KR20220000109A - 프로바이오틱스 관련 효소 분비능, 혈전분해 활성, 항균 활성이 있고, 유해효소 및 바이오제닉 아민을 생성하지 않는 바실러스 서브틸리스 srcm101393 균주 및 이의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 내산성, 내담즙성, 내열성, 장내 상피세포 부착능, γ-용혈 활성, 혈전분해 활성, 세포외 효소 분비능, 유해 미생물에 대한 항균 활성이 있고, 유해효소 및 바이오제닉 아민을 생성하지 않는, 기탁번호가 KCCM12265P인 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) SRCM101393 균주 및 이의 용도에 관한 것이다.

Description

프로바이오틱스 관련 효소 분비능, 혈전분해 활성, 항균 활성이 있고, 유해효소 및 바이오제닉 아민을 생성하지 않는 바실러스 서브틸리스 SRCM101393 균주 및 이의 용도{Bacillus subtilis SRCM101393 strain having probiotics-related enzyme secretion activity, fibrinolytic activity, antimicrobial activity, and not producing harmful enzyme and biogenic amine and uses thereof}

본 발명은 프로바이오틱스 관련 효소 분비능, 혈전분해 활성, 항균 활성이 있고, 유해효소 및 바이오제닉 아민을 생성하지 않는 바실러스 서브틸리스 SRCM101393 균주 및 이의 용도에 관한 것이다.

프로바이오틱스(Probiotics)란 살아있는 생균제로서 사람 및 동물에 투여된 생균이 장내의 소화관 벽에 밀집, 정착하여 유해균이 정착하지 못하게 하는 작용을 하며, 유산을 생성하여 장내의 pH를 낮추어서 유해세균이 증식하지 못하게 한다. 또한, 투여된 프로바이오틱스는 박테리오신(bacteriocin) 혹은 과산화물을 생성하여 병원균의 증식을 억제하며 영양분의 흡수를 담당하는 장융모의 활동을 도와준다. 이밖에도, 프로바이오틱스는 영양소의 흡수와 이용을 돕는 물질을 생성하고, 사료요구율을 개선시키며, 병원균이 생성하는 독성물질을 중화하는 물질을 생성하기도 한다. 프로바이오틱스는 대체로 동물 혹은 어류가 스트레스로 인한 소화관의 유용 균주 감소를 억제할 목적으로 이용되며, 항생물질을 경구투여하고 난 후 병원균보다 먼저 세균이 없는 소화관 벽에 부착하여 병원균이 정착하는 것을 방지한다.

프로바이오틱스로서 필요한 특성은 안전성, 기능적 측면(생존성, 정착성, 서식성, 항미생물제 생성능, 면역 촉진능, 항유전독성 활성, 병원성 세균의 억제능), 기술적 측면(관능적 특성, 안정성, 박테리오파지 저항성, 제조과정 중의 생존성) 및 GRAS(Generally Recognized As Safe) 미생물이다. 프로바이오틱스는 항생제와는 반대되는 특성을 가지고 있는데, 항생제가 미생물이 생산하는 대사 산물로서 소량으로 다른 미생물의 발육을 억제하거나 사멸시키는 물질이라면 프로바이오틱스는 균들의 공생, 상생의 능력을 이용하여 면역기능을 증진시키고 유해 미생물의 성장을 저해하는 등의 효과를 나타내고 있어 이러한 면역 증진 기능을 지닌 기능성 물질 및 프로바이오틱스는 현재 오남용으로 사회적 문제가 되고 있는 항생제의 대체 물질로서 이용이 가능하다.

우리나라 전통 장류의 발효 과정은 주로 바실러스(Bacillus), 아스퍼질러스(Aspergillus), 유산균 및 효모의 복합적인 대사 과정으로 이루어져 있다. 장류 제조는 프로테아제(proteases) 활성이 높은 바실러스와 아스퍼질러스 속으로 단백질 함량이 높은 콩을 가수분해하는 과정을 거치며, 적절한 증식 온도와 여러 미생물들의 상호 작용에 의한 발효가 이루어지기 때문에 바이오제닉 아민이 생산되기 적당한 조건이다. 한국인 식단 중 바이오제닉 아민 함량이 가장 높은 식품 7종 중 4종이 장류이고, 식단 특성상 장류 사용량이 젓갈보다 더 많다는 것을 고려하면, 한국인은 식사를 통해 건강에 해로운 수준까지도 바이오제닉 아민을 섭취할 수 있다. 이에 따라 GRAS 균주로서 장류 제조에 허용될 수 있는 바실러스 서브틸리스 균주들 중 유해 물질인 바이오제닉 아민 분해능력을 가지면서 안전성 확보를 위해 독소 유전자를 함유하지 않는 균주들이 요구되고 있다.

한편, 한국공개특허 제2017-0015684호에는 '장류의 유해 미생물에 대한 항균 활성, 항산화 활성 및 세포외 효소 분비능이 있고, 바이오제닉 아민을 생성하지 않는 전통장류 유래의 바실러스 서틸리스 SCM121 균주 및 이의 용도'가 개시되어 있고, 한국등록특허 제2044365호에는 '장 부착능이 우수하고, 항균 물질을 합성하는 유전자를 보유하며, 프로바이오틱스 특성을 가지는 바실러스 서틸리스 SCDB 291 균주 및 이의 용도'가 개시되어 있으나, 본 발명의 '프로바이오틱스 관련 효소 분비능, 혈전분해 활성, 항균 활성이 있고, 유해효소 및 바이오제닉 아민을 생성하지 않는 바실러스 서브틸리스 SRCM101393 균주 및 이의 용도'에 대해서는 기재된 바가 없다.

본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명자들은 국내 전통 장류 제품으로부터 내산성, 내담즙성, 내열성, 장내 상피세포 부착능, γ-용혈 활성, 혈전분해 활성을 가지며, 에스터라아제(esterase), 에스터라아제 리파아제(esterase lipase), 애시드 포스파타아제(acid phosphatase), 나프톨-AS-BI-포스포히드롤라아제(Naphthol-AS-BI-phosphohydrolase), α-글루코시다아제(α-glucosidase), β-글루코시다아제 및 프로테아제(protease) 효소를 분비하고, 리스테리아 모노사이토게네스(Listeria monocytogenes), 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococus aureus) 및 마이크로코커스 루테우스(Micrococcus luteus)에 대한 항균 활성이 있으며, 유해효소인 트립토파나아제(tryptophanase), 우레아제(urease) 및 β-글루쿠로니다아제(β-glucuronidase)와 바이오제닉 아민을 생성하지 않는 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) SRCM101393 균주(수탁번호: KCCM12265P)를 분리하였다. 본 발명의 바실러스 서브틸리스 SRCM101393 균주는 상기와 같은 프로바이오틱스 특징을 가지므로, 정장제로 유용하게 사용될 수 있으며, 또한 품질 좋은 장류 제조를 위한 스타터 균주 그리고 항균용 제제로도 사용이 가능함을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.

상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 내산성, 내담즙성, 내열성, 장내 상피세포 부착능, γ-용혈 활성, 혈전분해 활성, 세포외 효소 분비능, 유해 미생물에 대한 항균 활성이 있고, 유해효소 및 바이오제닉 아민을 생성하지 않는, 기탁번호가 KCCM12265P인 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) SRCM101393 균주를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 균주, 이의 배양액, 상기 배양액의 농축액 또는 그의 건조물을 유효성분으로 포함하는 프로바이오틱스 제제를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 균주, 이의 배양액, 상기 배양액의 농축액 또는 그의 건조물을 유효성분으로 함유하는 장류 제조용 스타터(starter) 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 균주, 이의 배양액, 상기 배양액의 농축액 또는 그의 건조물을 유효성분으로 함유하는 유해 미생물에 대한 항균용 조성물을 제공한다.

본 발명의 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) SRCM101393 균주는 내산성, 내담즙성, 내열성, 장내 상피세포 부착능, γ-용혈 활성, 혈전분해 활성, 세포외 효소 분비능 및 유해 미생물에 대한 항균 활성이 있고, 유해효소 및 바이오제닉 아민을 생성하지 않으므로 정장제, 장류 제조를 위한 스타터 균주 및 항균용 조성물 등의 관련 산업 분야에 매우 유용하게 이용될 수 있다.

도 1은 본 발명에서 분리한 바실러스 서브틸리스 SRCM101393 균주의 내산성, 내담즙성 및 내열성을 분석한 결과이다.
도 2는 본 발명에서 분리한 바실러스 서브틸리스 SRCM101393 균주의 계통도를 나타낸 것이다.

본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 내산성, 내담즙성, 내열성, 장내 상피세포 부착능, γ-용혈 활성, 혈전분해 활성, 세포외 효소 분비능, 유해 미생물에 대한 항균 활성이 있고, 유해효소 및 바이오제닉 아민을 생성하지 않는, 기탁번호가 KCCM12265P인 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) SRCM101393 균주를 제공한다.

본 발명에서는 전통 장류 제품으로부터 내산성, 내담즙성, 내열성, 장내 상피세포 부착능, γ-용혈 활성, 혈전분해 활성, 세포외 효소 분비능, 유해 미생물에 대한 항균 활성이 있고, 유해효소 및 바이오제닉 아민을 생성하지 않는 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 균주를 분리 및 동정하였으며, 이를 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) SRCM101393 균주로 명명하여 한국미생물보존센터(KCCM)에 2018년 05월 28일에 기탁하였다(수탁번호: KCCM12265P).

본 발명의 기탁번호가 KCCM12265P인 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) SRCM101393 균주에 있어서, 상기 세포외 효소는 에스터라아제(esterase), 에스터라아제 리파아제(esterase lipase), 애시드 포스파타아제(acid phosphatase), 나프톨-AS-BI-포스포히드롤라아제(Naphthol-AS-BI-phosphohydrolase), α-글루코시다아제(α-glucosidase), β-글루코시다아제 및 프로테아제(protease)이며, 상기 유해 미생물은 리스테리아 모노사이토게네스(Listeria monocytogenes), 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococus aureus) 및 마이크로코커스 루테우스(Micrococcus luteus)이고, 상기 유해효소는 트립토파나아제(tryptophanase), 우레아제(urease) 및 β-글루쿠로니다아제(β-glucuronidase)이며, 상기 바이오제닉 아민은 티라민(tyramine) 및 히스타민(histamine)이다. 또한, 상기 내산성은 pH2~5에 대한 내산성이며, 내담즙성은 0.3~1.5%(w/v)의 담즙산염에 대한 내담즙성이며, 내열성은 30~80℃의 내열성이다.

본 발명은 또한, 상기 기탁번호가 KCCM12265P인 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) SRCM101393 균주, 이의 배양액, 상기 배양액의 농축액 또는 그의 건조물을 유효성분으로 포함하는 프로바이오틱스 제제를 제공한다.

상기 프로바이오틱스 제제는 당업계에 공지된 방법에 따라 다양한 제형과 방법으로 제조 및 투여될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 바실러스 서브틸리스 SRCM101393 균주, 이의 배양액, 상기 배양액의 농축액 또는 그의 건조물은 약제학적 분야에서 통상적으로 사용되는 담체와 혼합하여 산제(powder), 액제(liquids and solutions), 정제(tablet), 캡슐(capsule), 시럽(syrup), 현탁제(suspension) 또는 과립제(granule) 등의 형태로 제조되어 투여될 수 있다. 상기 담체로는 예를 들어, 결합제, 활탁제, 붕해제, 부형제, 가용화제, 분산제, 안정화제, 현탁화제, 색소 및 향료 등일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 투여 용량은 체내에서의 활성성분의 흡수도, 불활성률, 배설속도, 피투여자의 연령, 성별, 축종, 상태 및 질병의 중증 정도 등에 따라 적절히 선택할 수 있다.

본 발명의 상기 프로바이오틱스 제제를 식품첨가물로 사용하는 경우, 상기 프로바이오틱스 제제를 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효 성분의 혼합양은 그의 사용 목적(예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 식품 또는 음료의 제조시에 본 발명의 프로바이오틱스 제제는 원료에 대하여 15 중량부 이하, 바람직하게는 10 중량부 이하의 양으로 첨가된다. 그러나 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 혼합양은 상기 범위 이하일 수 있으며, 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 혼합양은 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있다.

상기 식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 상기 프로바이오틱스 제제를 첨가할 수 있는 식품의 예로는 빵, 캔디류, 스낵류, 과자류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제 및 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 건강식품을 모두 포함한다.

본 발명은 또한, 상기 기탁번호가 KCCM12265P인 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) SRCM101393 균주, 이의 배양액, 상기 배양액의 농축액 또는 그의 건조물을 유효성분으로 함유하는 장류 제조용 스타터(starter) 조성물을 제공한다.

본 발명에 있어서, 장류 제조용 스타터(starter)란 장류 제조를 위해 발효에 관여하는 미생물을 포함하는 제제 또는 조성물을 의미한다. 장류 제조 시에 첨가함으로써 발효된 장류에서 생장할 수 있는 미생물 또는 우점종으로 생장할 수 있는 미생물을 제공하기 위하여 사용된다. 상기 장류 발효용 스타터를 사용하여 장류를 제조하는 경우, 상기 장류 발효용 스타터에 포함된 미생물에 의하여, 장류의 품질을 일정하게 조절하거나, 특정한 목적, 일 예로 장류에서 이취를 발생시키지 않거나, 감소시키는 목적 또는 장류에서 구수한 맛이나 단맛을 강화시키기 위한 목적을 달성할 수 있다.

본 발명의 균주를 배양하는 방법은 당업계에 통상적으로 이용되는 방법에 따라 배양할 수 있으며, 특별한 방법에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 균주를 배양하는 단계에서 얻어지는 상기 균주 또는 상기 균주의 배양물 또는 상기 균주의 배양액의 농축액을 첨가제로 사용할 경우, 상기 균주 또는 상기 균주의 배양물 또는 상기 균주의 배양액의 농축액을 그대로 첨가하거나 다른 첨가제를 함께 사용할 수 있으며, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효 성분의 혼합양은 그의 사용 목적에 따라 적합하게 결정될 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 균주 또는 이의 배양액을 스타터(starter) 균주로 이용하여 장류를 제조하는 방법을 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 기탁번호가 KCCM12265P인 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) SRCM101393 균주, 이의 배양액, 상기 배양액의 농축액 또는 그의 건조물을 유효성분으로 함유하는 유해 미생물에 대한 항균용 조성물을 제공한다.

본 발명의 항균 조성물이란 항미생물제를 총칭하는 의미인 항생제와 같은 의미일 수 있고, 항진균제, 살균제, 방부제, 보존제 또는 제균제와 같은 의미일 수 있으며, 바람직하게는 리스테리아 모노사이토게네스(Listeria monocytogenes), 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococus aureus) 및 마이크로코커스 루테우스(Micrococcus luteus) 등을 포함하는 병원성 미생물, 특히 그람 양성 병원성 미생물의 발육과 생활 기능을 저지 또는 억제할 수 있는 물질을 의미할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 항균 조성물은 바실러스 서브틸리스 SRCM101393 균주, 이의 배양액, 상기 배양액의 농축액 또는 그의 건조물 외에 당질, 단백질, 지질, 비타민류 및 미네랄류를 포함할 수 있다. 상기 당질, 단백질, 지질, 비타민류 또는 미네랄류는 그 사용 목적 및 용도에 따라 적의 선택될 수 있으며, 일 예로 상기 당질은 벌꿀, 덱스트린, 수크로오스, 팔라티노스, 포도당, 과당, 물엿, 당알콜(sugar alcohol), 소르비톨, 크실리톨, 말티톨일 수 있고 상기 단백질은 카제인(casein), 유청 단백질(whey protein) 등의 우유 유래 단백질, 대두 단백질, 이들 단백질의 트립신, 펩신 등의 동물 유래 효소 및 뉴트라아제(neutrase), 알칼라아제(alkilase)에 의한 가수분해물일 수 있으며, 상기 지질은 제1가 포화지방산, 다가 불포화지방산을 포함하는 해바라기유, 채종유(rapeseed oil), 올리브유, 홍화유(safflower oil), 옥수수유, 대두유, 팜유(palm oil), 야자유 등의 각종 식물 유래 유지, 중쇄 지방산(middle-chain fatty acid), EPA, DHA, 대두유래 인지질, 우유 유래 인지질일 수 있고, 상기 미네랄류는 인산칼륨, 탄산칼륨, 염화칼륨, 염화나트륨, 유산칼슘, 글루콘산칼슘, 판토텐산칼슘, 카제인칼슘, 염화마그네슘, 황산제1철, 탄산수소나트륨일 수 있으나, 각각의 예에 의해 특별히 제한되는 것은 아니다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

재료 및 방법

1. 균주 분리 및 배양 조건

전라북도에서 전통적인 방법으로 제조한 전통장류제품을 구입하여 실험에 사용하였다. 수거한 장류 1 g의 시료를 9 ㎖의 멸균 생리식염수(0.85% NaCl)에 넣어 십진법으로 희석한 후 LB(트립톤 1%, 효모추출물 0.5%, 염화나트륨 0.5%, 한천 1.5%) 고체배지에 도말하여 37℃에서 18시간 배양하였다. 순수한 균주를 분리하기 위해 단일 콜로니를 분리하였고, LB 액체배지에서 37℃, 18시간 배양하였다. 선별한 균주를 대상으로 멸균된 10% skim milk 보존액(in water)에 혼합하여 4℃에서 보관하였다. 보관 후 세포의 활성화는 LB 액체배지에서 37℃, 18시간 배양하여 활성화하여 사용하였다.

2. 선별 균주의 Bacillus cereus 독소 유전자 분석을 통한 안전성 분석

선별 균주의 안전성 여부를 확인하기 위해, Bacillus cereus가 생성하는 6개의 설사형 독소와 구토형 독소 유전자 보유 여부를 PCR 방법을 이용하여 분석하였다. PCR (Veriti 96-well Thermal Cycler, Life technologies)은 코젠 바이오텍의 PowerChek^TM Bacillus cereus Toxin 6-plex Detection kit를 사용하여 조사하였으며, CER, hblC, bceT, entFM, nheA, cytK의 6개 독소 유전자를 대상으로 유전자 보유 여부를 조사하였다. 먼저 PCR 반응을 위한 혼합물은 코젠 바이오텍의 매뉴얼에 따라 실시하였으며, PCR 반응 조건은 95℃에서 10분 1회 초기변성 후, DNA 증폭을 위하 95℃ 30초간 변성, 60℃에서 30초간 결합, 72℃에서 30초간 증폭 과정을 35회 실시하였고, 마지막으로 72℃에서 10분간 마지막 증폭을 1회 실시하였다. 증폭을 통해 확보한 PCR 산물은 반응이 끝난 PCR 산물은 1.5% 아가로스 겔에서 전기영동 한 후 UV transilluminator (Gel documentation, Bio-Rad)를 이용하여 밴드를 확인하여 독소 유전자의 보유 여부를 확인하였다.

3. 용혈성 및 유해효소 생성 분석

선별 균주의 용혈성을 확인하기 위해서 5% 양(sheep) 혈액(MBcell, Seoul, Korea)이 첨가된 혈액 아가 배지에 균주를 획선 접종하여 37℃에서 24시간 배양하여 균주 주위의 생기는 환의 형태로 용혈성을 확인하였다. 또한, 발암 관련 유해효소로 알려진 트립토파나아제(tryptophanase), 우레아제(urease) 및 β-글루쿠로니다아제(β-glucuronidase)의 생성 여부를 확인하였다. 트립토파나아제 생성 여부를 확인하기 위하여 TSB(Tryptone Soya Broth, Oxoid Ltd., UK) 배지에 접종한 후 37℃, 24시간 진탕배양 후 인돌 용액 드로퍼(BBL, USA)를 첨가하여 배지 표면에 색 변화로 확인하였으며, 우레아제 생성 여부는 urea rapid test kit (MBcell)에 선별 균주를 접종하고 바셀린 오일(MBcell)을 첨가하여 산소가 차단된 상태로 37℃, 4-24시간 배양하여 배지의 색 변화로 확인하였다. β-글루쿠로니다아제는 TBX agar(Tryptone Bile X-glucuronide agar, Oxoid Ltd., UK) 배지에 선별 균주를 접종하여 37℃, 24시간 배양 후 집락의 색 변화로 확인하였다.

4. 바이오제닉 아민 분석

균주의 바이오제닉 아민 함량을 확인하기 위하여 Moret & Conte (1995)의 방법을 따라 HPLC를 이용하여 분석을 진행하였다. 표준 용액은 0.1N 염산에 녹여 약 1 g/L가 되도록 제조한 후 0.1 ~ 100 mg/L의 농도로 희석해 준비하여 검량곡선을 작성하였다. 균주는 각 1,000 ppm의 티로신과 히스티딘이 함유된 MRS 액체배지에 접종하여 37℃에서 24시간 진탕배양 하였다. 배양액은 13,000×g에서 10분간 원심분리하여 상등액을 시료용액으로 분석에 사용하였고, 시료용액과 표준용액을 0.5 ㎖씩 취한 후 내부표준용액 1,7-diaminoheptane (0.1 g/L, sigma, USA) 0.25 ㎖씩 첨가하였다. 포화탄산나트륨용액(Sigma, USA) 0.25 ㎖과 1% 댄실염화물(dansyl chloride in acetone) 용액 0.4 ㎖을 첨가한 후 45℃에서 1시간 동안 유도체화 한 후 10% 프롤린 용액 0.25 ㎖를 첨가하여 과잉의 댄실염화물을 제거하고, 에틸에테르 2.5 ㎖를 가하여 3분간 진탕한 후 상등액을 취하였다. 이를 질소 농축기에서 완전히 증발시킨 후 잔여물을 아세토니트릴(acetonitrile) 0.5 ㎖에 녹이고 0.45 ㎛ filter를 이용해 여과하여 여과액을 HPLC 분석하였다. 분석 조건은 아래 표와 같다.

바이오제닉 아민 분석을 위한 HPLC 기기 분석 조건

Instrument	Agilent 1200 series
Column	Capcellpak C18 column, 4.6×250 mm
Column Detector	DAD detector (245 nm)
Flow rate	1.0 ㎖/min
Injection volume	20 ㎕
Mobile phase	A - 0.1% formic acid in H2O B - 0.1% formic acid in ACN
Gradient condition	A : B = 45 : 55, 0~10min A : B = 35 : 65, 10~15min A : B = 20 : 80, 15~25min A : B = 10 : 90, 25~33min A : B = 45 : 55, 33~40min over
Temperature	40℃

5. API ZYM kit을 이용한 19가지 기본 효소 활성 분석

선별 균주의 효소 활성을 확인하기 위해 총 19종의 효소의 기질 이용성을 기초로 제작된 API ZYM kit (BioMerieux, France)를 사용하였다. LB 아가 배지에 획선 도말하여 30℃에서 24시간 배양하여 순수 콜로니를 현탁 배지 2 ㎖에 풀어 McFarland standard 5~6 탁도로 맞춘 후 키트에 60 ㎕ 씩 분주 후 37℃에서 4시간 배양 후 ZYM A, B를 튜브 당 1방울씩 첨가하여 5분간 실온에서 반응시켜 색 변화를 확인하여 판독하였다.

6. 단백질 분해효소 활성 측정

단백질 분해효소(protease)의 활성은 Vermelho 등의 방법(1996)을 이용하여 웰 확산(well difussion) 방법을 이용하여 측정하였다. 효소활성 측정용 배지는 단백질 분해효소와 반응하는 기질로 2% 스킴 밀크에 1.5% 아가를 첨가하여 제조하였으며, 선별 균주의 효소액은 선별 균주를 LB 액체배지에서 30℃, 24시간 진탕배양 한 후 13,000rpm에서 10분간 원심분리하여 상등액을 취한 후 시료로 사용하였다. 효소활성 측정용 배지에 8mm 구멍을 뚫은 후 배양 상등액 100 ㎕를 분주하여 25℃에서 24시간 반응시킨 후 웰 주위로 생기는 환의 크기로 효소 활성을 측정하였다.

7. 혈전분해효소 활성 측정

식품의약품안전처 독성연구소 혈전용해제의 효능검색 방법(Fibrin plate 방법, Astrup and Mullertz, 1952)을 변형하여 혈전분해 활성분석에 사용하였다. 100 unit/㎖ 트롬빈 용액을 90mm petri-dish에 200 ㎕ 분주하고 0.5% 피브리노겐(fibrinogen) 용액 (in PBS buffer, pH7.4) 10 ㎖과 1.0% 아가로스 용액 10 ㎖을 순서대로 분주하고 잘 혼합하여 평판 피브린 플레이트를 제조하였다. 선별된 균주는 LB 액체배지에서 30℃, 24시간 진탕 배양하여 15,000×g로 10분간 원심분리 후 상등액을 취하고 0.45 ㎛ membrane 필터로 제균한 뒤 상기 피브린 플레이트 상의 6mm 구멍에 각각 분주하였다. 37℃에서 20시간 반응 후 생긴 투명한 환의 지름을 측정하여 혈전분해 활성을 확인하였다. 양성대조구로 우로키나아제(urokinase, 0.25 unit/㎖)를 사용하였다.

8. β-glucosidase 활성 분석

β-glucosidase 활성을 측정하기 위해 LB 액체배지에 Exculin Iron 아가를 혼합하여 LB-EI 배지를 제조하였다. 선별 균주를 LB-EI 배지에 접종하여 30℃에서 24시간 배양한 후 콜로니 주변의 색의 변화로 β-glucosidase 활성을 확인하였다.

9. 식중독 관련 유해 병원성 미생물에 대한 항균력 확인

식품을 부패 또는 오염시켜 식중독을 유발하는 리스테리아 모노사이토게네스(Listeria monocytogenes), 마이크로코커스 루테우스(Micrococcus luteus), 대장균(Escherichia coli) 및 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococus aureus)에 대한 항균 활성을 측정하였다. 항균 활성의 측정을 위해 리스테리아 모노사이토게네스 KCCM43155, E. coli KCCM11234, 스타필로코커스 아우레우스 KCCM11335은 한국미생물보존센터(KCCM)로부터 분양받았고, 마이크로코커스 루테우스 KCTC1056은 한국생명공학연구원 생물자원센터(KCTC)에서 분양받아 지시균주로 사용하였다. 측정 방법은 웰 확산 방법을 이용하였으며, 각 지시균주의 배양액(3.0×10⁵ cfu/㎖)을 0.8% 한천을 함유한 NB(nutrient broth) 소프트 배지에 첨가하여 평판배지를 제작한 후 선별 균주의 배양 상등액 100 ㎕를 웰에 분주하여 배양 상등액이 시험 평판배지에 확산되도록 한 후 지시균주의 생육 최적 온도에서 24시간 이상 배양하여 유해 미생물의 생육억제 환 크기를 측정하여 항균력을 측정하였다.

10. 내산성, 내담즙성, 내열성 분석

선별 균주의 내산성, 내담즙성, 내열성을 알아보기 위하여 선별 균주를 LB 액체배지에서 30℃에서 18시간 배양 후 이를 실험의 초기 접종 배양액으로 사용하였다. 선별 균주의 산에 대한 내성은 pH 2.0 ~ 5.0로 조절한 LB 액체배지에 초기 접종 배양액을 5%씩 접종하여 30℃에서 30분 진탕배양 반응 후 생균수를 측정하여 내산성을 확인하였다. 선별 균주의 담즙산염에 대한 내성은 담즙(oxgall)을 0.3 ~ 1.5% 첨가한 LB 액체배지에 초기 접종 배양액을 5%씩 접종하여 30℃에서 6시간 진탕배양 반응 후 생균수를 측정하여 내담즙성을 확인하였다. 또한, 선별 균주의 열에 대한 내성 효과는 LB 액체배지에 초기 접종 배양액을 5%씩 접종한 LB 액체배지를 각각 30 ~ 80℃에서 10분간 반응 후 생균수를 측정하여 내열성 정도를 확인하였다. 각 실험의 대조구는 담즙을 첨가하지 않은 배지, 30℃에서 반응한 생균수로 정하였다.

11. 장내 상피세포 부착능

24-well plate에 2×10⁵ cell/well로 접종된 CaCO2 세포들을 24시간 배양한 후 선별된 바실러스균 및 유산균을 MOI(multiplicity of infection) 10으로 45분간 감염시켰다. 세포에 침투하지 못한 처리 균주는 PBS 버퍼로 3회 세척하여 제거하였고, 1% Triton X-100 (in PBS)로 CaCO2 세포들을 파괴하여 세포에 침투했던 선발 균주를 연속적으로 희석해 LB에 도말하였다. 생균수를 확인하여 아래의 식에 대입하여 선발균주의 장내 상피세포 부착율을 산출하였다.

부착율(adhesion) (%) = [부착 균수/초기 처리균수] × 100

12. 선별 균주의 동정

선별 균주의 동정을 위해 균체는 한천 평판배지로부터 회수하였으며, 이들의 DNA는 Qiagen QIAamp DNA mini kit를 사용하여 추출하였다. 16S rRNA 유전자는 두 개의 알려진 유니버설 프라이머를 사용하여 증폭하였다. 두 유니버설 프라이머의 염기서열은 다음과 같다: 27F 5'-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3'(서열번호 2), 1492R 5'-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3'(서열번호 3). 또한, PCR을 위한 각 반응의 조건은 다음과 같다: 95℃에서 10분간 1회 초기 변성 후 DNA 증폭을 위하여 90℃에서 30초간 변성, 60℃에서 30초간 결합, 72℃에서 30초간 증폭 과정을 35회 실시하고 72℃에서 10분간 마지막 증폭을 1회 실시. 반응이 끝난 PCR 산물은 1.5% 아가로스 겔에서 전기영동한 후 UV transilluminator (Gel documentation, Bio-Rad)를 이용하여 밴드를 확인한 후 증폭이 확인된 PCR 산물은 마크로젠(주)에 의뢰하여 동정을 실시하였다.

실시예 1. 선별 균주의 Bacillus cereus 독소 유전자 분석을 통한 안전성 분석

바실러스 속 내 설사 및 구토를 유발하는 독소를 생성하는 것으로 알려져 식품의약품안전청에서 규제하고 있는 식중독유발 미생물인 바실러스 세레우스(Bacillus cereus)의 설사형 독소 및 구토형 독소 유전자에 대하여 선별된 SRCM101393 균주가 해당 유전자를 보유하고 있는지 PCR 분석을 통하여 확인하였다. 바실러스 세레우스 독소 유전자 6종(hblC, nheA, entFM, cytK, ces, bceT)에 대하여 확인한 결과 선별된 SRCM101393 균주는 6종의 독소 생성 유전자가 없는 것으로 확인되어, 구토 및 설사 등을 유발하지 않는 안전한 균주임을 확인하여 추후 식품 및 식품첨가제 등과 같은 다양한 응용 분야에 이용 가능함을 확인하였다.

바실러스 세레우스 독소 유전자 보유 여부 확인

Strain no.	Identification	Toxin gene
		hblC	nheA	entFM	cytK	ces	bceT
SRCM101393	B. subtilis	ND	ND	ND	ND	ND	ND
SRCM102745	B. subtilis	ND	ND	ND	ND	ND	ND
SRCM102750	B. subtilis	ND	ND	ND	ND	ND	ND

* ND ; Not Detection

실시예 2. 용혈성 및 유해효소 생성 분석

용혈은 자연적으로 적혈구가 파괴에 의해 일어나기도 하지만 유전적 결함, 화학물질, 미생물에 의한 독성물질에 의해 비정상적으로 일어나기도 한다. 특히, 미생물 감염에 의한 용혈성은 혈전성 혈소판 감소증이나 용혈성 요독증후군과 같은 질병으로 이어질 수 있어 선별된 균주의 용혈성을 분석하였다. 그 결과, 선별된 SRCM101393 균주는 주로 병원성 미생물이 나타내는 가용성 용혈소(hemolysin)에 의한 적혈구 막 파괴를 일으키는 β형 용혈성이 아닌, 용혈현상을 일으키지 않는 γ형 용혈성임이 확인되었다. 또한, 장내 미생물이 생산하는 트립토파나아제(tryptophanase), 우레아제(urease) 및 β-글루쿠로니다아제(β-glucuronidase) 등은 대장암을 유발하는 것으로 알려져 있어 선별 균주의 안전성 확보를 위하여 상기 유해효소의 생성 여부를 확인한 결과, 선별된 SRCM101393 균주는 3종의 유해효소 모두를 생성하지 않는 것으로 확인되어 안전성이 높은 균주임을 확인할 수 있었다.

용혈성 및 유해효소 생성 여부 확인

Strain no.	Identification	Hemolytic activity	Harmful enzyme
			Trytophanase	β-glucuronidase	Urease
SRCM101393	B. subtilis	γ-hemolysis	-	-	-
SRCM102745	B. subtilis	γ-hemolysis	-	-	-
SRCM102750	B. subtilis	γ-hemolysis	-	-	-

실시예 3. 식중독 관련 유해병원성 미생물에 대한 항균활성

식품 내에서 독소를 생성하여 섭취 시 두통, 구토, 설사 등 식중독을 일으키는 것으로 알려진 유해 미생물 6종에 대하여 SRCM101393 균주의 항균활성을 확인한 결과, 6종의 유해미생물 중 리스테리아 모노사이토게네스(Listeria monocytogenes) 2종과, 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococus aureus) 1종 및 마이크로코커스 루테우스(Micrococcus luteus) 1종에 대한 항균 활성을 보이는 것으로 확인되어, 유해 미생물에 대한 생육 억제 활성이 우수한 것을 확인 할 수 있었다.

유해병원성 미생물에 대한 항균활성

Strain no.	Identification	Antibacterial activity (halo size, cm)
		B. cereus KCCM 40935	L. monocytogenes KCCM 403075	L. monocytogenes KCTC 3444	E. coli KCCM 11234	S. aureus KCCM 11593	M. luteus KCTC 1056
SRCM101393	B. subtilis	-	1.3	1.1	-	1.0	1.0
SRCM102745	B. subtilis	-	1.2	1.1	-	-	-
SRCM102750	B. subtilis	-	-	0.8	-	-	-

- ; Not effect.

실시예 4. 바이오제닉아민 생성 분석

과량의 바이오제닉아민을 섭취 시 두통, 복통, 알레르기 등이 유발할 수 있다고 보고되고 있다. 특히, 히스타민의 경우 8-40 mg 이상 섭취 시 두통 등 증상이 발생하고, 티라민의 경우 100 mg 이상 섭취 시 중독 증상이 발생한다고 보고되고 있다. 따라서 선별된 균주를 대상으로 바이오제닉 아민 생성 유무를 조사하였으며, 그 결과 SRCM101393, SRCM102750의 경우 모두 검출되지 않았고, SRCM102745의 경우 정량되지 않는 인체에 무해한 수준 이하의 히스타민과 티라민이 생성되는 것을 확인하였다. 따라서 선별된 SRCM101393 분리주는 식품에 안전하게 사용 가능한 균주로 사료된다.

바이오제닉 아민 생성량

Strain no.	Identification	Biogenic amine production
		Tyramine (ppm)	Histamine (ppm)
SRCM101393	B. subtilis	ND	NQ
SRCM102745	B. subtilis	ND	6
SRCM102750	B. subtilis	ND	NQ

* ND, not-detection, NQ, not-quantitative

실시예 5. API ZYM kit을 이용한 19가지 기본 효소 활성 분석

선별된 균주의 다양한 효소활성을 확인하고자 API ZYM kit를 이용하여 효소활성을 확인하였다, 그 결과 선별 균주 3종은 에스터라아제(esterase), 애시드 포스파타아제(acid phosphatase), 나프톨-AS-BI-포스포히드롤라아제(Naphthol-AS-BI-phosphohydrolase) 및 α-글루코시다아제(α-glucosidase)에 대하여 공통적으로 활성나타내어 당지질을 가수분해하여 소화흡수에 도움을 줄 것으로 판단된다. 또한, SRCM101393 균주는 상기 4개의 효소 외에 에스터라아제 리파아제(esterase lipase) 및 β-글루코시다아제에 대한 효소 활성이 추가로 확인되었다.

실시예 6. 단백질 분해효소 활성 측정

발효 과정 중 미생물이 생성하는 다양한 효소들에 의해 콩이 가지는 단백질, 올리고다당류, 이소플라본, 지질 등이 소화되기 쉬운 아미노산, 유리당, 이소플라본 aglycone, 지방산 등으로 분해되어 발효 식품의 풍미 향상 및 기능성을 가지는 2차 산물을 생성한다고 알려져 있다. 대표적인 세포 외 분비 효소로 단백질을 가수분해하여 구수한 맛 성분인 아미노산, polypeptide 등을 생성하는 단백질 분해효소(protease) 활성을 선별한 균주를 대상으로 확인한 결과 2.1cm 이상의 높은 효소활성을 가지고 있어 추후 산업적으로 이용 가치가 높을 것으로 판단된다.

단백질 분해효소 활성

Strain no.	Identification	Protease activity (cm)
SRCM101393	B. subtilis	2.3
SRCM102745	B. subtilis	2.1
SRCM102750	B. subtilis	2.1

실시예 7. 혈전분해효소 활성 측정

고지방식인 서구식 식습관으로의 변화로 인하여 최근 혈관 내 혈전형성으로 혈관이 막히는 혈전증으로부터 야기되는 각종 혈관질환 및 관련 질병이 증가하는 추세이다. 이러한 혈전증 치료로 플라스민을 절단하는 우로키나아제, tPA(tissue type plasminogen activator)와 같은 치료제가 사용되나 매우 고가이며 그 부작용으로 인하여 최근 대체 혈전용해제에 대한 관심이 높아지는 추세로 선별 균주의 혈전분해 효소 활성을 확인하였다. 혈전분해 활성을 비교한 결과, SRCM101393과 SRCM102750의 균주가 혈전 용해 활성을 가짐을 확인하여 부작용이 많은 기존의 혈전용해제를 대신할 수 있는 새로운 가능성을 보여 주었다.

혈전분해 활성 확인

Strain no.	Identification	Thrombolytic activity (halo size(cm))
SRCM101393	B. subtilis	1.0
SRCM102745	B. subtilis	0.9
SRCM102750	B. subtilis	1.2

실시예 8. β-glucosidase 활성 분석

β-glucosidase는 배당체 화합물을 유리시키는 효소로 알려져 있으며, 대두를 이용한 발효 식품에는 대표적인 물질이 이소플라본이다. 이소플라본이 β-glucosidase에 의해 분해되면 다이드제인(daidzein)과 제니스테인(genistein)으로 분해된다. 최근 보고에 따르면 제니스테인은 강한 항암작용을 하는 것으로 확인되었으며, 특히 이러한 효소를 생산하는 미생물을 이용한 발효식품은 더욱더 기능성 식품으로 각광 받을 것으로 예측되고 있다. 선별한 바실러스 균을 대상으로 측정한 결과 SRCM101393가 높은 β-glucosidase 활성을 가지고 있으므로 식품으로의 가치가 높음을 확인하였다.

β-glucosidase 활성

Strain no.	Identification	β-glucosidase activity
SRCM101393	B. subtilis	++
SRCM102745	B. subtilis	-
SRCM102750	B. subtilis	-

-; negative effect, +; ~1.0 mm, ++; 1.1~2.0 mm.

실시예 9. 내산성, 내담즙성, 내열성 분석

사람의 소화기관을 안정적으로 많은 수의 생균이 장내 도달하기 위해서는 위액의 낮은 pH, 미생물의 세포막에 영향을 주어 사멸하게 하는 담즙산 및 식품 가공에 적용되는 온도에 대한 내성이 필요하므로 선별균주를 대상으로 내산성, 내담즙성, 내열성을 확인한 결과 도 1과 같다. SRCM1001393 균주의 경우 내산성, 내담즙성이 우수한 균주를 활용하면 위액의 낮은 pH와 담즙산염에도 다량의 생균이 장까지 이동하여 장내환경을 개선할 수 있을 것으로 기대되며, 내열성이 우수한 균주는 제품개발 시 고온의 처리조건에도 견디어 타 균주보다 유리한 특성을 지닐 것으로 사료된다.

실시예 10. 장내 상피세포 부착능

프로바이오틱스 활성을 가지는 미생물 섭취 시 장 내에 머물며 장내 유해미생물 억제 등 장내 환경 개선에 도움을 주는 것으로 보고되어 선발 균주를 대상으로 장내 상피세포주인 CaCO2 세포를 이용하여 장내 상피세포 부착능을 확인하였다. SRCM101393은 65.2%의 부착율을 보여 프로바이오틱스 활성이 우수하다고 알려진 락토바실러스 람노서스(Lactobactillus rhamnosus) GG 균주의 85%의 부착율에는 미치지 못하지만, 선별된 바실러스 서브틸리스 균 중에서 가장 높은 장내 상피세포 부착율을 보여주어 SRCM101393은 섭취 시 장 내로 도달하여 장내 상피세포에 효과적으로 부착할 것으로 사료된다.

장 상피세포 CaCO2 세포주 부착능

Strain no.	Identification	Adhesion rate (%)
SRCM101393	B. subtilis	65.2
SRCM102745	B. subtilis	58.1
SRCM102750	B. subtilis	63.6
LGG	L. rhamnosus GG	85.8

실시예 11. 선별 균주의 동정

SRCM101393균주의 동정을 위해 16S rRNA 유전자 염기서열(서열번호 1)을 분석한 결과 Bacillus subtilis로 판명되었으며, MEGA 7.0에서 표준 균주와 16S rRNA 염기서열을 토대로 계통수(phylogenetic tree)를 작성하였으며, 상동성을 분석한 결과 SRCM 101393은 Bacillus subtilis DSM 10과 유사성이 높게 나타났다. 최종적으로 본 발명에서 선별한 균주를 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) SRCM 101393으로 명명하였으며, 한국미생물보존센터(KCCM, Korean Culture Center of Microorganisms)에 Bacillus subtilis SRCM 101393으로 2018년 5월 28일자에 기탁하였다(수탁번호: KCCM12265P).

한국미생물보존센터(국외) KCCM12265P 20180528

<110> Microbial Institute for Fermentation Industyry <120> Bacillus subtilis SRCM101393 strain having probiotics-related enzyme secretion activity, fibrinolytic activity, antimicrobial activity, and not producing harmful enzyme and biogenic amine and uses thereof <130> PN20156 <160> 3 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 1458 <212> DNA <213> Bacillus subtilis <400> 1 gacgaacgct ggcggcgtgc ctaatacatg caagtcgagc ggacagatgg gagcttgctc 60 cctgatgtta gcggcggacg ggtgagtaac acgtgggtaa cctgcctgta agactgggat 120 aactccggga aaccggggct aataccggat ggttgtttga accgcatggt tcaaacataa 180 aaggtggctt cggctaccac ttacagatgg acccgcggcg cattagctag ttggtgaggt 240 aacggctcac caaggcgacg atgcgtagcc gacctgagag ggtgatcggc cacactggga 300 ctgagacacg gcccagactc ctacgggagg cagcagtagg gaatcttccg caatggacga 360 aagtctgacg gagcaacgcc gcgtgagtga tgaaggtttt cggatcgtaa agctctgttg 420 ttagggaaga acaagtaccg ttcgaatagg gcggtacctt gacggtacct aaccagaaag 480 ccacggctaa ctacgtgcca gcagccgcgg taatacgtag gtggcaagcg ttgtccggaa 540 ttattgggcg taaagggctc gcaggcggtt tcttaagtct gatgtgaaag cccccggctc 600 aaccggggag ggtcattgga aactggggaa cttgagtgca gaagaggaga gtggaattcc 660 acgtgtagcg gtgaaatgcg tagagatgtg gaggaacacc agtggcgaag gcgactctct 720 ggtctgtaac tgacgctgag gagcgaaagc gtggggagcg aacaggatta gataccctgg 780 tagtccacgc cgtaaacgat gagtgctaag tgttaggggg tttccgcccc ttagtgctgc 840 agctaacgca ttaagcactc cgcctgggga gtacggtcgc aagactgaaa ctcaaaggaa 900 ttgacggggg cccgcacaag cggtggagca tgtggtttaa ttcgaagcaa cgcgaagaac 960 cttaccaggt cttgacatcc tctgacaatc ctagagatag gacgtcccct tcgggggcag 1020 agtgacaggt ggtgcatggt tgtcgtcagc tcgtgtcgtg agatgttggg ttaagtcccg 1080 caacgagcgc aacccttgat cttagttgcc agcattcagt tgggcactct aaggtgactg 1140 ccggtgacaa accggaggaa ggtggggatg acgtcaaatc atcatgcccc ttatgacctg 1200 ggctacacac gtgctacaat ggacagaaca aagggcagcg aaaccgcgag gttaagccaa 1260 tcccacaaat ctgttctcag ttcggatcgc agtctgcaac tcgactgcgt gaagctggaa 1320 tcgctagtaa tcgcggatca gcatgccgcg gtgaatacgt tcccgggcct tgtacacacc 1380 gcccgtcaca ccacgagagt ttgtaacacc cgaagtcggt gaggtaacct tttaggagcc 1440 agccgccgaa ggtgggac 1458 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 2 agagtttgat cmtggctcag 20 <210> 3 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 tacggytacc ttgttacgac tt 22

Claims (5)

1. 내산성, 내담즙성, 내열성, 장내 상피세포 부착능, γ-용혈 활성, 혈전분해 활성, 세포외 효소 분비능, 유해 미생물에 대한 항균 활성이 있고, 유해효소 및 바이오제닉 아민을 생성하지 않는, 기탁번호가 KCCM12265P인 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) SRCM101393 균주.
2. 제1항에 있어서, 상기 세포외 효소는 에스터라아제(esterase), 에스터라아제 리파아제(esterase lipase), 애시드 포스파타아제(acid phosphatase), 나프톨-AS-BI-포스포히드롤라아제(Naphthol-AS-BI-phosphohydrolase), α-글루코시다아제(α-glucosidase), β-글루코시다아제 및 프로테아제(protease)이며, 상기 유해 미생물은 리스테리아 모노사이토게네스(Listeria monocytogenes), 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococus aureus) 및 마이크로코커스 루테우스(Micrococcus luteus)이며, 상기 유해효소는 트립토파나아제(tryptophanase), 우레아제(urease) 및 β-글루쿠로니다아제(β-glucuronidase)이고, 상기 바이오제닉 아민은 티라민(tyramine) 및 히스타민(histamine)인 것을 특징으로 하는 균주.
3. 제1항 또는 제2항의 균주, 이의 배양액, 상기 배양액의 농축액 또는 그의 건조물을 유효성분으로 포함하는 프로바이오틱스 제제.
4. 제1항 또는 제2항의 균주, 이의 배양액, 상기 배양액의 농축액 또는 그의 건조물을 유효성분으로 함유하는 장류 제조용 스타터(starter) 조성물.
5. 제1항 또는 제2항의 균주, 이의 배양액, 상기 배양액의 농축액 또는 그의 건조물을 유효성분으로 함유하는 유해 미생물에 대한 항균용 조성물.

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