KR101816121B1 - 혈전용해 활성 및 유해 미생물에 대한 항균 활성이 있고, 바이오제닉 아민을 생산하지 않는 바실러스 서틸리스 scdb 240 균주 및 이의 용도 - Google Patents

혈전용해 활성 및 유해 미생물에 대한 항균 활성이 있고, 바이오제닉 아민을 생산하지 않는 바실러스 서틸리스 scdb 240 균주 및 이의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 혈전용해 활성 및 유해 미생물에 대한 항균 활성이 있고, 바이오제닉 아민을 생산하지 않는 바실러스 서틸리스 SCDB 240 균주(KCCM11831P) 및 이의 용도에 관한 것으로, 본 발명의 바실러스 서틸리스(Bacillus subtilis) SCDB 240 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 함유하는 미생물 제제는 식품, 식품 첨가제, 사료 첨가제 또는 의약품으로 매우 유용하게 사용될 수 있으며, 특히, 본 발명의 바실러스 서틸리스 SCDB 240 균주는 장류의 발효 과정 동안 바이오제닉 아민을 분비하지 않으면서, 유해 미생물의 증식을 억제할 수 있으므로, 상기 균주를 이용하여 독성이 없는 안전한 장류 식품 생산 효과를 가져올 수 있으므로, 산업적으로 유용하게 이용될 수 있을 것으로 판단된다.

Description

혈전용해 활성 및 유해 미생물에 대한 항균 활성이 있고, 바이오제닉 아민을 생산하지 않는 바실러스 서틸리스 SCDB 240 균주 및 이의 용도{Bacillus subtilis SCDB 240 strain having fibrinolytic activity and antimicrobial activity against pathogenic microorganism and not producing biogenic amine and uses thereof}
본 발명은 혈전용해 활성 및 유해 미생물에 대한 항균 활성이 있고, 바이오제닉 아민을 생산하지 않는 바실러스 서틸리스 SCDB 240 균주 및 이의 용도에 관한 것이다.
한국의 장류 식품인 청국장, 된장 및 간장은 우리 조상으로부터 수백년 동안 섭취해온 음식으로서 특별한 부작용이 없는 식품이며, 항산화 효과, 혈전용해 효과, 혈압강하 효과 등을 유발하는 각종 유익한 생리활성 물질들이 포함된 것으로 알려져 있다. 전통 방식에 의해 제조하는 장류는 필연적으로 자연 환경에 노출되는 상태로 발효가 이루어지기 때문에 발효나 숙성과정 동안 토양이나 대기의 유해 미생물들에 의해 독소들이 생성될 가능성이 높다. 장의 발효에 관여하는 주된 미생물 중의 하나는 바실러스(Bacillus) 속이다. 세균으로서 바실러스 서브그룹(Bacillus subgroup) 1에 속하는 바실러스 마이코이드(B. mycoides ), 바실러스 튜린지엔시스(B. thuringiensis), 바실러스 안트라시스(B. anthracis) 또는 바실러스 세레우스(B. cereus)는 유해균으로 알려져 있다. 특히 바실러스 세레우스는 HBL(haemolysin BL), NHE(non-hemolytic enterotoxin) 또는 cytK(cytotoxin K)와 같은 설사나 장염을 일으키는 단백질을 생산할 수 있다. 또한, 식품에 오염된 바실러스 세레우스 균이 증식하여 생산한 독소(cereulide) 및 구토를 일으키는 펩티드 형태의 안트락스(anthrax)와 유사한 호흡 질환을 유발하는 세트락스(certhrax)를 생산한다.
또한, 바이오제닉 아민(biogenic amine)은 아미노산의 탈탄산 작용, 아미노기 전이작용 등의 화학적 작용에 의해 주로 생성되는 질소화합물로서, 단백질 함유 식품 내에서 미생물 또는 생화학적 활성에 의해 발생된다. 대표적인 바이오제닉 아민으로는 퓨트레신(putrescine), 히스타민(histamine), 티라민(tyramine), 카다베린(cadaverine), 스퍼미딘(spermidine) 및 세로토닌(serotonin) 등이 있다. 바이오제닉 아민은 체내에서 신경전달 물질로 직·간접적으로 작용하고 혈압조절 및 혈류 등의 심혈관계 질환에도 영향을 미치므로, 바이오제닉 아민 함유 식품의 섭취로 여러가지 약리적인 현상이 나타날 수 있다.
혈전은 생체내 반응 중 자연스럽게 생성과 분해가 평형을 이루고 있는 대사과정의 산물로서 혈액의 응고와 관련이 있다. 혈액응고는 혈관벽의 손상, 수술 후 혈류속도의 변화에 따른 혈액내 혈소판 수의 증가, 피브리노겐(fibrinogen)의 증가 등 혈액조성에 변화가 생겼을 때 발생할 수 있다. 혈전의 생성은 손상된 혈관 내피세포에 혈소판이 부착하여 피브린(fibrin)을 형성하면서 시작된다. 새로운 혈전용해제를 개발하기 위한 하나의 방법은 연계로부터 우수한 혈전용해능을 가지는 동물, 식물 또는 미생물 유래의 새로운 혈전용해제를 개발하기 위한 시도가 있었으며, 은행잎에서 추출한 성분이 혈류순환을 원활히 해주는 것으로 밝혀져 이를 사용한 제제들이 개발되어 상품화되었다. 동물에서도 혈전을 용해하는 것으로 알려진 많은 물질들이 보고되어 있으며, 또한, 미생물에서도 여러 가지 혈전용해 물질들이 확인되었는데 스트렙토코커스 속(Streptococcus sp.)에서 분리된 스트렙토키나제(streptokinase), 스타필로코커스 속(Staphylococcus sp.)에서 분리된 스테필로키나제(staphylokinase), 아스퍼질러스 속(Aspergillus sp.)에서 분리된 브리노라제(brinolase), 예르시니아 속(Yersinia sp.)에서 분리된 피브리노리신(fibrinolysin), 바실러스 속(Bacillus sp.)에서 분리된 피브린 분해효소(fibrinolytic enzyme) 등이 혈전용해제로 보고되어 있다.
본 발명에서는 전통 장류가 지향하는 전통적인 장류의 맛과 풍미는 유지하되 발효 미생물 제어를 통한 식품 위생상의 안전성을 동시에 확보하기 위해 발효 동안 유해 균주들의 증식을 억제하며, 바이오제닉 아민을 생산하지 않으면서 또한 혈전용해 활성을 가지는 발효 균주를 선발하였다.
한편, 한국등록특허 제1589026호에는 '바이오제닉 아민은 생산하지 않고, 유해 미생물에 대한 항균 활성이 있는 바실러스 서틸리스 SCJ1 균주 및 이의 용도'가 개시되어 있으나, 본 발명의 '혈전용해 활성 및 유해 미생물에 대한 항균 활성이 있고, 바이오제닉 아민을 생산하지 않는 바실러스 서틸리스 SCDB 240 균주 및 이의 용도'에 대해서는 개시된 바가 전혀 없다.
본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명에서는 전통 장류에서 혈전용해 활성, 유해 미생물에 대해 항균 활성을 지니고, 바이오제닉 아민을 생산하지 않는 새로운 바실러스 서틸리스(Bacillus subtilis) SCDB 240 균주를 분리하였다. 또한, 상기 균주는 프로테아제 및 α-아밀라제 효소를 분비하고, 항산화활성이 우수하므로, 품질 좋은 장류 제조를 위한 스타터 균주로 기존의 균주보다 훨씬 효과적임을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 장류로부터 분리된, 혈전용해 활성, 유해 미생물에 대한 항균 활성 및 항산화 활성이 있고, 바이오제닉 아민(biogenic amine)을 생산하지 않으면서, 프로테아제 및 α-아밀라제 효소를 분비하는 바실러스 서틸리스(Bacillus subtilis) SCDB 240 균주(KCCM11831P)를 제공한다.
또한, 본 발명은 바실러스 서틸리스(Bacillus subtilis) SCDB 240 균주 또는 이의 배양액을 스타터(starter) 균주로 이용하여 장류를 제조하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 바실러스 서틸리스(Bacillus subtilis) SCDB 240 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 함유하는 장류 제조용 미생물 제제를 제공한다.
또한, 본 발명은 바실러스 서틸리스(Bacillus subtilis) SCDB 240 균주를 포함하는 식품을 제공한다.
또한, 본 발명은 바실러스 서틸리스(Bacillus subtilis) SCDB 240 균주 또는 이의 배양액을 장류에 처리하는 단계를 포함하는 장류 유해 미생물 제어 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 바실러스 서틸리스(Bacillus subtilis) SCDB 240 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 함유하는 유해 미생물에 대한 항균용 조성물을 제공한다.
본 발명의 바실러스 서틸리스(Bacillus subtilis) SCDB 240 균주는 혈전용해 활성, 유해 미생물에 대한 항균 활성 및 항산화 활성이 있고, 바이오제닉 아민을 생산하지 않으면서, 프로테아제 및 α-아밀라제 효소를 분비하므로, 상기 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 함유하는 미생물 제제는 식품, 식품 첨가제, 사료 첨가제 또는 의약품으로 매우 유용하게 사용될 수 있다. 특히, 본 발명의 바실러스 서틸리스 SCDB 240 균주는 장류의 발효 과정 동안 바이오제닉 아민을 분비하지 않으면서, 유해 미생물의 증식을 억제할 수 있으므로, 상기 균주를 이용하여 독성이 없는 안전한 장류 식품 생산 효과를 가져올 수 있으므로, 산업적으로 유용하게 이용될 수 있을 것으로 판단된다.
도 1은 바실러스 서틸리스(Bacillus subtilis) SCDB 240의 바이오제닉 아민 생성여부를 정성실험한 결과를 나타낸다.
도 2는 바실러스 서틸리스(Bacillus subtilis) SCDB 240의 16S rRNA 염기서열을 나타낸다.
도 3은 바실러스 서틸리스(Bacillus subtilis) SCDB 240의 계통수(phyrogenetic tree)를 나타낸다.
도 4는 바실러스 서틸리스(Bacillus subtilis) SCDB 240가 바실러스 세레우스(Bacillus cereus) 독소 유전자를 보유하고 있는지 여부를 확인한 결과이다.
본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 장류로부터 분리된, 혈전용해 활성, 유해 미생물에 대한 항균 활성 및 항산화 활성이 있고, 바이오제닉 아민(biogenic amine)을 생산하지 않으면서, 프로테아제 및 α-아밀라제 효소를 분비하는 바실러스 서틸리스(Bacillus subtilis) SCDB 240 균주(KCCM11831P)를 제공한다.
본 발명에서 메주, 된장 및 고추장의 장류로부터 균주를 분리하였고, 그 중 바이오제닉 아민(biogenic amine)을 생산하지 않으면서, 프로테아제 및 α-아밀라제 효소를 분비하며, 혈전용해 활성 및 항산화 활성이 우수하고, 유해미생물인 바실러스 세레우스(Bacillus cereus) 및 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus)에 대해 항균 활성이 뛰어난 균주 바실러스 서틸리스(Bacillus subtilis) 균주를 확인하였으며, 이를 바실러스 서틸리스(Bacillus subtilis) SCDB 240 (KCCM11831P)로 동정하였다.
또한, 본 발명은 상기 바실러스 서틸리스(Bacillus subtilis) SCDB 240 균주를 포함하는 식품을 제공한다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 식품에서, 상기 식품은 장류일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 일 구현 예에 따른 식품에서, 상기 장류는 메주, 한식된장, 된장, 조미된장, 고추장, 조미고추장, 춘장, 청국장, 혼합장, 한식간장, 양조간장 및 혼합간장으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명은 상기 바실러스 서틸리스(Bacillus subtilis) SCDB 240 균주 또는 이의 배양액을 스타터(starter) 균주로 이용하여 장류를 제조하는 방법을 제공한다.
본 발명에 있어서, 장류 제조용 스타터(starter)란 장류 제조를 위해 발효에 관여하는 미생물을 포함하는 제제 또는 조성물을 의미한다. 장류 제조 시에 첨가함으로써 발효된 장류에서 생장할 수 있는 미생물 또는 우점종으로 생장할 수 있는 미생물을 제공하기 위하여 사용된다. 상기 장류 발효용 스타터를 사용하여 장류를 제조하는 경우, 상기 장류 발효용 스타터에 포함된 미생물에 의하여, 장류의 품질을 일정하게 조절하거나, 특정한 목적, 일 예로 장류에서 이취를 발생시키지 않거나, 감소시키는 목적 또는 장류에서 구수한 맛이나 단맛을 강화시키기 위한 목적을 달성할 수 있다. 본 발명에서는 바실러스 서틸리스 SCDB 240 균주 또는 이의 배양액을 스타터 균주로 이용함으로써, 바이오제닉 아민은 포함하지 않고, 혈전용해 활성 및 유해 미생물에 대한 항균 활성이 있으며, 더욱이 항산화 활성이 있고, 프로테아제 및 α-아밀라제를 포함하는 장류를 제조할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 바실러스 서틸리스(Bacillus subtilis) SCDB 240 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 함유하는 장류 제조용 미생물 제제를 제공한다.
본 발명에 따른 장류 제조용 미생물 제제는 용액, 분말, 현탁액, 분산액, 에멀젼, 유성 분산액, 페이스트, 분진, 흩뿌림 물질 또는 과립제로 제조할 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
또한, 본 발명은 상기 바실러스 서틸리스(Bacillus subtilis) SCDB 240 또는 이의 배양액을 장류에 처리하는 단계를 포함하는 장류 유해 미생물 제어 방법을 제공한다. 상기 장류 유해 미생물 제어는 본 발명의 바실러스 서틸리스 SCDB 240 균주를 장류에 처리함으로써, 유해 미생물의 성장을 지연시키거나 저해시키는 것을 의미한다.
본 발명의 균주를 배양하는 방법은 당업계에 통상적으로 이용되는 방법에 따라 배양할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 함유하는 유해미생물에 대한 항균용 조성물을 제공한다.
"항균 (antimicrobial)"의 의미는 어떤 농도에서 미생물의 성장 또는 생존을 감소, 방지, 억제, 또는 제거하는 능력을 의미한다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 항균용 조성물에서, 상기 유해미생물은 바실러스 세레우스(Bacillus cereus) 및 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 항균용 조성물에서, 상기 조성물은 바람직하게는 식품, 식품 첨가제, 사료 첨가제 또는 의약품 형태일 수 있고, 상기 식품은 유제품(우유, 두유, 가공우유), 발효유(액상 요구르트, 호상 요구르트), 드링크제, 육류, 소세지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 껌류, 아이스크림류, 스프, 음료수, 알코올 음료 및 비타민 복합제로 구성되는 군으로부터 선택될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 상기 바실러스 서틸리스(Bacillus subtilis) SCDB 240 균주를 식품첨가물로 사용하는 경우, 상기 균주를 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효 성분의 혼합량은 그의 사용 목적(예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 식품 또는 음료의 제조시에 본 발명의 균주는 원료에 대하여 15 중량부 이하, 바람직하게는 10 중량부 이하의 양으로 첨가된다. 그러나, 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있으며, 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 유효성분은 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있다.
상기 식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 바람직하게는 식품은 바실러스 서틸리스(Bacillus subtilis) SCDB 240 균주 균주를 함유하는 형태일 수 있으며, 또한 다른 식품의 첨가물로서도 이용될 수 있다. 상기 물질을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소세지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 건강식품을 모두 포함한다.
본 발명의 식품은 기능성 식품을 포함할 수 있는데, 본 발명의 기능성 식품에는 상기 유효성분 외에도 필요에 따라 다양한 보조성분을 추가로 함유할 수 있다. 본 발명의 기능성 식품의 경우, 비타민 A, 비타민 B1, 비타민 B2, 비타민 B3, 비타민 B6, 비타민 B12, 엽산 (folic acid), 비타민 C, 비타민 D3, 비타민 E 등의 비타민류와, 구리, 칼슘, 철, 마그네슘, 칼륨, 아연 등의 미네랄 또는 유산균 등을 포함할 수 있다.
또한 본 발명의 기능성 식품 중, 건강음료는 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 포함할 수 있다. 향미제로는 타우마틴, 스테비아 추출물과 같은 천연 감미제나, 사카린, 아스파르탐과 같은 합성 감미제 등을 들 수 있다. 천연 탄수화물로는 포도당, 과당 등의 단당류, 말토스, 수크로오스 등의 이당류, 덱스트린, 사이클로덱스트린 등의 다당류, 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알코올류 등을 들 수 있다.
본 발명의 사료 첨가제는 기초사료에 일정 비율로 첨가하는 것이다. 상기 기초사료는 주성분이 옥수수, 대두박, 유청, 어분, 당밀, 소금, 비타민 프리믹스 및 미네랄 프리믹스 등으로 이루어질 수 있다. 비타민 프리믹스는 비타민 A, 비타민 D, 비타민 E, 리보프라빈 및 나이아신으로 구성될 수 있으며, 미네랄 프리믹스는 망간, 철, 아연, 칼슘, 구리, 코발트 및 셀레니늄 등으로 구성될 수 있다.
본 발명은 또한, 본 발명의 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는 의약품을 제공한다. 상기 의약품은 항균물질을 함유하고 있으므로 유해 세균에 의한 질환을 예방 또는 치료할 수 있고, 혈전용해 활성이 있으므로, 혈전용해제로 사용될 수 있다. 상기 균주는 바람직하게는 바실러스 서틸리스(Bacillus subtilis) SCDB 240 균주일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실험 재료 및 방법
균주 분리 및 배양 조건
다양한 균주를 분리하기 위해 전라북도 순창군에서 전통적인 방법으로 제조한 된장 시료를 수거하여 실험에 사용하였다. 수거한 된장 1 g의 시료를 9 mL의 0.85% 멸균 생리식염수에 넣어 십진법으로 희석한 후 LB (트립톤 1%, 효모추출물 0.5%, 염화나트륨 0.5%) 고체배지에 도말하여 30℃에서 24시간 배양하였다. 순수한 바실러스 서브틸리스 균주를 분리하기 위해 단일 콜로니를 분리하였고, LB 액체배지에서 30℃, 24시간 배양하였다. 선별한 균주를 대상으로 20%의 글리세롤을 포함한 LB 액체배지에 혼합하여 4℃에서 보관하였다. 보관 후 세포의 활성화는 LB 액체배지에서 30℃, 24시간 배양하여 활성화하여 사용하였다. 효소의 활성도 측정은 균체 배양액을 12000 rpm, 4℃, 30분 원심분리 후 상등액을 회수한 후 0.45 μm 맴브레인 필터(Sartorius, Frankfurt, Germany)로 제균하여 측정하였다.
바이오제닉 아민 생성여부 확인(정성분석)
바이오제닉 아민 생성여부의 정성분석은 다음과 같이 수행하였다. 순수한 바실러스 균주 콜로니를 1백금 취하여 바이오제닉 아민 생성 배지에 획선으로 도말하였다. 바이오제닉 아민 생성을 확인하기 위한 배지로는 LB 배지(1% 트립톤, 0.5% 효모추출물, 1% 염화나트륨, pH 5.0)에 1.5% 한천과 0.25% 글리세롤, 0.006% 브로모크레솔퍼플, 0.1%의 히스티딘 또는 티라민을 첨가한 후 37℃에서 24시간 동안 배양한 후 발색여부를 확인하였다. 대조구로 상기 배지에서 아미노산만을 첨가하지 않은 배지에서 동일하게 실험한 후 대조구로 사용하였다.
바이오제닉 아민 생성여부 확인(정량분석)
티라민, 히스타민의 정량 분석은 HPLC를 이용하여 분석하였다. 분석을 위한 시료준비 및 추출은 다음과 같이 조사하였으며, 분석에 사용한 티라민, 히스타민, 티로신, 히스티딘 댄실염화물 및 1,7-디아미노헵탄은 시그마 알드리치(sigma aldrich)사 제품을 구입하여 사용하였고, 프롤린, 에테르 및 염산은 삼천 화학 제품을 사용하였다. 아세토나이트릴과 물은 J.T. Baker 사 제품을 구입해 사용하였다. 표준용액은 0.1 노르말 염산에 녹여 약 1 g/L 되도록 제조한 후 0.1에서 100 mg/L의 농도로 2종의 표준 용액을 희석해 준비하였고, 분석을 통하여 검량곡선을 작성하였다. 바이오제닉 아민 분석의 생성여부를 확인하기 위해 선별 균주를 티라민, 히스타민의 전구체인 티로신, 히스티딘이 각각 200 ppm이 함유된 LB 액체배지에 접종한 후 30℃에서 24시간 배양하였고, 배양액을 분석에 활용하였다. 배양액과 표준용액을 각각 시험관에 0.5 mL씩 취한 후 1,7 디아미노헵탄 (0.1g/L) 0.25 mL씩 첨가하였다. 포화탄산나트륨용액 0.25 ml와 1% 댄실염화물 아세톤 용액 0.4 mL를 추가하여 혼합한 후 마개를 하여 45℃에서 1시간 동안 유도체화하였다. 유도체화 후 10% 프롤린 용액 0.25 mL를 가하여 과잉의 댄실염화물을 제거하고, 시험관에 에테르 2.5 mL를 가하여 3분간 진탕한 후 상등액을 취하여 이를 질소농축기에서 완전히 증발시킨 후 잔사를 아세토나이트릴 0.5 mL에 녹이고 0.45 μm 필터로 여과한 후 HPLC를 이용하여 분석하였다. 분석조건은 아래 표 1과 같다.
바이오제닉 아민, 알코올, 당 분석을 위한 HPLC 기기 분석 조건
바이오제닉 아민 분석을 위한 HPLC 분석 조건
Instrument Agilent 1200 series
(Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA)
Column CapcellPak C18 Column
Detector DAD detector (254 nm)
Mobile phase
 A: 0.1% formic acid in H2O
B: 0.1% formic acid in ACN
Gradient condition



 A:B = 45:55, 0~10 min
A:B = 35:65, 10~15 min
A:B = 20:80, 15~20 min
A:B = 10:90, 20~30 min
A:B = 10:90, 40 min over
Flow rate 1.0 mL/min
Temperature 40℃
Injection volume 20 ㎕
혈전용해 활성의 측정
세포 외로 분비되는 혈전분해효소의 활성 측정은 식품의약품안전청 독성연구소의 혈전용해제의 효능검색 프로토콜 (Fibrin plate법)과 Astrup와 Mullerttz의 방법을 상호 보완하여 측정하였다. 피브리노겐을 최종농도가 0.5% (w/v)가 되도록 PBS 완충액 (0.067 M 소듐 포스페이트 버퍼, pH 7.4)에 용해시킨 후 평판에 부은 후 1.0% (w/v) 아가로스 용액을 동량 첨가하여 혼합하였고, 여기에 트롬빈 (1 unit/ml)을 200 ㎕ 첨가하여 평평한 플레이트를 제조하였다. 제조한 피브린 플레이트에 분리 균주 배양 상등액 시료 100 ㎕을 분주하여 활성을 측정하였다. 양성 대조구로는 플라스민 (1.0 unit/ml, 2.0 unit/mg)을 사용하였다. 각 균주가 나타내는 혈전용해 활성은 아래 식과 같이 플라스민이 나타내는 혈전용해 활성의 상대 활성으로 정의하였다.
혈전용해 활성(%) = (시료의 용해 영역/플라스민의 용해 영역) × 100
세포외 효소의 활성측정(정성분석)
선별 균주가 균체 외로 방출하는 세포외 효소들 중 단백질, 섬유소, 전분 분해효소의 활성을 측정하기 위하여 각 효소와 특이적으로 반응할 기질 성분이 포함된 고체 평판배지를 각각 제조하였다. 분리한 미생물의 각 배양 상등액을 0.45 μm 맴브레인 필터(Sartorius, Frankfurt, Germany)로 제균한 뒤 100 ㎕씩을 8 mm의 준비한 웰에 접종하여 25℃에서 24시간 반응시킨 후 저지원의 크기를 측정하였다. 단백질 분해효소(protease)의 분비능은 2% 스킴 밀크 (DifcoTM, MI, USA)에 1.5% 한천(Junsei Chemical Co. Ltd., Tokyo, Japan)를 첨가하여 분리균의 배양 상등액을 접종한 후 저지환의 크기를 관찰하였고, 섬유소 분해효소(cellulase)의 활성은 Teather와 Wood의 방법에 따라 1% 카르복실메틸 셀룰로스 (CMC, Junsei Chemical Co. Ltd., Tokyo, Japan)에 1.5% 한천을 첨가하여 분리균의 배양 상등액을 접종하고 0.1% 콩고레드 (Sigma-aldrich, MO, USA)로 염색하고, 1M NaCl로 세척한 뒤 저지원의 크기를 관찰하였다. 또한 전분분해효소(amylase)의 활성은 전분(starch)을 기질로 사용하여 1%의 가용성 전분 (Junsei chemical Co. Ltd., Tokyo, Japan)를 함유한 전분 배지에 각 선별한 균주의 배양 상등액을 상기 방법과 동일하게 제균하고 100 ㎕씩을 준비한 웰에 분주하고 25℃에서 24시간 반응시킨 후 루골 용액(Lugol solution, Sigma-aldrich, MO, USA)으로 염색한 뒤 분해능을 저지원의 직경의 크기를 관찰하여 측정하였다.
세포외 효소의 활성측정(정량분석)
선별 균주가 분비하는 세포외 활성의 정확한 측정을 위해 정량분석을 실시하였으며, 단백질 분해효소의 활성 측정은 다음과 같이 측정하였다. 표준 곡선은 L-티로신을 이용하여 작성하였고, 효소 활성도(Unit)는 상기 조건(37℃, pH 7.5)에서 1분 동안 생성되는 1.0 μM의 티로신 양을 1 unit으로 정의하였다. 단백질의 농도는 브래드포드 분석 방법으로 소 혈청 알부민 (1 mg/ml BSA, Bio-Rad, USA)을 표준시료로 하여 측정하였다. α-아밀라제의 효소활성 측정은 Bernfeld (EC 3.2.1.1)의 방법을 사용하여 측정하였으며, 표준곡선은 0.2% (w/v)의 말토스를 이용해 작성하였고, 효소 활성도는 상기 방법에서 전분으로부터 1분 동안 생성되는 1.0 mg의 말토스 양을 1 unit으로 정의하였다. 단백질의 농도는 단백질 분해효소의 측정과 동일하게 브래드포드 분석 방법을 사용하여 측정하였다.
알레르기 피부질환 및 식중독 관련 유해병원성 미생물에 대한 항균력 확인
알레르기 피부질환(아토피)의 주요 2차 감염 원인균으로 알려진 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus)와 식품을 부패 또는 오염시켜 식중독을 유발하는 바실러스 세레우스(Bacillus cereus)에 대한 항균 활성을 측정하였다. 항균 활성의 측정을 위해 바실러스 세레우스 KCTC 3624는 한국생명공학연구원 생물자원센터(KCTC)로부터, 바실러스 세레우스 KCCM40935, 스타필로코커스 아우레우스 KCCM11593, KCCM41331은 한국미생물보존센터(KCCM)으로부터 분양받아 지시균주로 사용하였다. 측정 방법은 웰 확산(well diffusion) 방법을 이용하였으며, 각 지시균주의 배양액(3.0×105cfu/ml)을 0.8% 한천을 함유한 NB(enriched nutrient broth) 소프트 배지에 첨가하여 평판배지를 제작한 후 선별 균주의 배양 상등액 100 ㎕을 웰에 분주하여 배양상등액이 시험 평판배지에 확산되게 한 후 지시균주의 생육 최적 온도에서 18시간 이상 배양하여 저해환의 크기를 측정하여 항균력을 측정하였다.
항산화 활성
선별한 균주의 DPPH법에 의한 전자 공여능의 측정은 다음의 DPPH(2,2-diphenyl-1-picryl-hydrazyl)의 방법에 따라 실험하였다. 100 μM DPPH 에탄올 용액 1mL에 200 ㎕의 배양 상등액을 가하였다. 대조구로 배양 배지만을 첨가한 실험구를 사용하며, 반응 산물은 30분 동안 실온에서 반응 후 528㎚에서 자외선/가시광선 분광광도계(UV/VIS spectrophotometer, SPECORD 200, Analytic jeca)로 흡광도를 측정하여 아래 식에 따라 항산화 활성의 정도를 측정하였다.
항산화 활성 (%) = [1-(Abs528 nm of sample)/(Abs528 nm of control)]×100
또한, SOD(superoxide dismutase)의 측정은 Sigma SOD determination kit을 사용하여 SOD 활성(억제율, %)을 측정하였으며, 실험방법은 제조사의 매뉴얼에 따라 순서대로 진행하였으며, 시료는 DPPH 측정과 동일한 시료를 사용하여 측정해 DPPH의 활성과 SOD 활성을 비교하여 항산화능을 측정하였다.
최종 선별 균주의 동정
최종 선별 균주의 동정을 위해 균체는 한천 평판배지로부터 회수하였으며, 이들의 DNA는 ZR Fungal/Bacterial DNA MiniPrep kit를 사용하여 추출하였다. 16S rRNA 유전자는 두 개의 알려진 유니버셜 프라이머를 사용하여 증폭하였다. 두 유니버셜 프라이머의 염기서열은 다음과 같다. 먼저 정방향 프라이머는 27F 프라이머 5'-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3'(서열번호 2), 역방향 프라이머 1492R 프라이머는 5'-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3'(서열번호 3). PCR을 위한 각 반응의 조건은 다음과 같다. DNA의 변성 95℃ 1분, 프라이머의 어닐링 60℃ 1분, DNA 가닥의 합성 72℃에서 1분 또는 2분의 과정을 35회 반복하는 조건을 사용하였으며, 반응이 끝난 PCR 산물은 1% 아가로스 겔 (5 ㎕, X-gal 30 mg/ml)에서 전기영동한 후 밴드를 확인한 후 증폭이 확인된 PCR 산물은 코스모진텍(주)에 의뢰하여 동정을 실시하였다.
최종 선별 균주의 바실러스 세레우스 ( Bacillus cereus ) 독소 유전자 분석을 통한 안전성 분석
최종 선별 균주의 식품 내 안전성 여부를 확인하기 위해 바실러스 세레우스가 생성하는 6개의 설사형 독소와 구토형 독소 유전자를 보유하고 있는지 확인하기 위해 PCR 방법을 이용하여 동정하였다. PCR (Veriti 96-well Thermal Cycler, Life technologies)은 코젠 바이오텍의 PowerChekTM Bacillus cereus Toxin 60 plex Detection kit을 사용하여 조사하였으며, CER, hblC, bceT, entFM, nheA, cytK 등 6개 독소 유전자를 대상으로 유전자 보유 여부를 조사하였다. 먼저 PCR 반응을 위한 혼합물은 코젠 바이오텍의 매뉴얼에 따라 실시하였으며, PCR 반응 조건은 1 cycle로 95℃ 10분, 35회로 95℃ 30초, 60℃ 30초, 72℃ 30초로 실시하였고, 72℃에서 10분간 후 연장(post-extension)을 실시하였다. 증폭을 통해 확보한 PCR 산물은 0.5% TAE 버퍼에 0.5 ug/mL SYBR green가 포함된 1.0% 아가로스 겔로 전기영동한 후 UV transilluminator (Gel documentation, Bio-Rad)에서 밴드를 확인하여 독소 유전자의 보유 여부를 확인하였다.
실시예 1. 전통 된장으로부터 미생물의 분리
다양한 효소활성 및 항균활성과 항산화 활성을 갖는 바실러스를 선별하기 위하여 전라북도 순창군에서 전통적인 방법으로 제조한 된장 117종을 수거하여 실험에 사용하였다. 된장으로부터 701종의 분리주를 확보하였으며, 분리한 균주는 -20℃에서 보관한 뒤 다음 연구에 이용하였다.
실시예 2. 바이오제닉 아민 생성여부 확인(정성분석)
선별한 분리주를 대상으로 하여 정성분석을 통한 바이오제닉 아민 생성 여부를 조사하였다. 그 결과 선별한 분리주 701종 중 322종의 분리주가 바이오제닉 아민을 생성하지 않음을 확인하였으며, 322종의 분리주를 대상으로 다음 연구를 진행하였다.
실시예 3. 바이오제닉 아민 생성여부 확인(정량분석)
앞서 조사한 정성분석을 기반으로 하여 선별된 분리주를 대상으로 정량 분석을 실시한 결과 대부분의 분리주에서 정성분석과 동일한 결과값을 확인하였고, 일부 분리주에서 정성에서는 측정되지 않았던 티라민이나 히스타민이 일부 검출되었지만 정량을 할 수 있는 정도의 수치는 나타내지 않아 다음 실험을 실시하였다.
분리주의 바이오제닉 아민 생성여부 결과
Num. Histamine Tyramine
SCDB235 x x
SCDB236 - -
SCDB237 x x
SCDB238 - -
SCDB239 - +
SCDB240 - -
-, 바이오제닉아민 생성하지 않음; +, 바이오제닉아민 생성함; x, 반응하지 않음.
실시예 4. 세포외 효소의 활성측정
각종 유기물 분해능의 검정을 위하여 프로테아제, 셀룰라아제, 아밀라제를 대상으로 효소활성을 측정하였다. 각각의 스킴밀크, CMC(carboxymethyl cellulose), 녹말(starch) 배지를 살균한 후, 배지가 완전히 굳은 다음 각각의 분리주를 배양한 배양액을 웰 확산 방법을 이용하여 실시하였다. 각종 효소의 활성이 검증되는 25℃에서 12시간 활성화한 후 스킴밀크, CMC, 녹말의 분해능을 저지원(clear zone)의 직경으로 조사하였다.
아래 표 3에서 볼 수 있는 바와 같이, SCDB240 균주는 정성 분석 방법에 따른 측정 결과 단백질, 전분 분해효소 활성을 갖고 있는 것으로 나타났다. 따라서 선별 균주인 SCDB240을 대상으로 단백질 분해효소와 α-아밀라제 활성에 대한 정량분석을 추가로 진행하였다. 그 결과 단백질 분해 효소능은 상대적으로 약한 수치를 나타내었으나 α-아밀라제 효소 활성은 21914±234.42 Unit/g의 활성을 나타내어 타 미생물에 비해 높은 전분 분해 효소 활성을 갖는 것으로 나타났다.
SCDB 240의 세포외 효소 활성 검정(protease, cellulase, amylase)
효소 활성 정성 (mm) 정량(unit/g)
Protease 19 1750±159.85
Cellulase 15 ×
Amylase 16 21914±234.42
실시예 5. 혈전 용해 활성 측정
혈전용해 활성의 경우 앞선 세포외 효소 활성 실험 결과 단백질 분해효소의 활성을 갖는 분리주를 대상으로 측정을 실시하였다. 일반적으로 단백질 분해 효소능을 갖는 균주 중에 혈전용해 활성을 갖는 균주가 많은 것으로 보고되고 있어 1차적으로 정성분석을 통해 활성을 갖는 400개의 분리주를 선별하고 이중 정량 분석 결과 1000 unit/g 이상의 단백질 분해 효소 활성을 갖는 균주 20종을 선별하여 혈전 용해 활성을 측정하였다. 대조군으로는 1 unit/ml의 플라스민과 활성 비교를 통해 실시하였으며 현재 시판중인 플라스민 활성 제품의 경우 대부분 2.0 unit/mg 단위로 판매되고 있어 혈전 용해 활성 우수 미생물 선별은 플라스민 1 unit/ml의 활성과 유사하거나 높은 활성을 갖는 분리주 10종을 선별하였다. SCDB 240은 1.0 Unit에 해당하는 21 mm의 활성을 갖고 있는 것으로 분석되어 선별 균주 중 가장 높은 혈전 용해 활성을 갖는 균주로써 특성을 나타내었다.
된장으로부터 분리한 분리주의 혈전용해 활성 측정 결과
NO Strains Identification Fibrinolytic enzymevity (diameter, mm)
1 SCDB 135 Bacillus amyloliquefaciens 18
2 SCDB 169 Bacillus subtilis 　 19
3 SCDB 192 Bacillus amyloliquefaciens 　 21
4 SCDB 210 Bacillus subtilis 19
5 SCDB 232 Bacillus subtilis 19
6 SCDB 240 Bacillus subtilis 21
7 SCDB 274 Bacillus amyloliquefaciens 20
8 SCDB 294 Bacillus subtilis 19
9 SCDB 337 Bacillus subtilis 19
10 SCDB 427 Bacillus subtilis 17
Plasmin 1500 ug / ml 3.0U 2.3
Plasmin 750 ug / ml 1.5U 2.2
Plasmin 500 ug / ml 1.0U 2.1
Plasmin 250 ug / ml 0.5U 2.0
실시예 6. 알레르기 피부질환 및 식중독 관련 유해병원성 미생물에 대한 항균활성
알레르기 피부질환 및 식중독 관련 병원성 미생물에 대한 항균활성의 측정은 앞선 혈전용해 활성 검증을 통해 선별한 5종의 분리주를 대상으로 웰 확산 방법을 이용하여 확인하였다. 그 결과 선별 분리주 5종 모두 바실러스 세레우스(Bacillus cereus) 및 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus)에 대한 항균활성을 지니고 있었으며(표 5), 특히 SCDB 240은 지시 균주 4종에 대한 모든 활성을 지니며 항균활성 또한 가장 높은 수치를 보이고 있어 알레르기 피부질환 및 식중독 유해 미생물에 대한 억제능이 가장 우수한 분리주로 확인하였다.
된장으로부터 분리한 분리주의 항균활성 측정 결과
No . Strains No . Antibacterial activity ( diameter , mm )
Bacillus cereus KCTC 3624 Bacillus cereus
KCCM40935 		Staphylococcus aureus KCCM11593 Staphylococcus aureus KCCM41331
1 SCDB 192 11 12 14 10
2 SCDB 240 15 15 14 14
3 SCDB 253 11 13 14 -
4 SCDB 255 13 14 14 -
5 SCDB 274 12 13 14 -
실시예 7. 항산화 활성
본 발명의 전통 된장으로부터 분리한 분리주 중 바이오제닉 아민 비생성 및 혈전용해 활성이 가장 우수한 분리주 SCDB 240의 항산화 효과 측정은 DPPH에 의한 자유 라디컬 소거 효과 및 수퍼옥시드 디스뮤타제를 측정하여 확인하였다. DPPH를 이용하여 선별주의 항산화 효과를 측정한 결과 4.41±0.17%로 약한 항산화능을 보이고 있었으나, SOD를 측정한 결과 21.02±1.74%의 항산화능을 보여, 추후 항산화 활성을 증가시키기 위한 배지 조성 및 발효 조건 최적화를 실시한다면 항산화 또한 우수한 균주로써의 사용이 가능함을 확인할 수 있었다.
된장으로부터 분리한 분리주 SCDB 240의 항산화 활성 측정 결과
Strains Identification SOD (%) DPPH (%)
SCDB 240 Bacillus subtilis 21.02±1.74 4.41±0.17
실시예 8. 최종 선별 분리주 SCDB 240의 동정
최종 선별한 SCDB 240 균주의 동정을 위해 16S rRNA 유전자 염기서열(서열번호 1, 도 2)을 분석하였으며, 결과를 기반으로 BLAST 검색 결과 SCDB 240은 바실러스 서틸리스(Bacillus subtilis)로 판명되었으며, 염기서열을 이용하여 Eztaxon serve에서 표준 균주와 상동성을 분석한 결과 SCDB 240(1379 bp)는 바실러스 서틸리스 아종 스피지제니 ATCC 6633T(NR118486), 바실러스 서틸리스 DSM 10T(AJ276351)과 각각 100%의 유사성을 나타내었으며, 16S rRNA 염기서열을 토대로 하여 계통수(phylogenetic tree)를 작성하였다. 최종적으로 바실러스 서틸리스 SCDB 240으로 명명하였으며, 한국미생물보존센터(KCCM, Korean Culture Center of Microorganisms)에 바실러스 서틸리스 (KCCM11831P)로 기탁하였다.
실시예 9. 바실러스 세레우스 ( Bacillus cereus ) 독소 유전자 분석을 통한 안전성 분석
된장으로부터 분리한 고초균의 균주 특성 및 기능성 효능 평가와 균주 동정을 통해 GRAS 균주로 확인된 SCDB 240을 최종 식품 적용 가능 기능성 균주로 선정하였으며, 이를 식품에 이용하기 위해 최종적으로 식중독 유발 독소 유전자의 유무를 확인하여 안전성을 확보하고자 하였다. SCDB 240에 대한 바실러스 세레우스(Bacillus cereus) 독소 유전자에 대하여 PowerChekTM Bacillus cereus Toxin 6-plex Detection kit을 사용하여 확인한 결과 6종의 독소를 생성하는 유전자가 없는 것으로 나타나 식중독에 대한 안전성을 지니고 있어 식품 및 식품첨가제 등과 같은 다양한 응용 분야에 이용 가능함을 확인하였다.
SCDB 240의 바실러스 세레우스 독소 유전자 분석 결과
Strain No . Identification
(16s rRNA seq ) 		PowerChek TM Bacillus cereus Toxin 6- plex Detection Kit
CytK nheA ent FM bceT hblC CER
SCDB 240 Bacillus subtilis ND ND ND ND ND ND
ND : 미검출
한국미생물보존센터(국외) KCCM11831P 20160415
<110> Microbial Institute for Fermentation Industry <120> Bacillus subtilis SCDB 240 strain having fibrinolytic activity and antimicrobial activity against pathogenic microorganism and not producing biogenic amine and uses thereof <130> PN16154 <160> 3 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 1379 <212> DNA <213> Bacillus subtilis SCDB240 <400> 1 tagcggcgga cgggtgagta acacgtgggt aacctgcctg taagactggg ataactccgg 60 gaaaccgggg ctaataccgg atggttgttt gaaccgcatg gttcaaacat aaaaggtggc 120 ttcggctacc acttacagat ggacccgcgg cgcattagct agttggtgag gtaacggctc 180 accaaggcaa cgatgcgtag ccgacctgag agggtgatcg gccacactgg gactgagaca 240 cggcccagac tcctacggga ggcagcagta gggaatcttc cgcaatggac gaaagtctga 300 cggagcaacg ccgcgtgagt gatgaaggtt ttcggatcgt aaagctctgt tgttagggaa 360 gaacaagtac cgttcgaata gggcggtacc ttgacggtac ctaaccagaa agccacggct 420 aactacgtgc cagcagccgc ggtaatacgt aggtggcaag cgttgtccgg aattattggg 480 cgtaaagggc tcgcaggcgg tttcttaagt ctgatgtgaa agcccccggc tcaaccgggg 540 agggtcattg gaaactgggg aacttgagtg cagaagagga gagtggaatt ccacgtgtag 600 cggtgaaatg cgtagagatg tggaggaaca ccagtggcga aggcgactct ctggtctgta 660 actgacgctg aggagcgaaa gcgtggggag cgaacaggat tagataccct ggtagtccac 720 gccgtaaacg atgagtgcta agtgttaggg ggtttccgcc ccttagtgct gcagctaacg 780 cattaagcac tccgcctggg gagtacggtc gcaagactga aactcaaagg aattgacggg 840 ggcccgcaca agcggtggag catgtggttt aattcgaagc aacgcgaaga accttaccag 900 gtcttgacat cctctgacaa tcctagagat aggacgtccc cttcgggggc agagtgacag 960 gtggtgcatg gttgtcgtca gctcgtgtcg tgagatgttg ggttaagtcc cgcaacgagc 1020 gcaacccttg atcttagttg ccagcattca gttgggcact ctaaggtgac tgccggtgac 1080 aaaccggagg aaggtgggga tgacgtcaaa tcatcatgcc ccttatgacc tgggctacac 1140 acgtgctaca atggacagaa caaagggcag cgaaaccgcg aggttaagcc aatcccacaa 1200 atctgttctc agttcggatc gcagtctgca actcgactgc gtgaagctgg aatcgctagt 1260 aatcgcggat cagcatgccg cggtgaatac gttcccgggc cttgtacaca ccgcccgtca 1320 caccacgaga gtttgtaaca cccgaagtcg gtgaggtaac cttttaggag ccagccgcc 1379 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 2 agagtttgat cmtggctcag 20 <210> 3 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 tacggytacc ttgttacgac tt 22

Claims (8)

  1. 장류로부터 분리된, 혈전용해 활성, 바실러스 세레우스(Bacillus cereus) 및 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus)에 대한 항균 활성 및 항산화 활성이 있고, 히스타민 및 티라민의 바이오제닉 아민을 생산하지 않으면서, 프로테아제 및 α-아밀라제 효소를 분비하는 바실러스 서틸리스(Bacillus subtilis) SCDB 240 균주(KCCM11831P).
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 제1항의 바실러스 서틸리스(Bacillus subtilis) SCDB 240 균주 또는 이의 배양액을 스타터(starter) 균주로 이용하여 장류를 제조하는 방법.
  5. 제1항의 바실러스 서틸리스(Bacillus subtilis) SCDB 240 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 함유하는 장류 제조용 미생물 제제.
  6. 제1항의 바실러스 서틸리스(Bacillus subtilis) SCDB 240 균주를 포함하는 식품.
  7. 제1항의 바실러스 서틸리스(Bacillus subtilis) SCDB 240 균주 또는 이의 배양액을 장류에 처리하는 단계를 포함하는 바실러스 세레우스(Bacillus cereus) 또는 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus)제어 방법.
  8. 제1항의 바실러스 서틸리스(Bacillus subtilis) SCDB 240 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 함유하는 바실러스 세레우스(Bacillus cereus) 또는 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus)에 대한 항균용 조성물.
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