KR102065580B1 - 항균 활성과 프로바이오틱스 특성을 갖는 락토바실러스 브레비스 scml 432 균주 및 이의 용도 - Google Patents

항균 활성과 프로바이오틱스 특성을 갖는 락토바실러스 브레비스 scml 432 균주 및 이의 용도 Download PDF

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정수지
류명선
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Abstract

본 발명은 유해 미생물에 대한 항균 활성, 항생제 내성, 항산화 활성, γ-용혈 활성 및 효소 분비능이 있고, 바이오제닉 아민, 유해물질 및 유해효소를 생성하지 않는 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis) SCML 432 균주에 관한 것으로, 본 발명의 락토바실러스 브레비스 SCML 432 균주는 정장제, 장류 제조를 위한 스타터 균주 및 항균용 미생물 제제 등 관련 산업에 다양하게 사용될 수 있는 유용한 균주로 판단된다.

Description

항균 활성과 프로바이오틱스 특성을 갖는 락토바실러스 브레비스 SCML 432 균주 및 이의 용도{Lactobacillus brevis SCML 432 strain having antimicrobial activity and probiotics properties and uses thereof}
본 발명은 항균 활성과 프로바이오틱스 특성을 갖는 락토바실러스 브레비스 SCML 432 균주 및 이의 용도에 관한 것이다.
유산균은 대표적인 GRAS(Generally recognized as safe) 균주로 발효식품에 존재하는 바이오제닉 아민의 생산을 저해하거나 분해하고, 발효과정에서 병원성 미생물의 증식 억제와 유기산과 단백질, 전분, 섬유소 등과 같은 분해효소를 생산함으로써 독특한 풍미와 조직감을 유지시켜줄 뿐만 아니라, 체내 유용 장내 미생물로 존재하며 항암 및 혈중 콜레스테롤 저감 작용과 면역력 증진 등에 도움을 준다고 알려져 있어 의약품이나 건강기능 식품의 개발에 있어 사람의 건강에 이로운 작용을 하는 프로바이오틱스로 주목받고 있다. 프로바이오틱스는 프리바이오틱스인 락투로오스(lactulose), 락토수크로오스(lactosucrose), 올리고당(oligosaccharides), 라피노오스(raffinose), 이눌린(inulin), 스타키오스(stachyose) 등 복합다당류를 탄소원으로 사용하여 바실러스(Bacillus)와 같은 고초균, 비피도박테리움(Bifidobacterium)과 락토바실러스(Lactobacillus) 속 유산균의 성장을 선택적으로 촉진시켜 주며, 인간과 동물의 장내 유해균을 제어함으로써 장내 환경을 개선시키는 역할을 한다고 보고되고 있다. 또한, PPAR-γ(peroxisome proliferator activated receptor-γ) 활성화를 통한 염증 억제 효과, 아토피성 피부염, 만성 신장질환 등에 대한 개선 효능이 밝혀지고 있으며, 프로바이오틱스와 식품 원료로 사용가능한 프리바이오틱스를 조합하여 장내 환경을 효과적으로 개선할 수 있는 신바이오틱스에 대한 연구가 국내외에서 활발히 진행되고 있다. 특히, 국내에서도 건강에 대한 인식이 날로 증가하고 자연식품에 대한 선호나 항생제 남용으로 인한 문제 등으로 프로바이오틱스의 사용이 권장되고 있는 추세이나, 대부분의 프로바이오틱스가 외국에서 수입한 생균을 원료로 사용하여 상품화되고 있기 때문에 수입대체 및 국내의 독자적 프로바이오틱스 균주의 개발과 관련 기술의 확보가 무엇보다도 중요한 시기이다.
한편, 한국등록특허 제1734368호에는 '유해 미생물에 대한 항균 활성, 항생제 내성, 항산화 활성, β-글루코시다제 및 세포외 효소 분비능이 우수하고, 바이오제닉 아민을 생성하지 않는 전통장류 유래의 락토바실러스 브레비스 SCML458 균주 및 이의 용도'에 대해 개시하고 있고, 한국등록특허 제1734367호에는 '유해 미생물에 대한 항균 활성, 항생제 내성, 항산화 활성, β-글루코시다제 및 세포외 효소 분비능이 우수하고, 바이오제닉 아민을 생성하지 않는 전통장류 유래의 락토바실러스 브레비스 SCML67 균주 및 이의 용도'에 대해 개시하고 있다. 하지만, 본 발명의 '항균 활성과 프로바이오틱스 특성을 갖는 락토바실러스 브레비스 SCML 432 균주 및 이의 용도'에 대해 아직까지 개시된 바가 없다.
본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명에서는 전통 장류에서 분리된 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis) SCML 432 균주(KCCM12269P)가 유해 미생물인 바실러스 세레우스(Bacillus cereus)에 대한 항균 활성, 9종의 항생제에 대한 내성, 항산화 활성, γ-용혈 활성과 에스터라아제(esterase), 에스터라아제 리파아제(esterase lipase), 루신 아릴아미다아제(leucin arylamidase), 발린 아릴아미다아제(valine arymidase), 산성인산가수분해효소(Acid phosphatase), 나프톨-AS-BI-포스포히드롤라아제(Naphol-AS-BI-phosphohydrolase), α-갈락토시다아제(α-galactosidase), β-갈락토시다아제(β-galactosidase), β-글루코시다아제(β-glucosidase) 및 N-아세틸-β-글루코사미니다아제(N-acetyl-β-glucosaminidase) 분비능이 우수하고, 바이오제닉 아민, 유해물질 및 유해효소를 생성하지 않는 것을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
상기 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 유해 미생물에 대한 항균 활성, 항생제 내성, 항산화 활성, γ-용혈 활성 및 효소 분비능이 있고, 바이오제닉 아민, 유해물질 및 유해효소를 생성하지 않는, 기탁번호가 KCCM12269P인 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis) SCML 432 균주를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 균주, 이의 배양액, 상기 배양액의 농축액 또는 그의 건조물을 유효성분으로 포함하는 프로바이오틱스 제제를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 균주, 이의 배양액, 상기 배양액의 농축액 또는 그의 건조물을 유효성분으로 함유하는 장류 제조용 스타터(starter) 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 균주, 이의 배양액, 상기 배양액의 농축액 또는 그의 건조물을 유효성분으로 함유하는 유해 미생물에 대한 항균용 조성물을 제공한다.
본 발명의 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis) SCML 432 균주(KCCM12269P)는 유해 미생물의 증식을 억제하고, 다양한 분해효소를 분비하며, 항생제 내성, 항산화 활성, γ-용혈 활성이 우수하고, 바이오제닉 아민, 유해물질 및 유해효소를 생성하지 않는 것을 확인하였다. 따라서, 본 발명의 락토바실러스 브레비스 SCML 432 균주는 정장제, 장류 제조를 위한 스타터 균주 및 항균용 미생물 제제 등 관련 산업에 다양하게 사용될 수 있는 유용한 균주로 판단된다.
도 1은 본 발명에서 분리한 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis) SCML 432 균주의 16S rRNA의 염기서열을 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명에서 분리한 락토바실러스 브레비스 SCML 432 균주의 계통도를 나타낸 것이다.
본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 유해 미생물에 대한 항균 활성, 항생제 내성, 항산화 활성, γ-용혈 활성 및 효소 분비능이 있고, 바이오제닉 아민, 유해물질 및 유해효소를 생성하지 않는, 기탁번호가 KCCM12269P인 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis) SCML 432 균주를 제공한다.
본 발명에서 전통장류로부터 균주를 분리하였고, 그 중 유해 미생물에 대한 항균 활성, 항생제 내성, 항산화 활성, γ-용혈 활성 및 효소 분비능이 있고, 바이오제닉 아민, 유해물질 및 유해효소를 생성하지 않는 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis) 균주를 확인하였으며, 이를 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis) SCML 432 균주로 동정하여 한국미생물보존센터(KCCM)에 2018년 05월 28일에 기탁하였다(기탁번호: KCCM12269P).
본 발명의 락토바실러스 브레비스 SCML 432 균주에서, 상기 유해 미생물은 바실러스 세레우스(Bacillus cereus)이며, 상기 항생제는 세팔로신(cephalothin), 린코마이신(lincomycin), 콜리스틴(colistin), 시프로프록사신(ciprofloxacin), 스트렙토마이신(streptomycin), 노르플록사신(norfloxacin), 카나마이신(kanamycin), 아미카신(amikacin), 트리메토프림/설파메톡사졸(trimethoprim/sulfamethoxazole)이며, 상기 효소는 에스터라아제(esterase), 에스터라아제 리파아제(esterase lipase), 루신 아릴아미다아제(leucin arylamidase), 발린 아릴아미다아제(valine arymidase), 산성인산가수분해효소(Acid phosphatase), 나프톨-AS-BI-포스포히드롤라아제(Naphol-AS-BI-phosphohydrolase), α-갈락토시다아제(α-galactosidase), β-갈락토시다아제(β-galactosidase), β-글루코시다아제(β-glucosidase) 및 N-아세틸-β-글루코사미니다아제(N-acetyl-β-glucosaminidase)이며, 상기 바이오제닉 아민은 히스타민(histamine) 및 티라민(tyramine)이며, 유해물질은 인돌(indole) 및 페닐피루브산(phenyl-pyruvic acid)이며, 유해효소는 β-글루쿠로니다아제(β-glucuronidase) 및 우레아제(urease)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명은 상기 균주, 이의 배양액, 상기 배양액의 농축액 또는 그의 건조물을 유효성분으로 포함하는 프로바이오틱스 제제를 제공한다.
상기 프로바이오틱스 제제는 당업계에 공지된 방법에 따라 다양한 제형과 방법으로 제조 및 투여될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 락토바실러스 브레비스 SCML 432 균주, 이의 배양액, 상기 배양액의 농축액 또는 그의 건조물은 약제학적 분야에서 통상적으로 사용되는 담체와 혼합하여 산제(powder), 액제(liquids and solutions), 정제(tablet), 캡슐(capsule), 시럽(syrup), 현탁제(suspension) 또는 과립제(granule) 등의 형태로 제조되어 투여될 수 있다. 상기 담체로는 예를 들어, 결합제, 활탁제, 붕해제, 부형제, 가용화제, 분산제, 안정화제, 현탁화제, 색소 및 향료 등일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 투여 용량은 체내에서의 활성성분의 흡수도, 불활성률, 배설속도, 피투여자의 연령, 성별, 축종, 상태 및 질병의 중증 정도 등에 따라 적절히 선택할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 프로바이오틱스 제제를 포함하는 식품을 제공한다.
본 발명의 상기 프로바이오틱스 제제는 유해 미생물에 대한 항균 활성, 항생제 내성, 항산화 활성, γ-용혈 활성 및 효소 분비능이 있고, 바이오제닉 아민, 유해물질 및 유해효소를 생성하지 않는, 기탁번호가 KCCM12269P인 락토바실러스 브레비스 SCML 432 균주, 이의 배양액, 상기 배양액의 농축액 또는 그의 건조물을 유효성분으로 포함한다.
본 발명의 상기 프로바이오틱스를 식품첨가물로 사용하는 경우, 상기 프로바이오틱스를 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효 성분의 혼합양은 그의 사용 목적(예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 식품 또는 음료의 제조시에 본 발명의 프로바이오틱스는 원료에 대하여 15 중량부 이하, 바람직하게는 10 중량부 이하의 양으로 첨가된다. 그러나 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 혼합양은 상기 범위 이하일 수 있으며, 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 혼합양은 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있다.
상기 식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 상기 프로바이오틱스를 첨가할 수 있는 식품의 예로는 빵, 캔디류, 스낵류, 과자류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제 및 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 건강식품을 모두 포함한다.
또한, 본 발명은 상기 균주, 이의 배양액, 상기 배양액의 농축액 또는 그의 건조물을 유효성분으로 함유하는 장류 제조용 스타터(starter) 조성물을 제공한다.
본 발명에 있어서, 장류 제조용 스타터(starter)란 장류 제조를 위해 발효에 관여하는 미생물을 포함하는 제제 또는 조성물을 의미한다. 장류 제조 시에 첨가함으로써 발효된 장류에서 생장할 수 있는 미생물 또는 우점종으로 생장할 수 있는 미생물을 제공하기 위하여 사용된다. 상기 장류 발효용 스타터를 사용하여 장류를 제조하는 경우, 상기 장류 발효용 스타터에 포함된 미생물에 의하여, 장류의 품질을 일정하게 조절하거나, 특정한 목적, 일 예로 장류에서 이취를 발생시키지 않거나, 감소시키는 목적 또는 장류에서 구수한 맛이나 단맛을 강화시키기 위한 목적을 달성할 수 있다.
본 발명의 균주를 배양하는 방법은 당업계에 통상적으로 이용되는 방법에 따라 배양할 수 있으며, 특별한 방법에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 균주를 배양하는 단계에서 얻어지는 상기 균주 또는 상기 균주의 배양물 또는 상기 균주의 배양액의 농축액을 첨가제로 사용할 경우, 상기 균주 또는 상기 균주의 배양물 또는 상기 균주의 배양액의 농축액을 그대로 첨가하거나 다른 첨가제를 함께 사용할 수 있으며, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효 성분의 혼합양은 그의 사용 목적에 따라 적합하게 결정될 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 균주 또는 이의 배양액을 스타터(starter) 균주로 이용하여 장류를 제조하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 균주, 이의 배양액, 상기 배양액의 농축액 또는 그의 건조물을 유효성분으로 함유하는 유해 미생물에 대한 항균용 조성물을 제공한다.
본 발명의 항균 조성물이란 항미생물제를 총칭하는 의미인 항생제와 같은 의미일 수 있고, 항진균제, 살균제, 방부제, 보존제 또는 제균제와 같은 의미일 수 있으며, 바람직하게는 바실러스 세레우스 등을 포함하는 병원성 미생물, 특히 그람 양성 병원성 미생물의 발육과 생활 기능을 저지 또는 억제할 수 있는 물질을 의미할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 항균 조성물은 락토바실러스 브레비스 SCML 432 균주, 이의 배양액, 상기 배양액의 농축액 또는 그의 건조물 외에 당질, 단백질, 지질, 비타민류 및 미네랄류를 포함할 수 있다. 상기 당질, 단백질, 지질, 비타민류 또는 미네랄류는 그 사용 목적 및 용도에 따라 적의 선택될 수 있으며, 일 예로 상기 당질은 벌꿀, 덱스트린, 수크로오스, 팔라티노스, 포도당, 과당, 물엿, 당알콜(sugar alcohol), 소르비톨, 크실리톨, 말티톨일 수 있고 상기 단백질은 카제인(casein), 유청 단백질(whey protein) 등의 우유 유래 단백질, 대두 단백질, 이들 단백질의 트립신, 펩신 등의 동물 유래 효소 및 뉴트라아제(neutrase), 알칼라아제(alkilase)에 의한 가수분해물일 수 있으며, 상기 지질은 제1가 포화지방산, 다가 불포화지방산을 포함하는 해바라기유, 채종유(rapeseed oil), 올리브유, 홍화유(safflower oil), 옥수수유, 대두유, 팜유(palm oil), 야자유 등의 각종 식물 유래 유지, 중쇄 지방산(middle-chain fatty acid), EPA, DHA, 대두유래 인지질, 우유 유래 인지질일 수 있고, 상기 미네랄류는 인산칼륨, 탄산칼륨, 염화칼륨, 염화나트륨, 유산칼슘, 글루콘산칼슘, 판토텐산칼슘, 카제인칼슘, 염화마그네슘, 황산제1철, 탄산수소나트륨일 수 있으나, 각각의 예에 의해 특별히 제한되는 것은 아니다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
재료 및 방법
균주 분리 및 배양 조건
전라북도 순창군 11개 면에서 전통 방법으로 제조한 메주 시료 약 180여 종을 유산균 분리를 위한 근원 시료로 사용하였다. 각각의 시료 1g을 멸균생리식염수 9mL에 단계 희석하여 MRS 아가(DifcoTM, MI, USA) 배지에 100㎕ 도말하여 37℃에서 48시간 배양하였다. 각각의 배양한 미생물을 집락 형태가 상이한 균주를 선별하여 순수 분리하였으며, 선별 분리주는 10% 스킴밀크(DifcoTM)에 재부유하고 80℃에 보관하여 하기 실시예에 사용하였다.
선별 균주의 동정
선별 균주의 동정을 위해 균체는 한천 고체배지로부터 회수하였으며, 이들의 DNA는 ZR Fungal/Bacterial DNA MiniPrep kit를 사용하여 추출하였다. 16S rRNA 유전자는 두 개의 알려진 유니버설 프라이머를 사용하여 증폭하였다. 두 유니버설 프라이머의 염기서열은 다음과 같다. 먼저, 정방향 프라이머는 27F 프라이머 5'-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3'(서열번호 2), 역방향 프라이머는 1492R 프라이머 5'-TACGGYTACCTTGTT ACGACTT-3'(서열번호 3). PCR 반응의 조건은 다음과 같다. DNA의 변성 95℃에서 1분, 프라이머의 결합 60℃에서 1분, DNA 나선의 합성 72℃에서 1분 또는 2분의 과정을 35회 반복하는 조건을 사용하였으며, 반응이 끝난 PCR 산물은 1.5% 아가로스 겔(5㎕, X-gal 30mg/mL)에서 전기영동 한 후 밴드를 확인한 후 증폭이 확인된 PCR 산물은 마크로젠(주)에 의뢰하여 16S rRNA 유전자의 서열분석을 실시하였다.
바이오제닉 아민 생성여부 확인
티라민, 히스타민의 정량 분석은 HPLC를 이용하여 분석하였다. 분석에 사용한 티라민, 히스타민, 티로신, 히스티딘 댄실염화물 및 1,7-디아미노헵탄은 시그마 알드리치(sigma aldrich, USA)사 제품을 구입하여 사용하였고, 프롤린, 에테르 및 염산은 삼천 화학 제품을 사용하였다. 아세토나이트릴과 물은 J.T. Baker사 제품을 구입해 사용하였다. 표준용액은 0.1N 염산에 녹여 약 1g/L 되도록 제조한 후 0.1~100mg/L의 농도로 2종의 표준 용액을 희석해 준비하였고, 분석을 통하여 검량곡선을 작성하였다. 바이오제닉 아민의 생성여부를 확인하기 위해 선별 균주를 티라민 및 히스타민의 전구물질인 티로신 및 히스티딘이 각각 200ppm이 함유된 MRS 액체배지에 접종한 후 37℃에서 24시간 동안 배양하였고, 배양액을 13,000rpm에서 10분간 원심분리하여 상등액을 분석에 활용하였다. 배양액과 표준용액을 각각 시험관에 0.5mL씩 취한 후 1,7-디아미노헵탄(0.1g/L) 0.25mL씩 첨가하였다. 포화탄산나트륨용액 0.25mL과 1% 댄실염화물 아세톤 용액 0.4mL을 첨가하여 혼합한 후 45℃에서 1시간 동안 유도체화 하였다. 유도체화 후 10% 프롤린 용액 0.25mL을 가하여 과잉의 댄실염화물을 제거하고, 시험관에 에테르 2.5mL를 가하여 3분간 진탕한 후 상등액을 취하여 이를 질소농축기에서 완전히 증발시킨 후 잔사를 아세토나이트릴 0.5 mL에 녹여 0.45㎕ 필터로 여과한 후 HPLC를 이용하여 분석하였다. 분석조건은 아래 표와 같다.
바이오제닉 아민 분석을 위한 HPLC 기기 분석 조건
HPLC 조건
기기 Agilent 1200 series
(Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA)
칼럼 CapcellPak C18 Column
검출기 DAD detector (254 nm)
이동상 A: 0.1% formic acid in H2O
B: 0.1% formic acid in ACN
구배조건 A:B = 45:55, 0~10 min
A:B = 35:65, 10~15 min
A:B = 20:80, 15~20 min
A:B = 10:90, 20~30 min
A:B = 10:90, 40 min over
유량 1.0 mL/min
온도 40oC
주입량 20㎕
식중독 관련 유해병원성 미생물에 대한 항균력 확인
식품을 부패 또는 오염시켜 식중독 유발하는 바실러스 세레우스(Bacillus cereus)에 대한 항균 활성을 측정하였다. 항균 활성의 측정을 위해 바실러스 세레우스 KCTC3624는 한국생명공학연구원 생물자원센터(KCTC)으로부터 분양받고, 바실러스 세레우스 KCCM40935은 한국미생물보존센터(KCCM)으로부터 분양받아 지시균주로 사용하였다. 측정 방법은 웰 확산 방법을 이용하였으며, 각 지시균주는 NB(Nutrient broth, Difco) 배지에서 37℃, 24시간 배양 후 흡광도를 측정하여 일정한 농도(OD660, 0.4)를 0.8% 아가를 함유한 NB 소프트 아가 배지에 첨가하여 평판배지를 제조하였다. 선별 균주는 MRS 배지에서 37℃, 24시간 진탕 배양하여 15,000 rpm으로 10분간 원심분리 후 상등액 취하여 0.45μm의 시린지 필터(Sartorius, Germany)로 제균한 뒤 6mm 웰에 각각 분주하였다. 분주 후 30℃에서 24시간 배양하여 각각의 웰 주변에 생기는 억제환의 크기를 측정하여 유해 미생물에 대한 항균활성을 확인하였다.
용혈성 및 유해 대사산물과 유해효소 생성 분석
균주의 용혈성을 확인하기 위하여 혈액 아가 배지를 이용하였으며, 혈액 아가 베이스(BD, USA)에 5% 양(sheep) 혈액(Kisanbio, Korea)를 첨가하여 혈액 아가 배지를 제조하였다. 균주를 혈액 아가 배지에 접종하여 37℃에서 24~48시간 배양하여 균주 주위로 생기는 환의 형태로 용혈성을 확인하였다. 유해대사산물로 인돌(indole), 페닐피루브산(phenyl-pyruvic acid)의 생성 여부를 확인하였다. 트립토판(tryptophan)의 탈아미노화로 인하여 생성되는 인돌을 균주가 생성하는지 확인하기 위하여 TSB 액체배지에 접종하고 37℃에서 24시간 진탕배양 후 인돌 용액드로퍼(BBL, USA)를 첨가하고 부드럽게 흔든 후 30초 내 배지 표면에 나타나는 색변화로 인돌 형성 여부를 확인하였다. 페닐피루브산은 페닐알라닌 아가(BD, USA) 배지에 균주를 접종하여 37℃에서 24~48시간 배양 후 10% 염화제2철(ferric-chloride)을 3-4방울 첨가 후 균주 주위로 색의 변화로 페닐피루브산 생성 여부를 확인하였다. 유해효소인 우레아제, β-글루쿠로니다아제의 생성 여부를 확인하였다. 우레아제는 우레아 신속 테스트 키트(MB cell, Korea)에 균주를 접종하고 바젤린 오일(vaseline oil)을 첨가하여 산소가 차단된 상태로 37℃에서 4~24 시간 배양하며 색 변화를 확인하여 우레아제 생성여부를 확인하였다. β-글루쿠로니다아제는 TBX 아가(Oxoid, Germany) 배지에 균주를 접종하여 37℃에서 24~48시간 배양 후 균주의 색 변화를 확인하여 β-글루쿠로니다아제 생성여부를 확인하였다.
항산화 활성 분석
항산화 활성은 DPPH 자유 라디칼 소거능으로 확인하였다. 100μM의 DPPH(2,2diphenyl1picrylhydrazyl, Sigma-aldrich) 에탄올 용액 1mL에 200㎕의 배양 상등액을 가하여 실온에서 30분간 반응시킨 후 UV/VIS 분광광도계(SPECORD200, Analytic jena, Jena, Germany)로 517nm에서 흡광도를 측정하였다. 대조구로는 MRS 배지를 사용하였으며, 하기 식을 활용하여 DPPH 자유 라디칼 소거능을 산출하였다.
DPPH 자유 라디칼 소거능(%)=[1-(A/B)×100]
A : Absorbance of DPPH solution with sample at 517nm
B : Absorbance of DPPH solution without sample at 517nm
API ZYM 키트를 이용한 효소활성 분석
선별 균주의 효소활성을 확인하기 위하여 총 19종의 각종 효소의 기질 이용성을 기초로 제작된 API ZYM 키트(BioMerieux, Marcy-I'Etoile, France)를 사용하였다. 선별 유산균을 MRS 아가 배지에서 획선 도말하여 37℃에서 48시간 동안 배양한 콜로니를 2mL 현탁 배지에 재부유하고, McFarland(BioMerieux)로 탁도 5~6으로 조정하여 각 튜브에 60㎕씩 분주하고 37℃에서 4시간 배양한 후 ZYM A 및 ZYM B 시약을 각 튜브에 한 방울씩 떨어뜨리고 5분간 실온에서 반응시켜 색 변화로 각각의 기질 효소에 대한 활성 여부를 판독하였다. 색의 변화 정도에 따라 0~5까지의 값으로 표시하였으며, 0은 음성반응, 5 (=40 nanomoles)는 최대 강도의 반응이고 4~1은 각각 30, 20, 10 및 5 nanomoles의 중간 값을 나타내며 3 이상일 경우 양성으로 판정하였다.
항생제 감수성 분석
선별 균주의 항생제 감수성 여부를 판단하기 위하여 NCCLS(National Committee for clinical Laboratory Standards)의 디스크 확산법으로 실시하였다. 사용한 항생제 디스크(BBLSensi-disc, Becton Dickinson Co., USA)는 세팔로신(cephalothin, 30㎍, CF), 네오마이신(neomycin, 30㎍, N), 린코마이신(lincomycin, 2㎍, L), 독시사이클린(doxycycline, 30㎍, D), 테트라사이클린(tetracycline, 30㎍, TE), 젠타마이신(gentamicin, 10㎍, GM), 콜리스틴(colistin, 10㎍, CL), 아목시실린/클라불란산(amoxicillin/clavulanic acid, 20㎍/10μg, AMC), 시프로프록사신(ciprofloxacin, 5㎍, CIP), 스트렙토마이신(streptomycin, 10㎍, S), 노르플록사신(norfloxacin, 10㎍, NOR), 카나마이신(kanamycin, 30㎍, K), 암피실린(ampicillin, 10㎍, AM), 에리스로마이신(erythromycin, 15㎍, E), 아미카신(amikacin, 30㎍, AN), 트리메토프림/설파메톡사졸(trimethoprim/sulfamethoxazole, 1.25㎍/23.75㎍, SXT)로 16종을 사용하였다. 선별된 균주를 물러-힌트 액체 배지(Merck, Darmstadf, Germany)에 접종하고 37℃에서 5시간 동안 배양한 후 MacFarland(BioMerieux) No. 0.5로 맞춰 물러-힌트 아가(Merck)에 도말하고 30분간 건조하여 상기 16종의 항생제 디스크를 놓은 후 37℃에서 24시간 동안 배양한 후 각 항생제에 대한 억제환의 크기를 측정하고 CLSI 가이드라인에 따라 감수성과 내성을 판정하였다.
실시예 1. SCML 432의 동정
SCML 432 균주의 동정을 위해 16S rRNA 유전자 염기서열(서열번호 1, 도 1)을 분석하였으며, 결과를 기반으로 BLAST(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/) 검색 결과 SCML 432는 락토바실러스 브레비스(Latobacillus brevis)로 판명되었으며, 염기서열을 이용하여 Eztaxon serve에서 표준 균주와 상동성을 분석한 결과 SCML 432는 락토바실러스 브레비스 ATCC 14869와 유사성이 높게 나타났으며, 16S rRNA 염기서열을 토대로 하여 계통수(phylogenetic tree)를 작성하였다. 최종적으로 락토바실러스 브레비스 SCML 432로 명명하였으며, 한국미생물보존센터(KCCM, Korean Culture Center of Microorganisms)에 기탁하였다(KCCM12269P).
실시예 2. 바이오제닉 아민 생성여부 확인
콩이 원료인 전통식품인 메주, 청국장 및 된장과 같은 발효식품에서 바이오제닉이 두통, 복통, 알레르기 등을 일으킨다고 보고되고 있으며, 히스타민의 경우 8-40mg 이상 섭취시 두통 등 증상이 발생하고, 티라민의 경우 100mg 이상 섭취시 중독 증상이 발생한다고 보고되고 있다. 따라서 선별된 균주를 대상으로 바이오제닉 아민 생성 유무를 조사하였다. 그 결과, 하기 표 2에 개시한 바와 같이 SCML 432 균주의 경우 바이오제닉 아민이 모두 검출되지 않았고, 다른 선별 균주의 경우 정량되지 않는 인체에 무해한 수준 이하의 티라민이 생성되는 것을 확인하였다. 따라서 SCML 432 균주는 티라민 및 히스타민을 생성하지 않으므로, 식품에 안전하게 사용 가능한 균주로 사료된다.
선별 균주의 바이오제닉 아민 생성능 분석
균주명 동정 바이오제닉 아민 생성
티라민 히스타민
SCML 432 L. brevis ND ND
SCML 379 L. brevis NQ ND
SCML 467 L. sakei NQ ND
ND; 미검출, NQ; 미정량
실시예 3. 식중독 관련 유해 병원성 미생물에 대한 항균 활성
바실러스 세레우스(Bacillus cereus)에 대한 항균 활성을 확인하고자 바실러스 세레우스(KCTC 3624 및 KCCM 40935) 2종에 대한 항균 활성을 웰 확산 방법을 통해 측정하였다. 그 결과, 하기 표 3에 개시한 바와 같이 SCML 432 균주가 바실러스 세레우스 KCTC 3624 및 KCCM 40935에 대해 항균 활성이 우수한 것을 확인하였다.
선별 균주의 항균 활성 측정 결과
균주명 동정 항균 활성(diameter, cm)
바실러스 세레우스KCTC 3624 바실러스 세레우스 KCCM 40935
SCML 432 L. brevis 15 17
SCML 379 L. brevis 14 14
SCML 467 L. sakei 12 17
실시예 4. 용혈성 및 유해 대사산물 , 유해효소 생성 여부 확인
선별 균주를 대상으로 인체에 유해한 영향을 미칠 수 있는 물질과 효소의 생성 여부를 확인하기 위하여 용혈성, 인돌 및 페닐피루브산(phenyl-pyruvic acid), β-글루쿠로니다아제 및 우레아제에 대한 분석을 실시하였다. 용혈성은 적혈구 막을 파괴하여 황달 및 빈혈을 유발하는 β-헤몰리시스(γ-hemolysis)와 적혈구 막을 파괴하지 않고 헤모글로빈을 메트헤모글로빈으로 산화시키는 α-헤몰리시스, 용혈현상이 없는 γ-헤몰리시스로 나눠볼 수 있는데, 선별 균주 모두 γ-헤몰리시스로 확인하였다. 인돌 및 페닐피루브산 및 β-글루쿠로니다아제 생성 여부에 대한 결과 역시 생성하지 않음을 확인하였고, 우레아제의 경우 SCML 379를 제외한 선별균주에서는 생성하지 않음을 확인하였다(표 4). 이로 인해 선별된 균주의 안정성을 확인하였다.
용혈성 및 유해 대사산물, 유해효소 생성 여부 확인
균주명 동정 용혈성 유해물질 유해효소
인돌 페닐피루브산 β-글루쿠로니다아제 우레아제
SCML 432 L. brevis γ-hemolysis - - - -
SCML 379 L. brevis γ-hemolysis - - - +
SCML 467 L. sakei γ-hemolysis - - - -
-; 음성효과, +; 양성효과
실시예 5. 항산화 활성 측정
상기 세포외 효소 활성 및 항균 활성 측정 실험을 통해 선발된 균주를 대상으로 DPPH에 의한 자유 라디칼 제거 효과를 측정하는 방법(Lee, J. H. et al., 2009. Food Sci. Biotechnol., 18, 959-964)으로 항산화 활성을 조사하였다. DPPH를 이용하여 선발된 균주의 항산화 활성을 측정한 결과, 선별 균주 중에 특히 SCML 432 분리주가 27.15±0.19%로 항산화 활성이 가장 높음을 확인하였다(표 5).
선별 균주의 항산화 활성
균주명 동정 DPPH 라디칼 소거능(%)
SCML 432 L. brevis 27.15±0.19
SCML 379 L. brevis 6.70±0.18
SCML 467 L. sakei 20.00±0.31
실시예 6. SCML 432 균주의 API ZYM 키트를 이용한 효소 활성
일반적으로 유산균이 프로바이오틱스로 사용되기 위해서는 이들이 생산하는 효소 또한 매우 중요한 부분을 차지하고 있어 최종 선별한 SCML 432 균주의 효소 생산 여부를 확인하기 위해 API ZYM 키트를 이용하여 조사하였다. 그 결과, 에스터라아제(esterase), 에스터라아제 리파아제(esterase lipase), 루신 아릴아미다아제(leucin arylamidase), 발린 아릴아미다아제(valine arymidase), 산성인산가수분해효소(Acid phosphatase), 나프톨-AS-BI-포스포히드롤라아제(Naphol-AS-BI-phosphohydrolase), α-갈락토시다아제(α-galactosidase), β-갈락토시다아제(β-galactosidase), β-글루코시다아제(β-glucosidase) 및 N-아세틸-β-글루코사미니다아제(N-acetyl-β-glucosaminidase) 활성이 있음을 확인하였다(표 6).
SCML 432 균주의 API ZYM 키트를 이용한 효소활성 분석
효소 결과 효소 결과
Control -1) Acid phosphatase +
Alkaline phospatase - Naphol-AS-BI-phosphohydrolase +
Esterase(C4) +2) α- galactosidase +
Esterase lipase(C8) + β- galactosidase +
Lipase(C14) - β-glucuronidase -
Leucine arylamidase + α-glucosidase -
Valine arylamidase + β- glucosidase +
Cystine arylamidase - N-acetyl-β- glucosaminidase +
Trypsin - α-mannosidase -
α-chymotrypsin - α-fucosidase -
-1); 음성효과, +2); 양성효과
실시예 7. SCML 432 균주의 항생제 감수성 분석
유산균의 경우 식품과 의약품의 소재로 많이 이용되고 있으며, 이로 인해 항생제 내성을 확인하는 것은 매우 중요한 요소임으로 최종 선별된 SCML 432 균주를 대상으로 항생제 감수성 분석을 하였다. 그 결과, 세팔로신(cephalothin), 린코마이신(lincomycin), 콜리스틴(colistin), 시프로프록사신(ciprofloxacin), 스트렙토마이신(streptomycin), 노르플록사신(norfloxacin), 카나마이신(kanamycin), 아미카신(amikacin), 트리메토프림/설파메톡사졸(trimethoprim/sulfamethoxazole) 계열의 항생제에 대하여는 내성을 지니고 있음을 확인하였다(표 7).
SCML 432 균주의 항생제 감수성 분석
항생제(code/disc potency) 결과
Cephalothin (CF/ 30μg ) ND
Neomycin(N/30μg) S
Lincomycin (L/ 2μg ) ND
Doxycycline(D/30μg) SS
Tetracycline(TE/30μg) S
Gentamicin(GM/10μg) S
Colistin (CL/ 10μg ) ND
Amocicillin/Clavulanic acid(AMC/20, 10μg) SS
Ciprofloxacin (CIP/ 5μg ) ND
Streptomycin(S/ 10μg ) ND
Norfloxacin (NOR/ 10μg ) ND
Kanamycin (K/ 30μg ) ND
Ampicillin(AM/10μg) SS
Erythromycin(E/15μg) SS
Amikacin (AN/ 30μg ) ND
Rimethoprim / Sulfamethoxazole ( SXT /1.25, 23. 75μg ) ND
직경: cm, ND; 미검출, S; 1.2-1.5., SS; 1.6-2.0
한국미생물보존센터(국외) KCCM12269P 20180528
<110> Microbial Institute for Fermentation Industyry <120> Lactobacillus brevis SCML 432 strain having antimicrobial activity and probiotics properties and uses thereof <130> PN18358 <160> 3 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 1498 <212> DNA <213> Lactobacillus brevis <400> 1 gctcagacga acgctggcgg catgcctaat acatgcaagt cgaacgagct tccgttgaat 60 gacgtgcttg cactgatttc aacaatgaag cgagtggcga actggtgagt aacacgtggg 120 aaatctgccc agaagcaggg gataacactt ggaaacaggt gctaataccg tataacaaca 180 aaatccgcat ggattttgtt tgaaaggtgg cttcggctat cacttctgga tgatcccgcg 240 gcgtattagt tagttggtga ggtaaaggcc caccaagacg atgatacgta gccgacctga 300 gagggtaatc ggccacattg ggactgagac acggcccaaa ctcctacggg aggcagcagt 360 agggaatctt ccacaatgga cgaaagtctg atggagcaat gccgcgtgag tgaagaaggg 420 tttcggctcg taaaactctg ttgttaaaga agaacacctt tgagagtaac tgttcaaggg 480 ttgacggtat ttaaccagaa agccacggct aactacgtgc cagcagccgc ggtaatacgt 540 aggtggcaag cgttgtccgg atttattggg cgtaaagcga gcgcaggcgg ttttttaagt 600 ctgatgtgaa agccttcggc ttaaccggag aagtgcatcg gaaactggga gacttgagtg 660 cagaagagga cagtggaact ccatgtgtag cggtggaatg cgtagatata tggaagaaca 720 ccagtggcga aggcggctgt ctagtctgta actgacgctg aggctcgaaa gcatgggtag 780 cgaacaggat tagataccct ggtagtccat gccgtaaacg atgagtgcta agtgttggag 840 ggtttccgcc cttcagtgct gcagctaacg cattaagcac tccgcctggg gagtacgacc 900 gcaaggttga aactcaaagg aattgacggg ggcccgcaca agcggtggag catgtggttt 960 aattcgaagc tacgcgaaga accttaccag gtcttgacat cttctgccaa tcttagagat 1020 aagacgttcc cttcggggac agaatgacag gtggtgcatg gttgtcgtca gctcgtgtcg 1080 tgagatgttg ggttaagtcc cgcaacgagc gcaaccctta ttatcagttg ccagcattca 1140 gttgggcact ctggtgagac tgccggtgac aaaccggagg aaggtgggga tgacgtcaaa 1200 tcatcatgcc ccttatgacc tgggctacac acgtgctaca atggacggta caacgagtcg 1260 cgaagtcgtg aggctaagct aatctcttaa agccgttctc agttcggatt gtaggctgca 1320 actcgcctac atgaagttgg aatcgctagt aatcgcggat cagcatgccg cggtgaatac 1380 gttcccgggc cttgtacaca ccgcccgtca caccatgaga gtttgtaaca cccaaagccg 1440 gtgagataac cttcgggagt cagccgtcta aggtgggaca gatgattagg gtgaagtc 1498 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 2 agagtttgat cmtggctcag 20 <210> 3 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 tacggytacc ttgttacgac tt 22

Claims (5)

  1. 바실러스 세레우스(Bacillus cereus)에 대한 항균 활성, 세팔로신(cephalothin), 린코마이신(lincomycin), 콜리스틴(colistin), 시프로프록사신(ciprofloxacin), 스트렙토마이신(streptomycin), 노르플록사신(norfloxacin), 카나마이신(kanamycin), 아미카신(amikacin) 및 트리메토프림/설파메톡사졸(trimethoprim/sulfamethoxazole) 내성, 항산화 활성, γ-용혈 활성 및 에스터라아제(esterase), 에스터라아제 리파아제(esterase lipase), 루신 아릴아미다아제(leucin arylamidase), 발린 아릴아미다아제(valine arymidase), 산성인산가수분해효소(Acid phosphatase), 나프톨-AS-BI-포스포히드롤라아제(Naphol-AS-BI-phosphohydrolase), α-갈락토시다아제(α-galactosidase), β-갈락토시다아제(β-galactosidase), β-글루코시다아제(β-glucosidase) 및 N-아세틸-β-글루코사미니다아제(N-acetyl-β-glucosaminidase) 분비능이 있고, 히스타민(histamine), 티라민(tyramine), 인돌(indole), 페닐피루브산(Phenyl-pyruvic acid), β-글루쿠로니다아제(β-glucuronidase) 및 우레아제(urease)를 생성하지 않는, 기탁번호가 KCCM12269P인 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis) SCML 432 균주.
  2. 삭제
  3. 제1항의 균주, 이의 배양액, 상기 배양액의 농축액 또는 그의 건조물을 유효성분으로 포함하는 프로바이오틱스 제제.
  4. 제1항의 균주, 이의 배양액, 상기 배양액의 농축액 또는 그의 건조물을 유효성분으로 함유하는 장류 제조용 스타터(starter) 조성물.
  5. 제1항의 균주, 이의 배양액, 상기 배양액의 농축액 또는 그의 건조물을 유효성분으로 함유하는 바실러스 세레우스(Bacillus cereus)에 대한 항균용 조성물.
KR1020180137911A 2018-11-12 2018-11-12 항균 활성과 프로바이오틱스 특성을 갖는 락토바실러스 브레비스 scml 432 균주 및 이의 용도 KR102065580B1 (ko)

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