KR101650328B1

KR101650328B1 - 바이오제닉 아민 분해 활성 및 유해 미생물에 대한 항균 활성이 있는 페디오코커스 펜토사세우스 균주 및 이의 용도

Info

Publication number: KR101650328B1
Application number: KR1020140128798A
Authority: KR
Inventors: 김용상; 오현화; 엄태붕; 정도연
Original assignee: 재단법인 발효미생물산업진흥원; 순창군
Priority date: 2014-09-26
Filing date: 2014-09-26
Publication date: 2016-08-23
Also published as: KR20160036784A

Abstract

본 발명은 장류로부터 분리된, 바이오제닉 아민(biogenic amine) 분해 활성 및 유해 미생물에 대한 항균 활성이 있는 페디오코커스 펜토사세우스(Pediococcus pentosaceus) SRCM 100743 균주(KCCM11571P), 상기 균주를 포함하는 식품, 상기 균주 또는 이의 배양액을 스타터 균주로 이용하여 장류를 제조하는 방법, 상기 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 함유하는 장류 제조용 미생물 제제, 상기 균주 또는 이의 배양액을 장류에 처리하는 단계를 포함하는 장류 유해 미생물 제어 방법 및 상기 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 함유하는 유해미생물에 대한 항균용 조성물을 제공한다.

Description

바이오제닉 아민 분해 활성 및 유해 미생물에 대한 항균 활성이 있는 페디오코커스 펜토사세우스 균주 및 이의 용도{Pediococcus pentosaceus strain having biogenic amine degradation activity and antimicrobial activity against pathogenic microorganism and uses thereof}

본 발명은 바이오제닉 아민 분해 활성 및 유해 미생물에 대한 항균 활성이 있는 페디오코커스 펜토사세우스 균주 및 이의 용도에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 장류로부터 분리된, 바이오제닉 아민(biogenic amine) 분해 활성 및 유해 미생물에 대한 항균 활성이 있는 페디오코커스 펜토사세우스 SRCM 100743 균주(KCCM11571P), 상기 균주를 포함하는 식품, 상기 균주 또는 이의 배양액을 스타터 균주로 이용하여 장류를 제조하는 방법, 상기 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 함유하는 장류 제조용 미생물 제제, 상기 균주 또는 이의 배양액을 장류에 처리하는 단계를 포함하는 장류 유해 미생물 제어 방법 및 상기 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 함유하는 유해미생물에 대한 항균용 조성물에 관한 것이다.

바이오제닉 아민(Biogenic amines)은 인체에서 생합성되는 미량의 필수 생리물질로서 합성 분해의 대사과정을 통해 일정한 균형을 이루고 있다. 이들은 미생물에 의한 발효과정 중 흔히 생성되는데 아미노산 탈탄산효소 반응으로 히스타민(histamine), 티라민(tyramine) 류의 모노아민과 퓨트레신(putrescine), 카다베린(cadaverine) 류의 디아민을 생성한다. 따라서 식품을 통해 인체 분해 한도를 넘는 양을 섭취할 때는 히스타민의 경우 혈압 저하와 알레르기, 티라민은 혈압 상승과 두통을 유발하며, 퓨트레신과 카다베린은 장내 미생물 대사를 통해 발암물질인 니트로소피페리딘(nitrosopiperidine), 니트로소피롤리딘(nitrosopyrrolidine)으로 전환될 수 있다.

한국인이 섭취하는 주 식품을 보면 김치, 장류, 젓갈, 막걸리, 절임류 등으로 이들은 모두 미생물 발효를 통해 만들어지기 때문에 바이오제닉 아민 과량 섭취에 따른 인체 안전성이 문제가 되었다. 이에 따라 2007년 식품의약품안전처(MFDS)는 주요 발효 식품을 대상으로 바이오제닉 아민 함량을 조사하였고, 그 결과 한국인의 바이오제닉 아민 섭취량 대부분은 전통 장류, 김치, 젓갈로부터 기인되며 이들 식품에서 높은 함량은 인체에 해로운 수준임을 보고하였다. 유럽의 경우에도 주 발효 식품인 포도주, 치즈, 소시지 등에서 바이오제닉 아민 함량이 높게 나타나 2011년 유럽 연합은 발효식품의 바이오제닉 아민 저감화를 위한 프로젝트를 진행했으며(BIAMFOOD #211441, 2008), 2013년 FAO/WHO 합동 전문가회의에서는 어류 내 히스타민 허용 한도를 200mg/kg 이내로 권고하였다(FAO/WHO, 2013).

발효 식품 내에 바이오제닉 아민의 함량은 합성 효소인 아미노산 탈탄산효소 활성과 분해 효소인 바이오제닉 아민 산화효소 활성에 의해 결정된다. 아미노산 탈탄산효소는 바실러스, 락토바실러스, 프로테우스, 페디오코커스, 스트렙토코커스를 포함하는 대부분의 발효 관련 미생물들에서 발견되었고, 티로신 탈탄산효소, 히트티딘 탈탄산효소, 오르니틴 탈탄산효소, 리신 탈탄산효소 등의 발현양은 발효 과정 중의 아미노산 농도, 당 농도, 온도, pH, 산소 농도, 염 농도에 의해 영향을 받는 것으로 알려졌다. 유산균은 식품의 pH를 낮추면서 동시에 항균 물질을 생산해 부패 미생물을 줄이는 역할을 하며, 대사과정을 통해 풍미를 높이는 주요 발효균이다. 하지만 소시지, 포도주, 치즈 등의 발효 식품에서 발견되는 유산균인 락토바실러스, 페디오코커스, 스트렙토코커스는 바이오제닉 아민 생산에 주 역할을 하는 것으로 보고되었다. 바이오제닉 아민을 분해하는 유산균으로 락토바실러스 플란타룸이 분리되었다. 국내에서는 전통 장류에서 분리한 바실러스 리케니포르미스, 바실러스 서틸리스, 바실러스 아밀로리퀘파시엔스가 히스타민, 티라민, 퓨트레신, 카다베린을 분해하는 것으로 알려졌지만, 유산균에 의한 바이오제닉 아민 분해 연구는 아직 보고된 바 없다.

다수의 미생물이 관여하는 장류 발효의 경우 미생물의 대사 제어는 어려운 일이기 때문에 우점 미생물의 역할은 중요하다. 최근 파이로시퀀싱(pyrosequencing)에 의해 수행된 메주와 된장의 세균 군집 구조를 보면 우점 유산균으로 메주에서 락토바실러스, 페디오코커스, 류코노스톡(Leuconostoc), 바이셀라(Weissella), 엔테로코커스가, 된장에서 테트라게노코커스(Tetragenococcus)가 주로 발견되었다. 이의 해결 방안은 MFDS의 GRAS (Generally Recognized As Safe) 균주이면서도 바이오제닉 아민 분해능력이 크며 유해균 억제 능력을 지닌 유산 균주를 분리하는 일이다. Nagoya 의정서에 따라 균주 사용료를 지불해야 하는 현 상황에서, 우리는 국내 토착미생물로서 식품 안전성이 검증된 유산균을 선발함으로서 한국 전통장류의 품질 고급화를 이루는데 연구의 목표를 두었다.

한편, 한국등록특허 제0506721호에는 '바실러스 리케니포미스 N1 및 이를 포함하는 식물병원성 진균 방제용 미생물 제제'가 개시되어 있으며, 한국등록특허 제1379230호에는 '장류의 유해 미생물에 대한 항균 활성 및 바이오제닉 아민 분해 활성이 있는 바실러스 리케니포미스 SCKB11 균주 및 이의 용도'가 개시되어 있으나, 본 발명의 '바이오제닉 아민 분해 활성 및 유해 미생물에 대한 항균 활성이 있는 페디오코커스 펜토사세우스 균주 및 이의 용도'에 대해서는 개시된 바가 전혀 없다.

본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명에서는 전통 장류에서 유해 미생물에 대해 항균 활성을 지니고, 히스타민 또는 티라민인 바이오제닉 아민을 분해하는 새로운 페디오코커스 펜토사세우스(Pediococcus pentosaceus) SRCM 100743 균주를 분리하였다. 상기 균주는 히스타민에서 23.7%, 티라민에서 15.7% 범위의 분해율을 보이고, 바실러스 세레우스, 슈도모나스 애루기노사, 마이크로코커스 루테우스, 스타필로코커스 아우레우스, 에스케리키아 콜라이, 엔테로코커스 패칼리스 및 리스테리아 모노시토게네스 등을 포함하는 그람 양성 유해균들에 대해 넓은 항균 범위를 보이므로, 위생 안전성이 높고, 품질 좋은 장류 제조를 위한 스타터 균주로 기존의 균주보다 훨씬 효과적임을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.

상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 장류로부터 분리된, 바이오제닉 아민(biogenic amine) 분해 활성 및 유해 미생물에 대한 항균 활성이 있는 페디오코커스 펜토사세우스(Pediococcus pentosaceus) SRCM 100743 균주(KCCM11571P)를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 균주를 포함하는 식품을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 균주 또는 이의 배양액을 스타터 균주로 이용하여 장류를 제조하는 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 함유하는 장류 제조용 미생물 제제를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 균주 또는 이의 배양액을 장류에 처리하는 단계를 포함하는 장류 유해 미생물 제어 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 함유하는 유해미생물에 대한 항균용 조성물을 제공한다.

본 발명의 페디오코커스 펜토사세우스(Pediococcus pentosaceus) SRCM 100743 균주는 유해 미생물에 대해 항균 활성을 지니고, 히스타민 또는 티라민인 바이오제닉 아민을 분해하므로, 상기 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 함유하는 유해미생물에 대한 항균용 조성물은 식품, 식품 첨가제, 사료 첨가제 또는 의약품으로 매우 유용하게 사용될 수 있다. 특히, 본 발명의 페디오코커스 펜토사세우스 SRCM 100743 균주는 장류의 발효 과정 동안 바이오제닉 아민을 분해하면서, 유해 미생물의 증식을 억제할 수 있으므로, 상기 균주를 이용하여 독성이 없는 안전한 장류 식품 생산 효과를 가져올 수 있으므로, 산업적으로 유용하게 이용될 수 있을 것으로 판단된다.

도 1은 본 발명에서 분리한 페디오코커스 펜토사세우스 SRCM 100743 균주의 다중구리 산화효소(Multicopper oxidase) 유전자의 PCR 증폭 결과를 나타낸다. M은 DNA 크기 마커, LE 17은 본 발명의 SRCM 100742 균주, LE 22는 본 발명의 SRCM 100743 균주를 말함.
도 2는 본원 발명의 페디오코커스 펜토사세우스 SRCM 100743 균주의 16S rRNA 유전자 분석에 따른 계통도를 나타낸다. LE 17은 본 발명의 SRCM 100742 균주, LE 22는 본 발명의 SRCM 100743 균주를 말함.

본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 장류로부터 분리된, 바이오제닉 아민(biogenic amine) 분해 활성 및 유해 미생물에 대한 항균 활성이 있는 페디오코커스 펜토사세우스(Pediococcus pentosaceus) SRCM 100743 균주(KCCM11571P)를 제공한다.

"항균 (antimicrobial)"의 의미는 어떤 농도에서 미생물의 성장 또는 생존을 감소, 방지, 억제, 또는 제거하는 능력을 의미한다.

본 발명에서 간장, 된장 및 고추장의 장류로부터 균주를 분리하였고, 그 중 유해미생물인 바실러스 세레우스(Bacillus cereus), 슈도모나스 애루기노사(Pseudomonas aeruginosa), 마이크로코커스 루테우스(Micrococcus luteus), 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus), 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli), 엔테로코커스 패칼리스(Enterococcus faecalis) 또는 리스테리아 모노시토게네스(Listeria monocytogenes)에 대해 항균 활성이 뛰어난 페디오코커스 펜토사세우스(Pediococcus pentosaceus) 균주를 확인하였으며, 이를 페디오코커스 펜토사세우스 SRCM 100743(KCCM11571P)으로 동정하였다.

본 발명의 일 구현 예에 따른 방법에서, 상기 바이오제닉 아민은 히스타민(histamine) 또는 티라민(tyramine)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 일 구현 예에 따른 방법에서, 상기 유해 미생물은 바실러스 세레우스(Bacillus cereus), 슈도모나스 애루기노사(Pseudomonas aeruginosa), 마이크로코커스 루테우스(Micrococcus luteus), 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus), 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli ), 엔테로코커스 패칼리스(Enterococcus faecalis) 또는 리스테리아 모노시토게네스(Listeria monocytogenes)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

또한, 본 발명은 상기 페디오코커스 펜토사세우스 SRCM 100743 균주를 포함하는 식품을 제공한다.

본 발명의 일 구현 예에 따른 식품에서, 상기 식품은 장류일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 일 구현 예에 따른 식품에서, 상기 장류는 메주, 한식된장, 된장, 조미된장, 고추장, 조미고추장, 춘장, 청국장, 혼합장, 한식간장, 양조간장 및 혼합간장으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

또한, 본 발명은 상기 페디오코커스 펜토사세우스 SRCM 100743 균주 또는 이의 배양액을 스타터(starter) 균주로 이용하여 장류를 제조하는 방법을 제공한다.

본 발명에 있어서, 장류 제조용 스타터(starter)란 장류 제조를 위해 발효에 관여하는 미생물을 포함하는 제제 또는 조성물을 의미한다. 장류 제조 시에 첨가함으로써 발효된 장류에서 생장할 수 있는 미생물 또는 우점종으로 생장할 수 있는 미생물을 제공하기 위하여 사용된다. 상기 장류 발효용 스타터를 사용하여 장류를 제조하는 경우, 상기 장류 발효용 스타터에 포함된 미생물에 의하여, 장류의 품질을 일정하게 조절하거나, 특정한 목적, 일 예로 장류에서 이취를 발생시키지 않거나, 감소시키는 목적 또는 장류에서 구수한 맛이나 단맛을 강화시키기 위한 목적을 달성할 수 있다. 본 발명에서는 상기 페디오코커스 펜토사세우스 SRCM 100743 균주 또는 이의 배양액을 스타터 균주로 이용함으로써, 바이오제닉 아민을 분해하고, 유해 미생물에 대한 항균 활성이 있는 장류를 제조할 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 페디오코커스 펜토사세우스 SRCM 100743 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 함유하는 장류 제조용 미생물 제제를 제공한다.

본 발명에 따른 장류 제조용 미생물 제제는 용액, 분말, 현탁액, 분산액, 에멀젼, 유성 분산액, 페이스트, 분진, 흩뿌림 물질 또는 과립제로 제조할 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.

또한, 본 발명은 상기 페디오코커스 펜토사세우스 SRCM 100743 균주 또는 이의 배양액을 장류에 처리하는 단계를 포함하는 장류 유해 미생물 제어 방법을 제공한다. 상기 장류 유해 미생물 제어는 본 발명의 페디오코커스 펜토사세우스 SRCM 100743 균주를 장류에 처리함으로써, 유해 미생물의 성장을 지연시키거나 저해시키는 것을 의미한다.

본 발명의 균주를 배양하는 방법은 당업계에 통상적으로 이용되는 방법에 따라 배양할 수 있다.

본 발명의 일 구현 예에 따른 항균용 조성물에서, 상기 유해미생물은 바실러스 세레우스(Bacillus cereus), 슈도모나스 애루기노사(Pseudomonas aeruginosa), 마이크로코커스 루테우스(Micrococcus luteus), 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus), 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli ), 엔테로코커스 패칼리스(Enterococcus faecalis) 또는 리스테리아 모노시토게네스(Listeria monocytogenes)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 일 구현 예에 따른 항균용 조성물에서, 상기 조성물은 바람직하게는 식품, 식품 첨가제, 사료 첨가제 또는 의약품 형태일 수 있고, 상기 식품은 유제품(우유, 두유, 가공우유), 발효유(액상 요구르트, 호상 요구르트), 드링크제, 육류, 소세지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 껌류, 아이스크림류, 스프, 음료수, 알코올 음료 및 비타민 복합제로 구성되는 군으로부터 선택될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 상기 페디오코커스 펜토사세우스 SRCM 100743 균주를 식품첨가물로 사용하는 경우, 상기 균주를 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효 성분의 혼합량은 그의 사용 목적(예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 식품 또는 음료의 제조시에 본 발명의 균주는 원료에 대하여 15 중량부 이하, 바람직하게는 10 중량부 이하의 양으로 첨가된다. 그러나, 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있으며, 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 유효성분은 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있다.

상기 식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 바람직하게는 식품은 페디오코커스 펜토사세우스 SRCM 100743 균주를 함유하는 형태일 수 있으며, 또한 다른 식품의 첨가물로서도 이용될 수 있다. 상기 물질을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소세지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 건강식품을 모두 포함한다.

본 발명의 식품은 기능성 식품을 포함할 수 있는데, 본 발명의 기능성 식품에는 상기 유효성분 외에도 필요에 따라 다양한 보조성분을 추가로 함유할 수 있다. 본 발명의 기능성 식품의 경우, 비타민 A, 비타민 B1, 비타민 B2, 비타민 B3, 비타민 B6, 비타민 B12, 엽산 (folic acid), 비타민 C, 비타민 D3, 비타민 E 등의 비타민류와, 구리, 칼슘, 철, 마그네슘, 칼륨, 아연 등의 미네랄 또는 유산균 등을 포함할 수 있다.

또한 본 발명의 기능성 식품 중, 건강음료는 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 포함할 수 있다. 향미제로는 타우마틴, 스테비아 추출물과 같은 천연 감미제나, 사카린, 아스파르탐과 같은 합성 감미제 등을 들 수 있다. 천연 탄수화물로는 포도당, 과당 등의 단당류, 말토스, 수크로오스 등의 이당류, 덱스트린, 사이클로덱스트린 등의 다당류, 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알코올류 등을 들 수 있다.

본 발명의 사료 첨가제는 기초사료에 일정 비율로 첨가하는 것이다. 상기 기초사료는 주성분이 옥수수, 대두박, 유청, 어분, 당밀, 소금, 비타민 프리믹스 및 미네랄 프리믹스 등으로 이루어질 수 있다. 비타민 프리믹스는 비타민 A, 비타민 D, 비타민 E, 리보프라빈 및 나이아신으로 구성될 수 있으며, 미네랄 프리믹스는 망간, 철, 아연, 칼슘, 구리, 코발트 및 셀레니늄 등으로 구성될 수 있다.

본 발명은 또한, 본 발명의 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는 의약품을 제공한다. 상기 의약품은 항균물질을 함유하고 있으므로 유해 세균에 의한 질환을 예방 또는 치료할 수 있다. 상기 균주는 바람직하게는 페디오코커스 펜토사세우스 SRCM 100743 균주일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

재료 및 방법

균주 분리

전통 방식으로 제조한 150종의 된장, 간장, 고추장을 구입한 후, 각 0.1 g을 취해 0.9 ㎖ MRS (de Man, Rogasa and Sharpe) 액체배지 (BD, USA)로 충분히 혼합하였다. 각 희석액 0.2 ㎖을 취해 MRS 아가 (BD, USA) 표면에 도말하여 28℃에서 24 시간 배양하였고, 한 플레이트 내에서 동일 균주의 선발을 피하기 위해 집락 형태가 상이한 균들을 분리하였다.

바이오제닉 아민 분해 균주의 1차 선발

산업적 용도를 위하여 382종의 균들 중 바이오제닉 아민을 생성하지 않는 균주 선발을 위해 다음과 같은 방법을 사용하였다. 즉, pH 5.3으로 조절한 배양 배지(0.4% 효모 추출물, 0.05% 트윈-80, 0.02% MgSO₄, 0.005% MnSO₄, 0.004% FeSO₄, 0.01% CaCO₃, 2% 아가, 0.006% 브로모크레솔 퍼플)를 멸균하고 0.1%의 히스티딘과 티로신을 각각 무균적으로 첨가하였다. 이 한천 배지에 균을 접종하여 30℃에서 24 시간 배양하였으며 이들 중 색의 변화가 없는 집락을 선발하였다. 선발 균들 중 히스타민과 티라민을 질소원으로 하는 최소 합성 배지(2% 글루코스, 0.1% 히스타민, 0.1% 티라민, 0.04% MgSO₄, 0.9% K₂HPO₄)에 접종하여 30℃, 48 시간 배양 후 집락을 형성한 8 종을 선발하였다.

바이오제닉 아민 분해력 확인

선발 균주의 바이오제닉 아민의 분해 능력을 정량적으로 분석하기 위해 HPLC를 수행하였다. 선발균들을 0.1% 히스타민과 티라민이 함유된 최소 합성 배지에서 30℃에서 48 시간 동안 배양 후 16,000 x g에서 10 분간 원심 분리를 하였다. HPLC 분석을 위한 유도체화 방법은 일본위생시험법(PSJ, 2005)의 일부를 변형하여 사용하였다. 즉, 상층액 100 ㎕에 100 ㎕ 아세톤에 용해된 1% 댄실 클로라이드(dansyl chloride), 50 ㎕ 포화 Na₂CO₃, 50 ㎕ 내부 표준물질 1,7-아미노햅탄을 섞어 45℃ 암소에서 1 시간 유도체화하였다. 이 용액에 50 ㎕ 10% 프롤린 용액을 넣어 과잉의 댄실 클로라이드를 제거한 뒤, 0.5 ㎖ 디에틸 에테르를 넣고 잘 섞어 3 분 후 분리된 상층액 만을 모아 디에틸 에테르 용매를 증발시켰다. 이를 200㎕ 아세토니트릴에 녹여 HPLC 분석에 사용하였다. HPLC는 역상 컬럼으로 C18 Capcell pack (Shiseido, Japan; 4.6 mm x 150 mm, 5 ㎛), 이동상은 0.1% 포름산이 용해된 H₂O (A)와 0.1% 포름산이 용해된 아세토니트릴(B)을 사용하였고, 농도 구배는 0-10 분, A:B=45:55; 10-15 분, A:B=35:65, 15-25 분, A:B=20:80; 25-30 분 A:B=10:90, 유속은 분당 1 ㎖이었으며 10 ㎕ 시료를 주입하였다. 시료 농도(Cs) 계산은 다음과 같았다.

Cs = RFs x (Cis x As)/Ais

RFs (시료의 response factor) = (Ais/As) x (Cs/Cis)

Ais, 내부 표준물질 피크 면적; As, 시료 피크 면적; Cis, 내부 표준물질 농도.

다중구리 산화효소( Multicopper oxidase ) 유전자 확인

바이오제닉 아민인 히스타민, 티라민, 퓨트레신을 알데히드와 암모니아로 분해하는 아민 산화효소 유전자를 검출하기 위해 MRS에서 24 시간 배양한 균 집락으로 콜로니 PCR을 수행하였다. 페디오코커스 펜토사세우스(Pediococcus pentosaceus) ATCC 25745의 구리 아민 산화효소(copper amine oxidase) 유전자(GenBank accession no. NC_008525 region: 555105-556634)를 기준으로 설계한 PCR 프라이머는 각각 5'-ATGGTTTGGCTGCCATGGTG-3' (정방향 프라이머, 서열번호 2), 5'- CGATCGCGACACTTTCGTCC-3' (역방향 프라이머, 서열번호 3)였고, PCR은 95℃, 5분 열 변성, 30회 (95℃ 1분, 55℃ 1분, 72℃ 1분), 72℃ 마지막 신장 순으로 수행하였다.

유해균 증식 억제능

유해균의 증식 억제 능력을 확인하기 위해 선발 유산균을 MRS 배지에 30℃에서 48 시간 배양하고 16,000 x g에서 10 분간 원심 분리하여 상층액을 취했다. 유해균 배양을 위해 바실러스 세레우스 배양액 200 ㎕는 CPMA(chromogenic polymixin B-methoprim agar) (oxoid, UK) 플레이트에, 마이크로코커스와 슈도모나스 각 배양액 200 ㎕는 영양 아가 플레이트에, 스타필로코커스, 에스케리키아 콜라이, 엔테로코커스 패칼리스(Enterococcus faecalis), 리스테리아 모노시토게네스(Listeria monocytogenes) 각 배양액 200 ㎕는 LB(Luria-Bertani) 아가 플레이트에 도말하였다. 6 mm 직경의 멸균 페이퍼 디스크 (Toyo Roshi, Japan)를 도말한 표면에 올린 뒤 선발 유산균 배양 상층액 20 ㎕를 각각 분주하여 37℃에서 18 시간 배양 후, 페이퍼 디스크 주위의 투명환의 크기를 측정하였다.

균주 동정

생화학적 특성에 따른 동정은 API 50 CHL kit (bioMerieux, Marcy I'Etoile, France)를 사용하여 제품 매뉴얼에 따라 분석했고, 얻어진 결과들은 온라인 박테리아 데이터베이스인 apiwebsoftware (bioMerieux)를 사용하여 분류균의 생화학적 특성을 비교 계산한 뒤 동정하였다. 16S rRNA 유전자의 염기 서열에 의한 동정을 위해 상용 프라이머로 27F (5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3', 서열번호 4)와 1,492R (5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3', 서열번호 5)을 사용하여 16S rRNA 유전자를 증폭하고, 이 PCR 산물을 정제한 후 염기 서열을 해독하였다. 이 염기 서열을 이용하여 BLASTN 검색과 Ribosomal Database Project (version 11)의 SeqMatch 프로그램에서 서열 일치도가 높은 표준 균주의 16S rRNA 유전자 염기서열을 얻었고, 염기 서열간의 상호 비교를 위해 CLUSTAL W (Thompson et al., 1994 Nucleic Acids Res . 22, 4673-4680)를 사용했다. 계통도 분석은 균주들의 16S rRNA 유전자 염기서열들을 정렬하고 크로마토그램의 비교와 수작업으로 갭(gap)이 최소화되게 보정한 후 Tamura-Nei model에 기초한 Maximum Likelihood 방법을 사용하여 작성하였다. 산출한 각각의 계통수에서 각 분지에 대한 통계적 신뢰도를 산출하기 위해 부트르트랩(bootstrap) 분석을 1,000회 실행하였으며, 계통 분석과 부트스트랩 분석은 MEGA 프로그램 (Tamura et al., 2011 Mol . Biol . Evol . 28, 2731-2739)을 사용하였다.

실시예 1. 바이오제닉 아민 저감화 균주의 선발

아민 저감화를 위한 접종균으로 사용하려면 아민 분해 능력이 생성 능력보다 크면서 GRAS에 포함된 유산균을 선발하는 것이 요구된다. 이를 위해 집락의 증식 동안 염기성 아민 생성에 의한 pH 변화를 지시약 발색을 통해 확인한 뒤, 아민 함유 최소 배지에서 집락 형성 유무를 확인하는 방식으로 8 종의 균주를 분리하였다. 이 선발 방법은 정량적이지 않았지만 다수의 장류 시료에서 아민의 생산과 감소 능력을 신속하게 확인하는데 유용하였다. 모노아민인 히스타민과 티라민에 대한 저감 능력을 확인하기 위해 8 종의 균주를 대상으로 HPLC로 정량적인 감소율을 조사하였다. 유일한 질소원으로 0.1% (w/v) 히스타민과 0.1% 티라민이 첨가된 최소 합성 배지에서 배양 후 분석한 결과, 각 균주에 따라 히스타민과 티라민의 감소율에 차이를 보였다(표 1).

본 발명에서 분석된 균주들의 히스타민 및 티라민 분해율

Strains	Degradation (%)
Strains	Histamine	Tyramine
Control	0	0
LE 5	10.43 ± 0.05	15.71 ± 0.01
LE 10	-0.86 ± 0.14	15.05 ± 0.23
LE 11	19.03 ± 0.15	17.84 ± 0.12
LE 13	10.74 ± 0.06	16.51 ± 0.08
LE 15	13.76 ± 0.09	8.73 ± 0.20
LE 17	13.71 ± 0.05	25.89 ± 0.08
LE 20	-4.80 ± 0.20	8.81 ± 0.11
LE 22	23.66 ± 0.02	15.64 ± 0.13

(상기 표에서 LE 17은 본 발명의 SRCM 100742 균주, LE 22는 본 발명의 SRCM 100743 균주를 말함)

이들 중 SRCM 100743 균주의 경우 히스타민은 평균 23.7%, 티라민은 15.7%가 감소한 반면, SRCM 100742의 경우 히스타민은 13.7%, 티라민은 25.9%가 감소하였다. 선발 균들에 의한 전체적인 감소율은 히스타민에서 10-24%, 티라민에서 8-26% 범위였다. 최근 포도주에서 분리한 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) ENOLAB Lb132 균주는 0.004% (w/v) 히스타민 또는 티라민이 첨가된 포도주에서 각각 28.4%, 14.7%의 감소율을 보였고, 락토바실러스 플란타룸 ENOLAB Lb98 균주에서는 각각 25%, 27.8% 감소되었다. 사용한 배양액과 아민의 농도가 서로 달라 균들 간 아민 분해 능력을 직접 비교할 수 없었지만, SRCM 100742 및 SRCM 100743 균주 또한 락토바실러스와 같은 아민 산화효소 활성이 있을 것으로 예상되었다. 선발 균주들 중 히스타민과 티라민에 대해 감소율이 높았던 SRCM 100742과 SRCM 100743 균주를 대상으로 MCO(multicopper oxidase) 유전자의 존재 유무를 PCR로 조사하였다. 두 균주 모두 페디오코커스 펜토사세우스(Pediococcus pentosaceus)로 동정되었으므로(도 2), 페디오코커스 펜토사세우스 ATCC 25745의 추정의 다중구리 산화효소 유전자를 기준으로 프라이머를 설계하고 PCR을 수행하였다. 페디오코커스 펜토사세우스 ATCC 25745의 추정의 다중구리 산화효소 보존 영역을 CD-검색 프로그램으로 분석했을 때 3개의 컵레독신 영역(cupredoxin domain)을 포함하는 산화 효소임을 보였다. 전기영동 결과 두 균주 모두 예상 PCR 산물 크기인 591 bp 위치에서 밴드가 나타나 이 유전자를 함유하고 있었고, 이들 유전자의 발현으로 바이오제닉 아민이 분해될 것으로 예상되었다(도 1).

실시예 2. 유해균주 억제 능력

선발 8종 유산균들 중 히스타민과 티라민의 분해 비율이 상대적으로 높았던 SRCM 100742 및 SRCM 100743 균주를 대상으로 병원성 유해균에 대한 항균 효과를 조사했고 그 결과는 표 2에 요약되어 있다. 두 유산균은 유해 균주 모두에 대해 항균 작용을 가졌고 특히 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus) KACC 10778에 대한 증식 저해 능력이 컸다. 유산균의 항균 능력은 주로 유산에 의한 pH 감소와 박테리오신 작용 때문이다. 낮은 pH 범위(pH 2-4)에서도 증식할 수 있는 엔테로코커스 패칼리스(Enterococcus faecalis)의 내산 특성을 고려할 때, 두 균주는 박테리오신을 생산하여 엔테로코커스 패칼리스에 대한 항균 활성을 나타내는 것으로 분석되었다.

본 발명의 페디오코커스 펜토사세우스 SRCM 100743 균주의 유해균주 억제 능력

Pathogenic strains	Inhibitor zone‡ (mm)
Pathogenic strains	SRCM 100742	SRCM 100743
바실러스 세레우스 KACC 13066	11.52±0.87	10.73±1.03
슈도모나스 애루기노사 KACC 10259	8.37±0.48	8.19±0.13
마이크로코커스 루테우스 KACC 11306	10.44±0.23	9.83±0.20
스타필로코커스 아우레우스 KACC 10778	14.82±2.65	15.41±1.69
에스케리키아 콜라이 KACC 13821	7.23±0.66	7.04±0.39
엔테로코커스 패칼리스 KACC 11304	10.92±0.55	10.40±0.35
리스테리아 모노시토게네스 KACC 10764	10.37±1.02	9.80±0.56

페디오코커스 속이 내는 박테리오신의 경우 Class IIa에 속하는 저분자성 펩티드로서 페디오신 PD-1, AcH/PA-1, SM-1, SA-1 등의 구조가 존재한다. 또한 열 저항 펩티드로서 121℃의 가열 시에도 항균 활성을 거의 그대로 유지할 수 있기 때문에 식품의 보존제로서 잠재적 가능성을 가지고 있다.

시토톡신 K, 넌-헤모리틱 엔테로톡신(non-hemolytic enterotoxin), 헤모리신, 세레울리드(cereulide) 등의 설사 및 구토독소를 생산하는 바실러스 세레우스는 자연계에 흔할 뿐 아니라 포자형성으로 열에 잘 견디기 때문에, MFDS는 식품 안전성 확보를 위해 2007년부터 모든 장류 제품에서 바실러스 세레우스 균의 허용한도를 1 x 10⁴CFU/g 이하로 고시하였다. 그러나, 위해 요소 중점 관리 제도(HACCP)가 정착되지 않은 소규모 전통 장류 제조업체 입장에서는 MFDS가 정한 바실러스 세레우스 균수 상한선을 맞추기가 어려운 실정이다. 그람 (+) 유해균들에 대해 항균 스펙트럼(spectrum)이 넓은 이 유산균들을 발효 스타터로 사용한다면, 장류의 위생 안전성을 향상하는데 도움을 줄 수 있을 것이다.

실시예 3. 선발 균주의 동정

RDP (Ribosomal Database Project)의 SeqMatch 프로그램을 통해 두 균의 16S rRNA 유전자 염기 서열과 가장 가까운 표준 균주들을 선정한 뒤 MEGA 프로그램에서 계통도를 분석하였다. SRCM 100743 균주는 16S rRNA 유전자 염기 서열이 1과 같았다. 페디오코커스 펜토사세우스 DSM 20336과 가장 가까운 근연관계로 16S rRNA 유전자의 염기 서열 상동성은 99.6%(1414 bp/1420 bp)였다(도 2). API 50 CHL kit에 의한 50 종류의 생화학적 검사 결과는 표 3에 요약되었으며 99.9%의 확률로 페디오코커스 펜토사세우스로 동정되었다. 호모 발효(Homofermentative) 특성을 가진 페디오코커스 펜토사세우스는 기질로서 펜토스인 L-아라비노스, D-리보스, D-자일로스를 이용할 수 있는 특징을 가졌다. 따라서 생화학 분석과 계통학적 분류를 고려하여 두 균주를 페디오코커스 펜토사세우스 SRCM 100742와 페디오코커스 펜토사세우스 SRCM 100743 (GenBank accession no. KM288715)로 각각 명명하였다.

본 발명의 페디오코커스 펜토사세우스 SRCM 100743 균주의 API 50 CHL kit에 의한 50 종류의 생화학적 검사 결과

Substrate	SRCM 100742	SRCM 100743
Control	-	-
Glycerol	-	-
Erythritol	-	-
D-Arabinose	-	-
L-Arabinose	+	+
Ribose	+	+
D-Xylose	-	-
L-Xylose	-	-
Adonitol	-	-
β-Methyl-D-xyloside	-	-
Galactose	+	+
Glucose	+	+
Fructose	+	+
Manose	+	+
Sorbose	-	-
Rhamnose	-	-
Dulcitol	-	-
Inositol	-	-
Mannitol	-	-
Sorbitol	-	-
α-Methyl-D-mannoside	-	-
α-Methyl-D-glucoside	-	-
N-Acetyl glucosamine	+	+
Amygdalin	+	+
Arbutin	+	+
Esculin	+	+
Salicin	+	+
Cellobiose	+	+
Maltose	+	+
Lactose	-	-
Melibiose	+	+
Sucrose	+	+
Trehalose	+	+
Inulin	-	-
Melezitose	-	-
Raffinose	+	+
Starch	-	-
Glycogen	-	-
Xylitol	-	-
Gentiobiose	+	+
D-Turanose	-	-
D-Lyxose	-	-
D-Tagatose	+	+
D-Fucose	-	-
L-Fucose	-	-
D-Arabitol	-	-
L-Arabitol	-	-
Gluconate	-	-
2-keto-gluconate	-	-
5-keto-gluconate	-	-

실시예 4. 장류 발효 균주로서 평가

전통 장류의 숙성 동안 발효 과정은 다수의 미생물들이 관여하지만 우점을 형성하는 균주들이 장류의 풍미와 식품 안전성 유지에 큰 영향을 준다. 장류 발효에 주요한 미생물 군집은 바실러스 속이지만, 풍미와 부패 방지에 함께 역할을 하는 것은 효모와 유산균이다. 오랫동안 소시지, 포도주, 피클, 치즈 등 유럽의 발효식품에 유산균으로 사용되어온 페디오코커스 속은 균주 안전성이 확립되어 있을 뿐 아니라 프로바이오틱스로서 잠재된 능력을 평가받고 있다. 바이오제닉 아민을 감소시키고 동시에 병원균에 대해 증식 억제 능을 가진 페디오코커스 펜토사세우스를 같은 특성을 지닌 바실러스 속과 함께 숙성을 진행한다면 식품안전성을 높이는데 효과적일 것이다. 또한 장류 환경인 10-12% 염 농도와 pH 4.2-8.2의 범위에서 잘 증식하는 페디오코커스 펜토사세우스의 일반적 배양 특성을 고려할 때, 장류 종균(starter)으로써 이 균주들은 적합하게 사용될 수 있다. 현재 MFDS가 제정한 식품 첨가물 규격(http://fse.foodnara.go.kr/origin/search_data_list.jsp)에 따르면 페디오코커스 속들 중 페디오코커스 펜토사세우스, 페디오코커스 애시디락티시, 페디오코커스 할로필러스 만이 GRAS 균주로 인정받고 있다.

한국미생물보존센터(국외)

KCCM11571P

20140923

<110> Microbial Institute for Fermentation Industry SUNCH'ANG <120> Pediococcus pentosaceus strain having biogenic amine degradation activity and antimicrobial activity against pathogenic microorganism and uses thereof <130> PN14287 <160> 5 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 1420 <212> DNA <213> Pediococcus pentosaceus <400> 1 atgaacgctg gcggcgtgcc taatacatgc aagtcgaacg aacttccgtt aattgattat 60 gacgtacttg tactgattga gattttaaca cgaagtgagt ggcgaacggg tgagtaacac 120 gtgggtaacc tgcccagaag taggggataa cacctggaaa cagatgctaa taccgtataa 180 cagagaaaac cgcatggttt tcttttaaaa gatggctctg ctatcacttc tggatggacc 240 cgcggcgtat tagctagttg gtgaggtaaa ggctcaccaa ggcagtgata cgtagccgac 300 ctgagagggt aatcggccac attgggactg agacacggcc cagactccta cgggaggcag 360 cagtagggaa tcttccacaa tggacgcaag tctgatggag caacgccgcg tgagtgaaga 420 agggtttcgg ctcgtaaagc tctgttgtta aagaagaacg tgggtaagag taactgttta 480 cccagtgacg gtatttaacc agaaagccac ggctaactac gtgccagcag ccgcggtaat 540 acgtaggtgg caagcgttat ccggatttat tgggcgtaaa gcgagcgcag gcggtctttt 600 aagtctaatg tgaaagcctt cggctcaacc gaagaagtgc attggaaact gggagacttg 660 agtgcagaag aggacagtgg aactccatgt gtagcggtga aatgcgtaga tatatggaag 720 aacaccagtg gcgaaggcgg ctgtctggtc tgcaactgac gctgaggctc gaaagcatgg 780 gtagcgaaca ggattagata ccctggtagt ccatgccgta aacgatgatt actaagtgtt 840 ggagggtttc cgcccttcag tgctgcagct aacgcattaa gtaatccgcc tggggagtac 900 gaccgcaagg ttgaaactca aaagaattga cgggggcccg cacaagcggt ggagcatgtg 960 gtttaattcg aagctacgcg aagaacctta ccaggtcttg acatcttctg acagtctaag 1020 agattagagg ttcccttcgg ggacagaatg acaggtggtg catggttgtc gtcagctcgt 1080 gtcgtgagat gttgggttaa gtcccgcaac gagcgcaacc cttattacta gttgccagca 1140 ttaagttggg cactctagtg agactgccgg tgacaaaccg gaggaaggtg gggacgacgt 1200 caaatcatca tgccccttat gacctgggct acacacgtgc tacaatggat ggtacaacga 1260 gtcgcgagac cgcgaggtta agctaatctc ttaaaaccat tctcagttcg gactgtaggc 1320 tgcaactcgc ctacacgaag tcggaatcgc tagtaatcgc ggatcaccat gccgcgggtg 1380 aatacgttcc cgggccttgt acacaccgcc cgtcacacca 1420 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 2 atggtttggc tgccatggtg 20 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 cgatcgcgac actttcgtcc 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 agagtttgat cctggctcag 20 <210> 5 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 5 ggttaccttg ttacgactt 19

Claims

장류로부터 분리된, 히스타민(histamine) 및 티라민(tyramine) 분해 활성 및 바실러스 세레우스(Bacillus cereus), 슈도모나스 애루기노사(Pseudomonas aeruginosa), 마이크로코커스 루테우스(Micrococcus luteus), 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus), 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli), 엔테로코커스 패칼리스(Enterococcus faecalis) 및 리스테리아 모노시토게네스(Listeria monocytogenes) 균주에 대한 항균 활성이 있는 페디오코커스 펜토사세우스(Pediococcus pentosaceus) SRCM 100743 균주(KCCM11571P).
제1항의 균주 또는 이의 배양액을 스타터(starter) 균주로 이용하여 장류를 제조하는 방법.
제1항의 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 함유하는 장류 제조용 미생물 제제.
제1항의 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 함유하는 바실러스 세레우스(Bacillus cereus), 슈도모나스 애루기노사(Pseudomonas aeruginosa), 마이크로코커스 루테우스(Micrococcus luteus), 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus), 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli), 엔테로코커스 패칼리스(Enterococcus faecalis) 및 리스테리아 모노시토게네스(Listeria monocytogenes) 균주에 대한 항균용 조성물.