KR101789155B1 - 발효시 높은 생균수를 갖는 락토바실러스 파라카제이 균주, 이를 포함하는 조성물 및 이를 이용한 발효 식품 제조 방법 - Google Patents
발효시 높은 생균수를 갖는 락토바실러스 파라카제이 균주, 이를 포함하는 조성물 및 이를 이용한 발효 식품 제조 방법 Download PDFInfo
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Abstract
본 명세서에는 신규한 락토바실러스 파라카제이 균주, 이를 포함하는 조성물 및 이를 이용하여 발효식품을 제조하는 방법이 개시된다. 본 발명의 일 측면인 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei) 균주는 번식력이 우수하여 배양시 생균수가 다른 균주에 비하여 높으며, 내산성이 우수하여 낮은 pH에서도 생존력이 우수하고, 내당성 및 내염성이 우수하다. 또한, 식중독 및 설사를 유발하는 유해균들에 대한 항균력도 우수하다. 따라서, 본 발명의 균주를 이용하면, 유산균이 지니는 효과가 극대화된 발효식품을 얻을 수 있다.
Description
본 명세서에는 신규한 락토바실러스 파라카제이 균주, 이를 포함하는 조성물 및 이를 이용하여 발효식품을 제조하는 방법이 개시된다.
일반적으로 유산균은 직접 혹은 간접적으로 식품에 첨가되어 이들의 대사산물인 유산에 의하여 식품의 저장성을 향상시키며, 식품의 향미와 조직을 개선한다고 알려져 있다. 또한, 발효식품을 통하여 섭취된 유산균은 장내로 유입된 후 병원성 미생물의 저해 및, 면역활성의 증진 등 숙주 동물에 많은 도움을 준다.
특히, 이 중에서 락토바실러스 속(Lactobacillus sp.) 미생물은 동형 또는 이형발효를 하는 젖산간균으로 사람을 포함한 동물의 장관 및 유제품이나 채소의 발효과정에서 흔히 볼 수 있다. 락토바실러스 속 미생물은 장내 pH를 산성으로 유지시켜 유해균의 번식을 억제하고 설사와 변비를 개선할 뿐만 아니라 면역기능, 비타민 합성, 항암작용, 혈청콜레스테롤 저하 등의 역할을 한다.
하지만, 유산균은 섭취 후 위산에 의해 90% 이상이 사멸되고, 위산에 생존한 유산균은 다시 담즙산에 의해 사멸되어, 최종 목적지인 장(腸)에 도착할 확률은 5% 정도에 불과하다.
따라서, 이를 개선하기 위해서는 높은 생균수를 가지고 위산에 내성이 있어, 장내에 도달되는 균수가 높고, 바람직하게는 항균 물질을 분비하여 유해균을 억제함으로써 장을 안정화시킬 수 있는 유산균의 개발이 요구된다.
일 측면에서, 본 발명의 목적은, 극한 환경에서도 생존력이 우수한, 유산균을 제공하는 것이다.
다른 측면에서, 본 발명의 목적은, 내산성, 내염성 및 내당성이 우수한 유산균을 제공하는 것이다.
다른 측면에서, 본 발명의 목적은, 유해균의 생장 억제력이 있는, 유산균을 제공하는 것이다.
다른 측면에서, 본 발명의 목적은, 인간의 장 건강을 향상시킬 수 있는 발효식품을 제공하는 것이다.
일 측면에서, 본 발명은, 9 중량%의 효모 추출물, 18 중량%의 펩톤, 18 중량%의 육추출물(beef extract) 및 36 중량%의 덱스트로스를 포함하고; 3~4 중량%의 시트르산 암모늄, 9 중량%의 아세트산 나트륨, 0.15~0.2 중량%의 황산마그네슘, 0.1 중량%의 황산망간 및 3~4 중량%의 디포타슘 소프세이트 중 하나 이상을 더 포함하고, pH가 6.0~6.5인 배지에서, 균주 5X107 CFU/ml를 접종하여, 35℃에서 24시간 배양한 경우, 생균수가 1.0X1012 CFU/ml 이상인, 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei) 균주를 제공한다.
일 측면에서, 본 발명은, 상기 균주, 그 파쇄물, 그 배양물 또는 그 추출물을 포함하는 조성물을 제공한다.
일 측면에서, 본 발명은, 상기 균주를 배양하는 단계를 포함하는 식품 제조방법을 제공한다.
본 발명의 일 측면인 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei) 균주는 번식력이 우수하여 배양시 생균수가 다른 균주에 비하여 높으며, 내산성이 우수하여 낮은 pH에서도 생존력이 우수하고, 내당성 및 내염성이 우수하다. 또한, 식중독 및 설사를 유발하는 유해균들에 대한 항균력도 우수하다. 따라서, 본 발명의 균주를 이용하면, 유산균이 지니는 효과가 극대화된 발효식품을 얻을 수 있다.
도 1은, 본 발명 균주의 계통도이다.
도 2는, 본 발명 균주와 락토바실러스 파라카제이(KCTC3510)의 생균수를 관찰한 결과를 보이는 도이다.
도 3은, 본 발명 균주(도 3a)와 락토바실러스 파라카제이(KCTC3510) 균주(도 3b)의 배양 형태를 보이는 도이다.
도 4는, pH2.5에서 배양시 본 발명 균주와 락토바실러스 파라카제이 균주의 생존률을 보이는 도이다.
도 5는, 본 발명 균주(도 5a)와 락토바실러스 파라카제이(KCTC3510) 균주(도 5b)의 내염성 실험 결과를 보이는 도이다.
도 6은. 본 발명 균주(도 6a)와 락토바실러스 파라카제이(KCTC3510) 균주(도 6b)의 내당성 실험 결과를 보이는 도이다.
도 7은, 발효 시간에 따른 생균수의 변화를 보이는 도이다.
도 2는, 본 발명 균주와 락토바실러스 파라카제이(KCTC3510)의 생균수를 관찰한 결과를 보이는 도이다.
도 3은, 본 발명 균주(도 3a)와 락토바실러스 파라카제이(KCTC3510) 균주(도 3b)의 배양 형태를 보이는 도이다.
도 4는, pH2.5에서 배양시 본 발명 균주와 락토바실러스 파라카제이 균주의 생존률을 보이는 도이다.
도 5는, 본 발명 균주(도 5a)와 락토바실러스 파라카제이(KCTC3510) 균주(도 5b)의 내염성 실험 결과를 보이는 도이다.
도 6은. 본 발명 균주(도 6a)와 락토바실러스 파라카제이(KCTC3510) 균주(도 6b)의 내당성 실험 결과를 보이는 도이다.
도 7은, 발효 시간에 따른 생균수의 변화를 보이는 도이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은, 일 측면에서, 9 중량%의 효모 추출물, 18 중량%의 펩톤, 18 중량%의 육추출물(beef extract) 및 36 중량%의 덱스트로스를 포함하고; 3~4 중량%의 시트르산 암모늄, 9 중량%의 아세트산 나트륨, 0.15~0.2 중량%의 황산마그네슘, 0.1 중량%의 황산망간 및 3~4 중량%의 디포타슘 소프세이트 중 하나 이상을 더 포함하고, pH가 6.0~6.5인 배지에서, 균주 5X107 CFU/ml를 접종하여, 35℃에서 24시간 배양한 경우, 생균수가 1.0X1012 CFU/ml 이상인, 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei) 균주이다.
상기와 같은 측면에서, 상기 배지는 락토바실러스 속 균주의 배양을 위한 것으로서,예컨대, MRS 브로쓰(MRS broth)일 수 있다.
일 구현예에서, 상기 균주는 9 중량%의 효모 추출물, 18 중량%의 펩톤, 18 중량%의 육추출물(beef extract) 및 36 중량%의 덱스트로스, 3~4 중량%의 시트르산 암모늄, 9 중량%의 아세트산 나트륨, 0.15~0.2 중량%의 황산마그네슘, 0.1 중량%의 황산망간 및 3~4 중량%의 디포타슘 소프세이트를 포함하고, pH가 6.0 ~6.5인 배지에서, 균주 5X107 CFU/ml를 접종하여 35℃에서 24시간 배양한 경우, 균주의 생균수가 1.3X1012 CFU/ml 이상이다. 또한, 일 구현예에서, 상기 균주를 상기 배지에서, 균주 5X107 CFU/ml를 접종하여, 35℃에서 22시간 배양한 경우, 균주의 생균수는 1.4X1012 CFU/ml 이상이다.
상기와 같은 측면에서, 상기 균주는, 35℃ 및 pH2.5에서, 균주 배양 직후의 생균수 에 대한 균주 배양 2시간 경과 후의 생균수의 비율은 0.9 이상일 수 있다. 에컨대, 상기 균주 배양 직후의 생균수에 대한 균주 배양 2시간 경과 후의 생균수의 비율은, 0.9 이상, 0.91 이상, 0.93 이상, 0.95 이상, 0.97 이상, 또는 0.99 이상일 수 있다, 일 구현예에서, 상기 배지에, 염화수소를 첨가하여 pH를 2.5로 조절하고, 35℃ 및 pH2.5에서, 2시간 동안 배양했을 때, 균주 배양 직후의 생균수에 대한 균주 배양 2시간 경과 후의 생균수의 비율은 0.9 이상일 수 있다. 즉, 상기 균주는 내산성이 있기 때문에, 낮은 pH 환경의 위장을 거치더라도, 사멸하지 않고, 장 내에서 활동할 수 있다.
또한, 상기 균주는, 35℃ 및 6%(w/v)의 염분농도에서 20시간 배양한 생균수에 대한, 35℃ 및 0%(w/v)의 염분농도 20시간 배양한 생균수의 비율이 0.35 이상일 수 있다. 일 구현예에서, 상기 균주는, 상기 배지에 염화나트륨을 첨가하여, 염도가 6%(w/v)인 배지에서, 35℃ 온도에서, 20시간 이상 배양한 경우의 생균수에 대한, 35℃ 및 0%(w/v)의 염분농도 20시간 배양한 생균수의 비율이 0.35 이상, 0.36 이상, 0.37 이상, 0.38 이상, 0.39 이상 또는 0.4 이상일 수 있다. 일 구현예에서, 락토바실러스 파라카제이(기탁번호: KCTC3510) 균주는 6%의 염도에서 배양하여 측정한 탁도가 약 4 맥파란 단위(McFarland units)인데 비하여, 본 발명 균주는 8 맥파란 단위여서, 본 발명 균주가 다른 바실러스 파라카제이 균주에 비하여, 내염성이 우수함을 알 수 있다. 일 구현예에서, 상기 균주는 내염성이 우수하기 때문에, 간장, 된장 등의 소스, 젓갈, 김치 등의 염장류 식품에서 유용하게 사용될 수 있다.
또한, 상기 균주는, 0.5 맥파란 단위의 균을 접종하여, 35℃ 및 25%(w/v)의 당농도에서 18시간 배양한 후의 세포탁도가 9.0 맥파란 단위 이상일 수 있다.
상기와 같은 측면에서, 상기 균주는 배양시 응집한 형태로 생장하는 것일 수 있다. 상기 균주는, 응집한 형태로 생장하여, 높은 생균수를 유지할 수 있다.
일 측면에서, 상기 균주는 항균 활성을 가질 수 있다. 항균 활성이란, 균주 자신 외의 다른 균주의 생육을 억제하고, 나아가 사멸시킬 수 있는 능력을 의미할 수 있다. 상기 균주는, 식중독 또는 설사 등의 발병 요인이 되는 균주에 대한 항균 활성을 지닐 수 있다. 예컨대, 상기 항균의 대상인 균은, 식품 유래 병원성 미생물을 포함할 수 있다. 예컨대, 상기 항균의 대상인 균은, 대장균(Escherichia coli), 포도상구균(Staphylococcus aureus), 세레우스균(Bacillus cereus), 녹농균(Pseudomonas aeruginosa) 및 리스테리아 모노사이토제니스(Listeria monocytogenes) 중 하나 이상일 수 있다.
상기와 같은 측면에서, 상기 균주는, 무 및 배추 중 하나 이상을 포함하는 채소의 발효물로부터 유래한 것일 수 있다. 상기 발효물은 예컨대, 김치일 수 있다.
또한, 상기 균주는 서열번호 1의 서열을 포함할 수 있다. 상기 서열번호 1의 서열은, 16s rDNA의 서열을 포함할 수 있다.
또한, 상기 균주는, 락토바실러스 파라카제이 SMB092일 수 있고, 기탁번호 KCCM11557P의 균주일 수 있다.
본 발명은, 다른 측면에서, 상기 균주, 그 파쇄물, 그 배양물 또는 그 추출물을 포함하는 조성물이다.
본 명세서에서 균주 파쇄물이란, 균주 자체를 화학적 또는 물리적 힘에 의하여 파쇄하여 얻은 산물을 의미할 수 있다.
본 명세서에서 배양물이란, 균주를 배양한 배지 내에 포함되어 있는 모든 물질을 포함하는 물질을 의미할 수 있으며, 예컨대 균주 배양의 결과물인 대사물 또는 분비물을 포함하는 물질 또는 그 파쇄물을 의미할 수 있다.
본 명세서에서, 추출물이란, 균주 자체, 균주의 파쇄물, 그 배양물 또는 이들의 혼합물을 추출용매를 이용하여 추출한 산물을 의미할 수 있다. 추출용매는 제한되지 않고 공지된 추출용매를 사용할 수 있다.
상기 조성물은, 항균용 조성물일 수 있다. 항균의 대상은, 식중독 또는 설사를 유도하는 미생물을 포함할 수 있고, 대장균(Escherichia coli), 포도상구균(Staphylococcus aureus), 세레우스균(Bacillus cereus), 녹농균(Pseudomonas aeruginosa) 및 리스테리아 모노사이토제니스(Listeria monocytogenes) 중 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 상기 조성물은, 식품 조성물 또는 약학적 조성물일 수 있다. 상기 식품 조성물은, 발효 식품을 포함할 수 있다. 예컨대, 상기 발효식품은, 주류, 빵류, 식초, 된장, 고추장 및 간장 등의 콩발효식품, 김치 및 젓갈 등의 소금절임류 등을 포함할 수 있다. 예컨대, 발효식품은, 유산균 발효 식품일 수 있다. 유산균 발효 식품은, 유산균을 직접적으로 이용하여 재료를 발효시킨 것을 포함할 뿐만 아니라, 다른 균주에 의해 발효된 식품에 상기 균주가 첨가된 식품도 포함할 수 있다. 유산균 발효 식품은 예컨대, 치즈, 요구르트, 또는 발효 빵 등일 수 있다.
또한, 상기 식품 조성물은 건강기능식품일 수 있다. 건강기능식품은, 예컨대, 프로바이오틱스 제품일 수 있다. 프로바이오틱스 제품은 균주를 포함하는 발효유, 과립 또는 분말의 형태일 수 있다.
본 발명의 일 관점에 따른 식품 조성물의 제형은 특별히 한정되지 않으나, 예를 들어, 정제, 과립제, 분말제, 드링크제와 같은 액제, 캐러멜, 겔, 바 등으로 제형화될 수 있다. 식품 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 증진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 포함할 수 있다. 각 제형의 식품 조성물은 유효 성분 이외에 해당 분야에서 통상적으로 사용되는 성분들을 제형 또는 사용 목적에 따라 당업자가 어려움 없이 적의 선정하여 배합할 수 있으며, 다른 원료와 동시에 적용할 경우 상승 효과가 일어날 수 있다.
본 발명의 일 관점인 약학적 조성물에 있어서, 약학 조성물은 경구 또는 비경구의 여러 가지 제형일 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 연질 또는 경질 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 하나 이상의 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로오스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 스테아린산 마그네슘, 탈크 등과 같은 윤활제들도 사용된다. 경구투여를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 일 관점에 있어서, 조성물은 목적하는 바에 따라 비경구 투여하거나 경구 투여할 수 있으며, 하루에 체중 1 ㎏당 0.1~500 ㎎, 바람직하게는 1~100 ㎎의 양으로 투여되도록 1 내지 수회에 나누어 투여할 수 있다. 특정 환자에 대한 투여용량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강 상태, 식이, 투여 시간, 투여 방법, 배설률, 질환의 중증도 등에 따라 변화될 수 있다.
본 발명의 일 관점에 따른 약학 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 연질 또는 경질 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 주사제 및 멸균 주사용액 등을 비롯하여 약제학적 제제에 적합한 어떠한 형태로든 제형화하여 사용될 수 있다.
본 발명의 일 관점에 따른 조성물은, 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 비경구, 경구 등의 다양한 경로로 투여될 수 있으며, 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 경피(trandermally), 정맥, 근육, 피하주사에 의해 투여될 수 있다.
본 발명은 다른 측면에서, 상기 균주를 배양하는 단계를 포함하는 식품 제조방법이다.
상기와 같은 측면에서, 상기 방법은, 상기 균주, 그 배양물, 그 파쇄물 또는 그 추출물을 식품에 첨가하는 단계를 더 포함할 수 있다.
이하, 하기의 실시예를 통하여 본 발명을 보다 구체적으로 설명한다. 그러나, 하기 실시예는 본 발명에 대한 이해를 돕기 위해 예시의 목적으로만 제공된 것일 뿐, 본 발명의 범주 및 범위가 이에 한정되지 않는다.
[실시예 1] 균주의 분리 및 선별
[실시예 1-1] 균주의 분리
본 발명 유산균의 분리를 위해 1차 미생물 분리와 2차 유산균 분리로 나눠서 진행하였다. 1차로 미생물을 분리하기 위하여, 경기(서울), 강원(강릉), 충북(청주), 경북(대구), 경남(창원), 전북(전주) 총 6개 지역의 전통시장에서 2일 ~ 7일 정도 숙성된 김치3종(배추 김치, 총각무 김치, 동치미)을 액상과 함께 곱게 간 후, 연속 희석법을 이용하여 멸균 생리식염수에 105~108배 희석한 후, 희석액 0.1ml을 유산균 분리용 한천배지인 MRS broth(Difco, USA) 에 도말한 후 30℃에서 48시간 배양하였다. 2차로 유산균을 분리하기 위하여, 1차에서 분리된 미생물을, pH 5.2 이하일 때 노란색으로 변화하는 BCP agar(Eiken, Japan) 배지에 접종한 뒤, 혐기 조건에서 30℃에서 48시간 배양하여, 노란색의 환이 생기는 미생물을 분리하였다.
[실시예 1-2] 균주의 선별
유산균의 선별을 위해 5% NaCl을 첨가한 MRS 배지에서 30에서 48시간 배양 후 집락을 형성한 내염성 유산균만 선별하였고, pH 4.0으로 조절한 MRS broth에 1% 접종 후, 30에서 24시간 배양 후 생육한 유산균만 선별하였고, 100ml의 MRS broth에 접종하여 30℃℃에서 48시간 배양 후 1010 이상의 생균수 결과를 보이는 유산균만 선별하여, 최종 8종의 유산균을 선별하였다(표 1).
| 분리시료 | 분리 | 내염성 (5% 이상) |
내산성(pH4.0) | 최대 생균수 (1010 이상) |
| 배추김치(3종) | 150 | 70 | 26 | 3 |
| 총각무김치(3종) | 142 | 81 | 17 | 4 |
| 동치미(3종) | 74 | 53 | 19 | 1 |
상기 8종의 균주 중 통상의 유산균에서는 관찰되지 않는 생장 특성(즉, 응집되어 생장함)을 갖는 균주(락토바실러스 파라카제이 SMB092)를 최종 선택하였다.
[실시예 2] 균주의 동정
대표적인 universal primer인 27F(5'-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3'(서열번호 2))와 1429R(5'-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3'(서열번호 3)) primer를 사용하여 PCR을 수행하여 16S rDNA (서열번호 1)를 증폭시킨 뒤, Wizard DNA 정제 키트를 이용하여 정제하고, 제노텍㈜(대전)에 염기서열의 분석을 의뢰하였다. NCBI Blast와 EzTaxon server 2.1(Jongsik Chun)에서 염기서열의 상동성 비교를 통해 동정한 결과 락토바실러스 파라카제이 ATCC 25302(Lactobacillus paracasei subsp. ATCC 25302(T))와 99.65% 유사한 것으로 나타났다.
그 후, EzTaxon server 2.1(Jongsik Chun)에서 선별 균주와 유사한 균주들의 16s rRNA 정보를 메가 프로그램(MEGA program)을 이용하여 염기 서열들을 정렬하고 시각적 관찰과 수작업으로 보정한 후 Maximum Likelihood 방법을 사용하여 계통도를 작성하였다(도 1).
상기 결과에 의해, 본 발명의 유산균은 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei)로 동정되었다.
한편, API Kit(50CHB, ZYM) 테스트를 통해 락토바실러스 파라카제이 ATCC 25302 균주와는 상이한 균주임을 확인하였다(표 2).
| API kit test | 락토바실러스 파라카제이 ATCC 253023510 | 락토바실러스 파라카제이 SMB092 |
| L-Arabinose | + | - |
| b - galactosidase | 0 | 2 |
[실시예 3] 생균수 측정
본 발명의 균주(SMB092 균주)와 KCTC에서 분양한 락토바실러스 파라카제이의 기준주인 Lactobacillus paracasei subsp. paracasei KCTC3510(Lactobacillus paracasei subsp. paracasei ATCC 25302)의 최대 생균수 비교를 위하여, MRS broth (Difco, USA)에 35에서 40시간 이상 배양하면서 시간별로 측정한 생균수 값을 표에 나타내었다. 그 결과, 본 발명 균주는 최대 1012CFU/ml까지 자랐으며, KCTC3510은 1010CFU/ml까지 자라, 본 발명 균주의 최대 생균수가 기준주보다 높은 것으로 나타났다.
[실시예 4] 생장 형태 관찰
본 발명의 유산균 배양시 생장 형태를 비교하기 위하여, MRS 액체 배지에 35에서 24시간 배양한 본 발명 균주와 기준주(KCTC3510)의 배양액을 각각 2% 접종 후, 35에서 24시간 동안 진탕 배양 후의 모습을 관찰하였다. 그 결과를 사진으로 나타내었다(도 3). 기준주는 고르게 퍼져 자라는 것으로 나타났으나, 본 발명의 유산균 SMB092는 입자성을 보이며 응집되는 형태로 자라는 것을 알 수 있었다.
[실시예 5] 항균력 관찰
본 발명 균주의 항균력을 조사하였다. 실험에 사용된 지시균들은 대장균(Escherichia coli KCTC 2441), 포도상구균(Staphylococcus aureus KCTC 3881), 세레우스균(Bacillus cereus KCTC 3624), 녹농균(Pseudomonas aeruginosa KCTC 1750), 리스테리아균(Listeria monocytogenes KCTC 3569) 5종으로 모두 한국생명공학연구원 생물자원센터에서 분양받아 사용하였다.
MRS(Difco, USA) agar 배지를 제조하여 agar 배지 중앙에 본 발명 균주를 점모양으로 접종한 후 35에서 24시간 배양하였다. 지시균들은 각각 Tryptic soy(Difco, USA) broth 배지에 접종하여 30에서 24시간 배양한 후, 멸균하여 40로 식힌 Tryptic soy agar 배지에 5%씩 접종하였다. 지시균이 접종된 agar 배지를 미리 본 발명 균주를 접종하여 배양해놓은 MRS agar 배지 위에 5ml씩 분주하여 굳힌 후, 30에서 24시간 배양하였다. 배양 후 저지환 생성 크기를 관찰한 결과, SMB092는 유해균 5종에 대하여 모두 항균력을 가지고 있었다(표 5).
| 포도상구균 | 세레우스균 | 농녹균 | 리스테리아균 | 대장균 | |
| SMB092 | 26 | 34 | 36 | 26 | 27 |
* 단위: 밀리미터(mm)
[실시예 6] 내산성 관찰
본 발명의 유산균 SMB092의 내산성을 확인하기 위하여, 1M HCl을 이용하여 pH 2.5로 조절 한 MRS broth에 35에서 24시간 배양한 두 유산균을 접종하여 0시간과 2시간 경과 후의 생균수를 측정하여, 균주의 생존율을 확인하였다(도 4). SMB092와 pH 2.5에서 2시간동안 생균수가 감소하지 않아, 위산에서도 살아 남을 수 있는 내산성을 가졌다.
[실시예 7] 내염성 관찰
본 발명의 균주와 기준주의 내염성을 확인하기 위하여, NaCl을 첨가하여, 염농도를 0%, 2%, 4%, 6%, 8%, 10%가 되도록 조절 한 MRS broth에 35에서 24시간 배양한 두 유산균을 접종하여 시간별 밀도를 측정하여, 생장율을 확인하였다. 그 결과, 본 발명 균주는 6% 이상의 염도에서도 우수한 생장률을 보여, 본 발명 균주가 기준주에 비하여 내염성이 우수함을 알 수 있었다(도 5).
[실시예 8]
본 발명의 균주와 기준주의 내당성을 확인하기 위하여, 글루코스를 첨가하여, 당농도를 2%(MRS 배지 기본 당 농도), 5%, 10%, 15%, 20%, 25%가 되도록 조절 한 MRS broth에 35에서 24시간 배양한 두 유산균을 접종하여 시간별 탁도를 맥파랜 농도계(McFarland densitometer)로 측정하여, 생장율을 확인하였다. 본 발명 균주는 높은 당농도에서도 우수한 생육속도와 높은 생균수를 나타내어, 기준주 보다 내당성이 더 강함을 알 수 있었다(도 6).
[실시예 9] 간장 발효액 제조시 생균수 관찰 및 산도 관찰
본 발명의 유산균과 기준주를 이용한 간장 발효를 위하여, 글루코스 2~3%, 염농도 2~2.5%의 기준으로 간장을 10~15% 첨가 후, 각 유산균을 1~3% 접종하였다. 접종 후, 30~35에서 2일간 발효하면서 생균수를 비교한 결과, 간장 발효액에서도 본 발명 균주(SMB092)균주가 기준주에 비하여 높은 생균수를 보임을 알 수 있었다. 특히, 최대 1013CFU/ml의 생균수를 보였으며, 발효 완료 후에도 1012CFU/ml 이상의 높은 생균수를 유지하였다(도 7). 한편, 간장 발효 후 젖산에 대한 산도(%)를 확인한 결과, 기준주가 1.5%의 적정 산도를 보인 반면, 본 발명의 균주는 1.89%의 높은 적정 산도를 보여서, 본 발명 균주가 높은 적정 산도를 얻기에 더 유리함을 알 수 있었다.
본 발명의 일 관점에 따른 조성물의 제형예를 아래에서 설명하나, 다른 여러 가지 제형으로도 응용 가능하며, 이는 본 발명을 한정하고자 함이 아닌 단지 구체적으로 설명하고자 함이다.
[제형예 1] 간장
| 성분 | 함량(중량%) |
| 실시예 1의 균주 분말 | 0.1 |
| 간장 | 13.0 |
| 포도당 | 2.0 |
| 합성보존료 | 1.0 |
| 효모추출분말 | 1.3 |
| 정제수 | 잔량 |
| 총합 | 100.0 |
[제형예 2] 발효고추양념
| 성분 | 함량(중량%) |
| 실시예 1의 균주 분말 | 0.1% |
| 홍고추 | 40.0 |
| 된장 | 7.0 |
| 정제소금 | 2.0 |
| 알파대두분 | 5.0 |
| 고춧가루 | 5.0 |
| 정제수 | 잔량 |
| 총합 | 100.0 |
[제형예 3] 곡물발효음료
| 성분 | 함량(중량%) |
| 미분 | 8.0 |
| 펙틴 | 0.1 |
| 액당화 효소 | 0.03 |
| 실시예 1의 균주 분말 | 0.1 |
| 감미료 | 0.05 |
| 정제수 | 잔량 |
| 총합 | 100.0 |
<110> SAMPIO FOOD COMPANY
<120> Lactobacillus paracasei having high viable cell count in
fermentation, composition comprising the same, and method for
manufacturing fermented food using the same
<130> 16P202IND
<160> 3
<170> KopatentIn 2.0
<210> 1
<211> 1447
<212> DNA
<213> 16s rDNA of SMB092
<400> 1
tacatgcaag tcgaacgagt tctcgttgat gcatcgtgct tgcaccgaga ttcaacatgg 60
aacgagtggc ggacgggtga gtaacacgtg ggtaacctgc ccttaagtgg gggataacat 120
ttggaaacag atgctaatac cgcatagatc caagaaccgc atggttcttg gctgaaagat 180
ggcgtaagct atcgcttttg gatggacccg cggcgtatta gctagttggt gaggtaacgg 240
ctcaccaagg cgatgatacg tagccgaact gagaggttga tcggccacat tgggactgag 300
acacggccca aactcctacg ggaggcagca gtagggaatc ttccacaatg gacgcaagtc 360
tgatggagca acgccgcgtg agtgaagaag gctttcgggt cgtaaaactc tgttgttgga 420
gaagaatggt cggcagagta actgttgtcg gcgtgacggt atccaaccag aaagccacgg 480
ctaactacgt gccagcagcc gcggtaatac gtaggtggca agcgttatcc ggatttattg 540
ggcgtaaagc gagcgcaggc ggttttttaa gtctgatgtg aaagccctcg gcttaaccga 600
ggaagcgcat cggaaactgg gaaacttgag tgcagaagag gacagtggaa ctccatgtgt 660
agcggtgaaa tgcgtagata tatggaagaa caccagtggc gaaggcggct gtctggtctg 720
taactgacgc tgaggctcga aagcatgggt agcgaacagg attagatacc ctggtagtcc 780
atgccgtaaa cgatgaatgc taggtgttgg agggtttccg cccttcagtg ccgcagctaa 840
cgcattaagc attccgcctg gggagtacga ccgcaaggtt gaaactcaaa ggaattgacg 900
ggggcccgca caagcggtgg agcatgtggt ttaattcgaa gcaacgcgaa gaaccttacc 960
aggtcttgac atcttttgat cacctgagag atcaggtttc cccttcgggg gcaaaatgac 1020
aggtggtgca tggttgtcgt cagctcgtgt cgtgagatgt tgggttaagt cccgcaacga 1080
gcgcaaccct tatgactagt tgccagcatt tagttgggca ctctagtaag actgccggtg 1140
acaaaccgga ggaaggtggg gatgacgtca aatcatcatg ccccttatga cctgggctac 1200
acacgtgcta caatggatgg tacaacgagt tgcgagaccg cgaggtcaag ctaatctctt 1260
aaagccattc tcagttcgga ctgtaggctg caactcgcct acacgaagtc ggaatcgcta 1320
gtaatcgcgg atcagcacgc cgcggtgaat acgttcccgg gccttgtaca caccgcccgt 1380
cacaccatga gagtttgtaa cacccgaagc cggtggcgta acccttttag ggagcgagcc 1440
gtctaat 1447
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> Primer(27F)
<400> 2
agagtttgat cmtggctcag 20
<210> 3
<211> 22
<212> DNA
<213> Primer(1429R)
<400> 3
tacggytacc ttgttacgac tt 22
Claims (18)
- 9 중량%의 효모 추출물, 18 중량%의 펩톤, 18 중량%의 육추출물(beef extract) 및 36 중량%의 덱스트로스를 포함하고,
3~4 중량%의 시트르산 암모늄, 9 중량%의 아세트산 나트륨, 0.15~0.2 중량%의 황산마그네슘, 0.1 중량%의 황산망간 및 3~4 중량%의 디포타슘 소프세이트 중 하나 이상을 더 포함하고, pH가 6.0 내지 6.5인 배지에서,
균주 5.0X107 CFU/ml를 접종하여, 35℃에서 24시간 배양한 경우, 생균수가 1.0X1012 CFU/ml 이상인, 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei) SMB092(수탁번호: KCCM11557P)균주. - 제1항에 있어서,
상기 균주는,
35℃ 및 pH2.5에서, 균주 배양 직후의 생균수에 대한 균주 배양 2시간 경과 후의 생균수의 비율이 0.9 이상인, 락토바실러스 파라카제이 SMB092(수탁번호: KCCM11557P) 균주. - 제1항에 있어서,
상기 균주는,
35℃ 및 0%(w/v)의 염분농도에서 20시간 배양 후의 생균수에 대한 35℃ 및 6%(w/v)의 염분농도에서 20시간 배양 후의 생균수의 비율이 0.35 이상인, 락토바실러스 파라카제이 SMB092(수탁번호: KCCM11557P) 균주. - 제1항에 있어서,
상기 균주는,
0.5 맥파란 단위(McFarland units)의 균을 접종하여, 35℃ 및 25%(w/v)의 당농도에서 18시간 배양한 후의 세포의 탁도가 9.0 맥파란 단위 이상인, 락토바실러스 파라카제이 SMB092(수탁번호: KCCM11557P) 균주. - 제1항에 있어서,
상기 균주는 배양시 응집한 형태로 생장하는 것인, 락토바실러스 파라카제이 SMB092(수탁번호: KCCM11557P) 균주. - 제1항에 있어서,
상기 균주는, 대장균(Escherichia coli), 포도상구균(Staphylococcus aureus), 세레우스균(Bacillus cereus), 녹농균(Pseudomonas aeruginosa) 및 리스테리아 모노사이토제니스(Listeria monocytogenes) 중 하나 이상의 식품 유래 병원 성 미생물에 대하여 항균 활성을 갖는, 락토바실러스 파라카제이 SMB092(수탁번호: KCCM11557P)균주. - 제1항에 있어서,
상기 균주는, 무 및 배추 중 하나 이상을 포함하는 채소의 발효물로부터 유래한 것인, 락토바실러스 파라카제이 SMB092(수탁번호: KCCM11557P) 균주. - 제1항에 있어서,
상기 균주는,
서열번호 1의 서열을 포함하는, 16s rDNA를 포함하는, 락토바실러스 파라카제이 SMB092(수탁번호: KCCM11557P) 균주. - 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항의 균주, 그 파쇄물, 그 배양물 또는 그 추출물을 포함하는 식품 조성물.
- 제9항에 있어서,
상기 식품은 발효식품을 포함하는, 식품 조성물. - 제10항에 있어서,
상기 발효는 유산균 발효이며, 상기 유산균은 상기 락토바실러스 파라카제이 SMB092(수탁번호: KCCM11557P) 균주인, 식품 조성물. - 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항의 균주, 그 파쇄물, 그 배양물 또는 그 추출물을 포함하며, 대장균(Escherichia coli), 포도상구균(Staphylococcus aureus), 세레우스균(Bacillus cereus), 녹농균(Pseudomonas aeruginosa) 및 리스테리아 모노사이토제니스(Listeria monocytogenes) 중 하나 이상의 식품 유래 병원성 미생물에 항균활성이 있는, 상기 식품 유래 병원성 미생물에 의한 감염 예방, 완화 또는 치료용 약학 조성물.
- 제1 내지 제8항 중 어느 한 항의 균주를 배양하는 단계를 포함하는, 식품 제조방법.
- 제13항에 있어서,
상기 균주, 그 배양물, 그 파쇄물 또는 그 추출물을 식품에 첨가하는 단계를 더 포함하는, 식품 제조방법. - 삭제
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
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| KR1020160071162A KR101789155B1 (ko) | 2016-06-08 | 2016-06-08 | 발효시 높은 생균수를 갖는 락토바실러스 파라카제이 균주, 이를 포함하는 조성물 및 이를 이용한 발효 식품 제조 방법 |
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| KR1020160071162A KR101789155B1 (ko) | 2016-06-08 | 2016-06-08 | 발효시 높은 생균수를 갖는 락토바실러스 파라카제이 균주, 이를 포함하는 조성물 및 이를 이용한 발효 식품 제조 방법 |
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ID=60301217
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| KR1020160071162A KR101789155B1 (ko) | 2016-06-08 | 2016-06-08 | 발효시 높은 생균수를 갖는 락토바실러스 파라카제이 균주, 이를 포함하는 조성물 및 이를 이용한 발효 식품 제조 방법 |
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| KR (1) | KR101789155B1 (ko) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20220101272A (ko) | 2021-01-11 | 2022-07-19 | (주)지에프씨생명과학 | 숙취 해소 효능을 갖는 락토바실러스 플란타룸 gfc_b001 균주 및 이를 유효성분으로 포함하는 식품 조성물 |
| WO2022265447A1 (ko) * | 2021-06-18 | 2022-12-22 | 한국생명공학연구원 | 락티카제이바실러스 속 또는 락토바실러스 속 균주를 유효성분으로 포함하는 암 진단, 예방 또는 치료용 조성물 |
-
2016
- 2016-06-08 KR KR1020160071162A patent/KR101789155B1/ko active IP Right Grant
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