KR20220004865A - 프로바이오틱스 관련 효소 분비능, 항산화 활성, 담즙산염 분해 활성, 항균 활성이 있고, 유해효소 및 유해대사산물을 생성하지 않는 락토바실러스 브레비스 srcm101607 균주 및 이의 용도 - Google Patents

프로바이오틱스 관련 효소 분비능, 항산화 활성, 담즙산염 분해 활성, 항균 활성이 있고, 유해효소 및 유해대사산물을 생성하지 않는 락토바실러스 브레비스 srcm101607 균주 및 이의 용도 Download PDF

Info

Publication number
KR20220004865A
KR20220004865A KR1020200081852A KR20200081852A KR20220004865A KR 20220004865 A KR20220004865 A KR 20220004865A KR 1020200081852 A KR1020200081852 A KR 1020200081852A KR 20200081852 A KR20200081852 A KR 20200081852A KR 20220004865 A KR20220004865 A KR 20220004865A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
strain
activity
harmful
srcm101607
lactobacillus brevis
Prior art date
Application number
KR1020200081852A
Other languages
English (en)
Inventor
류명선
서지원
정수지
양희종
정도연
Original Assignee
재단법인 발효미생물산업진흥원
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 재단법인 발효미생물산업진흥원 filed Critical 재단법인 발효미생물산업진흥원
Priority to KR1020200081852A priority Critical patent/KR20220004865A/ko
Publication of KR20220004865A publication Critical patent/KR20220004865A/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C12N1/205—Bacterial isolates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N63/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing microorganisms, viruses, microbial fungi, animals or substances produced by, or obtained from, microorganisms, viruses, microbial fungi or animals, e.g. enzymes or fermentates
    • A01N63/20—Bacteria; Substances produced thereby or obtained therefrom
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23C—DAIRY PRODUCTS, e.g. MILK, BUTTER OR CHEESE; MILK OR CHEESE SUBSTITUTES; MAKING THEREOF
    • A23C11/00—Milk substitutes, e.g. coffee whitener compositions
    • A23C11/02—Milk substitutes, e.g. coffee whitener compositions containing at least one non-milk component as source of fats or proteins
    • A23C11/10—Milk substitutes, e.g. coffee whitener compositions containing at least one non-milk component as source of fats or proteins containing or not lactose but no other milk components as source of fats, carbohydrates or proteins
    • A23C11/103—Milk substitutes, e.g. coffee whitener compositions containing at least one non-milk component as source of fats or proteins containing or not lactose but no other milk components as source of fats, carbohydrates or proteins containing only proteins from pulses, oilseeds or nuts, e.g. nut milk
    • A23C11/106—Addition of, or treatment with, microorganisms
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23C—DAIRY PRODUCTS, e.g. MILK, BUTTER OR CHEESE; MILK OR CHEESE SUBSTITUTES; MAKING THEREOF
    • A23C9/00—Milk preparations; Milk powder or milk powder preparations
    • A23C9/12—Fermented milk preparations; Treatment using microorganisms or enzymes
    • A23C9/123—Fermented milk preparations; Treatment using microorganisms or enzymes using only microorganisms of the genus lactobacteriaceae; Yoghurt
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
    • A23L11/00—Pulses, i.e. fruits of leguminous plants, for production of food; Products from legumes; Preparation or treatment thereof
    • A23L11/50—Fermented pulses or legumes; Fermentation of pulses or legumes based on the addition of microorganisms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/225—Lactobacillus
    • C12R2001/24—Lactobacillus brevis

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • Agronomy & Crop Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Nutrition Science (AREA)
  • Pest Control & Pesticides (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Dentistry (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Oil, Petroleum & Natural Gas (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

본 발명은 장내 상피세포 부착능, γ-용혈성, 항산화 활성, 담즙 분해 활성, 세포외 효소 분비능, 유해 미생물에 대한 항균 활성, 항생제 내성이 있고, 유해효소 및 유해대사산물을 생성하지 않는, 기탁번호가 KCCM12731P인 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis) SRCM101607 균주 및 이의 용도에 관한 것이다.

Description

프로바이오틱스 관련 효소 분비능, 항산화 활성, 담즙산염 분해 활성, 항균 활성이 있고, 유해효소 및 유해대사산물을 생성하지 않는 락토바실러스 브레비스 SRCM101607 균주 및 이의 용도{Lactobacillus brevis SRCM101607 strain having probiotics-related enzyme secretion activity, antioxidant activity, Bile salt hydrolysis, antimicrobial activity, and not producing harmful enzyme and harmful metabolite and uses thereof}
본 발명은 프로바이오틱스 관련 효소 분비능, 항산화 활성, 담즙산염 분해 활성, 항균 활성이 있고, 유해효소 및 유해대사산물을 생성하지 않는 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis) SRCM101607 균주 및 이의 용도에 관한 것이다.
프로바이오틱스(Probiotics)란 살아있는 생균제로서 사람 및 동물에 투여된 생균이 장내의 소화관 벽에 밀집, 정착하여 유해균이 정착하지 못하게 하는 작용을 하며, 유산을 생성하여 장내의 pH를 낮추어서 유해세균이 증식하지 못하게 한다. 또한, 투여된 프로바이오틱스는 박테리오신(bacteriocin) 혹은 과산화물을 생성하여 병원균의 증식을 억제하며 영양분의 흡수를 담당하는 장융모의 활동을 도와준다. 이밖에도, 프로바이오틱스는 영양소의 흡수와 이용을 돕는 물질을 생성하고, 사료요구율을 개선시키며, 병원균이 생성하는 독성물질을 중화하는 물질을 생성하기도 한다. 프로바이오틱스는 대체로 동물 혹은 어류가 스트레스로 인한 소화관의 유용 균주 감소를 억제할 목적으로 이용되며, 항생물질을 경구투여하고 난 후 병원균보다 먼저 세균이 없는 소화관 벽에 부착하여 병원균이 정착하는 것을 방지한다.
프로바이오틱스로서 필요한 특성은 안전성, 기능적 측면(생존성, 정착성, 서식성, 항미생물제 생성능, 면역 촉진능, 항유전독성 활성, 병원성 세균의 억제능), 기술적 측면(관능적 특성, 안정성, 박테리오파지 저항성, 제조과정 중의 생존성) 및 GRAS(Generally Recognized As Safe) 미생물이다. 프로바이오틱스는 항생제와는 반대되는 특성을 가지고 있는데, 항생제가 미생물이 생산하는 대사 산물로서 소량으로 다른 미생물의 발육을 억제하거나 사멸시키는 물질이라면 프로바이오틱스는 균들의 공생, 상생의 능력을 이용하여 면역기능을 증진시키고 유해 미생물의 성장을 저해하는 등의 효과를 나타내고 있어 이러한 면역 증진 기능을 지닌 기능성 물질 및 프로바이오틱스는 현재 오남용으로 사회적 문제가 되고 있는 항생제의 대체 물질로서 이용이 가능하다.
한편, 한국등록특허 제2100367호에는 '장 부착능이 우수하고, 항노화 활성 및 프로바이오틱스 특성을 가지는 락토바실러스 브레비스 SRCM103306 균주 및 이의 용도'가 개시되어 있고, 한국등록특허 제1960352호에는 '유해 미생물에 대한 항균 활성, 항생제 내성, 항산화 활성, 효소 분비능, 내산성, 내담즙성, 내열성 및 프리바이오틱스 기질 이용능이 우수하고, 바이오제닉 아민을 생성하지 않는 베리류 발효물 유래의 락토바실러스 브레비스 SBB07 균주 및 이의 용도'가 개시되어 있으나, 본 발명의 '프로바이오틱스 관련 효소 분비능, 항산화 활성, 담즙산염 분해 활성, 항균 활성이 있고, 유해효소 및 유해대사산물을 생성하지 않는 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis) SRCM101607 균주 및 이의 용도'에 대해서는 기재된 바가 없다.
본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명자들은 국내 전통 장류 제품으로부터 장내 상피세포 부착능, γ-용혈성, 항산화 활성, 담즙 분해 활성을 가지고 있으며, 에스터라아제(esterase), 에스터라아제 리파아제(esterase lipase), 루신 아릴아미다아제(leucin arylamidase), 발린 아릴아미다아제, 시스틴 아릴아미다아제, 애시드 포스파타아제(acid phosphatase), 나프톨-AS-BI-포스포히드롤라아제(Naphthol-AS-BI-phosphohydrolase), β-갈락토시다아제(galactosidase), β-글루코시다아제(glucosidase) 및 α-글루코시다아제 효소를 분비하고, 바실러스 세레우스(Bacillus cereus), 리스테리아 모노사이토게네스(Listeria monocytogenes), 마이크로코커스 루테우스(Micrococcus luteus), 대장균(Escherichia coli), 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus), 슈도모나스 에루지노사(Pseudomonas aeruginosa) 및 살모넬라 티피뮤리움(Salmonella typhimurium)에 대한 항균 활성이 있으며, 시프로플록사신(ciprofloxacin), 린코마이신(lincomycin), 오플록사신(ofloxacin), 옥사실린(oxacillin), 페니실린(penicillin), 스트렙토마이신(streptomycin) 및 반코마이신(vancomycin)에 대한 내성을 나타내며, 유해효소인 우레아제(urease)와 β-글루쿠로니다아제(β-glucuronidase), 그리고 유해대사산물인 인돌(indole) 및 페닐피루브산(phenylpyruvic acid)을 생성하지 않는 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis) SRCM101607 균주(수탁번호: KCCM12731P)를 분리하였다. 본 발명의 락토바실러스 브레비스 SRCM101607 균주는 프로바이오틱스 특징을 가지므로 정장제로 유용하게 사용될 수 있으며, 또한 품질 좋은 장류 제조를 위한 스타터 균주 그리고 항균용 제제로도 사용이 가능함을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 장내 상피세포 부착능, γ-용혈성, 항산화 활성, 담즙 분해 활성, 세포외 효소 분비능, 유해 미생물에 대한 항균 활성, 항생제 내성이 있고, 유해효소 및 유해대사산물을 생성하지 않는, 기탁번호가 KCCM12731P인 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis) SRCM101607 균주를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 균주, 이의 배양액, 상기 배양액의 농축액 또는 그의 건조물을 유효성분으로 포함하는 프로바이오틱스 제제를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 균주, 이의 배양액, 상기 배양액의 농축액 또는 그의 건조물을 유효성분으로 함유하는 장류 제조용 스타터(starter) 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 균주, 이의 배양액, 상기 배양액의 농축액 또는 그의 건조물을 유효성분으로 함유하는 유해 미생물에 대한 항균용 조성물을 제공한다.
본 발명의 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis) SRCM101607 균주는 장내 상피세포 부착능, γ-용혈성, 항산화 활성, 담즙 분해 활성, 세포외 효소 분비능, 유해 미생물에 대한 항균 활성, 항생제 내성이 있고, 유해효소 및 유해대사산물을 생성하지 않으므로 정장제, 장류 제조를 위한 스타터 균주 및 항균용 조성물 등의 관련 산업 분야에 매우 유용하게 이용될 수 있다.
도 1은 본 발명에서 분리한 락토바실러스 브레비스 SRCM101607 균주의 계통도를 나타낸 것이다.
본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 장내 상피세포 부착능, γ-용혈성, 항산화 활성, 담즙 분해 활성, 세포외 효소 분비능, 유해 미생물에 대한 항균 활성, 항생제 내성이 있고, 유해효소 및 유해대사산물을 생성하지 않는, 기탁번호가 KCCM12731P인 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis) SRCM101607 균주를 제공한다.
본 발명에서는 전통 장류 제품으로부터 장내 상피세포 부착능, γ-용혈성, 항산화 활성, 담즙 분해 활성, 세포외 효소 분비능, 유해 미생물에 대한 항균 활성, 항생제 내성이 있고, 유해효소 및 유해대사산물을 생성하지 않는 유산균을 분리하였으며, 최종 선별된 균주를 16S rRNA 염기서열을 통해 동정한 결과, 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis) 균주임을 확인하였다. 본 발명자는 상기 최종 선별된 균주를 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis) SRCM101607 균주로 명명하고 한국미생물보존센터(KCCM)에 2020년 5월 26일에 기탁하였다(수탁번호: KCCM12731P).
본 발명의 기탁번호가 KCCM12731P인 락토바실러스 브레비스 SRCM101607 균주에 있어서, 상기 세포외 효소는 에스터라아제(esterase), 에스터라아제 리파아제(esterase lipase), 루신 아릴아미다아제(leucin arylamidase), 발린 아릴아미다아제, 시스틴 아릴아미다아제, 애시드 포스파타아제(acid phosphatase), 나프톨-AS-BI-포스포히드롤라아제(Naphthol-AS-BI-phosphohydrolase), β-갈락토시다아제(galactosidase), β-글루코시다아제(glucosidase) 및 α-글루코시다아제이며, 상기 유해 미생물은 바실러스 세레우스(Bacillus cereus), 리스테리아 모노사이토게네스(Listeria monocytogenes), 마이크로코커스 루테우스(Micrococcus luteus), 대장균(Escherichia coli), 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus), 슈도모나스 에루지노사(Pseudomonas aeruginosa) 및 살모넬라 티피뮤리움(Salmonella typhimurium)이고, 상기 항생제는 시프로플록사신(ciprofloxacin), 린코마이신(lincomycin), 오플록사신(ofloxacin), 옥사실린(oxacillin), 페니실린(penicillin), 스트렙토마이신(streptomycin) 및 반코마이신(vancomycin)이며, 상기 유해효소는 우레아제(urease) 및 β-글루쿠로니다아제(β-glucuronidase)이고, 상기 유해대사산물은 인돌(indole) 및 페닐피루브산(phenylpyruvic acid)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명은 또한, 상기 기탁번호가 KCCM12731P인 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis) SRCM101607 균주, 이의 배양액, 상기 배양액의 농축액 또는 그의 건조물을 유효성분으로 포함하는 프로바이오틱스 제제를 제공한다.
상기 프로바이오틱스 제제는 당업계에 공지된 방법에 따라 다양한 제형과 방법으로 제조 및 투여될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 락토바실러스 브레비스 SRCM101607 균주, 이의 배양액, 상기 배양액의 농축액 또는 그의 건조물은 약제학적 분야에서 통상적으로 사용되는 담체와 혼합하여 산제(powder), 액제(liquids and solutions), 정제(tablet), 캡슐(capsule), 시럽(syrup), 현탁제(suspension) 또는 과립제(granule) 등의 형태로 제조되어 투여될 수 있다. 상기 담체로는 예를 들어, 결합제, 활탁제, 붕해제, 부형제, 가용화제, 분산제, 안정화제, 현탁화제, 색소 및 향료 등일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 투여 용량은 체내에서의 활성성분의 흡수도, 불활성률, 배설속도, 피투여자의 연령, 성별, 축종, 상태 및 질병의 중증 정도 등에 따라 적절히 선택할 수 있다.
본 발명의 상기 프로바이오틱스 제제를 식품첨가물로 사용하는 경우, 상기 프로바이오틱스 제제를 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효 성분의 혼합양은 그의 사용 목적(예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 식품 또는 음료의 제조시에 본 발명의 프로바이오틱스 제제는 원료에 대하여 15 중량부 이하, 바람직하게는 10 중량부 이하의 양으로 첨가된다. 그러나 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 혼합양은 상기 범위 이하일 수 있으며, 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 혼합양은 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있다.
상기 식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 상기 프로바이오틱스 제제를 첨가할 수 있는 식품의 예로는 빵, 캔디류, 스낵류, 과자류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제 및 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 건강식품을 모두 포함한다.
본 발명은 또한, 상기 기탁번호가 KCCM12731P인 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis) SRCM101607 균주, 이의 배양액, 상기 배양액의 농축액 또는 그의 건조물을 유효성분으로 함유하는 장류 제조용 스타터(starter) 조성물을 제공한다.
본 발명에 있어서, 장류 제조용 스타터(starter)란 장류 제조를 위해 발효에 관여하는 미생물을 포함하는 제제 또는 조성물을 의미한다. 장류 제조 시에 첨가함으로써 발효된 장류에서 생장할 수 있는 미생물 또는 우점종으로 생장할 수 있는 미생물을 제공하기 위하여 사용된다. 상기 장류 발효용 스타터를 사용하여 장류를 제조하는 경우, 상기 장류 발효용 스타터에 포함된 미생물에 의하여, 장류의 품질을 일정하게 조절하거나, 특정한 목적, 일 예로 장류에서 이취를 발생시키지 않거나, 감소시키는 목적 또는 장류에서 구수한 맛이나 단맛을 강화시키기 위한 목적을 달성할 수 있다.
본 발명의 균주를 배양하는 방법은 당업계에 통상적으로 이용되는 방법에 따라 배양할 수 있으며, 특별한 방법에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 균주를 배양하는 단계에서 얻어지는 상기 균주 또는 상기 균주의 배양물 또는 상기 균주의 배양액의 농축액을 첨가제로 사용할 경우, 상기 균주 또는 상기 균주의 배양물 또는 상기 균주의 배양액의 농축액을 그대로 첨가하거나 다른 첨가제를 함께 사용할 수 있으며, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효 성분의 혼합양은 그의 사용 목적에 따라 적합하게 결정될 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 균주 또는 이의 배양액을 스타터(starter) 균주로 이용하여 장류를 제조하는 방법을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 기탁번호가 KCCM12731P인 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis) SRCM101607 균주, 이의 배양액, 상기 배양액의 농축액 또는 그의 건조물을 유효성분으로 함유하는 유해 미생물에 대한 항균용 조성물을 제공한다.
본 발명의 항균용 조성물이란 항미생물제를 총칭하는 의미인 항생제와 같은 의미일 수 있고, 항진균제, 살균제, 방부제, 보존제 또는 제균제와 같은 의미일 수 있으며, 바람직하게는 바실러스 세레우스(Bacillus cereus), 리스테리아 모노사이토게네스(Listeria monocytogenes), 마이크로코커스 루테우스(Micrococcus luteus), 대장균(Escherichia coli), 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus), 슈도모나스 에루지노사(Pseudomonas aeruginosa) 및 살모넬라 티피뮤리움(Salmonella typhimurium) 등을 포함하는 병원성 미생물의 발육과 생활 기능을 저지 또는 억제할 수 있는 물질을 의미할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 항균용 조성물은 락토바실러스 브레비스 SRCM101607 균주, 이의 배양액, 상기 배양액의 농축액 또는 그의 건조물 외에 당질, 단백질, 지질, 비타민류 및 미네랄류를 포함할 수 있다. 상기 당질, 단백질, 지질, 비타민류 또는 미네랄류는 그 사용 목적 및 용도에 따라 적의 선택될 수 있으며, 일 예로 상기 당질은 벌꿀, 덱스트린, 수크로오스, 팔라티노스, 포도당, 과당, 물엿, 당알콜(sugar alcohol), 소르비톨, 크실리톨, 말티톨일 수 있고 상기 단백질은 카제인(casein), 유청 단백질(whey protein) 등의 우유 유래 단백질, 대두 단백질, 이들 단백질의 트립신, 펩신 등의 동물 유래 효소 및 뉴트라아제(neutrase), 알칼라아제(alkilase)에 의한 가수분해물일 수 있으며, 상기 지질은 제1가 포화지방산, 다가 불포화지방산을 포함하는 해바라기유, 채종유(rapeseed oil), 올리브유, 홍화유(safflower oil), 옥수수유, 대두유, 팜유(palm oil), 야자유 등의 각종 식물 유래 유지, 중쇄 지방산(middle-chain fatty acid), EPA, DHA, 대두유래 인지질, 우유 유래 인지질일 수 있고, 상기 미네랄류는 인산칼륨, 탄산칼륨, 염화칼륨, 염화나트륨, 유산칼슘, 글루콘산칼슘, 판토텐산칼슘, 카제인칼슘, 염화마그네슘, 황산제1철, 탄산수소나트륨일 수 있으나, 각각의 예에 의해 특별히 제한되는 것은 아니다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
재료 및 방법
1. 균주 분리 및 배양 조건
전라북도에서 전통적인 방법으로 제조한 전통장류제품을 구입하여 실험에 사용하였다. 수거한 장류 1 g의 시료를 9 ㎖의 멸균 생리식염수(0.85% NaCl)에 넣어 십진법으로 희석한 후 MRS 아가(DifcoTM, MI, USA) 배지에 도말하여 30℃에서 48시간 배양하였다. 순수한 균주를 분리하기 위해 단일 콜로니를 분리하였고, MRS 액체배지에서 30℃, 48시간 배양하였다. 선별한 균주를 대상으로 멸균된 10% skim milk 보존액(in water)에 혼합하여 4℃에서 보관하였다. 보관 후 세포의 활성화는 MRS 액체배지에서 30℃, 48시간 배양하여 활성화하여 사용하였다.
2. 용혈성, 유해대사산물 및 유해효소 생성 분석
선별 균주의 용혈성을 확인하기 위해서 혈액 아가(blood agar) 배지를 이용하였으며, blood agar base(BD, USA)에 5% 양(sheep) 혈액(Kisanbio, Korea)을 첨가하여 혈액 아가 배지를 제조하였다. 선별된 균주를 상기 혈액 아가 배지에 획선 접종하여 37℃에서 24~48시간 배양하여 균주 주위로 생기는 환의 형태로 용혈성을 확인하였다.
또한, 선별 균주의 발암 관련 유해대사산물인 인돌(indole) 및 페닐피루브산(phenylpyruvic acid)의 생성 여부를 확인하였다. 트립토판의 탈아미노화로 인하여 생성되는 인돌을 선별된 균주가 생성하는지 확인하기 위하여 TSB(Tryptone Soya Broth) 액체배지에 선별 균주를 접종하고 30℃에서 24시간 진탕배양 후 인돌 시약 드로퍼(BBL, USA)를 첨가하고 부드럽게 흔든 후 30초 내 배지 표면에 나타나는 색 변화로 인돌의 형성 여부를 확인하였다. 페닐피루브산은 페닐알라닌 아가(BD, USA) 배지에 균주를 접종하여 30℃에서 24~48시간 배양 후 10% 염화 제2철(ferric-chloride)을 3-4 방울 첨가한 후 균주 주위의 색 변화로 페닐피루브산의 생성 여부를 확인하였다. 발암 관련 유해효소로 알려진 우레아제(urease) 및 β-글루쿠로니다아제(β-glucuronidase)의 생성 여부를 확인하였다. β-글루쿠로니다아제는 TBX 아가(Tryptone bile X-glucuronide, Oxoid, Germany) 배지에 균주를 접종하여 30℃에서 24~48시간 배양 후 균주의 색 변화를 확인하여 β-글루쿠로니다아제 생성여부를 확인하였다. 우레아제는 urea agar(oxoid, germany) 배지에 균주를 접종하고 24~48시간 배양 후 균주의 색 변화를 확인하여 우레아제 생성 여부를 확인하였다.
3. DPPH radical 소거능 활성 분석
선별 균주의 항산화 활성은 DPPH 자유 라디칼 소거능을 측정하여 확인하였다. 항산화 활성 측정을 위한 시료는 각 선별 균주의 배양액을 13,000 rpm에서 10분간 원심분리한 후 상등액을 취하여 준비하였고, 100 μM DPPH(2,2-diphenyl-1-picryl-hydrazyl, Sigma, USA) 에탄올 용액 1 ㎖에 200 ㎕의 배양 상등액을 가하여 실온의 암실 조건에서 30분간 반응시킨 후 517 nm에서 UV/VIS 분광광도계(SPECOR 200, Analytic jena)로 흡광도를 측정하여 측정하였다. 대조구로는 MRS 배지를 사용하였으며, 아래 식을 활용하여 DPPH 자유 라디칼 소거능을 산출하였다.
DPPH 자유 라디칼 소거능(%) = (1 - A/B) x 100
A: 517 nm에서 시료가 첨가된 DPPH 용액의 흡광도,
B: 517 nm에서 시료가 첨가되지 않은 DPPH 용액의 흡광도.
4. API ZYM kit를 이용한 효소 활성 분석
선별 균주의 효소 활성을 확인하기 위해 총 19종의 효소의 기질 이용성을 기초로 제작된 API ZYM kit(BioMerieux, France)를 사용하였다. 선별 균주를 MRS 아가 배지에 획선 도말하여 30℃에서 48시간 배양한 콜로니를 2 ㎖의 현탁 배지에 재부유하고 McFarland standard 5~6 탁도로 맞춘 후 각 튜브에 60 ㎕씩 분주하고 37℃에서 4시간 배양한 후 ZYM A와 B를 각 튜브에 1방울씩 떨어뜨리고 5분간 실온에서 반응시켜 색 변화로 각각의 기질 효소에 대한 활성 여부를 판독하였다.
5. β-glucosidase 활성 분석
β-글루코시다아제(glucosidase) 활성을 측정하기 위해 MRS 액체배지에 Exculin Iron 아가를 혼합하여 MRS-EI 배지를 제조하였다. 선별 균주를 MRS-EI 배지에 접종하여 37℃에서 48시간 배양한 후 콜로니 주변의 색 변화로 β-글루코시다아제 활성을 확인하였다.
6. β-galactosidase 활성 분석
β-갈락토시다아제(galactosidase) 활성을 측정하기 위해 MRS 액체배지에 5.0 g 락토오스, 50 ㎎/㎖ X-gal(chromogenic substrate) 및 1.0 mM IPTG(isopropyl β-D-1-thioga-lactopyrinoside)를 첨가하여 MRS-갈락토시다아제 배지를 제조하였다. 선별 균주를 상기 배지에 접종하여 37℃에서 48시간 배양한 후 콜로니 주변의 색 변화로 β-갈락토시다아제 활성을 확인하였다.
7. 식중독 관련 유해 병원성 미생물에 대한 항균력 확인
식품을 부패 또는 오염시켜 구토, 설사, 복통 등을 유발하는 것으로 알려진 유해 미생물 7종에 대한 항균 활성을 측정하였다. 바실러스 세레우스(Bacillus cereus) KCCM 40935, 리스테리아 모노사이토게네스(Listeria monocytogenes) KCCM 43155, 대장균(Escherichia coli) KCCM 11234, 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococus aureus) KCCM 11335, 슈도모나스 에루지노사(Pseudomonas aeruginosa) KCCM 11803은 한국미생물보존센터(KCCM)으로부터, 마이크로코커스 루테우스(Micrococcus luteus) KCTC 1056은 한국생명공학연구원 생물자원센터(KCTC)로부터, 살모넬라 티피뮤리움(Salmonella typhimurium) ATCC 68169는 ATCC(American Type Culture Collection)로부터 분양받아 지시균주로 사용하였다.
측정 방법은 웰 확산 방법을 이용하였으며, 각 지시균주를 NB(Nutrient broth, Difco) 배지에 접종하여 37℃에서 24시간 배양한 후 배양액의 흡광도를 측정하여 일정한 농도(OD660, 0.4)로 조정하고, 상기 배양액을 0.8% 아가를 함유한 NB soft 아가 배지에 첨가하여 평판배지를 제조하였다. 선별 균주는 MRS 배지에서 30℃, 48시간 진탕 배양하여 13,000 rpm으로 10분간 원심분리한 후 상등액을 취하여 0.45 μm syringe 필터(Sartorius, Germany)로 제균한 뒤 6-mm 웰에 각각 분주하였다. 분주 후 37℃에서 24시간 배양하여 각각의 웰 주변에 생기는 억제환의 크기를 측정하여 항균활성을 확인하였다.
8. 탈지유 발효력(커드 생성능)
탈지유 발효력은 선별된 균주를 MRS 액체 배지에서 배양한 후, 멸균된 10% 스킴 밀크(skim milk, Difco)에 1%씩 접종하였다. 균주가 접종된 스킴 밀크는 30℃에서 5일 동안 정치배양 후 커드 생성 정도를 관찰하였고, 응고 정도에 따라 선별 균주의 탈지유 발효 활성을 확인하였다.
9. BSH(Bile salt hydrolase) 활성 분석
선별 균주의 BSH(Bile salt hydrolase) 활성을 확인하기 위하여 Dashkevicz and Feifhner (1989)의 방법을 변형하여 사용하였다. MRS 아가 배지에 담즙산의 일종인 TDCA(tauro-deoxycholic acid, Sigma, USA) 또는 GDCA(glyco-deoxycholic acid, Sigma)를 0.5%씩 첨가하여 MRS-bile salt 아가 배지를 제조하였다. 상기 배지에 선별 균주를 접종하고 30℃에서 5일간 혐기적 상태로 배양하여 균주 주위로 불투명한 침전이 형성되는지 여부를 관찰하여 BSH 활성을 확인하였다.
10. 장내 상피세포 부착능
24 웰 플레이드에 2×105 cell/well로 접종된 CaCO2 세포들을 24시간 배양한 후 선별된 균주를 MOI(multiplicity of infection) 10으로 45분간 감염시켰다. 세포에 침투하지 못한 처리 균주는 PBS 버퍼로 3회 세척하여 제거하였고, 1% Triton X-100(in PBS)로 CaCO2 세포들을 파괴하여 세포에 침투했던 선별 균주를 연속적으로 희석해 MRS에 도말하였다. 생균수를 확인하여 아래의 식에 대입하여 선발균주의 장내 상피세포 부착율을 산출하였다.
부착율(adhesion) (%) = [부착 균수/초기 처리균수] × 100
11. 항생제 감수성 확인
선별 균주의 항생제 감수성 여부를 확인하기 위하여 NCCLS(National Committee for clinical Laboratory Standards)의 디스크 확산법을 실시하였다. 사용한 항생제 디스크(BBL Sensi-disc, Becton Dickinson Co, USA)는 아미카신(amikacin, 30㎍, AK), 아목시실린-클라불란산(amoxicillin/clavulanic acid, 2㎍/ 1㎍, AUG), 암피실린(ampicillin, 10㎍, AMP), 세팔로틴(cephalothin, 30㎍, CL), 시프로플록사신(ciprofloxacin, 5㎍, CIP), 에리트로마이신(erythromycin, 15㎍, E), 젠타마이신(gentamicin, 30㎍, CN), 이미페넴(imipenem, 10㎍, IMI), 카나마이신(kanamycin, 30㎍, K), 린코마이신(lincomycin, 15㎍, MY), 메티실린(methicllin, 5㎍, MET), 네오마이신(neomycin, 30㎍, N), 니트로퓨레이션(nitrofuration, 300㎍, F), 오플록사신(ofloxacin, 5㎍, OFX), 옥사실린(oxacillin, 5㎍, OX), 페니실린 G(penicillin G, 1 IU/ 2 IU/ 10 IU, P), 리팜피신(rifampicin, 5㎍, RD), 스트렙토마이신(streptomycin, 10㎍/ 300㎍, S), 테트라사이클린(tetracycline, 30㎍, TE), 트리메토프림/설파메톡사졸(trimethoprim-sulfamethoxazole, 1.25㎍/ 25㎍, SXT) 및 반코마이신(vancomycin, 30㎍, VA) 등을 사용하였다.
감수성 시험방법은 선별된 균주를 Mueller hinton broth(Merck, Germany)에 접종하고 30℃에서 5시간 배양한 후 McFarland standard 0.5 탁도로 맞춘 후 Muller-Hinton agar에 도말하고 30분간 건조하여 16종의 항생제 디스크를 올린 후 30℃에서 48시간 방치한 후, 각 항생제에 대한 억제환 크기를 측정하고 CLSI(Clinical Laboratory Standards Institute) 가이드라인에 따라 감수성과 내성을 판정하였다.
12. 선별 균주의 동정
선별 균주의 동정을 위해 균체는 한천 평판배지로부터 회수하였으며, 이들의 DNA는 ZR Fungal/Bacterial DNA MiniPrep kit를 사용하여 추출하였다. 16S rRNA 유전자는 두 개의 알려진 유니버설 프라이머를 사용하여 증폭하였다. 두 유니버설 프라이머의 염기서열은 다음과 같다: 27F 5'-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3'(서열번호 2), 1492R 5'-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3'(서열번호 3). 또한, PCR을 위한 각 반응의 조건은 다음과 같다: 95℃에서 10분간 1회 초기 변성 후 DNA 증폭을 위하여 90℃에서 30초간 변성, 60℃에서 30초간 결합, 72℃에서 30초간 증폭 과정을 35회 실시하고 72℃에서 10분간 마지막 증폭을 1회 실시. 반응이 끝난 PCR 산물은 1.5% 아가로스 겔에서 전기영동한 후 UV transilluminator (Gel documentation, Bio-Rad)를 이용하여 밴드를 확인한 후 증폭이 확인된 PCR 산물은 마크로젠(주)에 의뢰하여 동정을 실시하였다. 염기서열의 크로마토그램을 이용하여 갭(gap)을 최소화한 후 NCBI(National Center for Biotechnology Information)에서 서열 일치도가 높은 표준 균주들의 16S rRNA 유전자 염기서열을 확보하여 계통도를 작성하였다. 계통도 분석은 Tamura-Nei 모델에 기초한 Maximum Likelihood 방법을 사용하여 분석하였고, 산출한 각각의 계통수에서 각 분지에 대한 통계학적 신뢰도를 산출하기 위해 bootstrap 분석을 1,000회 실행하였으며, 분석은 MEGA 7.0.26 프로그램을 사용하였다.
실시예 1. 용혈성, 유해대사산물 및 유해효소 생성 여부 확인
용혈은 자연적으로 적혈구가 파괴에 의해 일어나기도 하지만 유전적 결함, 화학물질, 미생물에 의한 독성물질에 의해 비정상적으로 일어나기도 한다. 특히, 미생물 감염에 의한 용혈성은 혈전성 혈소판 감소증이나 용혈성요독증후군과 같은 질병으로 이어질 수 있다. 용혈성은 적혈구 막을 파괴하여 황달 및 빈혈을 유발하는 β-헤몰리시스와 적혈구 막을 파괴하지 않고 헤모글로빈을 메트헤모글로빈으로 산화시키는 α-헤몰리시스, 용혈현상이 없는 γ-헤몰리시스로 나눠볼 수 있는데 본 발명의 선별 균주의 용혈성을 분석한 결과, 용혈현상을 일으키지 않는 γ형 용혈성(γ-hemolysis)임이 확인되었다. 또한, 장내 미생물이 생산하는 우레아제(urease) 및 β-글루쿠로니다아제(glucuronidase) 등은 대장암을 유발하는 것으로 알려져 있어 선별 균주의 안전성 확보를 위하여 상기 유해효소 생성 여부를 확인한 결과, 선별된 균주들은 2종의 유해효소 모두를 생성하지 않는 것으로 확인되었다. 또한, 유해대사산물로 알려진 인돌(indole) 및 페닐피루브산(phenylpyruvic acid)도 생성하지 않는 것을 알 수 있었다. 상기 결과를 바탕으로 본 발명의 선별 균주들은 안전성이 높은 균주임을 확인할 수 있었다.
선별 균주의 용혈성, 유해대사산물 및 유해효소 생성 여부 분석
Strain no. Identification Hemolytic activity Harmful substance Harmful enzyme
indole phenylpyruvic acid urease β-glucuronidase
SRCM 101603 L. brevis γ-hemolysis - - - -
SRCM 101607 L. brevis γ-hemolysis - - - -
SRCM 101649 L. brevis γ-hemolysis - - - -
GG L. rhamnosus γ-hemolysis - - - -
실시예 2. 항산화 활성 분석
DPPH에 의한 자유 라디칼 소거능을 측정하여 선별 균주의 항산화 활성을 분석하였다. DPPH는 페놀성 물질에 대한 항산화 작용의 지표물질 중 하나이며, 항산화 물질은 자유 라디칼에 전자를 공여하여 지방질 산화를 억제하고, 활성산소에 의한 노화를 억제하는 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 본 발명에 따른 선별 균주를 대상으로 항산화 활성 분석 결과, SRCM101603 균주와 SRCM101607 균주가 각각 21.85% 및 21.23%의 항산화 활성을 보여 식품으로 적용 시 활성산소를 감소시켜 항노화 활성을 나타낼 수 있을 것으로 판단되었다.
DPPH 자유 라디칼 소거능
Strain no. Identification DPPH radical scavenging activity (%, Mean)
SRCM101603 L. brevis 21.85
SRCM101607 L. brevis 21.23
SRCM101649 L. brevis 19.44
실시예 3. API ZYM kit를 이용한 19가지 기본 효소 활성 분석
선별된 균주의 다양한 효소활성을 확인하고자 API ZYM kit를 이용하여 효소활성을 확인하였다. 그 결과, SRCM101607 균주와 SRCM101649 균주는 β-갈락토시다아제(galactosidase) 및 β-글루코시다아제(glucosidase) 등 프로바이오틱스 관련 기능성 효소를 가지고 있어 잠재적 프로바이오틱스로서 가치가 있음을 확인할 수 있었다. 상기 기능성 효소 외에 SRCM101607 균주는 에스터라아제(esterase), 에스터라아제 리파아제(esterase lipase), 루신 아릴아미다아제(leucin arylamidase), 발린 아릴아미다아제, 시스틴 아릴아미다아제, 애시드 포스파타아제(acid phosphatase), 나프톨-AS-BI-포스포히드롤라아제(Naphthol-AS-BI-phosphohydrolase) 및 α-글루코시다아제 효소를 가지고 있음을 알 수 있었다.
Figure pat00001
실시예 4. β-glucosidase 활성 분석
대두를 이용한 발효 식품에는 당 성분이 혼합되어 있는 아글리콘(aglycone) 형태의 배당체가 존재하며 대표적인 물질이 이소플라본(isoflavone)이다. 이소플라본은 식물성 에스트로겐(phytoestrogen)이라 불리며, 체내에서 활성물질로 일컫어지는 것이 다이드제인(daidzein)과 제니스테인(genistein)이다. 배당체 형태로 존재하고 있는 이소플라본은 위산과 장내 미생물이 생산하는 효소인 β-글루코시다아제(glucosidase)에 의하여 유리된 형태, 즉 비배당화 형태의 다이드제인과 제니스테인 등으로 전환되어 장에서 흡수가 된다. 최근 보고에 따르면 제니스테인은 강한 항암작용을 하는 것으로 확인되었으며, 특히 이러한 효소를 생산하는 미생물을 이용한 발효식품은 더욱더 기능성 식품으로 각광 받을 것으로 예측되고 있다. 본 발명에서 선별된 균주들의 β-글루코시다아제 활성을 측정한 결과, SRCM101607 균주가 높은 β-글루코시다아제 활성을 가지고 있으므로 기능성 식품 제조에 활용될 수 있을 것으로 사료되었다.
β-glucosidase 활성
Strain no. Identification β-glucosidase activity
SRCM101603 L. brevis -
SRCM101607 L. brevis ++
SRCM101649 L. brevis +
-; negative effect, +; ~1.0 mm, ++; 1.1~2.0 mm.
실시예 5. β-galactosidase 효소 활성 분석
β-갈락토시다아제(galactosidase)는 한국인의 80%가 겪는 락토오스(lactose, 젖당, 유당)에 의한 유당 불내증의 저하에 도움을 주는 효소로 락타아제(lactase)라 불리기도 하며, 예로부터 유도성 효소의 전형으로 알려져 있다. 특히 포유류의 젖 성분에 많이 존재하는 유당은 갈락토오스와 글루코스가 β(1-4) glycoside 결합으로 형성된 이당류이며, 이를 가수 분해하는 효소가 락타아제로 세균에서는 β-갈락토시다아제로 알려져 있다. 락타아제의 활성이 결핍된 사람의 경우 우유를 섭취하였을 때 우유 성분 중 유당이 섭취되지 않고 소장의 내강에 축적되어 삼투압 상승을 유발한다. 이로 인해 수분 과잉이 되며, 맹장 내의 미생물에 의해 발효됨으로서 탄산가스를 발생시키고 대장 내 pH 저하 및 장을 자극하여 불쾌감을 줄 뿐만 아니라 일시적인 설사나 대장의 만성 염증을 유발하여 만성 설사를 일으킨다.
선별 균주 3종에 대한 β-갈락토시다아제 활성 측정 결과, 모두 β-갈락토시다아제 활성을 지니고 있어 유당 불내증 완화에 이용될 수 있음을 알 수 있었다.
β-galactocidase 활성
Strain no. Identification β-galactocidase activity
SRCM101603 L. brevis ++
SRCM101607 L. brevis ++
SRCM101649 L. brevis +
-; negative effect, +; ~1.0 mm, ++; 1.1~2.0 mm.
실시예 6. 식중독 관련 유해 병원성 미생물에 대한 항균활성
식품의 식중독 유해 병원성 미생물로 알려진 7종에 대해 웰 확산 방법을 통해 선별 균주의 항균 활성을 확인하였다. 그 결과, SRMC101603 균주와 SRCM101607 균주는 유해 미생물 7종에 대하여 광범위한 항균활성을 보유하고 있음을 알 수 있었고, 식중독 관련 미생물 제어에 활용 가능성이 매우 높을 것으로 사료되었다.
Figure pat00002
실시예 7. 탈지유(skim milk) 발효력 분석
균주의 생존율 향상을 위한 생균 보조물질로서 상업적으로 많이 사용되는 식품 원료인 스킴 밀크는 일부 유산균과 반응하여 커드(curd)를 형성하기도 한다. 선별 균주를 대상으로 탈지유 발효력을 확인하여 상업적 생균 보조물질 사용여부를 확인하였다. 분석 결과, 선별 균주 3종은 탈지유 발효력이 없어 생균 보조물질로 유제품을 사용하여도 커드가 생성되지 않을 것으로 예상되었다.
탈지유 발효력
Strain no. Identification Skim milk fermentation acitivity
SRCM101603 L. brevis -
SRCM101607 L. brevis -
SRCM101649 L. brevis -
실시예 8. BSH (Bile salt hydrolase) 활성 분석
간세포에서 콜레스테롤은 1차 담즙산인 콜산(cholic acid)과 케노디옥시콜산(chenodeoxycholic acid)으로 전환되며, 글리신(glycine)이나 타우린(taurine)과 결합된 후 GDCA(glyco-deoxycholic acid) 또는 TDCA(tauro-deoxycholic acid)의 형태가 되며, 주로 나트륨염 형태의 답즙산으로 존재하게 된다. BSH는 글리신이나 타우린이 결합하는 부위에 작용하여 답즙산이 유리 콜산(free cholic acid)이 되어 재흡수되지 않게 하고, 간세포는 재흡수되지 않은 양의 담즙산을 생성하기 위하여 콜레스테롤을 소모하여 체내 콜레스테롤이 낮아지게 된다. 이에, 선별 균주를 대상으로 TDCA와 GDCA가 첨가된 배지를 이용하여 정성적 BSH 활성을 확인한 결과, 선별 균주 3종은 글리신과 결합된 GDCA 담즙산을 분해하는 것으로 확인되었고, 이를 통해 체내 콜레스테롤 감소 효과가 있음을 유추할 수 있었다.
Bile salt hydrolase 활성 분석
Strain no. Identification Bile salt hydrolase activity
TDCA GDCA
SRCM101603 L. brevis - +
SRCM101607 L. brevis - +
SRCM101649 L. brevis - +
실시예 9. 장내 상피세포 부착능
프로바이오틱스 활성을 가지는 미생물 섭취 시 장 내에 머물며 장내 유해미생물 억제 등 장내 환경 개선에 도움을 주는 것으로 보고되어 선발 균주를 대상으로 장내 상피세포주인 CaCO2 세포를 이용하여 장내 상피세포 부착능을 확인하였다. 그 결과, SRCM101607 균주는 약 74%의 부착율을 보여 프로바이오틱스 활성이 우수하다고 알려진 락토바실러스 람노서스(Lactobactillus rhamnosus) GG 균주의 89%의 부착율에는 미치지 못하지만, 선별된 균주 중에서 가장 높은 장내 상피세포 부착율을 보여주어 SRCM101607 섭취 시 장 내로 도달하여 장내 상피세포에 효과적으로 부착할 것으로 사료되었다.
장 상피세포 CaCO2 세포주 부착능
Strain no. Identification Adhesion rate (%)
SRCM101603 L. brevis 60.08
SRCM101607 L. brevis 73.94
SRCM101649 L. brevis 64.1
LGG L. rhamnosus GG 89.42
실시예 10. 항생제 감수성 분석
유산균의 경우 식품과 의약품의 소재로 많이 이용되고 있어 항생제 내성을 확인하는 것은 매우 중요한 요소이므로, 선별된 균주를 대상으로 항생제 감수성 분석을 진행하였다. 그 결과 선별된 균주들이 다양한 항생제에 대항 내성을 가지고 있음을 확인할 수 있었으며, SRCM101607 균주의 경우 시프로플록사신(ciprofloxacin), 린코마이신(lincomycin), 오플록사신(ofloxacin), 옥사실린(oxacillin), 페니실린(penicillin, 1 IU), 스트렙토마이신(streptomycin, 10㎍) 및 반코마이신(vancomycin)에 내성을 보임을 알 수 있었다. 상기와 같은 항상제 감수성 및 내성 결과는 상업용 균주 선택 시 중요한 자료로 활용될 수 있을 것이다.
Figure pat00003
실시예 11. 선별 균주의 동정
SRCM101607 균주의 동정을 위해 16S rRNA 유전자 염기서열(서열번호 1)을 분석한 결과 Lactobacillus brevis로 판명되었으며, MEGA 7.0에서 표준 균주와 16S rRNA 염기서열을 토대로 계통수(phylogenetic tree)를 작성하였으며, 상동성을 분석한 결과 SRCM101607 균주는 Lactobacillus brevis ATCC 14869와 유사성이 높게 나타났다. 최종적으로 본 발명에서 선별한 균주를 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis) SRCM101607으로 명명하였으며, 한국미생물보존센터(KCCM, Korean Culture Center of Microorganisms)에 Lactobacillus brevis SRCM101607으로 2020년 5월 26일자에 기탁하였다(수탁번호: KCCM12731P).
한국미생물보존센터(국외) KCCM12731P 20200526
<110> Microbial Institute for Fermentation Industyry <120> Lactobacillus brevis SRCM101607 strain having probiotics-related enzyme secretion activity, antioxidant activity, Bile salt hydrolysis, antimicrobial activity, and not producing harmful enzyme and harmful metabolite and uses thereof <130> PN20158 <160> 3 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 1499 <212> DNA <213> Lactobacillus brevis <400> 1 cagacgaacg ctggcggcat gcctaataca tgcaagtcga acgagcttcc gttgaatgac 60 gtgcttgcac tgatttcaac aatgaagcga gtggcgaact ggtgagtaac acgtggggaa 120 tctgcccaga agcaggggat aacacttgga aacaggtgct aataccgtat aacaacaaaa 180 tccgcatgga ttttgtttga aaggtggctt cggctatcac ttctggatga tcccgcggcg 240 tattagttag ttggtgaggt aaaggcccac caagacgatg atacgtagcc gacctgagag 300 ggtaatcggc cacattggga ctgagacacg gcccaaactc ctacgggagg cagcagtagg 360 gaatcttcca caatggacga aagtctgatg gagcaatgcc gcgtgagtga agaagggttt 420 cggctcgtaa aactctgttg ttaaagaaga acacctttga gagtaactgt tcaagggttg 480 acggtattta accagaaagc cacggctaac tacgtgccag cagccgcggt aatacgtagg 540 tggcaagcgt tgtccggatt tattgggcgt aaagcgagcg caggcggttt tttaagtctg 600 atgtgaaagc cttcggctta accggagaag tgcatcggaa actgggagac ttgagtgcag 660 aagaggacag tggaactcca tgtgtagcgg tggaatgcgt agatatatgg aagaacacca 720 gtggcgaagg cggctgtcta gtctgtaact gacgctgagg ctcgaaagca tgggtagcga 780 acaggattag ataccctggt agtccatgcc gtaaacgatg agtgctaagt gttggagggt 840 ttccgccctt cagtgctgca gctaacgcat taagcactcc gcctggggag tacgaccgca 900 aggttgaaac tcaaaggaat tgacgggggc ccgcacaagc ggtggagcat gtggtttaat 960 tcgaagctac gcgaagaacc ttaccaggtc ttgacatctt ctgccaatct tagagataag 1020 acgttccctt cggggacaga atgacaggtg gtgcatggtt gtcgtcagct cgtgtcgtga 1080 gatgttgggt taagtcccgc aacgagcgca acccttatta tcagttgcca gcattcagtt 1140 gggcactctg gtgagactgc cggtgacaaa ccggaggaag gtggggatga cgtcaaatca 1200 tcatgcccct tatgacctgg gctacacacg tgctacaatg gacggtacaa cgagttgcga 1260 agtcgtgagg ctaagctaat ctcttaaagc cgttctcagt tcggattgta ggctgcaact 1320 cgcctacatg aagttggaat cgctagtaat cgcggatcag catgccgcgg tgaatacgtt 1380 cccgggcctt gtacacaccg cccgtcacac catgagagtt tgtaacaccc aaagccggtg 1440 agataacctt cgggagtcag ccgtctaagg tgggacagat gattagggtg aagtcgtac 1499 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 2 agagtttgat cmtggctcag 20 <210> 3 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 tacggytacc ttgttacgac tt 22

Claims (5)

  1. 장내 상피세포 부착능, γ-용혈성, 항산화 활성, 담즙 분해 활성, 세포외 효소 분비능, 유해 미생물에 대한 항균 활성, 항생제 내성이 있고, 유해효소 및 유해대사산물을 생성하지 않는, 기탁번호가 KCCM12731P인 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis) SRCM101607 균주.
  2. 제1항에 있어서, 상기 세포외 효소는 에스터라아제(esterase), 에스터라아제 리파아제(esterase lipase), 루신 아릴아미다아제(leucin arylamidase), 발린 아릴아미다아제, 시스틴 아릴아미다아제, 애시드 포스파타아제(acid phosphatase), 나프톨-AS-BI-포스포히드롤라아제(Naphthol-AS-BI-phosphohydrolase), β-갈락토시다아제(galactosidase), β-글루코시다아제(glucosidase) 및 α-글루코시다아제이며, 상기 유해 미생물은 바실러스 세레우스(Bacillus cereus), 리스테리아 모노사이토게네스(Listeria monocytogenes), 마이크로코커스 루테우스(Micrococcus luteus), 대장균(Escherichia coli), 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus), 슈도모나스 에루지노사(Pseudomonas aeruginosa) 및 살모넬라 티피뮤리움(Salmonella typhimurium)이고, 상기 항생제는 시프로플록사신(ciprofloxacin), 린코마이신(lincomycin), 오플록사신(ofloxacin), 옥사실린(oxacillin), 페니실린(penicillin), 스트렙토마이신(streptomycin) 및 반코마이신(vancomycin)이며, 상기 유해효소는 우레아제(urease) 및 β-글루쿠로니다아제(β-glucuronidase)이고, 상기 유해대사산물은 인돌(indole) 및 페닐피루브산(phenylpyruvic acid)인 것을 특징으로 하는 균주.
  3. 제1항 또는 제2항의 균주, 이의 배양액, 상기 배양액의 농축액 또는 그의 건조물을 유효성분으로 포함하는 프로바이오틱스 제제.
  4. 제1항 또는 제2항의 균주, 이의 배양액, 상기 배양액의 농축액 또는 그의 건조물을 유효성분으로 함유하는 장류 제조용 스타터(starter) 조성물.
  5. 제1항 또는 제2항의 균주, 이의 배양액, 상기 배양액의 농축액 또는 그의 건조물을 유효성분으로 함유하는 유해 미생물에 대한 항균용 조성물.
KR1020200081852A 2020-07-03 2020-07-03 프로바이오틱스 관련 효소 분비능, 항산화 활성, 담즙산염 분해 활성, 항균 활성이 있고, 유해효소 및 유해대사산물을 생성하지 않는 락토바실러스 브레비스 srcm101607 균주 및 이의 용도 KR20220004865A (ko)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020200081852A KR20220004865A (ko) 2020-07-03 2020-07-03 프로바이오틱스 관련 효소 분비능, 항산화 활성, 담즙산염 분해 활성, 항균 활성이 있고, 유해효소 및 유해대사산물을 생성하지 않는 락토바실러스 브레비스 srcm101607 균주 및 이의 용도

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020200081852A KR20220004865A (ko) 2020-07-03 2020-07-03 프로바이오틱스 관련 효소 분비능, 항산화 활성, 담즙산염 분해 활성, 항균 활성이 있고, 유해효소 및 유해대사산물을 생성하지 않는 락토바실러스 브레비스 srcm101607 균주 및 이의 용도

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20220004865A true KR20220004865A (ko) 2022-01-12

Family

ID=79339584

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020200081852A KR20220004865A (ko) 2020-07-03 2020-07-03 프로바이오틱스 관련 효소 분비능, 항산화 활성, 담즙산염 분해 활성, 항균 활성이 있고, 유해효소 및 유해대사산물을 생성하지 않는 락토바실러스 브레비스 srcm101607 균주 및 이의 용도

Country Status (1)

Country Link
KR (1) KR20220004865A (ko)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR102426030B1 (ko) * 2022-03-08 2022-07-27 재단법인 발효미생물산업진흥원 효소 활성, 항균 활성 및 프로바이오틱스 특성을 갖는 락토바실러스 브레비스 srcm209231 균주 및 이의 용도
KR102589192B1 (ko) * 2023-07-26 2023-10-16 재단법인 발효미생물산업진흥원 항염 활성 및 프로바이오틱스 특성을 가지는 락토바실러스브레비스 srcm 100917 균주 및 이의 용도

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR102426030B1 (ko) * 2022-03-08 2022-07-27 재단법인 발효미생물산업진흥원 효소 활성, 항균 활성 및 프로바이오틱스 특성을 갖는 락토바실러스 브레비스 srcm209231 균주 및 이의 용도
KR102589192B1 (ko) * 2023-07-26 2023-10-16 재단법인 발효미생물산업진흥원 항염 활성 및 프로바이오틱스 특성을 가지는 락토바실러스브레비스 srcm 100917 균주 및 이의 용도

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR102115506B1 (ko) 항균 활성과 프로바이오틱스 특성을 갖는 락토바실러스 파라카제이 srcm102343 균주 및 이의 용도
KR101839374B1 (ko) 항균 활성과 프로바이오틱스 특성을 갖는 바실러스 서틸리스 scgb 574 균주 및 이의 용도
US20080063666A1 (en) New lactic bacteria useful as probiotics
US7244424B2 (en) Strain of micro-organism Lactobacillus fermentum ME-3 as novel anti-microbiol and anti-oxidative probiotic
KR101868517B1 (ko) 다양한 생리활성과 열 안정성이 우수한 프로바이오틱 락토바실러스 퍼멘텀 pl9119
JP2001000143A (ja) Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒｐｙｌｏｒｉ除菌性飲食品
KR20190103755A (ko) 신규한 락토바실러스 플란타룸 균주 및 이의 용도
EP1840205B1 (en) Bifidobacterium lactis 668 strain used as a component for food products, starters, medicinal and cosmetic agents
KR102254751B1 (ko) 신규의 락토바실러스 플란타럼 WiKim83 균주 및 이의 용도
KR102065580B1 (ko) 항균 활성과 프로바이오틱스 특성을 갖는 락토바실러스 브레비스 scml 432 균주 및 이의 용도
KR102044365B1 (ko) 장 부착능이 우수하고, 항균 물질을 합성하는 유전자를 보유하며, 프로바이오틱스 특성을 가지는 바실러스 서틸리스 scdb 291 균주 및 이의 용도
KR20220004865A (ko) 프로바이오틱스 관련 효소 분비능, 항산화 활성, 담즙산염 분해 활성, 항균 활성이 있고, 유해효소 및 유해대사산물을 생성하지 않는 락토바실러스 브레비스 srcm101607 균주 및 이의 용도
KR102155849B1 (ko) 유해 미생물에 대한 항균 활성과 유산 생성능을 갖는 락토바실러스 플란타룸 srcm102369 균주 및 이의 용도
KR101839371B1 (ko) 항균 활성과 프로바이오틱스 특성을 갖는 바실러스 아밀로리퀘파시엔스 srcm 100731 균주 및 이의 용도
KR101996080B1 (ko) 항균 활성과 프로바이오틱스 특성을 갖는 락토바실러스 플란타룸 srcm101594 균주 및 이의 용도
KR102159379B1 (ko) 장 부착능 및 세포외 효소 분비능이 우수하고, 프로바이오틱스 특성을 가지는 바실러스 서틸리스 srcm101371 균주 및 이의 용도
KR101811246B1 (ko) 내산성, 내담즙성, 항산화 활성, 리파아제 저해활성, 혈전분해활성 및 항균 활성이 있고, 바이오제닉 아민을 생산하지 않으면서, 프로테아제 및 아밀라제 효소를 분비하는 바실러스 서틸리스 scgb 320 균주 및 이의 용도
KR101839372B1 (ko) 내산성, 내담즙성, 항산화 활성 및 항균 활성이 있고, 바이오제닉 아민을 생산하지 않으면서, 프로테아제, 셀룰라제 및 아밀라제 효소를 분비하는 바실러스 서틸리스 scgb 634 균주 및 이의 용도
KR101860836B1 (ko) 항균 활성과 프로바이오틱스 특성을 갖는 바실러스 아밀로리퀘파시엔스 scgb 1 균주 및 이의 용도
KR101839375B1 (ko) 항균 활성과 프로바이오틱스 특성을 갖는 바실러스 아밀로리퀘파시엔스 srcm 100730 균주 및 이의 용도
KR20220004864A (ko) 프로바이오틱스 관련 효소 분비능, 혈전분해 활성, 항균 활성이 있고, 유해효소 및 유해물질을 생성하지 않는 락토바실러스 플란타룸 srcm101587 균주 및 이의 용도
KR102136064B1 (ko) 담즙산염 분해 활성 및 식품 유해균에 대한 항균 활성을 가지며, 프로바이오틱스 특성을 보유한 락토바실러스 브레비스 scml 379 균주 및 이의 용도
KR20220000109A (ko) 프로바이오틱스 관련 효소 분비능, 혈전분해 활성, 항균 활성이 있고, 유해효소 및 바이오제닉 아민을 생성하지 않는 바실러스 서브틸리스 srcm101393 균주 및 이의 용도
KR102100367B1 (ko) 장 부착능이 우수하고, 항노화 활성 및 프로바이오틱스 특성을 가지는 락토바실러스 브레비스 srcm103306 균주 및 이의 용도
BG66485B1 (bg) Щам lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus с широк спектър на приложение

Legal Events

Date Code Title Description
E902 Notification of reason for refusal
E601 Decision to refuse application