하지 않고 김치를 제조한 경우와 대비하여 20 내지 48 % 연장되는 특성을 가지며,
상기 적숙기는 김치의 pH가 4.0 내지 4.6 사이의 범위이고,
상기 적숙기 도달시간 및 적숙기 유지시간은 김치를 제조하고 20 ℃에서 24 시간 유지시킨 후 3 ℃에서 저장하는 조건에서 측정된 것이며,
서열번호 1의 16s rDNA 염기서열을 가지는 것을 특징으로 하는 류코노스톡 메센테로이데스 서브스피시스 메센테로이데스(Leuconostoc mesenteroides subsp. mesenteroides) YSM1219 [기탁번호: KFCC11613P]. - 삭제
- 삭제
- (ⅰ) 적숙기 도달시간이 50 내지 80 시간이고, (ⅱ) 적숙기 유지시간이 균주를 투입하지 않고 김치를 제조한 경우와 대비하여 20 내지 48 % 연장되는 특성을 가지며,
상기 적숙기는 김치의 pH가 4.0 내지 4.6 사이의 범위이고,
상기 적숙기 도달시간 및 적숙기 유지시간은 김치를 제조하고 20 ℃에서 24 시간 유지시킨 후 3 ℃에서 저장하는 조건에서 측정된 것이며,
서열번호 1의 16s rDNA 염기서열을 가지는 것을 특징으로 하는 류코노스톡 메센테로이데스 서브스피시스 메센테로이데스(Leuconostoc mesenteroides subsp. mesenteroides) YSM1219 [기탁번호: KFCC11613P]; 또는 그 배양물;을 함유하는 식품첨가용 조성물. - (ⅰ) 적숙기 도달시간이 50 내지 80 시간이고, (ⅱ) 적숙기 유지시간이 균주를 투입하지 않고 김치를 제조한 경우와 대비하여 20 내지 48 % 연장되는 특성을 가지며,
상기 적숙기는 김치의 pH가 4.0 내지 4.6 사이의 범위이고,
상기 적숙기 도달시간 및 적숙기 유지시간은 김치를 제조하고 20 ℃에서 24 시간 유지시킨 후 3 ℃에서 저장하는 조건에서 측정된 것이며,
서열번호 1의 16s rDNA 염기서열을 가지는 것을 특징으로 하는 류코노스톡 메센테로이데스 서브스피시스 메센테로이데스(Leuconostoc mesenteroides subsp. mesenteroides) YSM1219 [기탁번호: KFCC11613P]; 또는 그 배양물;을 함유하는 발효식품. - (ⅰ) 적숙기 도달시간이 50 내지 80 시간이고, (ⅱ) 적숙기 유지시간이 균주를 투입하지 않고 김치를 제조한 경우와 대비하여 20 내지 48 % 연장되는 특성을 가지며,
상기 적숙기는 김치의 pH가 4.0 내지 4.6 사이의 범위이고,
상기 적숙기 도달시간 및 적숙기 유지시간은 김치를 제조하고 20 ℃에서 24 시간 유지시킨 후 3 ℃에서 저장하는 조건에서 측정된 것이며,
서열번호 1의 16s rDNA 염기서열을 가지는 것을 특징으로 하는 류코노스톡 메센테로이데스 서브스피시스 메센테로이데스(Leuconostoc mesenteroides subsp. mesenteroides) YSM1219 [기탁번호: KFCC11613P]; 또는 그 배양물;을 함유하는 스타터(starter)를 첨가하여 발효시키는 발효식품의 제조방법. - (ⅰ) 적숙기 도달시간이 50 내지 80 시간이고, (ⅱ) 적숙기 유지시간이 균주를 투입하지 않고 김치를 제조한 경우와 대비하여 20 내지 48 % 연장되는 특성을 가지며,
상기 적숙기는 김치의 pH가 4.0 내지 4.6 사이의 범위이고,
상기 적숙기 도달시간 및 적숙기 유지시간은 김치를 제조하고 20 ℃에서 24 시간 유지시킨 후 3 ℃에서 저장하는 조건에서 측정된 것이며,
서열번호 1의 16s rDNA 염기서열을 가지는 것을 특징으로 하는 류코노스톡 메센테로이데스 서브스피시스 메센테로이데스(Leuconostoc mesenteroides subsp. mesenteroides) YSM1219 [기탁번호: KFCC11613P]; 또는 그 배양물;을 함유하는 스타터(starter)를 첨가하여 발효시키는 김치의 제조방법. - 제 7 항에 있어서,
상기 스타터(starter)를 소금에 절인 김치용 채소 및 양념과 혼합하여 김치를 제조하는 단계; 및 상기 김치를 발효시키는 단계;를 포함하고,
상기 김치를 발효시키는 단계는, 15 내지 30 ℃에서 18 내지 30 시간 발효하는 스타터 활성화 과정; 및 1 내지 10 ℃에서 3 내지 10일 발효하는 적숙화 과정;을 포함하는 것을 특징으로 하는 김치의 제조방법. - 삭제
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